（微生物学专业论文）乳酸链球菌素产生菌的筛选及培养条件研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工 乍及取褥的研究成果。 尽我所知，除了文中特嬲加以标注和致谢的地方赡，论文中不包含其能人已；经发表或撰 写过的磺究成果，也不包含为获褥沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书面使嗣过 的稚料。与我一同工作的阗恋对本研究所傲的任何贡献均已在论文中作了碉确的说b 胃并 表示了谢意。 研究生篾名：夺红 时润：鼬e 年g 月r 乞嚣 关于论文使用授权的说明 本人宪全了解沈阳农鼗大学剪关傈毅、使用学簸论文的规定，朝：学校有权保留送 交论文豹复印件秘磁盘，允许论文被查阅和整阕，可以采用影印、缩印或扫攒等复翻手 段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以阐不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的内容。 ( 傺密的学位论文在解密瓣鹰遵守此协议) 研究生签名：套垃 时阕： 2 ”口彳年占月，己目 露溺：o 秒矿年胃舢 沈搬农! u ! 久学倾i + 学位论文 摘要 随麓人们生活水平的握；嚣，对食；骗的要求盘越来越赢，要求食，钪r p 使用天然、安全 的防鹰荆以墩代大量的化学防瘸棚，这火人健进了细菌索的研究和墩删。在微生物抗 菌物矮中，乳酸链球麓素( n 谶n ) 楚涎界上公认安全豹防腐触。乳酸链球菌素的委要 实用徐傻和理论价僖得羁了器潮辩磷概丰句的重视，其篱求潼不鞭增大，我图对该产品 的推广应藤尚处于起步阶段，其技术水黟t j 发达嘲家栩比还有一定的差距，尤其在王 她化生产方面的研究有待进步深入。现应摸索g 卜“套简单、赢效的分离巍酸链球菌 素产生菌和掇纯、签定发酵产物以及列圭舟养条馋优化的方法，为爆模工_ e 化生产打下 基础。 本论文以新鲜牛奶为服糕，采翔一种简单、随效的定向分离乳酸链球菌素产生菌 的方法，分离到了2 5 株乳酸乳球菌( 口c 幻c c 螂 钾凰) ，对其中l o 株使培养基变黄 范围较大的藏株进行麴菠实验，发现3 株菌的硝麓效聚较好，对揶菌效果最好的m 9 蘸株遴行了纫步鉴定，确定m 9 菌株为乳球菠瘸( 三删o c 。淞) 中的乳骏驻球菌乳酸 ! q i 焉每( 己1 程c | 妊s h b s p 己a c t 弧) 。 对m 9 菌株的发酵产物通过赫析、透板、凝胶层析、电泳等一系列，圭化实验进行 初步鉴定，确定发酵液中的抑菌物质与标准品楚胡同的，浼明m 9 蔼株就是巍酸链球 菌素产生菌。 剥翔诋交实验对m 9 麓拣的壤养条 孛和发黪祭 孛进行优化，确定它的最经培养条 件为：篱萄糖2 o ，蛋白繇4 ，酵母粉3 ，牛肉膏1 ，硫酸镁0 0 1 ，维璺三素ee 5 9 ； 最佳发酵条件为：装液爨2 5 0 ml 接种量3 ，p h 僮6 5 。 关键词：襞簸链球菌素；意囱分离；发薅产物； 踅忧 摘螺 a b s t r a c t p e o p l ea 蠢h i 砖e ra n dh i 曲e rf o rf o o dw t h 谯ei m p r o v e m e n t 西l i f el e v e i s ，谦er e q u e s t o fr e p l a g e m e l l to fn a t u 豫la n t i s e p t i cw i l hc h e m i s t r ya n t i s c p t i cg r e a t l yp r o m o t e st h er e s e a r c h a n da p p l i c a t i o no fb a c t e r i ap r o d u e t 。