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新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究 中文摘要 为了克服现有的电化学发光池存在的不足，应用氧化铟锡( i t o ) 玻璃和有机玻 璃等材料，研制出一种可以产生并检测电化学发光信号的流动注射电化学发光池， 该池较好地解决了现有电化学发光池存在的一些问题，也为实验室以后开展此方 面的实验工作提供硬件方面的准备。本文阐述了新型流动注射微型电化学发光池 的设计思想和设计图，详细介绍了该池的制作过程，并在具体的制作中对其结构 进行了优化，总结了该池的优点和主要创新点。 本文基于流动注射分析技术和电化学发光分析技术，采用i t o 玻璃作为工作电 极，通过设计新的流通式电化学发光池，进行动态对流传质为主的条件下i t o 玻璃 电极表面反应层中电化学发光反应的特征和分析特性的研究，探讨所设计的电化 学发光池中鲁米诺发光体系的发光行为，考察相关因素对鲁米诺电化学发光分析 特性的影响。通过对流动体系微型电化学发光池i t o 玻璃工作电极上的鲁米诺电化 学发光的相关因素和电化学发光池结构的优化，提高电化学发光池的分析性能和 应用范围。 利用葡萄提取物对电化学发光体系发光强度猝灭效率的不同，考察了流动注 射电化学发光池在评估葡萄籽核和肉质的抗氧化性能方面的应用，发现猝灭效率 与所加入水果提取液的样品含量成线性相关，据此评估样品的抗氧化性能，红提 籽的抗氧化能力明显强于红提肉。在实际样品测定中，该流动注射电化学发光池 具有较好的重现性，其设计和功能完全能满足电化学发光分析技术的要求，还可 进一步开发与其它技术如毛细管电泳( c e ) 或高效液相色谱( h p l c ) 等联用，在实际 应用研究分析中将有广阔的应用前景。 关键词： 流动注射；电化学发光池；电化学发光；鲁米诺；氧化铟锡( i t o ) 作者：田丙正 指导教师：屠一锋 d e s i g na n df a b r i c a t i o no f am i c r o - e l e c t r o c h c m i l u m i n e s c e n tc e l la n di t ss t u d yo f p e r f o r m a n c e a b s t r a c t d e s i g na n d f a b r i c a t i o no fam i c r o - e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n t c e l la n di t ss t u d yo fp e r f o r m a n c e a b s t r a c t i no r d e rt og e to v e rd i s a d v a n t a g e so fe x i s t i n ge l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n t ( e c l ) c e l l ， an o v e lm i c r o e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n t ( “- e c l ) c e l lb a s e do nf l o wi n j e c t i o nw a s d e s i g n e da n df a b r i c a t e d m a d eo fi n d i u mt i no x i d e s ( i t o ) a n dp d m s ，i th a ds o l v e dt h e p r o b l e m sw e l la n dp r o v i d e dh a r d w a r ef o rf u r t h e rs t u d y i nt h i sp a p e r , t h ed e s i g ni d e a a n dp l a no fe c lc e l lw e r ee x p o u n d f a c t u r ed e t a i l sw e r ei n t r o d u c e da n dt h es t r u c t u r e o ft h ec e l lw a so p t i m i z e d t h ec e l lh a sm a n ya d v a n t a g e sa n di r m o v a t i o n s i nt h i sp a p e r , t h ee c lb e h a v i o ro fl u m i n o lo nt h ei t og l a s sb a s e do nt h ef l o wc e l l w a ss t u d i e d n l e 。