（化学工程专业论文）固定化脂肪酶催化合成油酸丁酯的研究.pdf

北京化t 火学硕f ：学位论文 固定化脂肪酶催化合成油酸丁酯的研究 摘要 作为一种重要的有机精细化工产品，油酸丁酯在多个领域有着广 泛的应用。目前，商品化油酸丁酯多是通过化学方法合成的，生产过 程中存在反应条件剧烈、环境污染大、产品品质低等缺点。本论文在 前期探索的基础上，开展了固定化假丝酵母脂肪酶( c a n d i d as p 1 6 1 9 ) 催化合成油酸丁酯的研究，主要研究结果如下： ( 1 ) 载体选择研究表明，在疏水聚四氟乙烯( p t f e ) 无纺布复合膜、 p t f e 疏水膜、聚偏氟乙烯( p v d f ) 膜，亲水p t f e 无纺布复合膜、亲 水p t f e 壳聚糖( c s ) 复合膜5 种不同结构的固体膜中，疏水p t f e 无 纺布复合膜的负载量和酶活较高。在酶液浓度1 0 m g m l ，戊二醛浓 度o 5 ，交联时间2 h 的条件下可得到活性最高的固定化酶，此时酶 蛋白负载量为0 0 8 2 m g c m - 2 ，固定化酶活为2 6 6 0 u c m - 2 ( 2 ) 疏水p t f e 无纺布复合膜固定化假丝酵母脂肪酶的性能分析 显示，酶的热稳定性、p h 稳定性和操作稳定性都得到了显著提高； 重复催化水解橄榄油7 次后，残余活性为6 6 。固定化酶的反应动力 学常数测定表明，固定化酶表观米氏常数和最大反应速度较之游离酶 增大，这说明固定化酶对底物的亲和力较游离酶要弱，但单位时间内 的固定化酶催化效果要优于游离酶，同时固定化酶的半衰期较之游离 酶明显提高，为游离酶的1 5 倍。 ( 3 ) 以疏水p t f e 无纺布复合膜固定化假丝酵母脂肪酶催化合成 北京化t 大学硕f ：学位论文 油酸丁酯。结果表明，与游离酶催化相比，固定化酶将反应稳定时间 缩短了1 倍以上。温度对固定化脂肪酶催化反应的影响较小，且在 6 0 。c 的高温条件下固定化脂肪酶仍可以保持8 7 的高转化率，而游离 酶在6 0 。c 条件下转化率仅为3 7 。在本实验条件下，最佳的反应条 件为：给酶量5 0 u ，转速2 0 0 r r a i n ，醇酸摩尔比l ，底物油酸浓度为 o 1 2 m o l l ，反应温度3 7 。c ，反应时间2 h ，得到油酸丁酯的转化率 为9 0 。固定化脂肪酶催化合成油酸丁酯的重复性试验表明，催化反 应1 8 批后，转化率仍可保持7 3 ，达到了较好的催化效果，使脂肪 酶的重复利用率得到显著提高。 ( 4 ) 在摇瓶实验的基础上设计了填充柱式反应器，进行了固定化 酶催化合成油酸丁酯的循环工艺操作。结果表明，随着流量的增加， 停留时间缩短，对应的转化率降低。流量为2 5 m l m i n 。时，停留时间 为2 1 m i n ，反应2 5 h 转化率为7 4 。实验过程中脱水对转化率提高 有积极的作用。 关键词：脂肪酶，油酸丁酯，固定化酶，酯化，填充床反应器 北京化丁人学硕i ：学位论文 i m m o b i l i z a t i o no fl i p a s ea n di t ss t u d yo n s y n t h e s i so fb u t y lo l e a t e a b s t i 认ct a sa ni m p o r t a n tf i n ec h e m i c a lp r o d u c t ，n - b u t y lo l e a t eh a sb e e n e x t e n s i v e l yu s e di nm a n yf i e l d s h o w e v e r , p r e s e n t l yt h ec o m m e r c i a l n - b u t y l o l e a t ew a s c h e m i c a l l ys y n t h e s i z e d ，w h i c h h a d m a n y d i s a d v a n t a g e s ，s u c h a sv i o l e n tr e a c t i o n c o n d i t i o n s ，e n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o na n dp o o rp r o d u c tq u a l i t y i no r d e rt oo v e r c o m et h es h o r t c o m i n g o fc h e m i c a lm e t h o di ns y n t h e s i z i n gn - b u t y lo l e a t e ，i m m o b i l i z e dc a n d i d a s p 1 i p a s e sw a su s e da sb i o c a t a l y s tt oi n v e s t i g a t ei t sf e a s i b i l i t ya n d i n f l u e n c ef a c t o