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n f r b 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用 中文摘要 n f k b 信号通路在自噬激活和神经干细胞分化中的作用 中文摘要 目的：神经干细胞研究是当今生命科学研究的热点之一，源于其重要的发育分化 机制和潜在的临床应用价值，但对复杂的调控机制的了解还不够清楚，限制了神 经干细胞的广泛应用。我们的研究计划将从一个全新的角度：从n f 1 c b 传导通 路入手研究其对神经干细胞增殖分化的影响及自噬在其中发挥的作用，试图证明 自噬激活和阻断n f 1 c b 传导通路是诱导神经干细胞分化的有效手段。 方法：体外培养的神经干细胞中加入n f r , b 的抑制剂s n 5 0 ，取不同的剂量 ( 6 2 5 2 5p 咖1 ) 和时间点( 2 - 2 4h ) 相差显微镜下观察神经干细胞的增殖、分化情 况：s n 5 0 阻断n f k b 核转移的作用用n f r , bp 6 5 的免疫荧光检测，用激光共聚 焦显微镜作定性分析；采用m t t 法取不同的剂量和时间点检测细胞的增殖率； w e s t e r nb l o t 检测增殖细胞核抗原p c n a 蛋白表达；s n 5 0 对神经干细胞的细胞毒 性采用l d h 漏出率来检测；采用免疫荧光法、w e s t e r nb l o t 法检测神经干细胞、 神经元及神经胶质细胞的标志性蛋白的表达( n e s t i n 、m a p 2 、g f a p ) 生长相关 蛋i 刍( g a p 4 3 ) 、细胞周期调节蛋白c y c l i nd 1 和细胞周期调节蛋白激酶c d k 4 的表 达均用w e s t e r nb l o t 法；m d c 荧光染色及l c 3 免疫荧光检测自噬体形成；w e s t e r n b l o t 检测l c 3 i 和l c 3 i i 的生成，b e c l i n1 蛋白的表达变化。 结果：体外培养的神经干细胞中加入n f k b 的抑制剂s n 5 0 后，结果显示： s n 5 0 ( 6 2 5 5 0 “g m 1 ) 在各时间段1 2h 、2 4h ，对神经干细胞有明显的抑制作用， 与阴性对照组相比均有显著或高度显著性差异( p 0 0 5 、p 0 0 5 ) 。正常对照组p c n a 呈高水平表 达，s n 5 0 各剂量组作用2 4 小时后，p c n a 蛋白表达均显著降低( p ，蚤一建一i 崮 s _ 心一絮i ， j 4 “ q w h _ 一 “篇黜1 “口。p 。p h m 。 l 酣u c t l 佣 e 一c o m p i t b n f u s i o n 椭l o _ r j 蛐n f i g u r e4s c h e m a t i c m o d e lo f a u t o p h a g ya u t o p h a g , y i n v o n e s a t l e a s t f i v es t e p s ：( 】i n d u c t i o n ；( 2 ) e x p a n s i o n ；( 3 ) c o m p l e t i o n ；( 4 ) d o c k i n ga n d f u s i o n ；( 5 ) d e g r a d a t i o n 哺乳动物的另一个自噬蛋白一b e c l i n1 ，是酵母a p 9 6 v p s 3 0 蝴的同源，是 c l a s s1 1 lp h o s p h o i n o s i t i d e - 3 一k i n a s e ，v p s 3 4 ，复合物的一部分，参与自噬体膜的形 成。也是自噬体的一个重要标记物。b e c l i n l ( b e c n i ) 基凼编码一种6 0 k d a 分子 8 n f r b 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用 日d舌 量的卷曲螺旋蛋白，b e c l i n 。1 是第一个被确定的肿瘤抑制蛋白，参与自噬的溶酶 体的降解途径。因此，通过免疫印记检钡, u b e c l i n1 的表达水平，结合其他生化指 标，可对细胞的a u t o p h a g y 活性进行动态监测和判断。 许多外界刺激( 如饥饿，激素，手术) 和细胞内刺激( 如错误折叠蛋白的积聚， 一些小细胞器的损伤) 均可诱导自噬发生。因此，必定存在一种机制，感知细胞 内外的刺激，将正确的信号传导给调节因子，诱导自噬发生。自噬的调控是一个 复杂的过程，雷帕霉素的靶位t o r ( t a r g e to f r a p a m y c i n ) 、p 1 3 k - u p k b 、g t p 酶、 钙、激素、氨基酸、a t p 、a t g 蛋白以及蛋白合成过程都与之有关 3 8 , 3 9 。 3 2 自噬与神经干细胞 越来越多的证据表明自噬在发育和分化中起着重要的作用，比如应激引起的 酵母孢子形成及分化，线虫d o u e r 发育阶段的维持及寿命延长；在正常发育中， 如果使a t g 基因沉默或破坏a t g 基因，自噬功能受损会导致果蝇和线虫的发育缺 陷 4 0 , 4 1 】。