（生物化学与分子生物学专业论文）人kctd1基因的克隆及功能研究.pdf

摘要 我们从，喃r d n a 文库中鉴定了一个新的钾离子通道蛋白四聚体 1 ( k c t d i ) ，们目前还没有k c t d l 的相关研究报道。我们对人类k c t d l 基因的结构槲功能进行了初步研究。k c t d i 包括7 个外显子，编码2 5 7 个氨基酸，蛋白质分子量为2 9 4k d 。序列比对分析显示k c t d l 的n 端有一个进化上非常保守的b r o a d - c o m p l e x ，t r a m t r a c k ，a n d b r i c a - b r a c ( b t b ) 结构域。n o r t h e r n 实验显示k c t d l 在乳腺、肾、 脑和卵巢中比其它组织表达高，在几种常用细胞系中也均有表达。此 外，细胞定位实验发现k c t d l 在h e l a 和h b l l 0 0 细胞中主要定位在核 内。h e k 2 9 3 f t 和n i h 3 t 3 细胞中的报告基因实验揭示了k c t d l 是一个 潜在的转录抑制子，它通过其b t b 结构域起转录抑制作用，h d a c 的 抑制剂t s a 和丁酸钠都不能解除其抑制活性。最后，我们通过免疫共 沉淀实验和g s tp u ll - d o w n 实验，还发现k c t d l 的b t b 结构域可以介 导同源多聚体的形成。本文第一次报道了人类k c t d i 的相关研究， k c t d l 是一个定位于细胞核的蛋白并且有转录抑制功能，它通过其 b t b 结构域介导蛋白质的相互作用。 关键词：k c t d i ；b t b 结构域；转录抑制；同源多聚体 n a b s tr a c t w ei d e n ti f i e d p o t a s s i u m c h a n n e lt e t r a m e r i z a t i o n d o m a i n c o n t a i n i n g1 ( k c t d l ) g e n ei nah u m a nb r a i nc d n aii b r a r y ， b u tt h ec h a r a c t e r i z a t i o no fh u m a nk c t d lh a sn o tb e e ne l u c i d a t e d y e t h e r e ，w er e p o r tt h a tk c t d lg e n ec o n t a i n ss e v e ne x o n s ， e n c o d i n g2 5 7a m i n oa c i dr e s i d u e sw i t hap r e d i c t e dm o l e c u l a r m a s so f2 9 4k d a s e q u e n c ea l i g n m e n t ss h o w e dk c t d lp r o t e i nw i t h a nn - t e r m i n a lb r o a d c o m p l e x ，t r a m t r a c k ，a n db r i c a b r a c ( b t b ) d o m a i ni sh i g h l yc o n s e r v e di nt h ee v o l u t i o n n o r t h e r nb l o t a n a l y s i sr e v e a l e dt h a tk c t d li se x p r e s s e di nt h em a m m a r yg l a n d ， k i d n e y ，b r a i n ，a n do v a r yc o m p a r e dt oo t h e rt i s s u e s f u r t h e r ， t h es u b c e l l u l a rl o c a li z a t i o nr e s u l t ss h o w e dt h a tk c t d li s l o c a l i z e di nt h en u c l e io f h e l aa n dh b l l 0 0c e l l s r e p o r t e rg e n e a s s a y si nh e k 2 9 3 f ta n dn i h 3 t 3c e ll sf u r t h e ri n d i c a t e dt h a t k c t d la c t sa sap o t e n tt r a n s c r i p t i o n a lr e p r e s s o ra n di n h i b i t s t h et r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t yv i ai t sb t bd o m a i n ，t h o u g hk c t d l t r a n s c r i p t i o n a lr e p r e s s i o n i su n a f f e c t e d b y t h eh d a c i n h i b i t o r s ，t r i c h o s t a t i na ，a n ds o d i u mb u t y r a t e f i n a l l y ，w e f o u n dt h a tt h eb t bd o m a i no fk c t d im e d i a t e sh o m o m e r i c p r o t e i n 。