（果树学专业论文）若干核果类果树及番木瓜β半乳糖苷酶同源基因的克隆.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是在指导教师的指导下，通过 我的努力取得的成果。并且是自己撰写的尽我所知，除了文中作了标注和 致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包古其他人发表或撰写过的研究成 果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示 了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：王跷b日期：矿- j ，； 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定， 即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文 的全部或部分内容可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 曰 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：工易| 譬 指导教币亲笔签名： 劾镢豇 1 日期：， 日期；d 6 b 福建农林大学硕士学位论文 摘要 摘要 声半乳糖苷酶是果实成熟过程中唯一作用于卢( 1 ，4 ) 半乳糖苷 键而使细胞壁产生半乳糖残余物的酶，与果实软化密切有关。本研究以 台湾甜桃、美国黑李、龙眼梅、油捺、漳红番木瓜等果树的叶片( 或果 肉) 为材料，改良了基因组d n a 和总r n a 的提取方法，采用同源克隆 技术，分离出编码，半乳糖苷酶的基因片断或c d n a 片断，为采用反义 r n a 技术减缓果实软化进程奠定基础，主要研究结果如下： 1 改良了桃、李、梅、榇、番木瓜基因组d n a 和总r n a 的提取方法。 对传统c r a b 法提取基因组d n a 以及t r i z o l 提取总r n a 的方法进行改 良，得到纯净、完接的基因组d n a 和总r n a 样品。 2 根据苹果口半乳糖苷酶c d n a 序歹0 ，设计一对特异引物，直接进行 p c r 扩增，克隆了台湾甜桃、美国黑李、龙眼梅、油檬等核果类果树鼻- 半乳糖苷酶基因片断，测序结果表明，这些片断的大小分别为1 3 8 8b p 、 1 3 8 8b p 、1 3 8 9b p 、1 3 8 9b p ，它们之间具有很高的同源性，达9 8 9 0 。 用同一对特异引物，通过r t - p c r ，也克隆了桃的幼果口半乳糖菅酶c d n a 片断，测序结果表明，该片断的长度为8 6 2b v ，编码2 8 6 个氨基酸，序列 分析结果表明，这个片断与蔷薇科果树中的苹果、日本梨、欧洲梨的卢- 半乳糖苷酶基因具有较高的同源性，平均为8 7 。 3 根据苹果和梨芦半乳糖苷酶c d n a 序列，设计另一对特异引物，通 过r t - p c r 扩增，克隆了漳红番木瓜叶片和果实编码肛半乳糖苷酶c d n a 片断，测序结果表明，这两个片断长度均为7 9 1b p ，编码2 6 3 个氨基酸， 它们之间具有同源性很高，达9 9 1 2 ，仅出现7 个碱基的差异，与欧洲 梨、苹果、日本梨、丰香草莓、丰亡果、甜橙等果树自淞半乳糖苷酶c d n a 的同源性也很高，平均为8 0 - 8 8 。 关键词：桃( p r u n u sp e r s j c a ( l ) b a t s c h ) ；李( p r u n u ss a j i c j n al i n d l ，) ； 梅( p r u n u sn l l m l es i e b e tz u c c ) ；捺( p r u n u ss a l i c i n al i n d l v a r c o r d a t aj y z h a n ge t8 d ；番木瓜( c a r i c ap a p a y al ) ：夕，半乳糖 苷酶：同源克隆 塑罂查整查兰塑r 上堂丝堕壅 茎苎垫茎 c l o n i n go f f l - g a l a c t o s i d a s ei ns o m es t o n e f r u i t - t r e e sa n d p a p a y a a b s t r a c t 鼻- g a l a c t o s i d a s ei st h eo n l ye n z y m et h a th a sb e e ns h o w nt oc l e a v et h e p - ( 1 + 4 ) - g a l a c t a nb o n dd i r e c t l ya n dp r o d u c eg a l a c t o s y lr e s i d u e sf r o mt h e c e l lw a l ld u r i n gf r u i tr i p e n i n g , w h i c hr e l a t e st ot h es o