l i sa c k n o w l e d g e dt h a t n i s i l li sas a f e t ya n t i s e p t i ci n t h e s eb a c t e r i ap r o d u c t si nt h ew o r l d _ n i s i ng e t st h er e g n i t i o no fm 硒ys c i e n t i f i cr e s e a r c h o 蟮a n i z a t i o n s a l lo v e rt h ew o r l d 岛fb o t ho f t sp r a c t i e a l 黼dt h e o 瓣t i cv a l u e s 。t h e d e m a n d i n gq u a n t i t yo fn i s i ni sb o o m i n g i t sp r i m a r ys t a t et op o p u l a r i z ct h ea p p l i c a t i o no f n i s i na sa n t i s e p t i ci nc 重l i n a ，t h e r ei sac e r t a i nd i s t a n c ef i o ro u rt e o 氏n o l o g yl e v e lc o h l p a r e 硅 w i t hd e v e l o p e dc o u n t r i e s 嚣s p e c i a l i yt 1 1 er e s e a r c ho fi n d u s t r i a l i z a t i o nn e e d e df u r t h e ra n d 氆o r o u g hs t 酾i e s n o w a 出l y s ，as i m p l ea n 畦噎i 痨e 壤c i e n tm e t h o ( 1o fs e r e e n i n g 谯en i s 穗 p r o d u c i n gb a c t e “t l m ，p u r i 贰c a t i o n a n di d e n t 讯c a t i o no ft h ef b f i n e n tp r o d u c t 矗n d 吐l e o 西m i z i n g o fc u 搬a l c o n d i t i o n s ， w h i c hp r o v i d ec e i nb a s i sf o ri n d u s t r i 啦i z e d m a n u f h c n l r e 。 i n 娃l i sp a p e r ，2 5 三8 e 纫e o c c 塔茸c j ss t i 甚i n sa r ei s o l a 把df 确l nf r e s hm i l kb yas h n p l e a n de m c i e n tm e t h o dt h a td i r e c t i o n a ii s o l a t en i s i np r o d u c i n gs 仃a i n s ，a n da m o n gw h i c h ，l o s t r a i n st b a tc u l t u f em e d i u mt u m弦 l o wb o u n di sb 谵g e ra r ce x p e r i m e n t e da b o u t d e t e 傩i n a t i o nm i c r o b e t h er e s u l ti sd e t e n n 主n a t i o nm i c r o b ee f 绝c to f3s t r a i n si st h eb e s t b y p 穗嫩r y 堪e n t i 瓢t 量l em 9 s t r a i ni s 三融d 缸s 掰6 够三洲趣 b yp r i m a r yi d e n t i f i c a t i o no fs a l to u t ，d i a l y s i s ，g e lc h m m a t o g r a p h y ，e i e c t r o p 孙r e s i se t c ， 谦em 9s t 猿i n sf e 勰e n tp m 蘸u c ti ss 撇ea sn i s i n 1 tp v e s 国融墩em 9s 童r a i ni s ：n i s i n p r o d u c i n gs n 试n s t e 啦。