p r o t e i ni n t e r a c t i o n sb yc o 。i m m u n o p r e c i p i t a ti o na n d m g s t p u ll d o w na s s a y s t h e s e d a t ap r e s e n tt h ef i r s t c h a r a c t e r iz a ti o no fh u m a nk c t d la n ds u g g e s tt h a tk c t d lisa n u c l e a rp r o t e i nt h a tf u n c t i o n sa sat r a n s c r i p t i o n a lr e p r e s s o r a n dm e d i a t e s p r o t e i n p r o t e i n i n t e r a c t i o n st h r o u g hab t b d o m a i n k e yw o r d s ：k c t d l ； b t bd o m a i n ； t r a n s c r i p t i o n a lr e p r e s s i o n ； h o m o m e r i ci n t e r a c ti o n s i v a m p ：a m p i c i l l i n d t t ：d i t h i o t h r e i t o l 英文缩写表 i p t g ：i s o p r o p y l t h i o - - d - g a l a c t o s i d e g s t ：g l u t a t h i o n es t r a n s f e r a s e p m s f ：p h e n y l m e t h y ls u l f o n y l f l u o u r i d e 氨苄青霉素 二硫苏糖醇 异丙基硫代d 半乳糖苷酶 谷胱苷肽转移酶 苯甲基磺酰氟 d a b ：3 ，37 一d i a m i n o b e n z i d e n e3 ，37 一二氨基对二氨基联苯 、a ：b o v i n es e r t 仰a l b u m i n c d n a ：c o m p l e m e n t a r yd n a p b s ：p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e e c o li ：e s c h e r i c h i ac o li k d ：k i l o d a l t o n l b ：l u r i a b e r t a n im e d i u m o d ：o p t i c a ld e n s i t y o r f ：o p e nr e a d i n gf r a m e p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a t i o n 牛血清白蛋白 璐 、眦 磷酸缓冲液 聚合鳓拭反应 k c t d i ：p o t a s s i u mc h a n n e lt e t r a m e r i z a ti o nd o m a i n c o n t a i n i n g1 s d s ：o d i u nd o d e c y ls u l f a t e t e m e d ：t e t r a m e t h y l e n e d i a m i n e t s a h d a c 钾离子通道蛋白四聚体1 四甲基乙二胺 t r i c h o s t a ti na 组蛋白去乙酰基转移酶 菌额基度捱 一 一 一 撇 一 大 r 1 b 碗 一， l h 、 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：号诤哆 7 必宫年占茂 sb 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名： 导师签名： 期：沁寥年l ；只歹b 期：摊6 月厂日 人k c t d l 基冈的克隆及功能研究 出l ! 苎- 刖 声 许多蛋白质由功能上不连续的结构域组成；b r o a d - c o m p l e x ， t r a m t r a c k ，a n db r i c - a - b r a c ( b t b ) 结构域或者称为p o x v i r u sa n d z i n cf i n g e r ( p o z ) 结构域就是其中之一。