a t g 基因沉默还会导致盘基网柄菌子实体形成障碍【4 2 ，4 3 1 。而去除b e c l i n 1 基因，对小鼠胚胎的发生几乎是致命的m 】。 最新发表在c e l l 的一篇文章指出，在缺失了自我吞噬基因a t 9 5 或b e c l i n 1 的小鼠胚胎体中，细胞正常死亡但却存留在中心区域无法形成胚状腔4 5 , 4 6 。这 是由于垂死细胞的自噬能够促发健康细胞吞噬的信号，缺乏自噬就无法发出信 号。当磷脂酰丝氨酸( p h o s p h a t i d y l s e 渤e ) 暴露在细胞膜外部时就产生了”e a t m e ” 的信号。而分泌低浓度卵磷脂( 1 y s o p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ) 发出“c o m e g e t m e ”信号。 此外，研究人员还发现缺失自我吞噬作用作用的小鼠胚胎细胞具有较低水平的 a t p 。这项研究证实，自噬诱导信号对正常的发育至关重要【4 7 1 。 3 3 自噬和n f k b 众所周知，自噬大自噬在维持细胞的稳定性、发育、细胞生存、衰老、免 疫、肿瘤和神经退行性变中发挥作用。但是直到目前，自噬参与这些作用的机制 还不十分清楚。阐明自噬和n f r d 3 之间的相互关系将为译解自噬在复杂多变的 生物学进程中的作用打开新的思路。研究发现自噬能够有选择的降解信号通路中 的调节蛋白，而调控n f r , b 的信号转导通路对细胞功能的影响非常重要。而且， 自噬与蛋白酶体和h s p 9 0 在蛋白调节中形成一个网络。 泛素蛋白酶体系统调控n f r , b 通路 泛素蛋白酶体降解途径包括两个主要阶段。第一阶段为泛素与蛋白底物的 9 n f r b 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用前言 相互作用：高能硫酯键e 1 泛素复合物的形成，消耗分子a t p ，并释放一分 子单磷酸腺苷( a m p ) 和i 一分子焦磷酸。活化泛素( e l 一泛素复合物) 转移到e 2 s 上，释放出e 1 ，形成高能键e 2 泛素复合物。底物( 被磷酸化、氧化、错误折 叠或与辅助蛋白结合的蛋白质) 被e 3 s 识别并与之结合。e 2 - 泛素复合物上的泛 素转移到e 3 s 上，形成高能键复合物，继而底物通过赖氨酸的氨基形成酰胺键 与泛素连接，泛素分子逐个相加形成链状结构。此外，第一个泛素分子也可与底 物n 末端氨基酸残基连接_ 第二阶段为蛋白酶体对底物的降解：底物泛素链与 蛋白酶体1 9 s 的泛素受体相互作用，蛋白底物去折叠，并通过蛋白酶体受体端裂 隙进入2 0 s 核心内部，被逐步降解；在泛素羧基末端水解酶、脱泛素酶和寡肽酶 的作用下，释放出泛素分子( 可再次参与循环) 。泛素蛋白酶体系统 ( u b i q u i t i n - p r o t e a s o m es y s t e m ，u p s ) 在细胞生命过程中起重要作用，其中之一就 是激活n f r b 转录因子。 总的来说n f 1 c b 的激活机制是一个复杂的过程，尚未完全阐明。n f 一1 c b 通 过两条途径与i k b 解离而活化：一条途径依赖于i k k 的分解作用。首先i r b 在 i k k 的作用下发生丝氨酸位点磷酸化，磷酸化后的i r d 3 被泛素连接酶复合物s c f ( s k p c u l f b o x ) 家族成员e 3 r s1 1 ( b p t r c p 识别，从而促使i r b a 分子中的 l y s 2 1 、2 2 泛素化，然后被2 6 s 蛋白酶体识别并迅速降解。游离的n f r , b 迅速 入核促进基因的转录。另一条途径是被非蛋白酶体的特异蛋白酶降解。h a n 等【4 8 】 实验表明，在h e pg 2 肝细胞中t n f q 通过激活胞浆中的钙蛋白酶降解i r b 而使 n f r j 3 活化，此过程不依赖泛素蛋白酶体系。 除了经典的n f r b 通路活化途径之外，近年来发现的非常规的n f 诏通路 活化途径引起人们的注意：淋巴细胞毒素p 受体l t p r 和t n f 家族成员t a l l 1 受体b a f f 2 r 可诱导i k k a p1 0 0 - p 5 2 ：r e lb 途径。p 5 2 ：r e lb 是细胞中存在的一 种n f 1 c b 的异源二聚体形式。当p 5 2 前体分子同时也是1 1 ( b 家族成员的n f 一心 2 p 1 0 0 与r e lb 结合时，二聚体处于抑制状态；当l k k o t 被其上游蛋白激酶 n i k ( n f 1 ( bi n d u c i n gl ( i n a s e ) 激活后，进一步活化p 1 0 0 ，导致其发生磷酸化依赖性 的剪切，生成了有活性的p 5 2 ：r e lb 复合物并进入细胞核促进下游靶基因的转录 一圳。而研究发现，由于基因和生化手段阻断u p s 都不能组止i k k 的降解，因而 n i k 和i k k 都不能直接被u p s 降解。这些研究至少说明i k k 可以被不同于蛋白 酶体的另一种机制所降解，那就是自噬【5 0 ，5 1 1 。