i n f l u e n c e so fm a i ne f f e c tf a c t o r so nt h ec e l lw e r es t u d i e da n d o p t i m i z e d t h ep e r f o r m a n c e a n da p p l i c a t i o no ft h ec e l lw e r e i m p r o v e da f t e r o p t i m i z a t i o no f m a i ne f f e c tf a c t o r sa n ds t r u c t u r eo ft h ec e l l a p p l i c a t i o no ft h e c e l lt or e a l s a m p l e sw a ss t u d i e do na n t i o x y g e na b i l i t y e v a l u a t i o no ff r u i t s t h ee c li n t e n s i t yo fd e t e c t i o nc e l ld e c r e a s e dl i n e a r l yw i t ht h e c o n c e n t r a t i o no fr e dg r a p e t h ea n t i - o x y g e na b i l i t yo fr e dg r a p es e e dw a ss t r o n g e rt h a n r e dg r a p ef l e s h t h ec e l lh a sg o o dr e p r o d u c i b i l i t yi nr e a ls a m p l ed e t e r m i n a t i o n i t s d e s i g na n df u n c t i o nh a v es a t i s f i e dt h ee c la n a l y s i s i ta l s oc a nc o u p l e 、析t l lo t h e r t e c h n o l o g i e s ，s u c ha sh p l ca n dc ec ta 1 i tw i l lh a v eaw i d ea p p l i c a t i o ni nt h er e a l r e s e a r c ha n da n a l y s i s k e y w o r d s ：f l o wi n j e c t i o n ；m i n i a t u r i z e dd e t e c t i o nc e l l ； e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ；l u m i n o l ；i n d i u mt i l lo x i d e s ( i t o ) w r i t t e n b y ：b i n g z h e n gt i a n s u p e r v i s e db y ：y i f e n gt u 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个入和集体，均已在文中以明确方式标明扫本人承担本 声明的法律责任 研究生签名：复函垂e 1 期：驾：苎：箩 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本入所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文本人电子文档的内容和纸质论文豹起客褶一致囊除在保密期内豹 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理 新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究第一章引言 1 1 电化学发光概述 第一章引言 电化学发光( e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ，e c l ) ，或电致化学发光( e l e e t r o g e n e r a t e d c h e m i l u m i n e s c e n c e ) ，是在电极上施加一定的电压使电极反应产物之间或电极反应 产物与溶液中某组分进行化学反应，由电极反应引发的物质分子跃迁到激发态， 并在回到基态时以光的形式释放出能量的过程。 1 1 1 电化学发光的发展历史和研究进展 早在1 9 2 7 年，d u f f o r d 等首次发现在g r i g n a r d 化合物的无水醚溶液中，对阴 极和阳极施加一定的电压就可产生发光现象【1 1 。1 9 2 9 年，h a v e r yn 在碱性溶液中 电解鲁米诺时发现了在阳极有发光现象，揭开了电化学发光研究的序幕【2 】。但是直 到六十年代初的三十多年间，只有f r a y m a n n ，b e m a n a s e 和v o j i i r 等人报道过不足 十篇的文章【3 】。2 0 世纪的6 0 、7 0 年代，人们在将e c l 作为一种工具研究那些具 有新的光化学和电化学性质的化合物、络合物和团簇分子时，逐渐认识到这方面 工作对阐明化学发光机理很有帮助【蛔，e c l 现象的研究才得到重视。