r si ns y n t h e s i z i n g n - b u t y lo l e a t e t h em a i nr e s u l t sa s f o l l o w e d ： 1 i no r d e rt oo v e r c o m es h o r t c o m i n go ff r e el i p a s ei na p p l i c a t i o n ，l i p a s e i m m o b i l i z a t i o nw a sc a r r i e do u t ，a n de f f e c t so fs u p p o r ts t r u c t u r e c h a r a c t e r i c sa n di m p a c tf a c t o r sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a t h y d r o p h o b i cp o l y t e t r o f l u o r o t h y l e n ( p t f e ) w i t h a d h e s i v eb o n d e df a b r i c ( h p f ) m e m b r a n ew a st h em o s ts u i t a b l ec a r d e r a m o n gt h r e ek i n d so fm e m b r a n e c o m p a r e dt h r e ec a r t i e r , i m m o b i l i z e d c a n d i d as p 1 i p a s ew i t hh p fh a dh i g h e rp r o t e i nl o a d i n ga n dl i p a s e a c t i v i t yt h a no t h e r s t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o ri m m o b i l i z a t i o no f c a n d i d a s p 1 i p a s ew e r e ：g l u t a r a l d e h y d e c o n c e n t r a t i o n 0 5 ， 北京化t 人学硕 j 学位论文 c r o s s l i n k i n gt i m e2 h ，a n dt h ep r o t e i nl o a d i n ga n dl i p a s ea c t i v i t yw e r e 0 0 8 2 m g c m a n d2 6 6 0 u c m ，r e s p e c t i v e l y 2 i n v e s t i g a t i o no nc h a r a c t e r i s t i co fi m m o b i l i z e dc a n d i d as p 1 i p a s e s h o w e dt h a ti tw a sm o r es t a b l e t h e r m o s t a b i l i t y , p hs t a b i l i t ya n d r e u s a b i l i t y t h a nf r e e l i p a s e ，a n d i th a dg o o dr e p e a t a b i l i t yw i t h r e m a i n i n ga c t i v i t y6 6 a f t e r7c y c l e sr e u s e m o r e o v e r , t h er e a c t i o n k i n e t i c sc o n s t a n t so ff r e e e n z y m ea n di m m o b i l i z e de n z y m ew e r e d e t e r m i n e d 3 c a n d i d as p 1 i p a s ei m m o b i l i z e do nh p fm e m b r a n eb yf i l t e r i n ga n d c r o s s l i n k i n gw a su s e dt oc a t a l y z es y n t h e s i so fn b u t y lo l e a t e t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a t ，c o m p a r e dt of r e el i p a s e ，t h er e a c t i o ns t a b l et i m e o fi m m o b i l i z e d l i p a s e w a ss h o r t e nm o r et h a n2 h ，t h er e a c t i o n