f t e n i n go fm a n yf r u i t s i nt h ep r e s e n ts t u d y ，b a s e do nt h eo p t i m i z a t i o no ft h eg e n o m i cd n aa n d t o t a lr n ae x t r a c t i o nm e t h o d s ，t h ew r i t e rh a sc l o n e dt h ec d n ao rg e n o m i c d n a f r a g m e n t so f p - g a l a e t o s i d a s eg e n ef r o mt h el e a v e so rf r u i t so ft a iw a l l s w e e t p e a c h ，p l n m ，m u m e ，n a ia n dp a p a y a ( z h a n gh o n g ) i nf u j i a n t h em a i n r e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g ： 1 t h em e t h o d sf o re x t r a c t i n gg e n o m i cd n aa n dt o t a lr n af r o mt h e l e a v e sa n dp u l p so f p e a c h ，p l u m ，m u m e ，n a ia n dp a p a y aw e r em o d i f i e d t h e p u r ea n di n t a c ts a m p l e so fg e n o m i cd n a a n dt o t a lr n aw e r eo b t a i n e db y m o d i f y i n gt h et r a d i t i o n a lm e t h o do fc t a ba n dt r i z o lm e t h o df o rt h e s u c c e s s i v ep e ra m p l i f i c a t i o no rr t - p c rr e a c t i o n s 2 t w op c rp r i m e r sw e r ed e s i g n e db a s e do nt h ec o n s e r v e de d n a s e q u e n c eo f 鼻g a l a c t o s i d a s ef r o ma p p l e w i t ht h et e c h n o l o g yo fp e r ，w e h a v ec l o n e dt h ed n af r a g m e n t si np e a c h ，p l u m ，m u m ea n dn a i t h e i r s e q u e n c el o n g t h e sa l e1 3 8 8b p ，1 3 8 8b p ，1 3 8 9b pa n d1 3 8 9b p ，a n dt h e i r n u c l e i ca c i dh o m o l o g yi s9 8 9 0 w i t ht h et e c h n o l o g yo fr t - p c ra n dt h e s a m ep r i m e r s ，w ea l s oh a v ec l o n e da n8 6 2b pl o n gc d n af r a g m e n t c o n t a i n i n g2 6 3a m i n oa c i d si np e a c hy o u n gf r u i t s c o m p a r i s o n sb e t w e e n t h e 卢- g a l a c t o s i d a s es e q u e n c ef r o mm a r sd o m e s t i c a ，p y r u sp y r i f o l i a ，e y r u s 2 福建农林大学硕士学位论文 英文摘要 c o m m u n i si n d i c a t e das a m en u c l e i ca c i dh o m o l o g y , 8 7 3 t h eo t h e rt w op c rp d m e r sw e r od e s i g n e db a s e do nt h ec o n s e r v e d e d n as e q u e n c e so f 鼻一g a l a c t o s i d a s ef r o ma p p l ea n dp e a r w i t ht h e t e c h n o l o g yo fr t - p c r ，w eh a v ec l o n e dt h ee d n af r a g m e