一些研究认为n f 1 国活性被抑制 l o n f r j 3 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用前言 的结果是自噬被激活，在尤因肉瘤细胞( e w i n gs a r c o m a ) 内观察到n f r b 活性降 低，自噬被激活【5 2 1 。由此，研究认为n f r d 3 可以被u p s 、h s p 9 0 和自噬共同调 控。最近z e n g m 【5 3 】等研究发现自噬参与了成神经胶质瘤细胞n 2 a 细胞的分化【5 3 】。 他们的研究结果表明在维甲酸( r e t i n o i ca c i d ) 诱导的成神经胶质瘤细胞n 2 a 细胞 向神经元分化过程中自噬被激活。自噬的化学抑制剂3 - m a 和l y 2 9 4 0 0 2 可以抑 制细胞的分化，而敲除自噬基因b e c l i n1 后，细胞的分化也受抑制【5 3 1 。因此，我 们设想抑制n f r d 3 可能会促进神经干细胞的分化，这种分化的机制可能是通过 阻滞细胞周期、激活自噬的途径达到的。 4 我们的设想 基于上述研究，我们提出了非常重要的假设，即n f r d 3 信号通路及自噬与 神经干细胞的增殖、分化有关。在本研究中我们利用n f r d 3 抑制剂s n 5 0 阻断神 经干细胞n f k b 核转位，抑制其激活，观察阻断n f r b 信号传导通路对神经干 细胞增殖、分化的影响。我们以前的实验发现，注射s n 5 0 可以有效的抑制n f r _ b 入核，从而抑制n f r b 下游基因的表达【5 4 - 5 引。因此我们用s n 5 0 阻断n f r , b 信 号转导通路，研究自噬促进神经干细胞分化及在此过程中自噬与n f r d 3 信号转 导通路的关系。 n f r d 3 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用第一部分 第一部分阻断n f k b 通路对神经干细胞增殖的影晌 引言 最近的研究发现和n f - k b 的激活有关因素被证明可以促进神经干细胞增殖 【1 1 ，1 3 ，1 5 , 2 3 , 2 4 1 ，具体的机制尚不清楚。我们的实验直接使用n f r d 3 的抑制剂，加 到正常培养的神经干细胞，来观察其对神经干细胞的增殖的影响。期望能提供直 接的证据证明n f 心通路在干细胞增殖中所起的作用。 n f n b 抑制剂有很多种，到目前为止，已发现的n f r d 3 抑制剂有：蛋白酶抑 制剂、二硫氨基甲酸肽吡咯烷( p d t c ) 、二甲基亚砜( d m s o ) 、n 乙酰半胱氨酸 ( n a c ) 以及糖皮质激素和s n 5 0 等。目前广泛使用的n f w , b 抑制剂是s n 5 0 。s n 5 0 是一种可以穿透细胞的4 1 个氨基酸残基多肽，该多肽包含p 5 0 的核定位序列 ( n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns e q u e n c e 。n l s ) ，可以抑制卜陌r d 3 与d n a 结合【5 9 1 。 第一节神经干细胞的培养和鉴定 建立稳定、可靠的神经干细胞体外培养模型，是探索其增殖、分化机理和进 行神经干细胞体内移植的有效手段，是当代神经科学领域的研究热点课题之一。 目前，国外己建立了神经干细胞系，国内这方面研究还很匮乏，而对神经干细胞 增殖和分化的研究报道也较少。为此，我们利用单细胞克隆技术分离和培养胚胎 小鼠皮层起源的神经干细胞。我们已经初步建立了稳定、可靠的神经干细胞体外 培养模型，掌握了神经干细胞的冻存与复苏的方法，以及将神经干细胞球分散为 单细胞的可靠方法。 1 2 n f 1 ( b 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用第一部分 材料与方法 一、材料 1 药物与试剂 1 1 细胞培养的试剂：d m e m f 1 2 ( 1 ：1 ) 培养基，胎牛血清，胰酶( t r y p s i n ) ，n 2 添加剂( c a t ：1 7 5 0 2 - 0 4 8 ) ，p e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n ，美国g i b c o 公司；碱性成纤 维细胞生长因子( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r b a s i c ，b f g f ，c a t ：f 0 2 9 1 ) ，表皮生长因 子( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，e g f ，c a t ：e 4 12 7 ) ，美国s i g m a 公司。 1 2 抗体：抗巢蛋白( n e s t i n ) 抗体( c a t ：m a b 3 5 3 ，c h e m i c o n ) ；胶质纤维酸性蛋白 g f a p 抗体( c a t ：c 9 2 0 5 ，s i g m a ) ；微管相关蛋一2 ( m a p - 2 ) 抗体( c a t ：m 9 9 4 2 ， s i g m a ) ；f i t c - c o n j u g a t e da n t i - m o u s ei g g ( c a t ：7 15 1 6 5 - 1 5 0 ) 及h r p c o n j u g a t e d a n t i - m o u s ei g g ( c a t ：7 15 - 0 3 5 - 1 5 0 0 ，j a c k s o ni m m u n o r e s e a r c h ) 。 