b t b 家族是类k u p p e l 锌 指蛋白家族中的一种，b t b 结构域发现应追溯到1 9 9 4 年h 5 1 ，因最早 在果蝇b r o a d c o m p l e x 、t r a m t r a c k 、b r i c - a - b r a c 三个蛋白中发现而 得名。超过2 0 0 多种蛋白质的n 端存在由1 0 0 多个氨基酸残基组成的 高度保守的b t b 结构域，大多为疏水性氨基酸。从酵母到人的各个物 种中都有分布口利，这里面有转录因子，致癌蛋白，离子通道蛋白乜引。 分析二级结构可以看出b t b 结构域由4 段q 一螺旋组成，螺旋问由b 一 折叠连接，所形成的三维空间结构是与其它蛋白作用的特征模体。几 乎一半的b t b 蛋白同时在c 端含有一个或者多个k e l c h r e p e a t ，另 外一部分b t b 蛋白c 端含各种不同的锌指结构域( 以c 2 h 2 锌指为多) ， 参与转录调控。虽然许多b t b 蛋白含有其它的保守基序，包括k e l c h 重复序列、锌指结构、f y v e 锌指和a n k y r i n 重复序列睛1 ，但是单独的 b t b 结构域仍然能发挥其功能1 。b t b 结构域最重要的功能是形成蛋 白复合体，它能介导同源二聚体形成，也能和其它b t b 结构域形成异 源二聚体。b t b 蛋白已经在功能上被证明有核内d n a 结合活性并调控 多种基因绉射，并且也能与a c t i n 结合调节a c t i n 的组织和稳定性砼m 蚓。 完整的b t b 结构域对蛋白结合是必需的，对若干保守位点韵突变会导 致蛋白结合能力的丧失，导致功能缺失。没有二聚化的裸露的b t b 单 体蛋白是不稳定的。大量疏水的氨基酸残基暴露在外，b t b 蛋白单体 依靠疏水作用力结合成二聚体。同时，在与转录相关的b t b 蛋白中， b t b 结构域的正确折叠和形成蛋白复合体是b t b 蛋白有正常转录调控 功能的必要条件，也就是说这些b t b 蛋白必须与其他相关蛋白形成多 聚复合物的时候它的功能才能正常的显示出来。b t b 结构域对于所在 的蛋白的功能具有很重要的作用，因此了解b t b 结构域的结构特征和 功能对研究b t b 蛋白的功能具有重要的理论意义。 硕十学位论文 研究结果表明，b t b 结构域对转录调控至关重要且b t b 蛋白主要 充当转录抑制因子n 2 3 1 9 1 嘶6 1 蚓。一些b t b 蛋白招募n - c o r 、m s i n 3 a 、 s m r t 和具有h d a c 活性的h d a c 组成辅阻遏物复合物，如b - c e l l l y m p h o m a6 ( b c l 一6 ) 和p r o m y e l o c y t i cl e u k e m i az i n cf i n g e r ( p l z f ) 。 人类b c l 6 基因编码1 个由7 0 6 个氨基酸组成的编码一个p o z 锌指 蛋白( c r u p p l e 型锌指蛋白) ，属于一种转录抑制因子嘲1 。p l z f 最初 是作为r a rq 的融合蛋白被发现的。p l z f 是高度保守的蛋白，在人， 小鼠以及家禽类中都很保守，是一个6 7 3 氨基酸的转录因子。p l z f 的 n 端有一个b t b p o z 保守结构域，该结构域的主要功能是帮助p l z f 形成二聚体，同时此结构域也是p l z f 执行转录调控功能所必须的结 构域。在p l z f 的c 端有九个k r u p p e l 型锌指结构域，此结构域主 要负责结合特定的d n a 序列，从而指导p l z f 对特定的序列进行转录 调控。 具有h d a c 活性的h d a c ( 组蛋白去乙酰基转移酶) 组成辅阻遏物复 合物的形成，可能导致核小体重构和染色质结构的局部变化，从而影 响转录调控。组蛋白的乙酰化水平与肿瘤的产生、增殖、致癌基因和 肿瘤抑制基因的表达水平有密切的关系。h a t 通过对核心组蛋白分子 n 端2 5 4 0 个氨基酸范围内的赖氨酸残基进行乙酰化修饰，使染色 质处于松散、开放的状态，进而转录因子、转录调节复合物和r n a 合 成酶能够更加接近染色质，使得基因表达更加容易；h d a c 的作用与 h a t 相反，它使染色质处于一种紧密的超螺旋结构，基因表达受到抑 制嵋6 儿5 力璐8 i 。t r i c h o s t a t i na ( t s a ) ，一个特异的h d a c 可逆抑制剂，可 通过控制染色质构造减轻转录抑制n 2 儿矧h 训。属于异羟肟酸类h d a c 抑 制剂，结构均由环、脂肪链和异羟肟酸3 部分组成，是目前研究得 最多、最深入的一类h d a c 抑制剂。在体外n m 的浓度就可以发挥作用。 在体外实验中t s a 对h d a c 的抑制活性已得到充分证明，常作为验证 其他物质是否具有h d a c 抑制性的对照药物。