n t si np a p a y a l e a v e sa n dm a t u r ef r u i t s e a c hf r a g m e n te n c o d e sp a r to f t h e f l g a l a c t o s i d a s e ， c o n t m n s7 9 1n u c l e o t i d e sa n d2 6 3a m i n oa c i d s t h et w of r a g m e n t sh a v e s e v e a d i f f e r e n t b a s e s ， a n dt h e i rn u c l e i ca c i d h o m o l o g y i s 9 9 a 2 c o m p a r i s o n sb e t w e e nt h ep g a l a c t o s i d a s es e q u e n c e f r o mc y r u s c o m m u n i s ，m a l u sd o m e s t i c a ，c y r u sp y r i f o l i a ，f r a g a r i a xa n a n a s s a ， m a n g i f e r ai n d i c aa n dc i t r u s s i n e n s i si n d i c a t e dan u c l e i ca c i dh o m o l o g y b e t w e e n8 0 a n d8 8 k e yw o r d s ： p e a c h ( p r u n u sp e r s i c a ( l ) b a t s c h ) ；p l u m ( p r u n u ss a l i c i n al i n d l ) m u m e ( p r u n u sm l l l n es i e b e tz u e c ) ：n a i ( p r u n u ss a l i c i n al i n d l v a r c o r d a t aj y z h a n go ta 1 ) ：p a p a y a ( c a r i c ap a p a y al ，) ；卢一g a l a c t o s i d a s e h o m o - c l o n e 3 英文缩写英文全称 a m p 卢一g a l b p c d n a c t a b d e p c d n a d n t p d 1 t e d t a i p t g k b l b r n a o d p c r p e p g p v p p r n a r t - p c r r ( r p m ) t r i s x - g a l 缩略词 中文全称 a m p i c l l i n氨苄青霉素 芦一g a l a c t o s i d a s e口半乳糖营酶 b a s ep a i r s 碱基对 c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b on u c l e i ca c i d 互补d n a c e t y t r i e t h y la m m o n i u mb r o m i d e十六烷基三乙基溴化铵 d i e t h y l p y r o c 8 r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s 脱氧核苷三磷酸 d i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 i s o p r o p y l t h i o - b - d - g a l a c t o s i d e 异丙基硫一b d - 、p 乳糖苗 k i l o b a s ep a i r s千碱基对 l u r i a - b e r t a n im e d i al b 培养基 m e s s e n g e rr n a 信使r n a o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p e c t i ne s t e r a s e 果胶酯酶 p o l y g a l a c t u r o n a s e 多聚半乳糖醛酸酶 p o l y v i n y l p o l y p y r r o l i d o n e 多聚乙烯聚吡咯烷酮 r i b o n u c l e i ca c i d核糖核酸 r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 逆转录聚合酶链式反应 r o t a t i o n a ls p e e di nr e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 每分钟转数 t r i h y d r o x y m e t h l a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 一i n c l o y l d g a l a c t o s i d e 5 一溴- 4 - 氯一吲哚一d 一半乳糖苷 4 福建农林大学硕士论文 前言 前言 1 文献综述 果实采后软化腐烂给世界水果生产带来了极大的损失，受到植物生 理学家普遍关注。