2 0 世纪7 0 年代，随着电子技术的迅猛发展，特别是集成电路的广泛使用和高灵敏度的光电 传感器的开发，极大推动了电化学仪器的发展，可以使用多种激发信号，并可检 测到更弱的e c l 信号，电化学发光技术也得到不断发展。电化学发光的研究范围 有了很大的扩展，除研究某些发光体系外，还对电化学发光的仪器和电极系统进 行了改进。在电极种类、发光体系、脉冲信号发生系统、光电检测及信号记录等 方面都有所改进。同时，光谱电化学、电子自旋共振、计算机技术等方法也被引 入电化学发光的研究【7 1 。这些技术在电化学发光机理的研究方面起到了常规电化学 方法不可替代的作用。2 0 世纪8 0 年代以来，随着多种电极和仪器系统的改进以及 许多新体系的发现，e c l 反应机理研究的日趋成熟，e c l 作为一种高灵敏度和较 高选择性的分析方法，已成为分析方法中有效的检测方法。在此期间，电化学发 光开始与流动注射分析( f 认) 、高效液相色谱色谱( h p l c ) 和毛细管电泳( c e ) 等分离技术联用，提高了发光信号的重现性和稳定性，为其实际应用打下了良好 新型流动沣射微型电化学发光池的研制及j e 性能研究第一章引苦 的基础【引。九十年代，电化学发光开始用于免疫分析、p c r 分析和d n a 的单分子 检测【9 1 。此外，电化学发光开始用于发光器件的研制【1 0 1 。 近年来，e c l 法越来越引起电化学工作者的重视。在新电极的选择、被测物 质种类的扩大、检测方法的改进、检出限的降低和线性响应范围的扩大等方面都 取得了显著的成就。在新电化学发光试剂的合成和应用研究方面取得了比较大的 发展。汪尔康等将i t o 玻璃作为工作电极广泛应用于e c l 、c e e c l 中，实现了 脱氢酶( a d h ) 生物传感器的制备【l l 】、尿液中抗生素、林肯霉烈12 1 、氨基酸【1 3 】、 草甘膦( g l y ) 及其主要代谢物a m p a 的检测【1 4 】等。文章国内外对电化学发光分 析法的研究均匀评述。g u i b a u l t 等人1 1 5 1 综述了1 9 9 7 2 0 0 0 年间电化学发光在分析化 学中的应用，r i c h t e r 1 6 】详细介绍了电化学发光的原理、机理、发光体系以及对电 化学发光分析在临床、食品、环境和应用进行了总结。图1 简单表示了电化学发 光的发展历史和研究进展。 。1 1 ：曼1 1 寰! ，跏n i l 一、，o x a l 逮e 戳 1 ：) 1 2 1 _ i a t p t aa 譬 e c lf a r l 怎j 虻ra c i j a 如 o f 瓯 r d f 峄 廷叫姚ic o 懈咖tr q 啊1 产搠巍螺赫畸d r i v e n t 玢 e - c 1 l , 19 、6 5 f 磐字眦1 0 7 2 19 7 7 ；茹龆? 嚣孑删焉髫畸i l j r i ；i 懈l l1 9 i 沁il1 9 觳i - 广一一。i | 1 9 7 0 r 雌e c ! m g r m 酶 e 硝埯一m 尊m sf k 韬e f f e c 托 1 9 酮i 呦 e c l 艟 u t r m m i c m e 泌e n 诚皇 1 钟3 2 0 0 0 n i 纳，黔l i l s 鲥柚试i 触戳l 洲 f i g u r e1 t i m el i n eo fe c l ：19 6 4 19 6 5 ，f i r s te x p e r i m e n t s l 7 - 1 9 ；19 6 5 ，t h e o r y 2 0 ；19 6 6 ， t r a n s i e n t s 2 1 , 2 2 ；1 9 6 9 ，m a g n e t i cf i e l de f f e c t s 2 3 ；1 9 7 2 ，r u ( b p y ) 3 2 + 2 4 ；1 9 7 7 ，o x a l a t e 2 5 ：1 9 8 1 ， a q u e o u s 2 6 ；19 8 2 ，r u ( b p y ) 3 2 + p o l y m e r 2 7a n dp e r s u l f a t e 2 8 ；19 8 4 ，r u ( b p y ) 3 2 + l a b e l 2 9 ；19 8 7 ， t r i n p r o p y l a m i n e ( t p r a ) 3 0 31 ；19 8 9 ，b i o a s s a y 3 2 3 3 ；19 9 3 ，u l t r a m i c r o e l e c t r o d e s 3 4 ；19 9 8 ， l a s e ra c t i o n3 5 ；2 0 0 2 ，s e m i c o n d u c t i v en a n o c r y s t a l s3 6 ( m o d i f i e do nt h eb a s i so fr e f3 7 ) 2 掇盼 tl，tf a -忑黼 一 罄 一 e 哦 一 胁勰d 睦 i陬嘲盆；嚣 固“ n k 瓣 新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究第一章引言 1 1 2 电化学发光类型 e c l 体系按发光试剂的种类可以分为以下两类：( 1 ) 金属配合物电化学发光体 系；( 2 ) 有机化合物电化学发光体系，包括稠环芳烃类和酰肼类。