丁酸钠( n a b u ) 也是一种 常用的h d a c 抑制剂，有效浓度为i i l m 级。与其他h d a c 抑制剂相比， 正丁酸在体内代谢迅速。n a b u 能极有效地抑制h d a c 的活性，以及抑 人k c t d l 基冈的克隆及功能研究 制细胞增殖。n a b u 也是最有效的刺激或抑制特定基因表达的短链脂 肪酸盐。h d a c 抑制剂的主要作用是抑制h d a c 的活性，通过遮蔽h d a c 保守的h d a c 催化活性区来阻止h d a c 发挥生物学功能，降低其转录抑 制效应。 一些b t b 蛋白如h y p e r m e t h y l a t e di nc a n c e rl ( h i c - i ) 和g f b p - b n 羽能抑制转录活性，但转录机制仍不清楚。它们可以与其他缺乏h d a c 活性的抑制复合物相互作用；他们会消极干扰基本转录物的组成，如 s m r t n - c o r 与t f i i b 、t a f i l 3 2 妇引，或者他们可以参与建立异染色质 结构1 。不过，一个已被视为转录抑制物的b a c h 2 ，通过与m a z r 相互 作用，作为转录激活复合物的一部分结合在f g f 4 基因的启动子上行 使功能 2 3 oz f 5 的z i n p o z 结构域在转录抑制和激活两方面都是必 需的心。这就表明b t b 蛋白并不是一类传统意义上的转录调控因子， 而是一种既有转录激活作用又有转录抑制作用的蛋白，所以在发育和 细胞命运决定过程中有重要的作用 除了对转录活性的调控，b t b 蛋白如s p e c k l e t y p ep o zp r o t e i n ( s p o p ) 和k e a p l 是c u lli n3 泛素连接酶的底物连接蛋白，因此参与 了蛋白的降解和泛素化n 乜钊。另外，b t b 结构域能介导l z t r - 1 结合 到高尔基复合体，使l z t r 一1 的酪氨酸残基磷酸化并降解从而诱导细 胞凋亡心8 i 。b c l - 6 的过表达能通过调控一些凋亡调控基因的表达来诱 导细胞凋亡m 1 。有意思的是，b t b 蛋白被牵涉到了许多发育相关的过 程，如原肠胚形成、肢体形成、眼发育、卵巢形态发生、造血干细胞 命运决定。当然，这些蛋白的突变会引起癌症或发育障碍；这些蛋白 包括i n c l u d eb c l 一6 3 0 3 、p l z f 川2 训、h i c l n 羽嘲和k a i s o 1 。因 此，b t b 蛋白在生物过程中也发挥了多种作用，如生物体的发育、分 化、染色体重组等程序的调节，并与癌症有密切的关系。 本文鉴定了人的一个新的含有b t b 结构域的基因，p o t a s s i u m c h a n n e lt e t r a m e r i z a t i o nd o m a i n c o n t a i n i n gl ( k c t d l ) 。其属于钾 离子通道蛋白四聚体基因家族的一员，目前这个家族有2 1 个成员， 但关于这个家族的文献报道还很少，它们在n 端都具有一个b t b p o z 硕十学位论文 结构域和一个钾离子四聚体通道结构域( k t e t r a ) 。k _ t e t r a 结构域 又称为n 端细胞质四聚体结构域( t i 结构域) ，是电压门控钾离子通 道蛋白中一个非常保守的结构，编码分子特异性和家族特异性的q 亚基集成功能性的四聚体通道2 矧。k t e t r a 结构域在序列和结构上 和b t b p o z 结构域具有高度相似性，a r a v i n da n dk o o n i n 预测到 k t e t r a 结构域是b t b p o z 结构域的结构模板嵋利。两种结构域的比较， 显示它们在结构支架上高度相似惭1 。虽然小鼠、大鼠和人类k c t d i 的 核酸和蛋白序列在n c b i 数据库中都有报道，但它们的表达和功能都 还没有研究报道。我们发现k c t d i 在进化上高度保守，但和其它b t b 蛋白相比同源性较低。我们分析了k c t d i 在人组织和乳腺衍生的细胞 系中的表达谱，其主要在乳腺中表达，其次是肾、脑和卵巢。原核表 达纯化k c t d i 蛋白并制作了抗k c t d i 的多克隆抗体，亚细胞定位显示 k c t d i 主要存在于细胞核中。通过c o i p 和p u ll d o w n 实验证明k c t d i 的b t b 结构域可以直接的相互作用形成同源多聚体，并且其b t b 结构 域具有不依赖于h d a c 的转录抑制功能。 人k c t d l 基i 灭l 的克隆及功能研究 第一部分材料与方法 1 材料 1 1菌种和细胞株 大肠杆菌叵c o l id h 5q 和b l 2 1 ，细胞株h e l a 、h e k 2 9 3 f t 、h b l l 0 0 、 m d am b2 3 1 、m d a 腽4 5 3 、t 4 7 d 、n i h 3 t 3 、m c f 7 由本实验室保存。 