1 3 其他试剂：n f v d 3s n 5 0 ，c e l l p e r m e a b l ei n h i b i t o rp e p t i d e ( c a t ：p 6 0 0 ，b i o m 0 1 ) ； d i s p a s ei i ( c a t ：1 0 1 6 5 8 5 9 0 0 1 ，r o c h e ) ；脱氧核糖核酸酶i ( d n a s ei ，c a t ：d 4 2 6 3 ， s i g m a ) ，左旋多聚赖氨酸( p o l y - l 1 y s i n e ，c a t ：p 8 9 2 0 ，s i g m a ) ；其余试剂均为国药 集团分析纯产品。 2 。实验动物：昆明小鼠，雌性，s p f 级，孕1 4 1 6 天，清洁级，由苏州大学医学 部实验动物中心提供，生产许可证x c v k ( 苏) ：n o 2 0 0 2 0 0 0 8 ，使用许可证 s y x k ( 苏) ：n o2 0 0 2 0 0 3 7 。喂养条件如下：六只一笼，室温2 2 c ，湿度5 0 6 0 ， 通风良好，人工昼夜( 1 2h 1 2h ) ，自由摄食摄水。 3 主要实验仪器：c 0 2 培养箱，h e r a e u s b b l 6 u v 型，美国h e r a e u s 公司；倒置 显微镜、体视显微镜，日本o l y m p u s 公司；荧光显微镜t e 一2 0 0 0 ，日本n i k o n 公司；共聚焦荧光显微镜，n i k o nc o n f o c a lm i c r o s c o p ec l s i ，日本n i k o n 公司。 二、方法 1 神经干细胞体外培养 取孕1 4 1 6d 的昆明种小鼠，4 水合氯醛腹腔麻醉( o 1m l 1 0 曲，7 5 1 拘乙醇 中浸泡消毒2m i n ，打开腹腔暴露串珠样子宫。无菌条件下取出胎鼠，置于冰冷 1 3 n f v h 3 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用第一部分 的无菌磷酸盐缓冲液( p b s ) i 为，在无菌条件下，完整地取出脑组织，放入培养皿 中( 预先加入冷的p b s ) 漂洗二次后，体视显微镜下剥离出小鼠的大脑皮层，再仔 细剥离去掉软脑膜和血管。冷的p b s 漂洗三次后，加入1 2 5 胰蛋白酶5m l ， 3 7 c 消化1 5m i n ，加入含1 0 胎牛血清的d m e m f 1 2 培养液终止胰酶的消化。 加入0 5g 1d n a s ei 酶消化5r n i n ，用枪尖反复轻轻吹打得到较为纯净的单细胞 悬液，1 0 0 0r m i n 离心5m i n 。弃上清液，加入含2 n 2 的d m e m f 1 2 无血清培 养液( e g f2 0n g m l ，f g f2 0 n 咖l ，p e n i c i l l i n10 0u m l ，s t r e p t o m y c i n10 0m g m 1 ) ， 用吸管轻柔吹打，调整细胞密度接种到5 0m l 培养瓶中，3 7 c ，5 c 0 2 ，9 5 饱 和湿度条件下悬浮培养。4 8h 首次全量换液，此后每2d 半量换液，培养约7d 。 传代培养：吸出细胞悬液，经1 0 0 0r m i n 离心5m i n 后弃上清液，加入含l u m ld i s p a s ei i 的无血清d m e m f 1 2 培养液消化1 5h ，p b s 洗三次，重悬细胞， 1 0 0 0r m i n 离心5m i n ，吸去上清液，加入上述d m e m f 1 2 无血清培养液，轻轻 吹打制作成单细胞悬液，调整细胞密度为5 1 0 8 个m l ，接种到5 0m 1 培养瓶中， 静置培养7d ，每2d 半量换液。此后每7d 传代1 次。 2 免疫细胞化学法 2 1 溶液配制： 1 ) 4 多聚甲醛的配制：称取4 0g 多聚甲醛，用4 0 0m l 双蒸水在5 0 c 水浴下搅 拌，加入5mn a o h 待完全溶解后，加入5 0 0m l0 2m ，p h 7 4 的磷酸缓冲液， 将p h 调至7 2 7 4 ，用双蒸水定容至1 0 0 0m l ，4 c 保存。 2 ) o 1 t r i t o n x 1 0 0 ( v v ) ：用p b s 配制3 的t f i t o n x 1 0 0 储存液，轻摇至溶，4 保存，使用时再用p b s 稀释成o 1 。 3 ) 1 b s a 封闭液：用含0 1 t r i t o n x 1 0 0 ( v v ) 的p b s 配制，轻摇至溶，2 0 c 保 存： 2 2 盖玻片( c o v e r s l i p s ) 预处理： 1 ) 盖玻片浸入无水乙醇中脱脂并吹干； 2 ) 将盖玻片浸泡于含0 0 1 左旋多聚赖氨酸的2 4 孔培养板中，室温过夜； 3 ) 无菌蒸馏水冲洗三次，吹干后待用。 