据不完全统计，全世界水果的采后腐烂率般达2 0 一3 0 ，我国则更为严重，达3 0 一4 0 ，热带和亚热带地区甚至商达 5 0 。因此，尽快找出导致果实软化的主要原因，采用适合的技术手段， 延缓果实成熟软化进程，减少果实贮运过程中的损失，提高经济效益， 具有重要的现实意义。 果实软化与参与细胞壁中多糖降解的水解酶密切相关。这些水解酶 主要有：p - 半乳糖苷酶( 卢g a d 、腺苷蛋氨酸合成酶、a c c 合成酶( a c s ) 、 a c c 氧化酶( a c o ) 、果胶酯酶( p e ) 、多聚半乳糖醛酸酶( p g ) 、纤维 素酶( c e ) 、脂氧合酶( l o x ) 等，但在果实软化过程参与细胞壁组分 降解的水解酶种类迄今还难于确定。分子生物学研究认为，不同种类的 酶是受不同的基因调控的，各个基因的表达具有各自的时空特性，酶的 活性是受发育信号的基因调节表达的：果实软化是不同基因在各自时、 空间表达的共同作用的结果。传统研究认为，多聚半乳糖醛酸酶( p g ) 可 能是果实软化的关键酶( m c g l a s s o n ，1 9 8 5 ) ，但随着分子生物学技术的 逐渐完善和研究水平的不断深入，尤其是反义p gr n a 转基因番茄果实 的获得，p g 的作用还难于定论( s m i t h ，e ta l ，1 9 8 8 ；g i o v a n n o n i ，e ta l ， 1 9 8 9 ) 。近年来，随着生化与分子生物学技术，尤其是酶纯化技术、基 因克隆技术、遗传转化技术的完善和发展，许多与果实软化相关的酶被 纯化和测序，编码这些酶的基因也相继被克隆，这些基因主要有：肛g a l ( c a r e y ，e t a l ，1 9 9 5 ；r o s s ，e t a l ，1 9 9 4 ；陈昆松，等，2 0 0 0 ；a k i r a ，e t a l ，2 0 0 1 ) 、 腺苷蛋氨酸合成酶基因m o ，e ta l ，1 9 9 6 ；硒m ，e ta l ，1 9 9 9 ；k a s a z l i n d a ， e ta 1 2 0 0 2 ) 、a c c 合成酶基因爿c s ( s c h l a g n h a n f e r ，1 9 9 5 ；i k o m a ，e t a l 、1 9 9 5 ；刘传银等，1 9 9 8 ；金勇丰等，2 0 0 0 ) 、a c c 氧化酶基因彳c d 福建农林大学硕士论文 前占 ( c a l l a h a n ，e ta l ，1 9 9 2 ；m a c d i a r m i d ，e ta l ，1 9 9 3 ；陆路等，2 0 0 0 ) 、p e ( r a y ， e ta l ，1 9 8 8 ) ；p g ( 鞠戎等，1 9 9 4 ；党伟等，1 9 9 4 ；叶志彪等，1 9 9 4 ：张丽 等，2 0 0 3 ：李惠等，2 0 0 0 ，2 0 0 2 ；巩振辉等，2 0 0 4 ) 、c e ( t u c k e ge ta l ， 1 9 8 7 ；t r a i n o t t i ，e ta l ，1 9 9 7 ；b o n g h i ，e ta l ，1 9 9 8 ) ；脂氧合酶基因一 l o x ( f e r r i e ，e ta l ，1 9 9 4 ；陈昆松，等，1 9 9 8 ；李靖，2 0 0 4 ) 等。利用反义r n a 技术，已经成功地将4 c s 、a c o 、p g 等基因导入模式植物番茄，获得抗 果实软化的转基因植株，特别是含a c s 反义基因的番茄已投入商业生产， 为获得耐贮的水果品种开辟了一条新的途径。 口半乳糖苷酶( 肛g a l a c t o s i d a s e ) ，又称乳糖酶广泛存在于各种动 物、植物和微生物中。在植物生长中，p 半乳糖苷酶作为胞外酶与细胞 分裂或扩大生长过程中的松驰有关：在种子或果实中，鼻半乳糖苷酶起 水解贮藏多糖和壁多糖的作用，可能降解多糖中伊一构型半乳糖苷键， 为种子生长发育提供必要的能量来源。另外，它具有糖苷键结构特异性， 可作为乳糖降解和双糖合成催化剂，并有水解生物体内储存的多糖和半 乳糖残基、引起血型转化等生理功能。 一般在植物成熟期，卢半乳糖苷酶含量增加，降解含半乳糖苷的胞 壁多糖，释放游离的半乳糖，可溶性的半乳糖能促进胡椒成熟，能促发 番茄乙烯生成而加快成熟。p 半乳糖苷酶能催化卢半乳糖苷化合物的水 解，口半乳糖苷键发生断裂，生成半乳糖和葡萄糖；转半乳糖，降解乳 糖、生成低聚半乳糖，合成和修饰其它碳水化合物等作用。还与栀子花 的醇类香气的最终生成有极显著的相关。 口半乳糖苷酶在许多果实的早期软化过程中含量丰富，参与细胞壁 半乳聚糖侧链的降解，从而改变果胶分子相互作用及与其它聚体作用， 导致细胞壁完整性的下降。