1 2载体和工具酶 p g e x 一4 t 一2 为p h a r m a c ia 公司产品；p q e n 3 、p c m v - m y c 、p c m v h a 、 p t a l l u c 、p l 8 g 5 一l u c 、p l e x a v p l 6 为实验室保存；p c m v b d 为 s t r a t a g e n e 公司产品；限制性内切酶、t 4d n a 连接酶等购自n e w e n g l a n db i o l a b s 公司；t a qd n a 。 1 3抗体 抗h i s 的单克隆抗体、抗h a 的单克隆抗体和多克隆抗体、抗m y c 多克隆抗体为s i g m a 公司产品；抗g s t 的单克隆抗体、抗m y c 单克隆 抗体为s a n t ac r u z 公司产品；二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔i g g 和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠i g g 购于j a c k s o ni m m u n or e s e a r c h 公司。a l e x af l u o r4 8 8 和a l e x af l u o r5 9 4 偶联的羊抗鼠i g g 和羊 抗兔i g g ( m o l e c u l a rp r o b e s ) 。 1 4试剂盒 柱离心式凝胶回收试剂盒与质粒小量提取试剂盒购自a m b i o g e n 公司，p c r 试剂盒购自t a k a r a 公司；s e n s i s c r i p tr tk i t 、质粒中 量提取试剂盒为q i a g e n 公司产品；l u c i f e r a s ea s s a y 试剂盒购自 p r o m e g a 公司。 1 5其它试剂 t s a ( b i o m 0 1 ) ，s o d i u mb u t y r a t e ( n a b u ) ( s i g m a ) ，b 一巯基乙 醇，s d s ，t r i s 碱，d e p c ，i p t g ，t r i s - 饱和酚，d t t ，b s a ，d n t p ， 琼脂糖，溶菌酶，丙烯酰胺，亚甲双丙烯酰胺，t e m e d ，p m s f ，溴酚 蓝，考马斯亮蓝为上海生工的进口分装试剂。d a b ，过硫酸铵，购自 硕十学位论文 g i b c o 公司。谷胱甘肽琼脂4 b 凝胶珠为p h a r m a c i a 公司产品。尼龙 膜、p v d f 购于m i n i p o r e 公司。d n a 分子量标准，蛋白质分子量标准 均购于m b if e r m e n t a s 公司。同位素a 一3 2 pa t p 购于北京福瑞公司。 新生小牛血清为杭州四季青公司产品。t r i z o l 、脂质体l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 购于美国i n v i t r o g e n 公司。其它常规试剂均为国产分析纯。 1 6所需溶液 ( 1 ) d n a 琼脂糖凝胶电泳溶液 5x t b e ：t r i s 碱5 4 9 ；硼酸2 7 5 9 ；2 0m l0 5 me d t a ( p h8 0 ) ； 加水定容至1 l 6 上样缓冲液：0 2 5 溴酚蓝；0 2 5 二甲苯青f f ；1 5 聚蔗 糖( f i c o l14 0 0 ) 水溶液 ( 2 ) 大肠杆菌培养基 l b ：酵母提取物5g ；蛋白胨1 0g ；n a c i5g ；加水定容至1 l 。 2x y t ：酵母提取物l o g ；蛋白胨1 6 9 ；n a c i5 9 ；加水定容至 l l 。( 固体培养基加入2 终浓度的琼脂粉) ( 3 ) 用于g g t 融合蛋白质提取的溶液 1xp b s ( p h7 3 ) ：1 4 0m mn a c i ；2 7m mk c i ；i 0m mn a 2 h p 0 4 ： 1 8m mk h ：p 0 4 裂解缓冲液：1 p b s ，l o m md t t ，1 m mp m s f ，2 0 0ug m e 溶菌酶 冲洗缓冲液：1 p b s ，i m md t t 洗脱缓冲液：1 2 5 m mt r i s h c lp h 8 0 ，2 5 m m 谷胱甘肽，l o o m m n a c l ，0 1 t r i t o nx 1 0 0 ( 4 ) 用于h i s t a g 融合蛋白质提取的溶液 入d il u e n t ：1 0 m mt r i s h c ip h 7 5 ，l o m mm g s 0 4 裂解缓冲液：5 0 m mt r i s h c ip h 8 0 ，l o o m mn a c i ，5 甘油，5 m m b 一巯基乙醇，i m m 咪唑 冲洗缓冲液：5 0 m mt r i s - h c lp h 8 0 ，l o o m mn a c l ，5 甘油，5 m m b 巯基乙醇，l o m m 咪唑 6 人k c t d i 基冈的克隆及功能研究 洗脱缓冲液：5 0 r a mt r is - h c lp h 8 0 ，1 0 0 m mn a c l ，5 甘油，5 m m 1 3 一巯基乙醇，5 0 0 m m 咪唑 ( 5 ) 用于蛋白质p a g e 电泳的溶液 凝胶储液：3 0 丙烯酰胺o 8 亚甲双丙烯酰胺水溶液 4 x t r i s c l s d s ( p h8 8 ) ：在4 0i i l l 水中溶解6 0 5 9t r i s 碱， 用h c l 调至p h8 8 ，加水至1 0 0m l 。