e f f i c i e n c yc o u l db ee n h a n c e d t h ei n f l u e n c eo ft e m p e r a t u r eo n i m m o b i l i z e dl i p a s ew a sm i n i m a l a n dt h ec o n v e r s i o nr a t eo f i m m o b i l i z e dl i p a s ew a s8 7 a t6 0 c ，u n d e rt h es a m ec o n d i t i o nt h e c o n v e r s i o nr a t eo ff r e ee n z y m ew a sl o w e rt h a nt h em a x i m u md a t a ，j u s t b e c a u s ei t s a b i l i t y t oe n d u r e t e m p e r a t u r e f l u c t u a t i o ni n c r e a s e d m e a n w h i l e ，t h em a x i m u mc o n v e r s i o nr a t eo fi m m o b i l i z e dl i p a s ew a s 9 0 ( a m o u n to fl i p a s e5 0 u ，2 0 0 r p m ，r a t i oo fa l c o h o lt o a c i d 1 ， s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o no 12 t o o l l ，3 7 。c ，2 h ) i na d d i t i o n ，r e l a t i v e c o n v e r s i o nr a t ew a s81 a f t e r18c y c l e sr e u s e ，w h i c hi n d i c a t e dt h a t i m m o b i l i z a t i o ni n c r e a s e dl i p a s er e u s a b i l i t y i v 北京化丁大学硕 j 学位论文 4 t h ep a c k e db e dr e a c t o rh a sb e e nu s e dt os y n t h e s i so fn b u t y lo l e a t e f o rc i r c u l a t i o np r o c e s so p e r a t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a t ，t h er e s i d e n c e t i m eh a sb e e ns h o r t e nw i t ht h ef l o wr a t ei n c r e a s e d m e a n w h i l e ，t h e m a x i m u mc o n v e r s i o nr a t eo fp b rw a s7 4 ( f l o wr a t e2 5m l m i n ， 3 7 。c ，r a t i oo fa l c o h o lt oa c i d1 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n0 1 2 t o o l l 1 ， a m o u n to fl i p a s e1 81 u ) k e y w o r d s ：l i p a s e ，n - b u t y l o l e a t e ， i m m o b i l i z a t e d e n z y m e ， e s t e r i f i c a t i o n ，p b r v 北京化t 人学硕 ：学位论文 符号说明 酯化反应转化率， 氢氧化钠甲醇溶液的浓度，m o l l - 1 消耗的氢氧化钠甲醇溶液的体积，m l 反应底物油酸的初始摩尔量，m o l 原溶液中的蛋白含量，m g m l - 1 原溶液的体积，m l 冲洗液和使用后酶液混合溶液中的蛋白含量，m g m l - 1 冲洗液和使用后酶液的混合体积，m l 固定化膜面积，c i l l 2 某一时刻所测脂肪酶的活性，u c l t l - 2 脂肪酶的初始活性，u c 1 1 - 1 - 2 脂肪酶活力，u 一 脂肪酸浓度，j a m o l m l - 1 脂肪酸溶液的体积，m l 酶液的浓度，g l - 1 酶液的用量，m l 作用时间，m i n 最大反应转化率， 某时刻的反应转化率， 表观米氏常数，m o l l 1 最大反应速度，m o l $ - i l - 1 半衰期，m i l l 衰减常数， 停留时间，r a i n 填充柱内径，e n l 填充柱长度，c i n 流量，m l m i n 1 y c矿q，c，y 4 吼 印 口a所q圪，k纰缸名d， 北京化工大学学位论文原创性声明 学位论文作者签名：屋争矽 7 研年多月3 日 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北 京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在上年解密后适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授 日期：鲨乞：生：兰 日期：幽：堑：兰 北京化丁人学硕 j 学位论文 1 1 引言 第一章文献综述 脂肪酸酯是一大类十分重要的有机化合物，也是人们同常生活中用途较多的 物质【l 】。