苹果果实软化与户一半乳糖苷酶活性的增加以 及细胞壁多糖中半乳糖组分的减少密切相关( 金昌海等，2 0 0 0 ) 。p 一半 乳糖苷酶在苹果软化前没有活性，随着软化进行，活性增强，同时，苹 果中半乳糖明显减少( 冉辛拓，1 9 9 5 ) 。研究发现在桃果实发生软化的 福建农林大学硕 ：论文 前高 起始两天内，主要是卢- 半乳糖苷酶水解果胶分子上的乳糖支链，从而促 进果胶物质的降解，加速果实的软化( 刘卫晓等，2 0 0 2 ) 。柿果实采后 贮藏早期，p 半乳糖苷酶活性在前6 天迅速上升，而后下降( 罗自生等， 2 0 0 1 ) 。梅果采后，半乳糖苷酶活性上升较早，梅果的早期软化( 贮藏期 前5 d ) 与鼻半乳糖苷酶关系密切，这与在网纹甜瓜上的报道一致( 陆胜 民等，2 0 0 3 ) 。甜樱桃果实成熟软化过程中口半乳糖苷酶活性显著提高( 焦 中高等，2 0 0 3 ) 。油橄榄果实成熟过程中水溶性鼻半乳糖苷酶活性迅速 增加。猕猴桃果实的成熟衰老过程伴随着p 半乳糖苷酶活性的增加，研 究认为猕猴桃果实后熟软化进程分两个阶段：第一阶段为果实软化启动 阶段( 采后3 5 d ) ，第二阶段为快速软化阶段。p 半乳糖苷酶可能在猕猴 桃果实后熟软化的启动阶段起作用( 陈昆松等，2 0 0 0 ) 。但有研究结果 表明在猕猴桃果实成熟过程中该酶活性无明显变化，因而认为该酶与果 实成熟软化无关( w c g r z y n ，e t a l ，1 9 9 2 ；r e d g w e l l ，e t a l ，1 9 9 5 ) 。r e d g w e l l e t 口f ( 1 9 9 5 ) 用a o a 处理猕猴桃抑制了乙烯的生成及果胶物质的降解， 从而推迟果实的成熟软化，但半乳糖仍然丧失。同时，用半乳糖处理果 肉抑制半乳糖的丧失，但对果实的软化却没有影响。因而认为半乳糖的 丧失与果胶的溶解是两个独立的过程。 口半乳糖苷酶作为一个与细胞壁降解相关的重要酶，它与许多果实 的软化有关。近年来，随着分子生物学和蛋白质工程的研究深入，已从 数种果实中分离纯化伊半乳糖苷酶和克隆了，一半乳糖苷酶基因。在高等 植物中，口半乳糖苷酶是在成熟过程中唯一作用于户( 1 ，4 ) 半乳糖 苷键而使细胞壁产生半乳糖残余物的酶( s m i t h ，e ta l ，1 9 9 8 ) 。与果实 软化相关的卢一半乳糖苷酶已经从番茄( p r e s s y ，1 9 8 3 ；c a r e y ，e t a l ，1 9 9 5 ； c a r r i n g t o n ，e ta l ，1 9 9 6 ) 、苹果( k n e e ，1 9 7 3 ；d i c k ，e ta l ，1 9 9 0 ，y o s h i o k a ， e t 口f ，1 9 9 4 ：r o s s ，e t a l ，1 9 9 4 ，金昌海等，2 0 0 0 ) 、甜瓜( r a n w a l a ，e t 口，1 9 9 2 ) 、鳄梨( d ev e a u ，甜a l ，1 9 9 3 ，a k i r a ，e ta l ，2 0 0 1 ) 、猕猴 桃( r o s s ，e t a l ，1 9 9 3 ) 、咖啡( g l o d e n ，e t a l ，1 9 9 3 ) 、柿( k a n g ，e l a l ， 7 福建农林大学硕士论文 前占 1 9 9 4 ) 、木t 果( a l i ，e t a l ，1 9 9 5 ) 和日本梨( k i t a g a w a ，e t a l ，1 9 9 5 ：a k i r a ， e t a l ，2 0 0 1 ) 等的果实中纯化出来，而且它们的性质已经得到鉴定。 研究表明，虽然在果实中存在不同的p 半乳糖苷酶的同工酶，但并 不是所有的同工酶在果实软化巾都对细胞壁的半乳糖基的丧失起重要 的作用。在番茄中发现的三种卢半乳糖苷酶( 卢g a li 、i i 、i i i ) ，只 有p 半乳糖苷酶积极参与户( 1 ，4 ) 半乳糖苷键的降解，与果实软 化相关( p r e s s y ，1 9 8 3 ；c a r e y ，e ta l ，1 9 9 5 ；c a r r i n g t o n ，e ta l ，1 9 9 6 ) 。 在日本梨中有5 种物质显示p 半乳糖苷酶活性( 卢g a li v ) ，其中 p g a li i i 可能对日本梨果实的软化起重要作用( k i t a g a w ae ta 1 1 9 9 5 ) 。 从苹果中分离得到4 种口半乳糖苷酶同工酶( g a i a s ei 、g a i a s ei i 、 g a i a s e1 i 和g a i a s ei v ) 。研究结果表明g a i a s ei 和g a i a s e1 1 对细 胞壁多糖具有较强的降解能力，与苹果细胞壁多糖的降解以及果实的软 化密切相关( 金昌海等，2 0 0 0 ) 。从鳄梨果实中分离得到3 种夕- 半乳糖 苷酶同工酶( a v - g a li ，a v - g a l i i ，a v - g a l i i i ) ，研究认为a v - g a l i 在鳄梨果实软化中起重要作用( a k i r a ，e ta l ，2 0 0 1 ) 。 