用0 4 5um 滤膜过滤后，再加 入o 4 9s d s 。于4 可保存1 个月。 4 t r i s c l s d s ( p h6 8 ) ：在4 0i i l l 水中溶解6 0 5 9t r i s 碱， 用h c i 调至p h6 8 ，加水至i 0 0m l 。用0 4 5pm 滤膜过滤后，再加 入o 4 9s d s 。于4 c 可保存1 个月。 5 s d s 电泳缓冲液：t r i s 碱1 5 1 9 ；甘氨酸7 2 9 ；s d s5 9 ；加 水定容至l l 6 s d s 上样缓冲液( 2 0m l ) ：4 t r i s c l s d s ( p h 6 8 ) 1 4m l ， 甘油6m l ，s d s2 9 ，d t t1 8 6 9 ，溴酚蓝2 4m g 。分装成0 5m l 于 - 7 0 储存。 染色液( 1 0 0 m l ) ：考马斯亮兰r 2 5 00 2 5 9 ，5 0 甲醇9 1l n l ，冰 醋酸9l i l l ( 6 ) 用于w e s t e r n - b l o t 检测的溶液 电转移缓冲液：在4 l 水中加入1 8 2gt r i s 碱和8 6 5 9 甘氨酸， 加水至6 l ，调p h 约为8 3 8 4 。 t b s ：1 0 0m mt r i s c 1 ( p h7 5 ) ；0 9 n a c i t b s t ：1 0 0m mt r i s c 1 ( p h7 5 ) ；0 9 n a c l ；0 1 t w e n 一2 0 封闭剂：含1 0 脱脂奶粉的t b s 溶液 d a b n i c l 显色液：5 m ll o o m m lt r i s h c lp h7 5 ，1 0 0pld a b 贮存液( 4 0 m g m l ) ，2 5uln i c i 贮存液( 8 0m g m l ) ，1 5 i jl3 双氧 水，临用前混合。 ( 7 ) 用于细胞培养的溶液 7 硕十学位论文 d m e m 高糖( g i b c oi n v i t r o g e n 公司) 母液( 1l ) ：d m e m1 3 5g ， n a h c o 。3 7 9 ，青霉素钠( r p i 公司) 0 3 1 5 9 ，硫酸链霉素( r p i 公司) 0 5g ，用1mh c i 将p h 调到7 2 7 4 ，过滤灭菌，4 保存。 d m e m 高糖培养液( 1 0 0m l ) ：d m e m 高糖母液8 9i i l l ，新生小牛血 清( 杭州四季青公司) 1 0m l ，0 2 ml 一谷氨酰胺1m l ，过滤灭菌，4 保存。 0 2 胰酶( a m r e s c o 分装) ( 5 0 0m l ) ：胰酶l g ，e d t a0 2g ，n a c i 3 5g ，t r i s1 5 g ，k c l0 1 8 5g ，k h 2 p 0 40 1 2 0g ，n a 2 h p 0 40 1 5 0g ， 葡萄糖0 5 0 0g ，酚红0 0 0 5g ，青霉素0 1 5 7 2g ，链霉素o 2 5g ， 用1mh c i 将p h 调到7 2 7 4 ，过滤灭菌，分装后一2 0 保存。 无钙镁p b s ( 1 l ) ：n a ：h p o 0 5 7g ( 先溶解) ，l ( h ：p o 。o 2 5g ，n a c i l o g ，k c l0 2 5 9 ，过滤或高压灭菌，4 c 保存。 细胞冻存液( 1 0 0m l ) ：d m e m 液7 0 l l ，新生小牛血清或胎牛血 清2 0m l ，d m s o ( 二甲基亚砜) 1 0m l ，过滤灭菌，- 2 0 保存，最好现 用现配。 ( 8 ) 免疫共沉淀和p u ll - d o w n 所用的溶液 r i p ab u f f e r ：5 0i i l mt r i s h c ip h7 2 ，1 5 0m mn a c l ，1 t r i t o n x 1 0 0 ，1 脱氧胆酸钠，0 1 s d s ，1m mp m s f b i n d i n gb u f f e r ：5 0m mt r i s h c ip h7 4 ，1 5 0i i i mn a c l ，1 0 甘 油，1m me d t a ，0 0 5 n p 一4 0 ，5m md t t ，1m mp m s f ( 9 ) 用于n o r t h e r nb l o t 所用的试剂 2 0xs s c ：3mn a c i ，0 3m 柠檬酸钠( p h7 0 ) 洗液1 ： 2xs s c ，0 0 0 5 s d s 洗液2 ：0 1xs s c ，0 i s d s ( 1 0 ) 用于组织蛋白提取所用的l y s i sb u f f e r 1 0 0m in a c i ，l n p 4 0 ，1 0 0m mt r i s h c ip h 7 5 ，1m md t t ，1 t r i t o nx 一1 0 0 ，5m ue d t a ，5i j g m la p r o t i n i n ，5 l jg m ll e u p e p t i n ， lug m lp e p s t a t i n ，1m mp m s f ( 临用前加) 8 人k c t d l 基闪的克隆及功能研究 1 7主要仪器设备 5 8 1 0 r 5 8 1 0 ，5 4 1 4 d 冷冻离心机德国e p p e n d o r f 公司 温度梯度p c r 仪德国e p p e n d o r f 公司 蛋白质核酸检测仪德国e p p e n d o r f 公司 k s 一2 5 0 细胞超声波破碎机宁波市经济技术开发区科生技术公司 d y y i i i 一6 b 稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂 d y y t b 转移电泳仪北京六一仪器厂 d y y i i i 一31 d 电泳槽北京六一仪器厂 d y y i i i 一4 0 b 转移电泳槽北京六一仪器厂 超净工作台苏州集团苏州安泰空气技术有限公司 一8 0 立式超低温冰箱美国f o r m a 公司 生物安全柜c l a s s l ia b 3美国f o r m a 公司 荧光显微镜a x i o s k o p2p l u sz e i s s 公司 s z 一9 3 自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂 s z - 9 7 自动三重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂 h h 一6 恒温水浴锅湖南湘仪 台式t d 5 低速水平离心机湖南湘仪 漩涡振荡器太仓市科教器材厂 a e 2 0 0 型电子天平m e t t l e r 公司 p b1 5 0 1 一e 型电子天平 m e t t l e r 公司 d e l t a 3 2 0 型p h 计m e t t l e r 公司 超纯水器m 订i - q 公司 凝胶成像系统上海天龙公司 t s 型脱色摇床江苏海门市麒麟医用仪器厂 恒温金属浴杭州大和公司 二氧化碳培养箱s h e ll a b 公司 电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司 旋转式培养箱太仓市科教仪器厂 立式圆形压力蒸汽灭菌锅l s - b 5 0 l 型上海医用核子仪器厂 硕十学位论文 s h z - d ( i i i ) 循环水式真空泵 2 实验方法 巩义市英峪予华仪器厂 2 1k c t d i 基因的生物信息学分析 在n c b i 的g e n e b a n k 中搜索人k c t d l 的m r n a 和编码序列，找出 其外显子和表达的蛋白质序列，用d n as t a r 软件对k c t d l 的e d n a 进 行初步的分析。然后对其所编码的蛋白质序列进行结构分析和同源性 的比较。不同物种的k c t d l 的比较和k c t d l 与其他b t b 蛋白的进化关 系。 2 2人k c t d l 全长及分段克隆和表达载体构建 2 2 1 引物设计与合成 根据g e n b a n k 中人k c t d i 和人b c l - 6 ( a m i n oa c i d s1 1 8 1 ) 基因 序列，用d n a s t a r 软件设计基因的特异引物，如表1 - 1 ： 表1 - 1 引物的名称和序列 引物序列5 7 3 7 酶切位点 k c t d l - f k c t d l - r 5 - c c g g a a t t c t t g g a t c c a t g t c 从g a c c t c t g a t c a c 一3 5 一a c g c g t c g a c t t a g t c c a g a g g c t c t t g c 一3 k c t d l n r5 一a c g c g t c g a c g t c t g c t t c c a t c t t t c c 一3 k c t di c f5 - c c g g a a t t c t t g g a t c c g a a a g a t g g a g c a g g a c a 一3 b c l 一6 一b t b p o zf5 一c g c g g a t c c a a a a t g g c t c g c g g c t g 一3 b c l 一6 一b t b p o zr5 一g a c g t c g a c g g c a a a g g c t c t g c t c t c a 一3 e c o r i ，b a m h i s a l i s a l i e c o r i ，b a m h l b a m h i s a li 将设计好的引物送于上海生工公司合成后，将引物溶解至终浓度 l oum 。 