2 3 免疫细胞化学法步骤： 选取来自单细胞克隆的培养细胞接种于放有多聚赖氨酸包被的盖玻片的2 4 孔培养板，并加入有血清培养基( 1 0 的胎牛血清+ d m e m f 1 2 ) ，分别于2h 后行 1 4 n f r b 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用 第一部分 n e s t i n 免疫荧光染色，7d 后行m a p 2 、g f a p 免疫荧光染色。神经干细胞培养中 止后，弃培养基，用预冷的p b s 洗涤2 次，4 多聚甲醛或冰甲醇固定1 5r a i n ，p b s 洗涤2 次；0 1 t r i t o n x1 0 0 孵育1 0m i n ，p b s 洗涤2 次；i b s a 封闭液室温孵育1 h ，p b s 洗涤2 次：以封闭液稀释第一抗体n e s t i n 抗体( 1 ：1 0 0 ) ，m a p 一2 抗体( 1 ：1 0 0 0 ) ， g f a p 抗体( 1 ：2 0 0 0 ) 加入适量，4 c 孵育过夜；p b s 洗涤3 次，加入f i t c 或c y 3 耦联 的二抗( 1 ：8 0 0 ) ，室温避光孵育2h ；p b s 洗涤3 次，d a p i ( 0 5 “m 1 ) 孵育1 0r a i n ； 以5 0 、7 0 、9 5 、1 0 0 四个浓度梯度的乙醇梯度脱水，取出盖玻片，滴加荧 光封片液，将其覆盖在载玻片上，自然晾干，于荧光显微镜下和共聚焦显微镜下 观察，摄片。 结果 1 光镜观察原代神经干细胞培养情况 孕1 4 - - 1 6d 的鼠胚的皮层脑细胞，在无血清d m e m f 1 2 培养液中，加入b f g f 、 e g f 及n 2 条件下，以5 1 0 8 个l 接种，相差显微镜下观察可见，视野内细胞分散均 匀，细胞呈圆形，胞体光亮，周围有光晕，表明细胞活力较好( f i g u r e5 ，a ) 。培 养2 4h 后，可见细胞沉于培养皿底部，背景内有一些死细胞碎片，细胞胞体较圆， 三五聚集成团块，未见突起和生长锥，胞浆透亮，团块周边细胞的折光性好，呈 桑椹状，细胞生命力旺盛( f i g u r e5 ，b ) 。7 2h 后有明显球状团块产生( f i g u r e5 ，c ) ， 细胞间界限不很清楚，球状团块周围有明显光晕、悬浮状态，称之为神经细胞球 ( n e u r o s p h e r e ) 。培养皿中也可见散在细胞，悬浮或贴壁，贴壁的多会生长出短突 起，但随培养时间的延长，细胞全部呈悬浮状态，说明培养基对干细胞的存活生 长有选择作用。随培养时间的延长，神经球逐渐增大，5d 时，出现许多大小不 等的细胞集落，每个神经球由几十甚至几百个细胞聚集形成，细胞排列紧凑 ( f i g u r e5 ，d ) 。 陌棚饼号传导通路和自噬棰神经干翱胞丹仡中的怍用第一帮分 闺黼 曲：、静 f i g u r e5 p h a s ec o n n 碱i m a g eo fn e m u s p l m ec u l t u r e n s c sw e r ec u r u c di ns e r u m - f l o e d m e m f 1 2 m e d i u mc o n l - g i n o ge p i d e m a l 目w m f t o r ( e g f , 2 0 a g n d ) , b a s i c f i b r o b l a s t g o w t h f a o o f ( b m f , 2 0a g m 1 ) a n dn 2s u p p l e m e n t 1 0 0u 枷o fl n i c i l l j n a n d1 0 0 喇o f s t r e p t “m y c l n i n f l a s k s i nah u m i d i f i e d ( 5 c o 9 5 a i r ) h n c u b a t o r m3 7 a cw 岫5 d t h ec e l l s g r e w 硒鲰n o 饿j i l gn e u m s p h e r e sa g 吣；b 婵咄c ( 7 2b ) ；d ad ) h w f i e d m i c r o s c o p e ( x 2 0 0 ) 神经细胞球稳定增大阻后( e 0 7 “中心细胞开始困营养不良而呈现褐色，提 示需立即传代处理。经机械吹打传代后很多单细胞周围都无明显光是( 细胞已死 亡) ，少部分单细胞2d 后出现分裂相，随后渐形成细胞团及神经球，生长性状基 本同原代：部分未被完全吹散的神经球可见迅速在其周边长出新的折光性强而透 亮的细胞，再次成球，但球体不规则。传代后细胞生命力明显较原代接种时差。 这一方面是由于体外培养的细胞远较从组织取材来的细胞脆弱，另一方面也提示 非干细胞在传代时会死亡。 2 免疫细胞化学法检测神经干细胞及神经细胞标志蛋白表达 原代和传代培养的神经球细胞表选集蛋白抗原e s t i n ) 免疫荧光染色显示，神 经球内圆形细胞s 6 n 呈强阳性表达，核未着色( f i g u r e6 ) n s c 定向分化后，细 胞逐渐增大，突起变长，分化成神经元及胶质细胞样形态。