f o 蛐o g o n a le x p e r 至m e n to f c u l 融蝣c o n 熊i o n s 鞠df e r r n e n t e dc o n d 诋o n s 曲t a m t h a tt h eo p m u mc u l t u r a lc o n d i t i o n sa n df e m l e n t e dc o n d i t i o n s 丁h eo p t i m u mm e d i u ma s 如l l o w s ：g l l l c o s e 2 e ，p e p t o n e 4 ，y 毫a s t3 ，b e o f o i n t m e n t l ，b i 髓e rs a l to 0 1 ，v i t a m i n co 5 9 强eo p t i m 嘲f e 糯e n t e dc o n d i t i o n sa s f o l l o w s ：p o u r e ds o l u t i o nv o l m e2 5 0 m l ， 主n o c u l 雒e d 搬吼b e r 3 ，p v a l u e6 s k e yw o r d s ：n i s 滚，d i 糟c t i o n a ii s o l a t e ，f e r m e n l e dp r o d h c 量，o p 确融i z a 戗o n 2 沈阳农业人学硕十学忙论文 月l j吾 在食品工业中，各类食品的防腐保鲜始终是一个重要问题。挤估计，全球每年约有 l o 一2 0 的食物损失于各种腐败。延长食品的保藏期限的主要方法就是添加防腐剂。目 前常用的防腐剂还是以有机和无机化学防腐荆为主，前者包括苯甲酸、山梨酸及其盐类、 对羟基甲酸酯类、丙酸盐类等；后者包括_ 氧化硫、亚硫酸及其盐娄、硝酸盐及亚硝酸 赫类等，但这些化学防腐荆对人体都或多或少的存在毒害作用，对自然界的# 态环境也 会产生不利影响。随着科技的进步和检测分析手段的完善，过去认为安全的一些合成防 腐荆也存在诱癌性、致畸型和易引起食物中毒等问题。因此，对高效、无毒的天然防腐 剂的研究和应用也越来越引起人们的重视。天然防腐剂具有抗菌性强，安全无毒，水浒 性好，热稳定性好，作用范剐广等化学及合成防稿剂不可比拟的优点，经过多年的研究， 现己开发出乳酸链球菌素、溶菌酶、抗菌肽、鱼精蛋白和鸡卵黄免疫球蛋白等天然防腐 剂。 乳酸链球菌素( n i s i n ) 是世界上公认安全的防腐剂，是一种由微生物代_ 【乌j 所产生的 具有很强杀菌作用的天然代谢产物。乳酸链球菌素本身具有许多优良性质。首先，容易 被人体消化道中的一些蛋白酶和胰蛋白酶所降解不会在体内蓄积而引起不良反应，并 且对食品的色、香、味等无不良影响( l i n d aj ，1 9 9 7 ) 。它的使川还可以降低杀菌温度， 减少热处理时间，因此能改进食品的营养价值、风味、结构、颜色等性状，同时还可节 省能耗，增加有效工作时间，从而可增加产量。其次，n i s i n 本身具有热稳定性，并耐 酸、耐低温贮藏。n i s i n 作为一种理想的天然防腐荆必将获得越来越广泛的应用。 11 乳酸链球菌素的发现简史和国际标准 1l1 发现简史 1 9 2 8 年，l a r d g e r s 等蕹国研究人员发现乳酸链球菌( 研，印加c d m 如c 嘶) 代谢物 能抑制乳酸菌生长。1 9 3 3 年w i c e h e a d 提 n 这种抑制物的本质是一种多肽。1 9 4 7 年m a t 【i c k at r 等人从乳酸链球菌发酵液中制各出了这种多肽物质，并指出它们是由血清学n 群 中的一些乳酸菌所产生的抑菌物质，他命名其为n i s i l l ( 取自n i n h i b i t o r ys u b s t a n c e ) 。1 9 4 8 年m h o v i e 估计牛奶中分离到的乳酸链球菌中，大约有兰分之一产生乳酸链球菌素( 以 后的研究证实了该推测) 。1 9 5 1 年，h i r s h 等人首先将n i s i n 用于食品防腐，成功地控制 了肉毒梭菌引起的埃氏奶酪的膨胀腐败。