脂肪酸酯按其脂肪酸的碳链可分成短链脂肪酸酯和长链脂肪酸酯。短链 脂肪酸酯呈天然水果香味，是重要的香精、香料组分，广泛应用于食品、医疗、 化妆品及医药等日常生活用品中拉j 。长链脂肪酸酯是精细化工、医药、材料工业 的重要成分，在化妆品工业中可以作为油脂原料、溶剂和香料使用【3 】，并可用作 一些高级名牌个人护理用品的润肤剂原料。 油酸丁酯属于长链脂肪酸酯，作为一种重要的有机精细化工产品，在多个领 域有着广泛的应用。目前，工业上油酸丁酯的合成主要是通过化学方法来实现的， 但在生产过程中存在设备腐蚀严重、酸污染废水排放量大、油酸丁酯品质低等缺 点，尤其随着国家“节能减排”政策的实施，传统油酸丁酯合成方法越来越不符 合国家的政策取向，因此，探索新型的、环境友好的油酸丁酯合成方法日益迫切。 生物酶催化是近年来深受大家青睐的化合物合成方法，特别是脂肪酶，在食品加 工、轻工业、发酵及医药中有着广泛的应用。但由于游离脂肪酶存在稳定性差、 难于重复利用、生产成本高等缺点，很大程度上限制了脂肪酶的工业化应用。近 年来，人们尝试将酶固定化以增强其稳定性，提高其重复利用率等，对推动酶催 化的工业应用起了积极作用。 1 2 脂肪酶的性质概述 1 2 1 脂肪酶的简介 脂肪酶( l i p a s e ，e c 3 1 1 3 ，甘油酯水解酶) 是一类特殊的酯键水解酶，其 基本的功能是催化其天然底物甘油酯水解为甘油和脂肪酸【4 j 。脂肪酶催化反应通 常具有高度立体异构专一性和化学选择性，并且反应不需要辅酶，反应条件温和， 副产物少。按照底物专一性脂肪酶一般可分为底物选择性的脂肪酶、位置选择性 的脂肪酶、脂肪酸选择性的脂肪酶、立体专一性脂肪酶、无选择性的脂肪酶。 脂肪酶广泛存在于动物组织、植物种子和微生物中。按其来源，脂肪酶又可 分为哺乳动物脂肪酶、细菌脂肪酶和真菌脂肪酶，其中在微生物中的分布最广， 据估计，目前有6 5 个属的微生物产脂肪酶。 人们对脂肪酶的研究始于1 9 世纪，先后报道了对兔胰脂肪酶、胃脂肪酶、 种子脂肪酶活性的研究结果，2 0 世纪初才发现了微生物脂肪酶。由于微生物脂 肪酶种类多，具有比动植物脂肪酶更广泛的作用p h 值、温度范围以及更好的底 北京化t 人学硕l j 学位论文 物专一性，并且得到了工业化生产，获得了纯酶制剂，使得微生物脂肪酶的研究 和应用有了相当迅速的进展。 近几十年来，随着越来越多的产脂肪酶优良菌株被发现以及对非水介质中脂 肪酶催化性质研究的深入，脂肪酶的应用领域越来越广，如应用在食品、医药、 皮革、同用化工以及废水处理等方面。 1 2 2 脂肪酶的结构及催化机制 研究表明，来源不同的脂肪酶其氨基酸组成数量也不同，从2 7 0 - - - 6 4 1 个不等， 分子量为2 o 1 0 4 6 o x l 0 4 道尔顿【5 j 。尽管脂肪酶具有不同的氨基酸组成，但由于 生物的同源性和进化过程的保守性，其活性中心仍具有相同或相似的结构。多数 脂肪酶活性中心是由丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸组成的三联体，只有g e o t r i c h u m c a n d i u m 和c a n d i d ac y l i n d r a c e a 等少数脂肪酶例外，它们的活性中心都是由丝氨 酸、谷氨酸和组氨酸组成【6 7 】。在构成脂肪酶活性中心的三联体结构中，丝氨酸 通过氢键与组氨酸相连，天冬氨酸或谷氨酸也通过羟基形成氢键与组氨酸相连。 在反应过程中，三者通过与底物形成四面体中间复合物完成催化过型引。 在正常情况下，丝氨酸蛋白酶直接暴露在表面，而脂肪酶活性中心隐藏在v 型结构中，表面被相对疏水的氨基酸残基形成的0 【螺旋片断( 又称为“盖子 ) 结构覆盖，能对三联体起保护作用【9 j 。当脂肪酶与界面接触时，此盖子打开，通 过亲电子域的形成导致脂肪酶构象改变，从而使活性中心暴露出来，与底物结合 发生催化反应。 多数脂肪酶是糖蛋白，其糖基部分约占脂肪酶分子量的2 1 5 ，以甘露糖 为主，整个分子由亲水部分和疏水部分组成，活性中心靠近分子疏水端【1 0 】。酶 的活性中心与疏水头很接近，这样就使活性中心也与底物连接；此外亲水尾使酶 分子在界面上定向更加稳定。 在水体系中，大多数脂肪酶活性很低或没有活性。当酶接触双相油水界面时， c t 螺旋片断折叠起来，酶的活性中心暴露出来，酶就处于激活状态，底物进入疏 水性的通道与活性部位结合，从而形成酶底物复合物【1 1 1 。