这些e c l 体系虽 然都涉及激发态分子以光的形式释放能量回到基态，但是其发光机理不尽相同。 详细发光机理见有关综述【3 羽。 一无机化合物的电化学发光体系 无机化合物电化学发光体系中，最典型的电化学发光试剂是钌联吡啶配合物 r u c o p y ) 3 2 + ，该试剂在水溶液和有机溶剂中发光效率高，溶解度好，可进行可逆单 电子转移反应，在电化学发光基础理论和分析应用研究中占有重要地位。 二有机化合物的电化学发光体系 有机电化学发光物主要有稠环芳烃类，酰肼类化合物，吖啶酯，光泽精等。 稠环芳烃类物质的电化学发光反应一般在非水介质如乙腈、二甲酰胺、苯基 氰、四氢呋喃、l ，2 二甲基乙氧己烷等中进行，并要求体系除氧，分析应用比较 少。近年来，稠环芳烃与共反应物质发光的研究得到了新的应用【3 9 1 。 酰胼类化合物是一类典型的电化学发光物质，其代表化合物为鲁米诺。对鲁 米诺的电化学发光已进行了大量的研究工作，提出了鲁米诺氧化发光【4 0 1 和还原发 光的发光机理。鲁米诺的电化学发光反应与其化学发光反应相同，许多物质可以 催化或增强鲁米诺h 2 0 2 电化学发光反应，因此，鲁米诺电化学发光分析广泛的应 用于许多物质的测定，如a g + ，c r 3 + ，c u ( i i ) ，h g ( i i ) ，p b ( i i ) ，m n ( i i ) ，n i 2 + ，y 3 + ， s 0 3 2 。，h e 0 2 ，溶解0 2 ，没食子酸，肾上腺素，核黄素，鞣酸，硫脲等。 1 1 3 电化学发光的基本原理 根据电化学发光的发光强度进行分析的方法称为电化学发光分析法，它与化 学发光相同之处是二者的发光均由进行能量电子转移反应的组分所产生；不同之 处是电化学发光由电极上施加的电压所引发和控制，化学发光是由试剂的混合所 引发和控制。 3 新型墟自注射微型电化学发光的 f 制监j t 性膛q f 宄第一章引言 ；、廿+ + 念m “”悬“、 。l “ r f 1 。， _ h t “ 一i a n h _ k - ”q ( a )( b ) f i g u r e2 s c h e m a t i cd i a g r a m ss h o w i n gt h eg e n e r a lp r i n c i p l e so f ( a ) c h e m i l u m i n e s c e n c e ta n d ( b ) e l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e r e p r i n t e dw i t hp e r m i s s i o nf r o mr e f 5 1c o p y r i g h t2 0 0 7e l s e v i e r e c l 反应按发光机理归纳起米，1 二要有f 列四种情况： 一、发光物直接接收电极提供的能量生成激发态或自由基离子 e c l 的氧化剂、还原剂是在各自激发电位脉冲时产生1 ：工作电极j 二，此方式 按激发态分子或自由簟离子产牛的历料可分为两类： ( 1 ) 单重激发态途径的e c l ( s - r o u t e ) 大多数芳香族化合物的电化学发光按这类机理进行【4 t 。4 2 1 。电解生成的阴、阳 离子自由基湮灭产生单鼋激发态分了回到基态时产生光辐射，这类e c l 过程可用 f 列反应式表述： ae _ a + ( 屯极氧化) a + e _ a ( 电极还原) a + + a _ + 。a ( 自由基潭火) 1 a + _ a q - h v ( 发光过程) ( 2 ) z 重激发态途径的e c l ( t - r o u t e ) 当电子接受体和电子给予体反应产生的能量比较低，小足以产生单重激发志 时，则可以通过- | 币激发态途径( t - r o u t e ) 产牛e c l 辐射。这类反腑机理可片j 下 列反应武表述： a e _ a 1 ( 电极钮化) 新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究第一章引言 a + e a 一( 电极还原) a 斗+ a 一一3 a + + a ( 自由基湮灭) 3 a + + 3 a _ 1 a + a ( 激发态转化) 1 a _ a + h v ( 发光过程) 式中：3 a 为a 的三重激发态。某些稠环芳烃与金属络合物电极上自由基离子 的形成和相应的发光机理也常用此三重态理论解释【4 3 1 。 二电化学产物同溶液中氧化还原剂发生e c l 反应 具有e c l 发光性能的化合物在被氧化或还原以后可以同溶液中的还原剂或氧 化剂( 共反应物) 之间发生电子转移反应，形成激发态的发光体，然后产生光辐 射。其发光机理】如下所示： a - - e - - * a 斗( 电极氧化) 或a + e - a 一( 电极还原) a 件+ r - - * 1 a + o ( 激发态转化1 ) 或a 斗十o _ 1 a + + r ( 激发态转化2 ) 1 a 。_ a + h v ( 发光过程) 该类电化学发光反应研究应用范围最广，较典型的例子是水溶液中联吡啶钌 体系的e c l 。