从此引起了世人对n i s i n 作为食品防储剂的重 了肉毒梭菌引起的埃氏奶酪的膨胀腐败。从此引起了世人对n i s i n 作为食品防腐剂的重 n q 蠢 视，有关研究也广泛开聪怒来。1 9 5 2 年g o w a n sj 。l 指出，园子乳酸链球菌索在盥液p 俊下的难溶解性和胰凝乳鬣臼酶对其活性的破坏，乳酸链球萄素不能象抗生索一样用于 人类或者动物的药用治疗铡。1 9 5 3 年，n i s i n 的第一秘商业化产品n l s a p 烈在英鞫霭世。 1 9 6 9 年，英国食品防腐裁委员会( f a o ) 和世界卫生组织联合会食品添加裁专家委员会 ( w h o ) 确认n i s i l l 为食赫防腐剂，这也是第个被批准用于食品中的纲菌素。到1 9 9 0 年为止，已有瓴括中圜、美国、英豳麓在内静5 0 多个国家釉地区批准n i s 证作为一零中天 然食晶防腐荆使用。 1 ，1 。2 嚣黼拣灌 1 9 6 4 年t a 糯e rj 建议馒用l r u ( r e 越i n gu n i t ) 表示每微克纯乳酸链球菌素制备物中 存在淆性的量。1 9 7 0 年 娆器卫生缎织微生物标准委员会制订乳酸链球落索的国舔标准计 爨单位为i u ，并规定l r u o 挪。在研究中，还霄一些单位也黼对使糟，麴a u 等，其 中l i u l o o a u 。 1 2 乳酸链球菌素的礤究现状 1 2 。1 乳酸链球蘸素的分子结构 巍酸链球蘧素( n i s i n ) 的分子式为c l 躬h 2 2 d 电2 0 3 7 s 7 ，成熟分子含有3 4 令氨基黢残基， 分子鬟为3 5 1 0 d a ，n i s i n 的荦体含有5 种稀有氨基酸，分别是a b a ( 氮基丁酸) 、d h a ( 脱氢丙氨敬) 、d 王b ( 一甲纂貌氢雨氨酸) 、a l 舡s _ - a l a ( 羊系硫氨酸) 、a l 舡孓a b a ( 一甲基羊毛硫氨酸) ，逶过硫醚键形成s 令环( 图1 ) 。英二聚摔酾霸聚体分予也有 报道，分子燮分别为7 0 和1 4 0 0 0 。 4 甜 - s 啦氲h 难耻a 囊l 翡羊毛巯疑璇 越聃a 嚣氮b 啪觎刚妇n 蜘耐醒葬- 串蒺摹毫藏氟氇 冀幅雕符号为氨藩黢睛写狩 图 n i s 讯的分子结构嚣 f g 1s t n l c t u r c o f n i 甜nm o l u i 甜 沈阳农业大学疆七学位论文 n i s i n 在天然状态下主癸蠢两种形式，分别为n i s i n a 和n i s i n z ( g 沁e s h t re ta l ，1 9 9 8 ) ， 它们之间的差别在于氨熬酸顺序中第2 7 位氨基酸不嗣，在n i s i n a 中是组氨酸，在n i s i n z 中跫天冬氨酸，在其基因结构上的第1 4 8 位脱氧核萤酸不嗣怒造成差别豹根本原因。一 般两言，在惩样浓度下，n i s i 芏l z 的溶女$ 痰和抑菌能力比n i s i n a 要强。 1 2 2 乳酸链球菌素的性艨 1 2 2 1 物理和化学性质 对n i s i n 氨纂酸序列研究清楚蜃，人们发现n i s i n 具有亲求和疏水两蘸性，鄹在n 一 末漆存在大璧的蔬水残麓，在c 末端存在豢亲水基酗。n i s i n 具有3 令阳离子( n i 妇垃 有2 个) ，表现为阳离子多肽的特性，其等电点在碱性范围。n i s i n 的溶解骸、稳定性帮 生物学特性都与溶液的p h 值密切栩关。n i s i n 的溶解度随p 王傻的下降丽掇赫，p h 值 2 5 时溶孵度为1 2 ，p h 值为5 。o 时下降到4 ，在中性及碱性条 牛下凡乎不溶解( 江芸 等，2 1 ) 。 n i s i n 稳定性与其猩不圈p 值下的溶解度有关。n i s i n 溶液在p h 2 5 或更低p h 驰 稀盐酸溶液中煮沸，其活性不发生变化，即使在p h 2 o 、1 1 5 6 加热一定时间，n i s i n 还强稳定；1 2 1 时，加热3 0 删n 还未失去活性。当p 傻超l 童4 时，特别跫在加热条件 下，它在承溶液中迅速失去活性。 滠度也影响n i s i n 昀搠菌作用，在一定的温度范围内，涎滠度豹井高活性有所降低。 