m a p - 2 和g f a p 免疫 荧光染色结果显示部分细胞呈m a p - 2 染色阳性，都分细胞呈g f a p 染色阳性 n f - g b 信号传导通路和自噬在种经十胞分化中的作用第一部分 n e s t i nd a p i m e r g e f i g u r e6e x p r e s s i o np e t t e mo f c u l t u r e dm o u s ed e r i v e d s d h n e u m s p h m sc u l t u r e dw i t h m i t o g e n s c o l l e c t e do ng l a s ss l i d e s ，f i x e da n ds t a i n e df o rn e s f i nf g r e e n ) a n dd a p i ( b l u e ) f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e 。2 0 0 f i g u r e7 d j 脯m 帅m l o no fn e u r o s p h e r e s f o l l o w i n gm i t o g e nw i t h d r a w a li m m u n o s t a i n i n go f n e u r o n a l l yd i f t h r e m i a t e dn e u r o s p h e r ed e r i v e dn s c sc el l sw e r ec u l t u r e do np o l y - l l y s i n c o a t e d c o v e r s l i p smt h ea b s e n c eo f e g f a n db f g fm a p 2f g r e e n le x p r e s s i o n m a t k ef o rl l l m a b l r e n e u r o i i sw a su p - r e g u l a t e di t h e】i s3d a y sa f t e ra d h e s i o nt ot h ec o a t e ds u b s t r a t ed i s s o e i a t e d n s c sw e r ec u l t u r e df o ff o t i td a v sl nt h ea b s e n c eo fc y t o k i n e s 】ni i l e d 】i i 1 1c o n t a i n i n g1 0 f b s f o l l o w e db yf i x a t i o na n ds t a i n i n gf o rg f a p ( r e d ) f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ex 2 0 0 n f k b 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用 第一部分 第二节n f v , b 抑制剂s n s 0 对神经干细胞增殖的影响 我们计划在体外培养的神经干细胞中加入n f v , b 的抑制剂s n 5 0 ，选择不同 的处理剂量和时间，采用m t t 法、l d h 法、w e s t e r nb l o t 法检测神经干细胞的 增殖情况。m t t 法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤 药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经 济，被认为是正确评价细胞增殖和存活情况的一种客观指标。l d h 漏出率是反 映细胞毒性的一个有效指标，因此本课题采用l d h 漏出率法来检测s n 5 0 给药 对体外培养的神经干细胞毒性的影响，根据l d h 漏出率的变化来确定细胞损伤 程度的变化，从而证明s n 5 0 对神经干细胞增殖的抑制是否通过细胞毒性导致细 胞死亡而发挥作用的。此外，选择增殖细胞核抗原( t h ep r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a r a n t i g e n ，p c n a ) 的表达情况作为细胞增殖状态指标。增殖细胞核抗原是一种能很 好反映细胞增殖活性的标记物。作为一种调节蛋白，p c n a 在细胞周期g 1 期开 始升高，s 期合成达到高峰，g 2 期和m 期则又下降，因此，p c n a 可很好地反 映细胞动力学的变化，代表细胞增殖的潜能。 材料与方法 一、材料 1 药物与试剂 1 1 细胞培养材料：同上节。 1 2 抗体：n f - r j 3 ( p 6 5 ) 抗体( c a t ：3 0 3 4 ，c e l ls i g n a l i n gt e c h n o l o g y ) ；增殖细胞核抗 原p c n a 抗体( c a t ：s c 5 6 ，s a n t ac r u z ) ；p - a c t i n 抗体( c a t ：a 5 4 41 ，s i g m a ) ： h r p - c o n j u g a t e da n t i m o u s ei g g ( c a t ：7 15 0 3 5 151 ) ，h r p c o n j u g a t e da n t i r a b b i t i g g ( c a t ：711 - 0 35 - 15 2 ) ，c y 3 一c o n j u g a t e da n t i - r a b b i ti g g ( 7 1l - 16 5 15 2 ，j a c k s o n i m m u n o r e s e a r c h ) 。 