随着分子生物学研究的发展，目前已分别从番茄( c a r e y ，e t a l ，1 9 9 5 ) 、 苹果( r o s s ，e t a l ，1 9 9 4 ) 、猕猴桃( 陈昆松等，2 0 0 0 ) 、日本梨( a k i r a ， e ta l ，2 0 0 1 ) 、鳄梨( a k i r a ，e fa l ，2 0 0 1 ) 等植物果实组织中克隆到了卢一半 乳糖苷酶基因，为揭示鼻半乳糖苷酶在果实软化中的作用提供了可能， 有助于进一步探讨p 半乳糖苷酶对果实尤其是多年生果树果实成熟衰 老的调控作用。 2 本研究目的与意义 果实软化是果实成熟时相伴的重要现象，它直接影响果实的品质和 商品价值，也是果实采收和贮藏过程中品质评估的重要指标。引起果实 软化的原因除了果胶多糖降解外还存在其他的因素。最近有关果实软化 机理的研究焦点逐渐转向了与细胞壁非果胶成分降解相关的一些糖苷 摄建农林大学硕士论文 前音 酶和半纤维素等非果胶多糖。基因工程技术的发展，特别是控制果实成 熟软化的多个基因分离克隆研究，为研究果实成熟衰老机理提供新的途 径。 本研究以台湾甜桃( p r u n u sp e r s i c a ( l ) b a t s c h ) 、美国黑李 ( 尸m n u $ s a l i c i n al i n d l ) 、龙眼梅( p r h 1 sm u m es i e b e tz u c c ) 、油术奈 ( e r n ss a l i c i n al i n d l v a t c o r d a t aj y z h a n ge ta 1 ) 和漳红番木瓜( c a r i c a p a p a y al ) 的果实( 或叶片) 为材料，在优化了其基因组d n a 和总r n a 提取方法的基础上，进行相应的1 3 半乳糖苷酶的克隆研究，力图为进一 步研究1 3 半乳糖苷酶在果实成熟软化过程中的作用机理提供证据和奠 定基础。 3 研究的技术路线 叶片果肉 基因 厂- 回收、连接、转化、测序 j r 序列分析 9 提 录 mii转i_1 计气j f 一 揩上 r阢 第一章试验材料与方法 l 试验材料 1 1 植物材料 供试材料台湾删 ( p r u n u sp e r s i c a ( l ) b a t s c h ) 、美国黑李卿n 5 s a l i c i n al i n d l ) 、龙眼梅( p r u n u sm u n es i e b e tz u c c ) 、油捺( e r u n u ss a l i c i n a l i n d l v a l c o r d a t aj y z h a n ge ta 1 ) 的嫩叶和果实，采自福建农林大学试验 场：试验所用的漳红番木瓜( c a r i c ap a p a y al ) 嫩叶和果实采自福建 漳州市农科所；嫩叶洗净晾干后，去除叶脉，称取1 0 9 ，装到干净的5 m l 离心管中，取同一株树上的果实，经洗涤、去皮、去核后，将果肉切成 小块，称取2 o g 装到5 m l 离心管中；这些样品用液氮速冻，置于一7 0 c 冰 箱保存备用。 1 2 菌株、载体 大肠杆菌( e s c h e r i c h i a 矗) d h 5 a 菌株由北京大学蛋白质工程及基 因工程国家重点实验室林忠平教授提供；p g e m - te a s y - v e c t o r 购于 p r o m e g a 公司。 1 3 常用试剂 n a c l 、n a o h 、n a a c 、t r i s 、p v p p 、c t a b 、e d t a - n a 2 2 h 2 0 、s d s 、 l i c i 、c a c l z 、i p t g 、x g a l 、a m p 、t r y p t o n e 、y e a s te x t r a c t 、e b 、琼脂 糖、琼脂粉等为进口分析纯，购于华美生物技术有限公司；h c i 、去离 子甲酰胺、d e p c 、b - 巯基乙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、冰 乙酸等为国产分析纯试剂，购于上海生工生物工程技术服务有限公司。 1 4 常用缓冲液、溶液及培养基的配制 ( 1 ) d n a 提取缓冲液( 室温保存) 2 ( w l v ) c t a b o i mt r i s h c l ( p h 8 0 1 1 0 福建农林大学硕七论文 第一章试验材料与方法 2 0 m me d t a ( p h 8 0 、 1 4 mn a c l ( 2 ) c t a b n a c ! 