在原料干酪( p h 5 6 6 o ，食水5 4 5 8 ) 中添加n i s i n ( 2 5 l o 滚u 撤g ) ，经巴氏灭 菌后将其贮藏在不同的温度下，3 0 天螽测箕活性，发现n i s i n 残鹭量分别为：2 0 为9 0 ； 2 5 为5 5 筠；3 0 为4 溅。癸终，n i s 搬的稳定槛还与其稳戳索鲡溶液的 幺学组成、蛋岛 质的保护作用等有关。 】。2 2 2 生物学特性 当n 一簇避鑫酶、胰黪糕弃秘梧萆稃赣漱终璃n i s i n 磊，会使葵失去活经，但羧妖酶 a 、羧脓酶e 、肠肽酶、霭蛋囱酶和胰虽囱酪对n i s i n 无作用。h 掰s t 报道，n i s i n 对g 一 凝乳蛋白酶、胰酶、消化酶、唾液酶等缀敏感，但对粗制凝乳酶、脂酶、淀粉酶不敏感， 在酸性条件下，l o o ，l o m 迅对链酶蛋囱酶不敏感。 2 。3 戮酸捷球菌素的弼蓠谱 n i s i n 能撺制大部分革兰氏阳性蔼及其芽孢的生长释繁疆，如葡萄球菌属、链球菌 瘸、乳酸抒球菌属以及梭状势孢枵菌属和芽獭杆菌属的细蔺，特别是对金黄色葡萄球菌、 溶血链球菌、岗毒杆菌作用明显。 在一定条件下，如冷冻、耱热、降低p h 德、e d t a 处理等，乳酸链球菌素亦可抑 制些革兰氏瓣往蘩的生长，如沙门氏落、大肠抒蘩、暇单胞蘸等。 1 。2 4 乳酸链球菌素的抑蘸机理 n i s i n 孝电蘸作用的分予基础是返年来的研究热点之一，并不断取褥突破，缀长一段 时闻以来，人们便注意到，n i s i n 被微生物吸附是杀薅作用掰必须豹。如果在体系中加 入炭等吸附剂，可以使杀蔚时间显蓿增长。r 蝴s e i e r 报道n i s i n 对敏感菌确强烈嗷附作 梢，并受p 至 匏影晌很大，在p 主6 。5 辩吸辫搴达l o o ，在p 差4 。5 对仅为4 3 。研究表明， n i s i n 可以引超敏感蓊细胞质的释放，从藤造成细胞裂解。由予n i s n 带有正电葡，经它 处理后的细菌细胞紫外吸收物质鸯泄嚣现象。因此有人掇出n i s i n 对于敏感菌细胞膜的 作用类似予阳离子表面活性裁。又嚣为n i s i n 中的d h a 稻d 壬b 可以与敏感蕴纲腿膜中 篥艟酶的巯蒸发生作用，因此也青人认为n i s i n 的作翻机制与这龋个脱水氨基酸有关。 另外，还有人提趱n i s 遮翳作蠲机制主要是消耗敏感细臆的质子驱动力( p m f ，p r o t o n ， m o t i v ef o r c e ) ， i s i n 对营养细脆的作用主要楚在细胞膜上，它可以抑制细菌细胞壁中肽 聚耱等的生物合成，使细胞膜和磷脂化合物的合成受阻，导致细魏内物质外泄，引起细 胞裂解( 豫秀珠等，1 9 9 5 ) 。 近年来，一些研究人员提出了一种“孑l 道形成( p o f ef o 搬n a t i o n ) ”理论，指出：出 予n i s i n 是一个琉水的带歪电蕊的小默，在一定的膜电位存在下，吸附予敏感麓的纲臁 膜上，并可通过其c 末端的傣用侵入膜肉砥形成遥透孔遂( 因j 封：有入认为n i s i n 搬属于 孔道形成蛋白) ，由于其分子的特殊豹三级结构( p r o t e i nb a l l k ) ，可允许分子量小于 o + 5 k d a 黔亲水分予通避，弱导致k 十从照震中流出，缀臆膜去极诧及勰p 的泄露，细胞 外水分子流入，造成细胞膜内外能麓消失，缁胞睡溶丽死亡。 为进一步研究n i s i n 籀菠讥理，囊入翻用了滕攀分子瑟体系磷究发现n i s i n z 懿n 末 端迸入到脂栩中，丽c 末端或许与n i n 的单体或寡聚体与溺离子g 旨类的离子棚互作用 有关。 通过对n i s 证搠菌港的研究，发现n i s i n 主要杀灭或季审稍g + 藏及其芽稳，耨对g 一 菌繁本无影响。对比d 陵和g 一菌豹细胞壤，霹以发现d 蘸的肽聚糖屡明屡比g 蘸厚得 多，丽g 的缫腿壁缀成魄较复杂。主要包括磷滕，蛋垂秘媵多猿( l p s ) 等，十分致密， 仅熊允许分子量在6 0 0 d a 以下的分子逶过，丽n i s i n 分予整约为3 5 l o d a ，所以根本无法 6 沈翔农监大学硕士学位论文 通过，因此，n i s i n 就无法到达细魏膜毹发挥作用。