脂肪酶不仅具有油水 界面的亲和力，还能在界面上以高催化速率水解不溶于水的酯，但这种界面上催 化机制目前仍不清楚。尽管如此，油水界面的存在对脂肪酶催化活性影响的重 要性仍然不可忽视，因此了解脂肪酶的活性结构和催化机理有助于更好的研究和 利用脂肪酶。m a c r a e 等【1 2 】研究表明，在油水界面上油脂量决定脂肪酶活性；增 加乳化剂量，可提高油水界面的饱和度，从而提高脂肪酶活性f 1 3 】。此外，增加 油水界面面积，可承载更多脂肪酶分子，也可增加催化反应速率【1 4 1 。 北京化t 人学颁f ：学位论文 1 2 3 影响脂肪酶催化反应的因素 脂肪酶催化的酯化反应受到各种因素影响，包括： ( 1 ) 反应溶剂 反应溶剂直接与酶接触，不仅关系酶活的大小，而且影响整个反应的进行， 是目前酶催化反应研究的热点之一。与水相催化相比，有机溶剂可以改变脂肪酶 的热稳定性，增加非极性底物的溶解度，影响酶的底物特异性及酶反应的平衡方 向和反应速度。因此，有机溶剂对酶催化性能的影响值得关注。 有机溶剂对酶促反应的影响主要通过与酶分子的直接作用，与底物或反应产 物的相互作用或与酶分子周围的水相互作用而影响反应的进行。l o g 尸通常被用 于表示溶剂的极性和它们对酶活的影响，尸是溶剂的辛醇水分配系数。如l a a n e 等【1 5 】通过实验发现：酶在l g p 2 的极性溶剂中活性较低，在2 9 9 e e ) 。 目前，尽管溶剂对酶活性和选择性的影响规律和机制还不十分清楚，但是， 实验结果表明，通过改变溶剂可以调控有机相中脂肪酶催化反应的特异性和效 率，这方面将有着广阔的发展前景。 ( 2 ) 含水量的影响 虽然将酶催化反应体系由水相变为非水相有很多优点，但非水相酶催化反应 体系中并非不含水分，而是含有微量水。这些微量水对非水体系中酶的催化活性 将产生较大影响。 就酶分子本身而言，其表层必须有足够的水分子来维持其天然构象，即水分 北京化t 大学硕卜学位论文 子直接或间接地通过氢键、疏水作用、范德华力等维持着酶分子催化活性所必需 的三维构象，而水的除去必然导致其天然构象的改变而使酶活下降。但z a k s 等 1 1 6 1 的研究结果显示：并不是所有的水分子都与酶的催化活性有关，实际上只有 与酶蛋白分子紧密结合的一层水分子( 甚至只是在酶的催化中心附近的水分子) 对酶的催化活性才是重要的。所以维持酶催化活性所必需的最少水量被称为“必 需水”，因而只要有这层微观的“必需水”的存在，酶即使在宏观的非水相中也 具有催化活性。 另一方面，高含水量也易导致酶的“热失活”。z a k s 等【2 2 】报导，在水溶液中， 猪胰脂肪酶( p o r c i n ep a n c r e a s ) 在1 0 0 。c 下几乎立即失活，而在水含量极低时 ( 0 0 1 5 0 8 ) ，其在1 0 0 。c 下的半衰期长达数十小时，这可能是由于水作为一 种“润滑剂”，为酶分子提供了结构上的高度易变性，而脱水可以使酶结构的刚 性增大，从而使其热稳定性提高。此外，过量的水会在酶分子周围形成水簇，或 使粉末状酶形成胶状物，这都能导致酶活的下降【2 3 1 。另外，在有水生成的可逆 反应( 如酯化、酯交换、肽合成) 中，水分的存在也对反应的热力学平衡不利。 所以，在非水相酶反应体系中存在一个“最佳含水量”。该最佳含水量不仅 取决于酶种类，也与所选用的有机溶剂有关。例如，一个脂肪酶分子只要结合几 个水分子就会显示活性，而在辛烷中糜蛋白酶催化反应需吸附5 0 个水分子，乙 醇脱氢酶和多酚氧化酶在溶剂中显示活性时都有成百上千个水结合在酶分子上， 足够形成一个单分子层1 2 4 1 。通常体系“最佳含水量 是个极低的值，并未达 到水在有机溶剂中的饱和点。有人认为用水的热力学活度( 反w ) 来表示非水相体系 中的水含量较为合适【2 5 , 2 6 1 。h a i l i n g 2 7 1 在总结了大量实验结果的基础上，认为酶在 不同的有机溶剂中能达到最大酶活的水活度基本相同。 适量水可以改变酶水化状态和酶的柔性，并进而改变酶催化反应的速度。目 前有关水对酶选择性的影响的研究主要集中在对旋光异构体选择性的影响上，对 脂肪酶的位置选择性和立体选择性则研究的较少，且有些研究结果差别较大，甚 至相互矛盾，这可能与研究者采用的酶、底物和反应条件不同有关。比如b e r g l u n d 等【2 8 】用圆柱假丝酵母脂肪酶( c r l ) 在环己烷中催化消旋的2 甲基癸酸酯化，以癸 醇为供体水活度为o 8 的选择性高于0 1 6 的；而以己醇为供体，则选择性没有变 化。 ( 3 ) 温度的影响 酶的催化作用受温度影响很大，一方面，与一般化学反应一样，提高温度可 以增加酶促反应的速度。通常温度每升高1 0 ，反应速度加快一倍左右；另一 方面，酶是一种活性蛋白质，在化学键的维持下具有高度的立体结构，而温度过 高将导致化学键的断裂，引起蛋白质变性，从而导致酶的失活【4 】。所以，反应温 4 北京化t 人学硕i ：学位论文 度对酶活的影响曲线一般呈钟罩形，在一定温度范围内，酶催化活性随温度的升 高而增加，并在某一温度时达到最大，然后酶活随温度升高而下降，直至完全失 去活性。