溶液( 室温保存) 1 0 的c t a b o 7 m n a c i ( 3 ) t e 缓冲液( p h 8 0 ) 1 0m m t r i s h c i ( p h 8 o 、 1m m e d t a o h 8 o ) ( 4 ) 2 5 ) ( t a e 电泳缓冲液储存液( 1 l ) 称取5 3 0 6 9e d t a n a 2 2 h 2 0 加入1 5gn a o h ，溶解后，用1 nn a o h 调至p h 8 0 ，再加入1 2 1 o g t r i s ，搅拌溶解，加入2 9 3 5 m l 冰乙酸，混匀， 加水定容至1 l ，用时稀释2 5 倍。 ( 5 ) 无r n a s ch 2 0 取d e p c 加入到水中，终浓度为o 1 ( v ) ，在磁力振荡器上搅 拌过夜，使d e p c 充分溶解到水中，高压灭菌后备用。 ( 6 ) r n a s e 溶液( 1 0 m g m 1 ) 将r n a s e 溶解于1 0m mt d s h c i ( p h 7 6 ) 、1 5m m n a c i 溶液，在沸 水中煮3 0 m i n 后，备用。 ( 7 ) a m p r 溶液 用无菌水溶解，配成1 0 0 m g m l 母液，分装到1 5 m l e p 管，用液氮 冻融法除菌，即放入液氮冻5 m i n ，迅速放入3 7 ( 2 解冻，重复3 次，放一2 0 冰箱备用。 ( 8 ) x - g a l ( 2 0 m g m 1 ) 溶液 称取1 0 0m gx g a l ( 5 溴4 氯- 3 - 吲哚- 1 3 一d - 半乳糖苷) ，加入1 0m l 二甲基甲酰胺溶解，分装到1 5 m l e p 管中，液氮冻融法除菌，用锡箔包 装遮光，放2 0 c 冰箱保存备用。 ( 9 ) i p t g ( 2 0 0 m g m 1 ) 溶液 福建农林大学硕士论文 第一章试验材料与方法 称取2 0 9i p t g ( 异丙基硫代- b d 半乳糖苷) ，加入1 0 m ld d h 2 0 溶 解，分装到1 5 m l e p 管中，液氮冻融法除菌，放一2 0 c 冰箱保存备用。 ( 1 0 ) 细菌培养基 l b 液体培养基( 1 l ) t r y p t o n1 0 o g ，y e a s te x t r a c t5 0 9 ，n a c i1 0 0 9 加水定容至1 l ，高压 灭菌后，备用。 l b 固体培养基 在l b 液体培养基中加入1 5 琼脂粉，高压灭菌后，备用。 含a m p 的l b 培养基 将高压灭菌后的l b 培养基，冷却至4 0 5 0 ，在无菌条件下，按1 0 0 m l 加入1 0 0 u l a m p ( 1 0 0 m g m 1 ) ，混匀，放4 c 备用。 1 5 试剂盒 t f i z o l 购于l i f et e c h n o l o g i e s 公司；c d n a 的合成试剂盒( f e r m e n t a s 公司) ；1 0xr e a c t i o nb u f f e r ，2 5m mm g c l 2 ，1 0m md n t pm i x ( f e r m e n t a s 公司) ；t a qd n ap o l y m e r i c ( 北京天为时代科技有限公司) ：d n a 快 速纯化回收试剂盒( 北京博大泰克p c r 片段胶回收试剂盒) ；t 4d n a 连 接试剂盒( p m m e g ad n a 片段连接试剂和盒) ；d n am a r k e r d l 2 0 0 0 ( t a k a r a 宝生物工程( 大连) 有限公司) 。 1 6 引物 委托上海博亚生物技术有限公司合成。 2 试验方法 2 1 砌临酶活性的灭除 用于r n a 提取的研钵、药匙、镊子、试剂瓶、3 m n a a c 和h 5 2 ) 、 1 0 m u c l 、d d h 2 0 等用具和试剂用o 1 d e p c 处理过夜，无r n a 酶的 专用枪头、p c r 管、1 5 m l 离心管( 购于华美生物工程有限公司) 经 福建农林大学硕士论文 第一章试验材料与方法 1 1 m p a ( 1 2 1 ) 高压灭菌3 0 m i n ，备用或在6 0 烘干备用。 2 2 基因组d n a 的提取方法：( 改良c r a b 法) ( 1 ) 取叶片1 o g ，液氮研磨，加1 0 ( w w ) 的p v p p ，将材料粉末 移入装有1 0 m l 提取缓冲液离心管中，加入2 ( v v ) 的b 巯基乙醇， 摇匀，放入6 5 恒温水浴锅，3 0m i n ，每1 0r a i n 轻摇1 次，冷却至室温，加入 等体积的氯仿，轻摇，室温，1 0 0 0 0 r , 1 5 m i n 。 ( 2 ) 取上相，加入1 1 0 倍体积c t a b m a c l ( 6 5 0 ) ，颠倒混匀，加入等体 积的氯仿，室温，1 0 0 0 0 r , 1 5m i n 。 ( 3 ) 取上相，加入等体积的异丙醇，- 2 0 c ，1 5 r a i n 将沉淀物转入1 5 m l 离心管种，加入l m l7 0 z 醇，4 0 ，5 0 0 0 r , 5 m i n ，去上清重复一次。 ( 4 ) 加入3 0 0 z lt e ( p h 8 o ) ，6 5 c 水浴锅溶解沉淀后，加入2 0 0 a5 m n a c i ，混匀，加入2 倍体积的无水乙醇，- 2 0 c ，3 0 m i n ，4 c ， 5 0 0 0 r , 1 0 m i n 。 ( 5 ) 去上清，加入3 6 0 p lt e ，6 5 ( 2 水浴锅溶解沉淀后，加入靴lr n a s e 混 匀，3 7 0 ，1 5r a i n 再加入等体积氯仿，4 c ，1 0 0 0 0 r , 1 5 m i n 。 ( 6 ) 取上相，加入1 陀倍体积5 mn a a ，混匀，再加入2 倍体积的无水乙 醇，混匀，4 1 2 ，8 0 0 0 r , 5 m i n 。 ( 7 ) 去上清，力口入l m l7 0 乙醇，4 c ，8 0 0 0 r , 5 m i n 。 ( 8 ) 去上清，晾干，加入l o o p lt e - 2 0 c 保存，备用。 ( 9 ) 取5p l 样品加入2 al o a d i n gb u f f e r 上样，1 琼脂糖凝胶， 5 8 v c m 电泳2 0 r a i n , 紫外检测d n a 的完整性。取2 且l 样品稀释5 0 0 倍 检测样品d n a 含量( 分光光度计法) 。 2 3 总r n a 提取方法( t r i z o l 法) ( 1 ) 1 0g 番木瓜叶片( 或果实) ，加1 0 ( w w ) 的p v p p , 液氮研磨至 粉状。取少许果粉装入加有1 0m lt r h o l 试剂1 5m l 离心管中，震荡 福建农林大学硕士论文 第一章试验材料与方法 至混匀，静置5 m i n 4 ，1 2 ，0 0 0 x g ，1 0 r a i n 。 ( 2 ) 取上清，加0 2 m l 氯仿，震荡至混匀，静置3 m i n ，4 ，1 2 ，0 0 0 x g ， 1 5 r a i n 。 ( 3 ) 取上清，加0 5 m l 异丙醇，静置1 0 m i n ，4 ，1 2 ，0 0 0 x g ，1 0 m i n 。 ( 4 ) 去上清，加1 0m l7 5 酒精，4 ，7 5 0 0 x g ，5m i n 。 ( 5 ) 加入3 0 p l 无r n a a s eh 2 0 。- 7 0 保存，备用。 ( 6 ) 取3 肛i 样品加入1 p l l o a d i n g b u f f 样，l 琼脂糖凝胶5 - 8 v c m 电泳1 5m i n ，紫外检测r n a 的完整性。取2 z l 样品稀释5 0 0 倍检测样品 r n a 含量( 分光光度计法) 。 2 4c d n a 的合成 取1 0 z g 模板总r n a ，加1 m lo l i g o ( d t ) 1 8 引物，加d e i o n i z e dw a t e r 至1 2 蛳l ，7 0 变性5 r a i n ，冰浴1m i n ；依次加入5 x r e a c t i o nb u f f e r4 毗l ， r n a s e i n h i b i t o r1 蛳l ，1 0m md n t p2 0 朋，3 7 ，5 m i n ，冰浴1r a i n ：再加 入m m l v r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e1 0 y 1 ，4 2 ( 2 ，l h ；7 0 ，1 0 m i n 。一2 0 c 保存 备用。 2 5p c r 产物片段的回收 d n a 片段回收采用北京博大泰克p c r 片段胶回收试剂盒，其步骤如 下： ( 1 ) 取i 0 叫lp c r 产物上样电泳，切下目的条带，胶块尽量小； ( 2 ) 按1 0 0 叩l 胶块加7 0 0 z 1 溶胶液的比例，室温溶胶，其问偶尔摇动； 装柱，1 2 ，0 0 0r ，离心3 0s ；去掉废液； ( 3 ) 5 0 0 1 漂洗液漂洗( 漂洗液原液：无水乙醇= 1 ：3 ) ，1 2 ，0 0 0 f 离心3 0 s ；重复漂洗一次倒掉废液后，1 2 ，0 0 0r ，离心2m i n ； ( 4 ) 在柱子中加入3 q “1 的沈脱缓冲液，静置2m i n ，1 2 ，0 0 0r ，离心1m i n ， 收集洗脱液。2 0 c 保存备用。 1 4 福建农林大学硕士论文 第一章试验材料与方法 2 6 回收片段的连接 回收片段的连接采用p r o m e g a 公司t 4d n a 片段连接试剂盒：p c r 片段回收产物7 o “l ，p g e m - te a s y v e c t o r 1 0 d ，2 b u f f e r 5 叱l ，t 4 d n a 连接酶1 叫l ，1 6 0 ，过夜。 2 7 连接产物的转化 2 7 1e c o l i 感受态细胞的制各 ( 1 ) 从超低温冰箱中取出d h 5 a ，划l b o 平板，3 7 ，1 2 h ； ( 2 ) 挑取单菌落于5 m l l b 培养基中，3 7 0 ，1 9 0 f ，1 2 h ； ( 3 ) 取菌液5 0 0 # 1 接种于2 5 m l l b 培养基中，3 7 c ，1 9 0r ，2 - 3 h ； ( 4 ) 将菌液冰浴1 0m i n ，将菌液转入1 5m l 离心管中，