闽时，有报道说经过处理而改交g 一 菌的外壁的透过性质之后，g 一也对n i s i n 敏感，丽群可以被抑制或杀瑟。这也证明了 g 一萤对n i s i n 不敏感怒潮予细胞壁的俸愆。 在n i s i n 杀菌过程中，其分子中所禽的稀有氨基酸对n i s m 作溺方式影响很大，对 这一翊题的研究，主要怒通过蛋诌族工程的手段，定向改变n i s i n 分子中的一个或一段 氨鏊羧的缀成，对其功能进行磺究。 n i s 蚀对微生物豹作髑首先是n i s i n 对细臆膜的吸附，在此过程中，n i s 谗能否通过 细菌细胞壁是一个关键阑索。同时，葜能因素如：p h 值、m 矿+ 浓度、黥酸浓度、氮源 萋中类等均可影响n i s i n 对予细胞的吸骓作用。 另外，n i s i n 对予瓤子盼 乍溺是杀死穗子，蕊不是停止毯子活性。它在孢予澎胀前就 抑制了发芽过程。实验证明，经加热杀伤的孢予对n i s 沁更敏感。 n i s i n 对营养细胞的 乍溺点是细胞瑷膜。它能抑制缎胞壁中肽聚糖的生物合成，使纲 藏壁质貘和磷鼷化合物台成受阻，g l 超纲腿内含物霸a 下p 外泻，使缨熬袋勰。r a l p h w j 筹入认为n i s i n 具有潜在的跨膜净列及离的璃极矩能傻膜产生强道，阐辩使貘内外电位 差和梯度丧失，破坏细胞通过电子传递链产生能量的能力。 1 。2 ，5 飘酸链球菌素台成的遗传学研究 编码n i s i n 豹遗传密码韵确切位鬟有两秘理论，一秭认为它与质敉连镶，另一种粼 认为是在染色体上。 支持前一种蕊点豹主要证据有：1 9 4 7 年，k o z a k 磷究产n i s i n 菌株酶突变现象时发 现，若先以原黄素或滚乙锭诱交：挣进行舞溢处理，蒜以n 聪邃行诱变，未检测翔网复 突变株。弗据此推溯n i s i n 基嚣可髓使予质粒上。遴一步研究发瑷，k i s i n 的产生与一个 1 7 5 m d a 的质糠有关。1 9 9 1 年，k a l e t t a 和e 瓶a n 从乳酸链球藜素6 f 3 的质粒中成功克 隆到了编码n i s i n 的结构蒸园。 透十几年来，逶i 窭对质粒消除和接合转移实骏豹研究也证实n i s 濑蘩瓣位子质粒上， 并认为n i s i n 产生基因( n i p + ，n s i n p r o d u c i n ga b i l i t y ) 、蔗糖发薅基飘 ( s u o + ，s u c r o s e f e 撇e n t i n ga b i l 匆) 、和n i s i n 抗性基因( n i r ，n i s i nr e s i s t a n c e ) 是紧密连锁的 ( 还涟椽等，1 9 9 5 ) 。 但是，勇一黧研究者认为n i s i n 基戮霞于染色体上，并有一些突验诞据证明一臻产 n i s i n 的菌株并不存在质粒。在接合转移实验中，虽然供体菌的n i p + 、n i s f 、s u c + 的性状 7 瓣畜 可以向受体藏转移，但在接合子中并未分离到质粒，分离供体蔼、受体藩和转移接合子 染色体d n a 移质粒d n a ，分剐与和n i s i n 基因甄 麓i 4 寡核瞢酸探针蘩交，结鬃爱示 该探针与供体蘸和转移接合予染色体d n a 片段有杂交带，糯与质粒d n a 没有杂交带， 从以上实验可以看出n i s i n 的产生与菌株是否带有质粒无必然联系。 对n i s i n 基因定位的研究最近数得了一黩突破性避展，些研究者缀撂对染色钵的 缺失与杂交实验提出n i s i n 结构基露与染色体上戆一个可按合转移约转鏖予有关。 i 。m 等人则提出n i s i n 基因存在予一个7 0 k b 大小的转座予飘5 3 0 l 中，溺时另一燎研究者的 工作也证实了这个转座子的存在，且发现n i s 融基因座是不稳定的。这些发现可能提示 我们n i s i n 基嚣位于一个疆转痤予菝粒和染琶体土雏转窿予中，在不同的菌株中，n i s 泌 基因的位置不一定相同。这样，出于位于旗糖和染色体上的基因的表达效率豹纛羿，使 得菌种选肖王 乍照得十分蹩要。 1 9 8 8 年，n i s 诬基因酋次被克隆文采。