2 2 2p c r 扩增k c t d l ，k c t d i n , k c t d i cj 煅b c l - 6 一b t b p o z 编码芋歹0 在0 2 m lp c r 反应管中加入： 双蒸水 1 9 8 7 5ul p c r 缓冲液 2 5ul dntp(10mm)05 1 tl 1 0 人k c t d l 基冈的克隆及功能研究 t a qd n a 聚合酶 ，0 1 2 5ul 脑文库d n a 1ul 弓i 物- f 0 5ul 曼! 塑= 塞 ； q ：昼坚坠 上 共2 5 | ll ，充分混匀置于p c r 仪中 k c t d l 、b c l 一6 一b t b p o z 的p c r 扩增条件为：9 5 2m i n ，随后 9 4 4 5s e c ，6 0 4 5s e c ，7 2 4 5s e c 进行2 5 个循环，7 2 1 0 m i n 。k c t d l n 、k c t d i c 的条件基本类似，只有变性、退火、延伸的时 间均为3 0s e c 。 2 2 3d n a 凝胶电泳及胶回收 将p c r 扩增产物在含e b 的1 5 琼脂糖凝胶上电泳，将目的条带 用胶回收试剂盒回收，用于下一步克隆。d n a 凝胶回收步骤如下： ( 1 ) 用干净的手术刀割下含所要回收d n a 的琼脂块，放入1 5i i l l 离心管中，按每1 0 0m g 琼脂糖凝胶加入4 0 0i ll 胶块融化液b u f f e rq g ， 置于5 0 水浴1 0m i n ，使胶彻底融化。 ( 2 ) 向上述胶块融化液中加入b u f f e ro g 量的1 3 体积量的异丙 醇，均匀混合。 ( 3 ) 将溶液转移到含收集管的离心柱内，1 2 0 0 0r m p 离心1 分钟。 ( 4 ) 加0 5m lb u f f e rq g 于离心柱内，1 2 0 0 0i m p1 分钟，倒去 收集管内的液体，并将离心柱重新放于收集管内。 ( 5 ) 加入7 5 0m lb u f f e rw b 于离心柱内，1 2 0 0 0r m p1 分钟，倒 去收集管内的液体，并将离心柱重新放于收集管内。 ( 6 ) 重复步骤8 一次。高速离心2m i n ( 1 2 8 0 0r m p ) 后，将离心 柱转移到一干净的1 5m l 的离心管中。 ( 7 ) 加入5 0 | llb u f f e re b 或者超纯水于离心柱的滤膜中央， 静置1 - 3m i n ，1 0 0 0 0r m plm i n ，则溶液中含有目的d n a 片段。将d n a 片段溶液置于一2 0 保存。 2 2 4 连接 硕十学位论文 将回收的k c t d l 片段和载体连接。先将回收的d n a 片段和载体用 限制性内切酶处理：e c o r l s a l l 酶切k c t d l 、k c t d l n 、k c t d i c ， e c o r i x h o i 酶切p c m v m y c 、p c m v - h a ，b a i i l h i s a l i 酶切k c t d l 、k c t d l n 、 k c t d l c 和p q e n 3 、p g e x - 4 t - 2 。从p c m v m y c k c t d l 中酶切出 k c t d l ( e c o r l n o t l ) ，再连接入p c m v 一肋( e c o r i n o t l ) 。 将回收的目的片段与载体连接过夜。在一个标准的2 0ul 连接反 应体系中，加入5 0n g 载体、o 2p m o l 的目的片段产物、2ul l ox l i g a t i o nb u f f e r 、2ul1 0 b s a 、lul 的t 4d n a1 i g a s e ，其余用 水补足，1 6 连接过夜。 2 2 5 制备感受态及转化 制备大肠杆菌感受态细胞： ( 1 ) 取1 大肠杆菌ec o l l 接种于含2l i l ll b 培养基的试管中， 3 7 振荡培养过夜。 ( 2 ) 取0 1m l 过夜培养物转种于含1 0m ll b 培养基的三角瓶中， 3 7 振荡培养3h 至o d 咖为0 3 ( 3 ) 然后把培养物倒入1 5 m l 离心管中，冰浴1 0m i n 。 ( 4 ) 在4 下以4 0 0 0r p m 离心5m i n ，去上清液。 ( 5 ) 把菌体悬浮子1 5m l 冰冷的0 1mc a c l ：溶液中，置冰上3 0 m i n 。 ( 6 ) 然后再在4 下以4 0 0 0 r p m 离心1 0m i n ，去上清液。 ( 7 ) 将菌体悬浮于o 1m lc a c i ：溶液中，冰浴放置