酰肼类化合物a b e l 、光泽精、碱性鲁米诺发光体系、各种无机配 合物包括一些量子点材料的e c l 均属此类发光机理。 鲁米诺( 3 - 氨基邻苯二甲酰肼) ，在碱性条件下能被许多氧化剂( h 2 0 2 ，0 2 ， c 1 0 ，1 2 ，k 1 0 4 等) 氧化而发出蓝色的光，发光反应的量子产率介于o 0 1 0 0 5 之 间，在水介质中，最大发射波长为4 2 5 n m ，由于这类化合物发光效率高，试剂稳 定，反应在水相中进行，是研究最早、最多、应用最广泛的电化学发光试剂。在 碱性水溶液中，鲁米诺一般经历解离和生成自由基离子等过程生成激发态离子， 如图3 所示。 5 新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究 第一章引言 o f i g u r e3 s c h e m a t i cd i a g r a m ss h o w i n gt h eg e n e r a lp r i n c i p l e so fe c l 三氧化物修饰的阴极发光 在某些金属氧化物电极上可观察到另一类e c l 现象阴极发光。氧化物覆 盖的半导体金属电极在阴极极化时向溶液中注入热电子，使溶液中协同反应剂过 硫酸盐：氧或过氧化氢等产生强氧化性的自由基；没有协同反应试剂存在下也会 在电极表面形成阳离子中心或阴离子空穴形式的强氧化性物质；这些强氧化性物 质氧化一些物质会产生发光【4 5 4 6 】。 四半导体纳米材料的电致化学发光 半导体纳米材料的光学性质同材料本身的尺寸大小和表面状态密切相关。相 比普通材料，半导体纳米材料载流子更易通过扩散从纳米粒子内部迁移到表面， 促进氧化还原反应。研究表明分散在非水溶剂体系中的半导体纳米材料，如量子 点s i 4 7 】，c d s e 4 s 等可以通过电化学手段被氧化或还原，进而产生e c l 辐射。 1 1 4 电化学发光应用 一、电化学发光作为分离技术的检测器 电化学发光的高灵敏度、宽线性范围、仪器设备简单等优点，使得这种方法 在一些分离技术中得到青睐。高效液相色谱和毛细管电泳的常规检测器如u v 或荧 光光谱对于很多没有发光基团的物质不能直接测定，而是通过复杂的衍生手段， 且存在激发光源、光散射的影响。采用电化学发光作为检测器，可以克服这些问 题，因为电化学发光不需要激发光源，而且许多物质不需要任何前处理就能直接 6 星 一诤一 新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究 第一章引言 分离检测，尤其是联吡啶钉的电化学发光。 二、电化学发光传感器和发光器件 在电化学发光的研究中，通过化学修饰的方法将直接或间接参与化学发光反 应的试剂固定在电极上而构建的_ _ 类实验装置泛称为电化学发光传感器。电化学 发光传感器一定程度上减少了贵重试剂的使用，使实验装置简单化或微型化，在 分析化学中日益受到重丰见【4 9 5 0 1 。 ( 1 ) 联吡啶钌的电化学发光传感器 过渡金属配合物最为常用的是联吡啶钌( r u ( b p y ) 3 2 + ) 与其衍生物。在电化学发 光中，联吡啶钌在反应前后的化学形态和性质基本不变，是一个循环反应过程。 因此将联吡啶钌或其衍生物固定化制成所谓的电化学发光传感器是近年来电化学 发光领域研究的重要方向。依据电极的修饰方法大致可分以下几种：( 1 ) n a t i o n 膜法 【5 1 1 ( 2 ) l b 膜法嘲( 3 ) 分子自组装膜法【5 3 】( 4 ) 溶胶凝胶法【5 4 1 。 ( 2 ) 鲁米诺电化学发光生物传感器 涉及鲁米诺电化学发光反应的传感器固定化的试剂多不是鲁米诺分子，而是 间接参与发光反应的底物氧化酶。这类装置通常称为电化学发光生物传感器。底 物氧化酶催化底物产生过氧化氢，而后过氧化氢与鲁米诺进行电化学发光反应。 酶的固定化主要有两种方式：一种是将酶以适当的方法固定在刚性载体上，然后将 负载酶的载体置于电极表面或附近，载体和电极可分离；另外一种是将酶通过共 价键合的方法直接固定在电极上。朱果逸等【5 5 】采用本体修饰的方法将葡萄糖氧化 酶固定在碳糊电极中制成了电化学发光葡萄糖传感器。 ( 3 ) 电化学发光传感器的微型化 f i a c c a b r i n o 等【5 6 】将叉置阵列微金电极和光电二极管组合到一块5 x 6 舢n 2 的硅质 芯片上制作了集成化和微型化的e c l 传感器，不仅体现了芯片实验室的设计思想， 其集成化的结构特点也利于e c l 的检测。 三、无机物的分析 h a a p a k k a # 争 5 7 】首次研究了c 0 2 + 和c u 2 + 对鲁米诺电化学发光的催化情况，并对这 两种离子进行了测定。此后，安镜如等 5 8 - 6 1 1 还对n i 2 + 、a g + 、r 、c p + 进行了测定， 某些阴离子也可以采用电化学发光法测定【6 2 删。 7 新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究第一章引言 四、有机物质的分析 电化学发光主要用于分析过氧化物【6 5 。6 ，、有机酸( 如草酸【6 引、丙酮酸【6 9 】、抗 坏血酸7 川等) 、酚类物质【7 l 】、醇类物质【7 2 1 、酮类物质7 3 1 、脂肪胺和氨基酸【7 4 1 等。 