反应转化率达到最大值时的温度称为该酶的最适温度。高于或低于最适 温度时，反应转化率逐渐降低。大多数动物酶的最适温度范围为3 7 4 0 。c ，植物 酶的最适温度范围为5 0 6 0 c 。但是，每种酶的最适温度不是固定的，它也与作 用的时间长短有关，反应时l 、日j 增长时，最适温度呈下降趋势。 温度对酶催化反应的作用主要体现在以下几个方面【4 】：一是降低反应体系粘 度，促进三相传质；二是有利于反应生成的水及时蒸发，使平衡向酯化方向移动； 三是在较高温度而又不致引起酶变性失活的情况下，酶具有较高的催化活性。 ( 4 ) 底物结构特征的影响 在酶催化反应中，不同反应底物对酶的催化活性有显著影响。底物构成基团 的不同决定了其空间构型、带电特征、极性、疏水性的差异，这些差异必然会影 响到底物与酶的结合，进而影响酶的选择性【4 j 。 在酶促酰化反应中，酰化试剂的结构对酶的立体选择性有明显的影响。同样 的酰基不同的供体形式( 如游离的脂肪酸、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙烯酯、酸酐等) 其选择性也会不同。k u o 等【2 9 】的研究结果表明，不同的饱和直链脂肪酸对脂肪酶 p s l ( p s e u d o m o n a ss p ) 催化的2 辛醇酰化反应的立体选择性有显著影响。在正己 烷、甲苯和环己烷中，随着酰化试剂( 脂肪酸) 链长的增加酶的活性和立体选择 性都呈现一个由低到高、再由高到低的变化趋势。 r a n g h e a r d 等【3 0 】通过有机溶剂中脂肪酶催化多组分竞争反应来考察脂肪酶对 各类醇的选择专一性，结果表明脂肪酸及多元醇对脂肪酶的活性都有影响，特别 是多元醇的碳链长度对脂肪酶活性影响较为显著。王军【3 i 】利用固定化白地霉脂 肪酶催化油酸与不同的醇进行酯化反应，结果显示对除甲醇和乙醇外的伯醇而 言，醇碳数对脂肪酶的表观活性或油酸转化率无明显影响，且脂肪酶对醇无立体 选择性。王军还通过正丁醇与辛酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、芥酸的酯化反应考 察了白地霉脂肪酶对脂肪酸的选择性，结果显示，白地霉脂肪酶对油酸有较高的 选择性。 ( 5 ) p h 值的影响 水相中进行的酶催化反应受p h 的影响非常强烈，而在近乎无水的非水相反 应体系中无法对p h 进行直接测定。但z a k s 等瞄】发现，酶对它所存在的最后一 个水溶液的p h 有“记忆能力，即酶在水溶液中催化某反应的最适p h 就是它 在非水相体系中催化该反应的最适p h 。对该现象的解释为：从分子水平来说， 酶的可电离基团在给定p h 的水溶液中获得某一电离状态，该电离状态与酶的催 化活性有关；如果酶在有机相中也能维持这种电离状态的话，它也可以表现出最 北京化t 大学硕l j 学位论文 佳的催化活力。因此在将酶用于非水相中的酶催化时，最好先将其溶解在具有最 佳p h 的水溶液中，然后通过冷干或溶剂沉淀的方法得到酶的干粉。同样地，也 可以在将酶加入到有机溶剂中之前，用具有最佳p h 的缓冲水溶液使该有机溶剂 饱和。 这种记忆性p h 对反应的影响可以说是十分剧烈的。如在辛烷中进行的n 乙酰基一l 苯基丙氨酸乙酯与丙醇之间的转酯化反应，使用在p h 7 8 时( 该酶在 水溶液中的最佳p h ) 沉淀的枯草溶菌素催化时，比用直接购得未经处理的商品 酶的催化活性高3 0 0 倍【3 2 1 。 1 2 4 脂肪酶在有机相中的催化反应 ( 1 ) 催化类型 脂肪酶是专门在异相系统即油水界面上起催化作用的酶，由于脂肪酶很难 溶于有机溶剂，因此在很长一段研究时间内，脂肪酶多在非有机体系中使用，如 在水相体系中催化水解油脂。 然而，在实际工业生产中，有机溶剂体系中的反应占多数，而生物酶在有机 + 溶剂中不但溶解度小，活性和稳定性也远比在水溶液中低 3 3 1 ，因此，这大大限 制了生物酶的应用范围。早在1 9 8 4 年，z k a s 和k l b i n a o v 掣1 6 】首先报道了脂肪酶 在有机相中具有极高的热稳定性和催化活性。从此，脂肪酶有机相催化成为酶工 程研究的最活跃的研究方向之一。特别是近几年，生物酶在有机合成中的应用越 来越多【3 4 , 3 5 ，这主要得益于对生物酶性能研究的深入，如发现在纯有机溶剂【3 6 】 或含某些有机溶剂的水溶液中，酶活性和稳定性大大提耐3 8 1 。脂肪酶这种性 质的发现为包括生物法合成油酸丁酯在内的有机体系酶催化提供了可能。 研究表明，在有机介质中脂肪酶能催化许多类型的反应( 表1 - 1 ) ，包括酯类 化合物的分解反应、酯化反应、酯交换反应、内酯合成反应、肽合成、酯聚合及 酰化等【3 9 1 。 