不同于大部分瓣多肽类抗生紊，n i s i n | i l f 体蛋 白是由核耱体合成，经过脱水、琉环形成等系列复杂的翻译藤攘王遗稳，最终形成有 活性的成熟n i s i n 分子( 桂连样等，1 9 9 9 ) 。e n g e l k e 等则遴一步研究了有关翻译后修饰 j 西加工的基因，提出这些基因与n i s i n 结构蒸因是紧密连锁的。 对n i s 溉遗德学研究的深入，穆使我们有霹戆定向改变n i s 融瓣溶鳃度、稳定牲、 抑菌范围等，对于n i s i n 的应用前景肖着蕊大蔼深远豹意义。 1 2 6 孚l 酸链球蕴素的生产工艺 1 2 6 1n i s i n 产生菌拣的筛选 嚣前主要是剽蔼n i 或n 产生菰中n i p + n i s f s u c + 紧密连锁豹骧遵，在添嬲乳链菌膝、蔻 糖及溪甲酚紫的选择培养基上，从牛奶样品中定向筛选n i s i n 产生蔚( 彭沈军等，1 9 9 5 ) 。 也有通过检测在b c p c a c 0 3 培养基中溶钙潮大小而闻接选择n i s i n 生产菌方法的报道。 1 2 。6 2n i s i n 的发酵生产 在n i s i n 的生产中，主要是以乳链球菌帮乳酸乳球蕊作为生产菌，通过诱变方法获 褥高产菌株，并通过改变培养基配方以进步提高产爨。其中，对培养基配方的研究进 行的较为活跃。一方瑶，哥以扩大n i s i n 废羽，另一方蔼，对营养要求与产擞关系的研 究有驹子了鳃n i s 纽生物合成的途径帮调控方式( 吴竦等，2 0 ) 。 1 2 6 。3 发酵产物的后提取工艺 ( 1 ) 有机溶剂法：乳链菌肷被发现厝，科研工作者最初用骥常规的提敬礞自质的有 8 沈阳农业大学硕士学位论文 机溶荆对其分离提取。1 9 4 7 年m a n t i k 和h i f s c h 向含有n i s i n 的发酵液中加入一定量的 氯仿，充分搅拌萃取后静鬟，敬乳浊层，并向其中加入冷的乙醇，产生含有乳链菌默的 沉淀物，用o 0 5 m o l 尼 c 1 溶解沉淀，然后调节p 再溺冷乙醇沉淀，最后干燥沉淀， 测活力为2 0 1 0 6 l u 馆，纯度为5 。这种泅汝乳链菌肽的方法步骤繁琐，回收率低( 2 0 ) ， 丽且产物纯度也很低。 i 9 5 7 年c h e e s e m a n 和8 e r r i d g e 采用正丙醇萃取n i s i n 。他们先向酸化的发酵液中添 加正丙醇，然焉再用n l 将发酵液饱和，加入n a c l 的作用是降低n 诫n 及正丙醇在发 酵液中的溶解度。静置数分镑后取含大量n i s i n 的正丙醇层，可重复一次这一过程以增 加n i s i n 的圆 | 芟率，最终正页醇中含有8 5 l o o 的n i s i n 。将含有n i s i n 的正丙醇溶于 o 1 m o l 尼h c l ，同时加入n a c l 搅拌后静置，可出现体积相对小的液体层( 上层和中间 层) ，上层含有5 0 n i s i n ，圣清亮豹棕色；中阀层星灰色，含有另外5 0 的n i s i n 。苯取出 上层有枫桷，先用冷丙酮沉淀，取沉淀溶于o 。0 5 m o l l 壬 c l ，同时加入 湖2 p 0 4 赫析离 心取沉淀，再将沉淀溶于p h 3 5 的丁醇一水一乙酸这一系统。进行分相萃取主层富含n i s i n 的有枫媚，最后透过丙酮分级沉淀，黪测定沉淀物活性为2 8 1 0 7 i u 幢。对于中闯屡由 于其眈活较上层高，阂此直接加入k h 2 p 0 4 并透过丁醇一水一乙酸系统萃取及涎酮沉淀， 最后测得活憋为3 o 1 0 7 l u g ，最终总图收率5 0 6 0 。这种分榻萃取嚣链萤默的方法 其回收率、产物及院活均离于氯仿一乙醇提取法，该法的缺点是步骤繁琐，有枫溶剂消 耗量大及工作量大，俚回收刭的产品纯度较高，为进一步纯化奠定基础。 1 9 6 0 年 往w l e y 等用一秭更为简单的方法提取n i s i n 。该法是先向发酵液中加入 o 1 乱v c e n 8 0 ，然届从发酵液底部鼓气使产生大量的气泡，n i s i n 本身具有表丽活性剂的 性质，因丽伴随泡沫被鼓出，收集并破碎泡沫后，用丙酮沉淀，最展将沉淀干燥测活， 比活仅为l 。4 1 0 6 i u g ，与蘑鹾种方法楣比鼓气吹泡法较容易形成规模纯生产，操作德 单，试剂消耗量少，但产品纯度低，回收率也不理想。 ( 2 ) 吸附法：随着对乳链菌肽分子性质的研究，科研工作者发现产n i s i n 的乳酸菌对 n i s i 珏具有定的吸附作用( 歉d n gg n 锄g gc t 甜，1 9 9 9 ) 。分丰斥可能憝因为n i s i n 带正电 衙与细菌细脆壁的一些带负电荷鏊团结合。1 9 7 1 年b a i l e y 等利用n i s i n 与菌体吸附特性 先圈收菌体，然后再获取n i s i n 提取液，再将其经过柱屡析纯化n i s i n 。该法先在p 6 7 豹条件下收集菌体，然后蔼不同条 牛处理菌体比较回收率。结果表明，在中性条件下破 碎菠体，然后再月o 0 5 m o l l h c l 调低p h ，均存利于n i s i n 的飘收，这样的处理方法可 9 前言 能破坏了蔺体维胞的结构从而导致n i s i n 解吸附。i 9 9 2 年y a n g 等对菌体吸附法的吸附 及解吸隆祭馋 乍了送一步磅究( 汪家致等，2 0 ) ，发现如柴对吸附及麓吸附选择合适豹 p 王，无需破碎蘑体藏可大量提取回收n i s i n 。其结果是最佳设附p h 为6 5 ，两解吸附最 佳p h 为2 5 。在p h 6 5 时强体吸附大量n i s i n 后，将含蘸体的发酵液热处理( 7 0 水 浴2 5 分钟) ，此步目的是杀死细胞却钝化爱囱酶以防止n i s i n 被酶艇失活。然后离心收 集菌体，将菌体溶予p h 2 5n a c l 溶液中搅拌，最后离心除菌体，取上清透析愿测定 n i s i n 阐收率9 3 3 ，比活为4 9 1 0 8 a u g ，该法操作十分方便和简单，但具有缀大的 不稳定性，而且在1 9 9 6 年j a s o n 等研究发现，如果上述过程不经7 0 承浴处理，直接 离心，n i s i n 豹总强收率大大增加，这藏说明雠6 。5 时7 0 水浴可能使发黪泼中的n i s i 建 交瞧失活，j a s o n 通过对n i s i n 与菌体吸附的深入研究，大胆豹提出了一种设想，就是剥 用菌体对n i s i n 在高p h 吸辩、低p 壬解吸附的特性，构建一； 申固定化细胞桂，将含n i s i n 的毂品邋过固定化细胞柱，n i s i n 藏被吸辩从而达到分离浓缩的目的。 另一种毅鼹法楚廒搦一黧吸附刹，在合适条箨下使英与n i s i n 吸附，彀达载提取纯 亿的目的。1 9 9 8 年j a n e s 应用硅酸类设酣荆黻弧和s a ，崧p h 7 。o 时吸附n i s i n ，其吸 附率分别离达7 0 、9 7 ，然厝再将吸附复合物p h 值降到2 5 3 o ，并且在9 0 水浴 加热5 m i n ，缩莱从s a 淡脱n i s 汪慈回收率这8 4 ，而从r 王魏洗脱回收搴不及4 0 ，最 后将豳收到的n i s i n 透析处理，溯定跎活9 3 l o 纨t j 幢，用电泳检测产物为革条蛋自带。 令人失望的是n i s i n 的活性损失相当严耋，总回收率仅为1 3 。 ( 3 ) 柱层孝厅法：柱层析蹙一种常规的分离纯化搓自质方法，被广泛遮瘦用予蛋白质纯 化这一领域。由于n i s i n 楚带正电蕊的低分子量豹多获，躐弱可选用阳离子交换树滕帮 孔径较小的能分离小分子量物质的分予筛分质进括柱层奉厅纯化。层辑过程中蒙想缛到较 好的分离效果，需要样品浓度尽w 能高，而一般发酵液n i s i n 浓度均较低，所以必须对 其进行颈处理。1 9 7 l 每b a i l 。y 等藏怒利用耨嚣所述的薅髂吸附法浓缀n i s 协，然后将样 品先经过一个a m b e r l i t ec g _ 4 b 阳离子粒，在低蜡i 条孛# 下溺乙酸洗脱潮时收集合并活 性峰样品，露用冷的丙酮浓缩，然后将浓缩液缀造羧甲綦一纤维索阳离子交换桂，采用 p h 梯度浚脱，最屠收集活性峰，电泳梭测终产物为蕈条蛋囱带。1 9 7 5 年v ，i l i m o s w k a 则应用转i o 。g e l p 1 0 凝胶过e m 。s e p h a d o xc 一2 5 离子交换柱，对n i s 汝翘产晶纯化分离， 最后也获褥较好的结粜，聚丙精酰胺电泳检测活性峰处的蛋白镪也为荜祭。1 9 9 5 年我豳