五、药物分析 g r e e n w a y 等【7 5 】采用联吡啶钌电化学发光法选择性地测定了b 肾上腺功能药物 氧希洛尔( o x p r e n o l 0 1 ) ，线性范围为0 0 0 0 1 0 0 4 m m o l l ，检测限为3 5 n m 0 1 l 。 六、免疫分析 免疫分析是临床检测的一种重要技术，电化学发光在此方法中体现了其非放 射性标记、快速、灵敏、动力学范围宽的优点。利用竞争和双抗体夹心免疫电化 学发光( i e c l ) 澳i j 定促黄体激素( l h ) 、牛血清l g g 、牛血清生长激素和蛙甲状腺降钙 素等已有报道【3 甜。另) i i e c l 还可用于人体肿瘤相关糖蛋白的测定【7 6 1 。 七、核酸杂交分析 电化学发光核酸杂交分析是9 0 年代初期发展起来的一门新颖的d n a 分析技术 【7 7 1 ，可替代放射性同位素标记的传统的核酸分子杂交手段。王鹏等【7 8 1 对电化学发 光在核酸杂交分析中的应用进行过比较详细地评述。 八、电化学发光成像研究电化学过程 电化学发光成像法可以观察电极表面电化学发光强度的分布情况，而电化学 发光强度对电极表面的活性具有很大的依赖性，因此利用电化学发光成像法 可以直观地反映电极表面活性点的分布。在分析化学中利用电化学发光的成像图 可以直接地研究电极表面状况，如揭示电极表面的吸附层的覆盖度和均匀性，研 究电极表面活性分布的表征、电极表面粗糙度的表征、流体动力学研究、反应动 力学研究、固态电子传输研究、反应动力学研究，研究电化学发光反应的机理等【7 9 1 。 九、其它应用 如研究d n a 与金属络合物的相互作用【8 0 】和观察酶活性的变化等8 1 1 。 1 1 5 电化学发光的发展前景 电化学发光由于结合化学发光和电化学方法的优点，一方面可以从光学和电 化学两个侧面对一些体系进行更全面的研究，这样可以更加有利于揭示许多大单 独用一种方法难以深入了解的问题。另一方面，电化学发光分析方法的灵敏度常 常只取决于电极表面附近分析物的浓度，极大地方便了分离与富集，使电化学发 8 新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究第一章 引 言 光方法迅速发展成为免疫分析和d n a 分析最具竞争力的方法之一。今后电化学发 光研究的热点主要有下面几个方向： 1 电化学发光方法与其它分离技术的联用与开发，使电化学发光方法成为一种 广谱的分析方法。不同分析技术联用已成为解决复杂分析问题的必然要求，并成 为分析科学发展的一个趋势。如：e c l 可以与液相色谱、毛细管电泳等联用，作为 高灵敏度检测器，拓宽其应用范围。若这些技术能很好地联用，可以解决化学、 生命科学和环境科学等领域中的一些重要物质的分离和检测问题。 2 电化学发光仪器的研究和微型化电化学发光仪器包括电化学发光生物芯片 的研究和开发：主要是提高电化学发光效率、降低激发电位和提高制作电化学发 光器件的工艺水平，使电化学发光仪器微型化，智能化和遥控化。目前国外已有 i c e n 、宝林曼和日立等公司的e c l 仪器推向市场，但这些仪器的流通池还存在电 极表面清洗不方便及电极分布不甚合理等问题，并且售价较高，新型的微型化的 e c l 仪的开发将更能满足目前临床检验和其它分析工作的要求。 3 电化学发光机理的研究。进一步开展电化学发光机理的研究，为提高电化学 发光效率提供理论基础。 4 e c l 物质的固定化问题：为了解决e c l 物质的重复利用问题，已有不少学者 尝试通过聚合、l b 膜自组装技术、离子交换树脂和溶胶凝胶将e c l 物质固定在电 极表面制成修饰电极加以利用，然而这些膜在流动体系中的寿命比较短，需要进 一步的探索。若能解决固定化问题，这将为便携式e c l 传感器的开发带来希望。 5 成像技术： 刍e n g s t r o m 等提出电化学发光成像法研究表面电化学发光强度分 布情况以来，电化学发光成像技术已经用来研究电化学活性物质和电流密度、电 极上的分布情况和聚合膜在电极上的附着情况等。电化学发光成像技术提供的信 息丰富，可控性好，作为芯片检测器，生物体系的研究等方面有着很大的潜力。 1 2 流动注射电化学发光及其它电化学发光联用技术 2 0 世纪八十年代，电化学发光开始与流动注射分析( f 队) 、高效液相色谱 ( h p l c ) 和毛细管电泳( c e ) 等分离技术联用，提高了发光信号的重现性和稳定 性，为其实际应用打下了良好的基础【8 】。将电化学发光的实验装置与其它分离技术 结合，则可进行流动体系的分析。流动注射系统、液相色谱和毛细管电泳等已经 9 新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究 第一章引言 与电化学发光技术联用。电化学发光联用技术的主要实验装置包括输液系统、电 化学发光池和检测系统。输液系统包括手动输液、流动注射系统、液相色谱和毛 细管电泳等几种方式f 8 2 1 。 1 2 1 流动注射电化学发光联用技术 丹麦的j r u z i c k a 和e h h a n s e n 于1 9 7 4 年首次提出了流动注射分析( f i a ) ， 流动注射分析具有操作简便、分析速度快、重现性好、节省试剂和样品、易于实 现自动化等优点，已广泛用于化学、环境、生命科学、医药、临床等。