6 北京化- t 大学硕i j 学位论文 表1 - 1 脂肪酶催化反应类型 t a b l ei - it y p e so f l i p a s e c a t a l y z e dr e a c t i o n 反麻类型 反应式 水解反应 r c o o r + h 2 0h r c o o h + r o h 酯化反应 r c o o h + r oh r c o o r + h 2 0 酯交换反应 r c o o r - + r ”c o o r c o o r + r ”c o o r 醇解反应r c o o r i + r ”c o o r c o o r + r ”c o o r 酸解反应r c o o r - + r ”c o o r c o o r + r ”c o o r ( 2 ) 催化反应 在脂肪酶的众多催化反应类型中，尤以酯化反应应用最为广泛。徐岩等【删 用微生物脂肪酶在有机相中合成短链芳香酯，结果表明：脂肪酶在正庚烷中催化 合成芳香酯的转化率比在水相中有明显的提高。在1 0 个不同来源的商品脂肪酶 中，选择了其中催化己酸乙酯效果最好的毛根霉( m u c o rm i e h e i ) 、假丝酵母 ( c a n d i d ar u g o s a ) 和猪胰( p o r c i n ep a n c r e a s ) 三种脂肪酶对7 个短链脂肪酸酯进行 合成，其中m u c o r 彪五p f 脂肪酶对这几个芳香酯4 8 h 的合成转化率均在9 0 以上。 b r e n d a 等【4 1 】采用毛根霉( r z o m u c o rm i e h e i ) 来源的固定化脂肪酶催化米糠油与中 链脂肪酸的酯交换反应，制取m c t ( 中链脂肪酸甘油酯) ，获得了较好的效果。 g a r f i e l d 4 2 】最先用真菌脂肪酶在有机介质中对内酯合成进行了研究。沈芳等 4 3 】用假丝酵母菌株所产的脂肪酶催化羟基十五烷酸甲酯合成环十五内酯，结 果表明在混合羟基脂肪酸甲酯中，假丝酵母脂肪酶c a n d i d as p g x u 0 8 具有很好 的专一性，底物于4 0 、1 8 0r m i d - 1 、p h = 6 0 、脂肪酶活力1 2 4 5 u 的条件下在环 己烷中反应7 2h ，转化率为1 7 。h a 甑一删利用s p o r o b o l o m yc e o d o r u s 成功地 将亚油酸合成y 癸内酯。 脂肪酶在有机溶剂中的催化作用为一些只能在有机溶剂环境下进行的反应 研究提供了方便，且脂肪酶种类繁多，底物特异性各异，使得研究者可以合成更 多种类的产物【4 5 1 。 7 北京化t 大学倾 ：学位论文 1 3 脂肪酶的固定化 虽然生物酶在催化反应中具有很多优点，但由于游离生物酶在反应体系中存 在稳定性差、易失活、不溶于有机溶剂、不可重复利用等问题，再加上商业生物 酶价格偏高，因此，生物酶在实际生产中的应用受到了很大限制【4 6 】。在此情况 下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展，不仅在一定程度上克服了上述游离 酶的不足，而且保持了酶特有的催化活性，从而成为生物技术中最为活跃的研究 领域之一。 1 3 1 酶固定化的定义及意义 1 9 1 6 年n e l s o n 和c r r i f f i n 4 7 最先发现了酶的固定化现象，从此拉开了固定化 酶研究工作的序幕。1 9 5 3 年g r u b h o f e r 和s o h l e i t h 首先将羧肽酶、淀粉和糖化酶、 胃蛋白酶和一核糖酸酶等用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂进行固定。1 9 6 9 年日本 的千烟一郎博士首次将固定化酶应用于工业生产，将固定化的酰化氨基酸水解酶 用来从混合氨基酸中生产l 氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元【4 8 】。 固定化酶最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍 生物，所以曾称为“水不溶酶和“固相酶 。后来发现也可以将酶包埋在凝胶 内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸 出。在这种情况下，酶本身是可溶的。因此，仍用水不溶酶和固相酶的名称就不 恰当了。在1 9 7 1 年召开的第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶” ( i m m o b i l i z e de i l z y m e ) 的名称【3 6 1 。 酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的 催化反应、并可回收及重复使用的一类技术1 4 9 。我国从2 0 世纪6 0 年代开始微 生物脂肪酶的研究开发，7 0 年代工业化生产脂肪酶制剂，目前已有许多学者就 脂肪酶的固定化展开了实验室研究，但商业化技术尚不成熟。固定化酶与游离酶 相比，具有下列优点【3 6 】： ( 1 ) 有利于酶与底物、产物的分开，实现酶的可重复使用，从而使酶的使用 效率大大提高，降低使用成本； ( 2 ) 固定化酶具有一定的机械强度，可以搅拌或装柱的方式作用于底物溶液， 使反应过程能够管道化、连续化和自动化； ( 3 ) 在大多数情况下，酶在固定化后稳定性得到较大提高，可延长使用和贮 存时间； ( 4 ) 酶的催化反应过程更易控制。