1 3b c a 蛋白定量试剂盒、e c l 化学发光显色试剂盒，美国p i e r c e 公司； 1 r n f v b 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用 第一部分 1 4 其他化学试n - 四氮唑蓝( m 订) ，f l u k a 产品；l d h 试剂盒，南京建成生物 制品研究所；其余试剂均为国药集团分析纯产品。 2 实验动物：同上节。 3 主要实验仪器：紫外分光光度计、迷你型蛋白电泳槽、迷你型半干转印槽， 美国b i o r a d 公司；x 光片洗片机，日本k o d a k 公司，其余同上节。 二、方法 1 神经干细胞原代培养：同上节。 2 免疫荧光法检测s n 5 0 对神经干细胞内n f v , b 核转位的影响：( 按悬浮细胞免 疫组化的方法处理，与贴壁细胞方法略又不同) 2 1 溶液配制：同上节。 2 2 载玻片预处理： 1 ) 将载玻片泡酸后洗净； 2 ) 浸入无水乙醇中脱脂并吹干； 3 ) 将载玻片浸泡于含0 5 明胶和0 0 5 硫酸铬钾的玻片处理液中； 4 ) 取出载玻片3 7 * ( 2 烘干过夜后待用。 2 3 免疫荧光法检测步骤： 1 ) 选取来自单细胞克隆的神经干细胞球，在完全培养基培养，加或不加2 5 g m l s n 5 0 ，分别于lh 后行p 6 5 免疫荧光单标记染色。 2 ) 培养中止后，吸取各组细胞悬液，1 0 0 0r p m 室温离心5m i n ； 3 ) 弃上清，细胞用预冷的p b s 离心洗涤2 次； 4 ) 留少许上清，用枪冲散细胞，吸取1 0 “l ，滴于已做过预处理的载玻片上， 用血涂片的方法将其均匀涂开； 5 ) 待涂片快晾干时，用2 0 预冷的甲醇固定1 0 2 0 m i n ； 6 ) 将载玻片置于p b s 中洗涤4 次，室温吹干； 7 ) 滴加1 b s a 封闭液封闭细胞，4 ，1h ； 8 ) 将载玻片置于p b s 中洗涤4 次，室温晾干； 9 ) 滴加p 6 5 一抗孵育( 1 ：1 0 0 ) ，4 过夜； 1 0 ) 将载玻片置于p b s 中洗涤4 次，室温晾干； 11 ) 加入c y 3 耦联的第二抗体( 1 ：8 0 0 ) ，室温避光孵育2h ； 1 9 n f k b 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用第一部分 1 0 ) 将载玻片置于p b s 中洗涤4 次，暗处晾干： 11 ) d a p i ( 0 5 9 9 m 0 染色1 0r a i n ； 1 2 ) p b s 洗涤3 次，以5 0 、7 0 、9 5 、1 0 0 四个浓度梯度的乙醇梯度脱水 1 1 ) 滴加荧光封裱液封片； 1 3 ) 共聚焦荧光显微镜下观察，摄片。 3 m t t 比色法： 3 , 1 测定原理及计算方法? m t t ：化学名3 ( 4 ，5 二甲基噻唑2 ) 2 ，5 二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝。 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性m t t 还原为水不溶性的 蓝紫色结晶甲臌( f o r m a z a n ) 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 ( d m s o ) 胃e 一溶解细胞中的甲臌，用酶联免疫检测仪在4 9 0n l t l 波长处测定其光吸收 值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，m t t 结晶形成的量与细胞数 成正比。 3 2 细胞处理及实验步骤 取传代培养的神经干细胞，用完全培养基调整细胞浓度为1 1 0 5 个m l 后接种 于9 6 孔培养板中，3 7 c ，5 c 0 2 条件下培养。分组：实验组加入不同浓度s n 5 0 ( 终 浓度分别为6 2 5g g m l 、1 2 5p g m l 、2 5 肛g m l 、5 0g g m 1 ) ，阴性对照组加入等体 积生理盐水，每组均设3 复孔，分别培养1 2h 、2 4 h 。培养终止前4h 加入m t t ( 5 m g m l ，p b s 配制，过滤除菌) ，1 0 斗l 每孔，3 7 c 继续培养4h 后每孔加入酸化的 1 0 s d s1 0 0g l 终止反应，放置过夜，于酶标仪检测波长为5 7 0l m 时的吸光度 a 值。重复3 次。 4 l d h ( l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ，l d h ) 漏出率测定 4 1 测定原理及计算方法 l d h 漏出率增加是反映细胞毒性的一个有效指标，因此本课题采用l d h 漏 出率法来检测s n s 0 给药对体外培养的神经干细胞毒性的影响，根据l d h 漏出 率的变化来确定细胞损伤程度的变化，从而证明s n 5 0 对神经干细胞增殖的影响 是否通过细胞毒性导致细胞死亡而发挥作用的。