回顾流动 注射分析的发展历史，人们不难发现各种分析化学的检测方法，如电化学检测技 术、荧光检测方法、光度分析法、原子吸收和原子发射分析方法、化学发光和电 化学发光分析方法等都在流动注射分析的实际应用中发挥了巨大的作用，推动了 流动注射技术在各个历史发展阶段的进一步发展与壮大。 在这些已经报道和广泛应用的检测方法中，电化学发光分析方法由于它具有 分析的灵敏度高、响应的浓度线性范围宽和反应的可控性强等特点，已经在流动 注射分析的实际应用之中得到了广泛应用。该方法不但传承了化学发光反应的特 点和化学发光分析方法的优缺点，而且呈现出自身独有的一系列特点，如呈现出 很好的可控制性；电化学发光信号更易于检测。然而，在经典的e c l 分析即静态 e c l 分析中，由于电极污染效应、合适的电极材料选择、使用的有限性，使得静 态e c l 分析的重现性和分析速度和自动化程度受到严重的限制。为此，人们提出 了许多的研究思路和技术( 如超声处理电极技术、印刷电极技术和流动注射技术 等) 来解决电化学发光分析所面临的问题，取得了很好的效果。在这些研究思路 中，流动注射技术与电化学发光分析结合研究方向显出巨大的潜力和前景，受到 了广大电化学发光分析工作者的广泛青睐，取得了丰硕的研究成果。 在电化学发光联用技术中，最常用的输液系统是流动注射分析系统，见图4 。 由于电化学发光现象一般比较短暂且随时间变化较大，使用间歇式手工操作时较 难取得良好精度，流动注射分析( f i a ) 系统却极适用于这类反应。流动注射电化 学发光分析保存了一般电化学发光法的优点而同时具备f i a 的一般优点：( 1 ) 流动注 射电化学发光分析所用的分析装置比较简单，无需复杂的分光元件和光强测盈装 置，操作方便，一般实验室可自行安装。( 2 ) 方法的灵敏度高，一般在n g g - p g g 数 量级。( 3 ) 线性范围宽，反应物的发光强度与待测物的浓度可在4 5 个数量级范围内 1 0 新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究第一章引言 成线性关系。( 4 ) 一般的电化学发光分析中由于反应速度快，发光强度随时间改变， 重现性较差。在流动注射条件下，可显著提高分析结果的重现性。( 5 ) 电化学发光 分析的选择性不高，需要与分离方法相结合。流动注射可提供高效率的在线分离 手段。( 6 ) 电化学发光对环境因素( 温度、酸度、试剂、离子强度) 的变化敏感，但 这些因素在流动注射条件下都不难得到控n t 8 3 1 。 f i g u r e4 s c h e m a t i cd i a g r a mo f af i e c ld e t e c t i o ns y s t e m r e p r i n t e dw i t hp e r m i s s i o nf r o mr e f8 4 c o p y r i g h t2 0 0 6e l s e v i e r 1 2 2 其它电化学发光联用技术 电化学发光具有灵敏度高、宽线性范围、仪器设备简单等优点，并可检测大 量的物质，这些特点使其与h p l c 和c e 联用时成为一种非常好的检测方法。使得 这种方法近年来在一些分离技术中得到青睐。高效液相色谱和毛细管电泳的常规 检测器如u v 或荧光光谱对于很多没有发光基团的物质不能直接测定，而是通过 复杂的衍生手段，在待测物质的分子上嫁接发光基团，并且存在激发光源、光散 射的影响，采用电化学发光作为检测器，可以克服这些问题，因为电化学发光不 需要激发光源，而且许多物质不需要任何前处理就能直接分离检测。 已有多种不同的方法将电化学发光检测与色谱相结合【8 5 1 。从原理来说，色谱 装置就是在流动注射电化学发光系统的进样器和电化学发光池之间安置一个起分 离作用的柱子。发光试剂可以在柱后加入，也可以在柱前加入，即在流动相中， 因此按照发光试剂在流路中添加的顺序可以分为两种设计模式： ( 1 ) 柱后混合法，图5 1 是柱后混合方法的框图，这种模式的优点是：可以 很容易地改变溶液的p h 值以适应电化学发光反应的要求。缺点是：在流路中增加 1 1 新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究 第一章引言 了一个泵；柱后混合导致样品稀释，色谱峰变宽；不利于微型化等。 图5 1 ：l c e c l 流路图( 柱后) ( 2 ) 柱前添加在流动相中，如图5 2 所示，这种模式的优点是：只需要一个泵， 因此装置相对简单；峰型好，检出限低；易于微型化。缺点是：由于发光试剂在 柱子上的吸附，使得分离效率降低，保留时间延长。 图5 2 ：l c e c l 流路图( 柱前) 电化学发光还可与毛细管电泳( c e ) 联用。c e 中样品体积极小，因而需要灵 敏的检测手段，而电化学发光恰恰可以进行灵敏的检测。与色谱不同的是，由于 毛细管需要很高的分离电压，对电化学发光有一定影响，因此分离电流和电化学 发光检测池要隔绝，常规的电化学发光流通池不能直接和毛细管分离柱相耦合。 c e e c l 的流通池的基本设计大体是如图6 所示。与色谱检测的相同之处是发光试 剂的加入也有柱前和柱后之分。 