如使用填充式反应器时，一旦底物不与酶 接触，即可使酶反应终止； 北京化1 _ 大学硕一l ：学位论文 ( 5 ) 固定化酶极易与反应体系分离，可获得不被酶污染、纯度较高的产物， 简化了提纯工艺，提高了产量和产品质量； ( 6 ) l lu - i 溶酶更适于多酶体系的使用，不仅可利用多酶体系中的协同效应使 酶催化反应速度大大提高，而且还可以控制反应按一定顺序进行； ( 7 ) 辅酶固定化和辅酶再生技术，使固定化酶和能量再生技术或氧化还原体 系合并使用，从而扩大其应用范围。 经过三十多年的研究和发展，固定化酶技术已取得了长足的进步，先后开发 了多种固定化方法和性能多样的载体材料，取得了丰硕的成果。但是真正实现工 业化应用的固定化酶却不多，主要原因是固定化成本较高、固定化效率及稳定性 差、连续操作使用性还有待提高。目前，人们正进一步开发更简便、更适用的固 定化方法以及性能更加优异的载体材料，以期有更多的固定化酶取得工业规模的 应用。 1 3 2 固定化方法的选择与比较 酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心。酶的 活性中心是由一定的氨基酸残基所构成的。酶在固定化状态下发挥催化作用时， 既要保证其高级结构的完整性，又要使活性中心的氨基酸残基不发生变化。因此， 在制备固定化酶时，应避免活性中心的氨基酸残基参与固定化反应。同时还要避 免可能导致酶蛋白高级结构破坏的固定化操作，如高温、强酸、强碱、有机溶剂 的处理等。由于酶蛋白的高级结构是依赖于疏水键、氢键、盐键等较弱的键维持 的，所以固定化时应采取尽可能温和的条件【5 0 】。迄今为止，寻找性能优良、价 格便宜的载体和合适的固定化方法仍是固定化酶研究的重要组成部分。优良的酶 固定化载体应具备以下性能1 5 l 】：( 1 ) 较好的机械强度；( 2 ) 耐受化学物质或微生物 的侵蚀；( 3 ) 具有合适的反应基团，或容易用物理及化学方法进行衍生；( 4 ) 适当 的亲水性和疏水性；( 5 ) 多孔性载体或网格松散的凝胶；( 6 ) 使用后的载体最好能 通过简单、经济的方法再生。 因此，依据载体的性质，酶的固定化方法可分吸附法、凝胶化法、共价结合 法、包埋法及交联法五大判5 2 - 5 5 。 1 3 2 1 吸附法 吸附法是最早的酶固定化方法，世界上第一个工业化的固定化酶是葡聚糖凝 胶( d e a e - s e p h a d e x a 2 5 ) 吸附的氨基酰化酶，即采用了该方法。如图1 1 所示， 酶和载体间的作用力可以是氢键、疏水键、兀- 电子亲和力、离子键合力等。a r i c a 等【5 6 】将脂肪酶吸附固定在甲基丙烯酸2 羟乙酯( h e m a ) 和甲基丙烯酰胺苯丙 9 北京化t 人学硕f j 学位论义 氨酸( m a p a ) 的共聚物膜上，发现酶的吸附量随着膜材料中m a p a 比例的增加 而增加，最高可达1 3 5 p g c m 3 , 对同膜载体重复地进行酶的脱附和再吸附实验， 每一次都能够维持很高的载酶量。魏纪平等 57 】用有机溶剂沉淀法将脂肪酶固定 在大孔阴离子树脂上，脂肪酶活力回收率达到4 8 3 ，半衰期为3 6 0 h 。此法优点 是操作简便、固定化过程温和、酶活力回收率高、载体易再生；缺点是酶和载体 的结合力较弱，酶易受外界因素的影响而脱落。 1 3 2 2 凝胶化法 哟各一 图1 - 1 吸附法示意图 f i g 1 - 1s c h e m a t i cd i a g r a mo fa b s o r p t i o nm e t h o d 用特定的超滤膜对酶溶液进行超滤时，由于酶分子不能透过膜而在膜表面沉 积，当膜液两相界面处酶蛋白的浓度达到凝胶化浓度时，酶便以一薄凝胶层的 形式固定在膜的表面( 如图1 2 所示) 。p r o n k 5 8 j 将脂肪酶溶液超滤，借助浓差极 化在纤维素膜表面形成了脂肪酶凝胶层。这一方法固定的脂肪酶由于处于微细环 境中，稳定性高，有效地保留了酶的活性和专一性。此外，由于胶层中酶的浓度 较高，因而催化反应的转化率较高。但此种方法也存在一定的不足，由于膜表面 形成的脂肪酶凝胶层的存在，增大了过膜阻力，不利于反应产物的分离。 过 滤 方 向 0 0 0 0 图1 2 凝胶化法示意图 f i g 1 - 2s c h e m a t i cd i a g r a mo fg e lm e t h o d l o 北京化_ t 火学顾f ：学位论文 1 3 2 3 包埋法 包埋法可分为网格型和微囊型。将酶分子包埋于高分子凝胶细微网格中的称 网格型；将酶包埋在高分子半透膜中的称微囊型( 如图1 3 所示) 。w o n 掣 j 用 海藻酸盐对脂肪酶进行包埋法固定化，得到的固定化酶具有很高的催化活性。鲁 玉侠等唧】以海藻酸钠为载体，用包埋法制各固定化脂肪酶。在6 0 下加热固定 化脂肪酶和游离脂肪酶1 5 h ，固定化酶活力仅损失3 0 ，而游离脂肪酶的酶活只 为原来的1 8 。