l d h 在胞浆内含量丰富，正常 时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此日 j 。细胞培养液中 l d h 活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔l d h 活性比 较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤。本法操作简便快捷，自然释放率低。l d h n f r d 3 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用 第一部分 能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2 ，4 二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙， 在碱性溶液中呈棕红色，通过比色分别得出细胞匀浆和培养液的a 值，l d h 漏 出率按以下公式计算： l d hl e a k a g e ( ) - - - a 培养液( a 培养液+ a 细胞匀浆液) x 1 0 0 4 2 细胞处理及实验步骤： 取单细胞克隆取得的神经干细胞接种于2 4 孔细胞培养板中，分组同m t t 法，3 7 0 、5 c 0 2 条件下培养2 4h 。培养结束时，1 5 0 0r p m 离心5r a i n ，取细 胞的培养液上清作为细胞培养液样品；而离心所得细胞用1 t r i t o nx 1 0 0 于3 7 裂解3 0m i n ，然后再次3 0 0 0r p m 离心5m i n ，取上清作为细胞裂解液样品。l d h 活性按检测试剂盒说明书进行，步骤如t a b l e1 所示。 t a b l e1 l d h 活性检测步骤 测定管测定空白管 蒸馏水( m 1 ) 样品( m 1 ) 基质缓冲液( m 1 ) 0 2 5 辅酶i 溶液( m 1 ) o 0 5 混匀，3 7 水浴1 5m i n 2 , 4 二硝基苯肼溶液( m 1 ) 0 2 5 混匀，3 7 水浴1 5m i n 0 4 m o l ln a o h 溶液( m 1 ) 2 5 0 0 5 0 0 5 0 2 5 o 2 5 2 5 混匀，室温放置3m i n ，4 4 0n m ，蒸馏水调零，1c m 光径，测各管吸光度a 值；计算l d h 漏出率。 5 w e s t e r nb l o t 法 5 1 溶液配制 1 ) 细胞裂解液：1 0m mt r i s h c i ，p h7 5 ；1 5 0m mn a c i ：5m me d t a ；1 t r i t o n x 1 0 0 ；1 去氧胆酸钠；1 s d s ；1 片p r o t e a s ei n h i b i t o rc o c k t a i lt a b l e t ( r o c h e ) ； 2 ) 分离胶缓冲液：1 5 m 碱s ，p h8 8 ； 3 ) 积层胶缓冲液：1 mt r i s ，p h6 8 ； 4 ) 过硫酸铵溶液：l o ( w v ) ，过硫酸铵溶液粉末溶于去离子水中，现配现用； 5 ) 上样缓冲液( 5 ) ：0 2 5mt r i s ：1 0 s d s ；2 5 p 巯基乙醇：2 5 甘油；2 5 溴 2 l n f c b 信号传导通路和自噬在神经干细胞分化中的作用 第一部分 酚蓝； 6 ) 电泳缓冲液：0 0 2 5mt r i s ；0 1 9 2m 甘氨酸：0 1 ( w v ) s d s ；临用前直接将 储存液( 1 0 ，p h8 3 ) 稀释即可； 7 ) 转移缓冲液：0 1 9 2m 甘氨酸；o 0 2 5mt r i s ，p h8 3 ；2 0 甲醇；0 1 s d s ； 临用前配制，低温预冷： 8 ) 漂洗液( 1 0 t b s ) ：8 0g ln a c l ；2 4g r lt r i s ；p h7 6 ：临用前稀释并加入o 1 ( v v ) t w e e n 2 0 ： 9 ) 封闭液：5 脱脂牛奶，直接用t b s t 配制。 5 2 蛋白样品制备 1 ) 细胞总蛋白的提取 神经干细胞经s n 5 0 ( 终浓度分别为6 2 5i 上g m l 、1 2 5i t g m l 、2 5g g m 1 ) 2 4h 后终止培养，用预冷的p b s 漂洗2 次，3 0 0 0r p m 离心1 0m i n 收集细胞。按5 1 0 5 个细胞加入5 0 6 0 山裂解液的比例加入细胞裂解液，吹打混匀，冰浴1 5m i n ， 用超声波细胞破碎仪在冰浴中短暂多次超声细胞，直至裂解液不粘稠。4 。c 、1 2 0 0 0 r p m 离心1 0m i n ，吸取上清，7 0 。c 保存备用。 2 ) 样品准备 用b c a 蛋白定量试剂盒测定以上所提取蛋白的浓度( 方法请参见产品说明) ， 调整上样量使各组蛋白总量一致，各样品上样总量控制在2 0 - 6 0g g 。在样品中加 入5 上样缓冲液中，1 0 0 煮沸5m i n 使蛋白质变性。 5 3s d s p a g e 凝胶电泳 1 ) 将玻璃板洗净，无水乙