1 2 新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究 第一章引言 8 图6c e e c l 流路图：1 ：含发光试剂的进样池2 ：多孔毛细管3 ：光导装置 4 ：e c l 测定池5 ：工作电极6 对电极7 参比电极8 避光盒 1 3 电化学发光仪器及电化学发光池研究 1 3 1 电化学发光仪器研究 电化学发光研究所需的仪器主要组成部分包括电信号发生装置、电化学发光 池、光电转换装置和检测系统。 电信号发生装置一般采用普通的电化学仪器，可产生各种e c l 所需的电信号， 如直流、交流( 方波、正弦波、三角波) 和多种脉冲信号( 如线性扫描、正矩形 扫描、双阶跃脉冲等) 。 电化学发光池是e c l 系统的核心部分。由于现阶段商品化的e c l 电化学发光 池比较少，大多数研究者一般都是根据不同实验需要来自行设计电化学发光池。 电化学发光池一般被放置在暗箱中，以避免在测定过程中受自然光的干扰。 常用的光电转化装置一般采用光电倍增管或电感耦合装置( c c d ) 等。 检测系统包括电化学仪器和光学仪器两大部分，电化学仪器一般为c h 系列电 化学分析仪。光学仪器通常为化学发光强度测定仪。化学发光强度检测装置主要 有光电二极管、光电倍增管和c c d 等，其中c c d 还可用于化学发光图象的观察。 e c l 澳j 定是基于电化学激发完成的化学发光过程，因此在测量设备上就必须 包括有电化学分析和光谱分析两类分析仪器的功能，而国内目前此类仪器的开发 和销售较少，一般的研究工作都是借助原有的电化学和光学仪器联合使用，专 门化程度低、性能尚待提高，在仪器连接和使用上也比较复杂，而且许多功能 还不完善。另外，不同的研究工作对以上仪器的要求不尽相同，所以至今电化学 1 3 新型流动诧射微型电化学发光池的研制及其性能研究第章引占 发光研究所用的仪器多数还是要研究者自己自行设计、搭建蛳i ，见图7 f i g u r e7 h o m e m a d ee c li n s t r u m e n t u l s e t u pf r o m d r w u j i a nm i a o sr e s e a r c h l a b o m t u r yi nt h ed e p a r t m e n to fc h e m i s t r ya n db i o c h e m i s t r ya tt h eu n i v e r s i t yo f s o u t l l e mm i s s i s s i p p i ：( a ) c o m p u t e rs y s t e m ；( b ) f a r a d a yc a g e ；( c ) p o t a n t i o s t a t ；( d ) l i g h t t i g h tm e t a lb o xc o n t a i n i n g ( e ) p m ta n d ( f ) s a m p l eh o l d e r ；( g ) e l e e t r o m e t e r ；( h ) h i 曲一v o l t a g ep o w e rs u p p l y 本实验窀从事电化学发光研究已有多年，在电化学发光仪器方面也取得了一 系列成果【”- s g l ，本实验中电化学发光研究所用的仪器多数是自己自行殴计、措建， 下面将详细介绍本实验室电化学发光研究所用仪器的主要组成部分： 图8 本实验室自行搭建的电化学发光仪器 新型流动注射微型电化学发光池的研制及其性能研究 第一章引言 ( a ) 方波发生光电数据采集c o m 系统( 软件与数据处理功能模块) 研究表明，e c l 的激发信号以正矩形脉冲最理想，本系统通过电脑生成一个顺 序输出的正矩形数字脉冲信号，脉冲周期、占空比、上限和下限电位均独立用数 字输人，因此可根据需要生成所需的数字脉冲。在检测器上采集的光强信号同样 是脉冲信号，经过转换后以数字脉冲形式读入计算机中并可实时显示，信号采集 速率可由指令输人控制，采入的光强数据脉冲可以由软件处理，采用两种方式， 一是由软件读出每个脉冲的峰高对时间作图作为测定曲线，二是对每个脉冲进行 积分对时间作图作为e c l 泱j 定曲线。电脑通过串行口与d a d 模块进行通讯。 ( b ) m j i 型多功能计算机接口仪( d a d 转换采样模块) 该模块实现两个功能，一是将计算机送来的数字脉冲转换成模拟信号作为恒 电位模块的信号源，二是对光检测放大模块输出的模拟电压信号进行采样转换为 数字信号传输给计算机，该模块是计算机和模拟设备间的一个转换界面。 ( c ) 恒电位仪( 恒电位模块) 上述经d a 转换产生的模拟脉冲电压只有很小功率，不满足驱动电化学反应的 要求，而且现代电分析技术均采用三电极技术，保证施加在工作电极上的电解电 位是准确的，因此必须采用恒电位模块实现这些功能，该模块设计有三个输出连 接至e c l 的三个电极，分别是工作电极、参比电极和辅助电极，工作电极与参比电 极之间的电压与输人的脉冲信号保持一致，溶液内阻产生的电压降由参比电极反 馈后通过改变辅助电极的电位得以补偿，在工作电极和辅助电极之间形成电化学 反应电流，该电流值的大小反映了