（基础兽医学专业论文）保加利亚乳杆菌超浓缩培养及生物学变化规律.pdf

摘要 摘要 保加利乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sb u l g a r f c u s ，lb ) j “泛麻刚r 食品发酵、i ：业乳酸发酵、 饲料行业和医疗保健领域。乳酸菌的制备依赖丁- 超浓缩培养技术，超浓缩培养的方法很多， 主要有化学中和法、缓冲盐法、吸附法、渗析法、连续培养和膜生物反应器法。必须在合适 的培养条件下、应用合适的培养基和培养方法，掌握培养过程中各种物质的生化代谢规律和 菌体细胞结构等的变化规律，才能真正实现保加利弧的超浓缩培养。 本实验应用草冈素试验对适合保加利距乳杆菌超浓缩培养条件( 温度、初始p h 值和培 养方式) 进行了筛选，确定最适的培养条件为：4 l 、初始p h 值为6 6 、在微氧条件下进行 培养。利_ j 正交试验分别对m r s 培养基中主要营养物质( 葡萄糖、蛋白胨、牛肉粉、酵母 浸粉) 、盐类( 柠檬酸二铵、磷酸氢一钾、乙酸钠、m g s 0 4 7 h 2 0 、m n s 0 4 4 h 2 0 ) 和生长冈 子( 谷氨酸、麦芽汁、番茄汁) 进行优化，确定适合保加利弧乳杆苗超浓缩培养最佳的培养 基配方( 以10 0 0 m l 中的含鼍为标准) ：蛋向胨1 5 9 、牛肉粉1 0 9 、酵母浸粉7 5 9 、葡萄糖3 0 9 、 柠檬酸_ 二铵2 2 5 9 、磷酸氢二钾1 5 9 、乙酸钠6 9 、m g s 0 4 7 h 2 00 4 8 9 、m n s 0 4 。4 h 2 0o 3 5 9 、 谷氨酸o 5 9 、麦芽汁8 0 m l 、番茄汁5 0 m l 、吐温8 0l m l ，调p h 值为6 6 加水至10 0 0 m l ， 1 2 1 灭菌t 5 m i n 。试验证明在2 2 h 采j j 微孔滤膜过滤二次培养，并对二二次培养的培养基中葡 萄糖和蛋白质进行优化是适合保加利弧乳杆菌的超浓缩培养方法，并在2 8 1 1 活菌数达到最高， 为1 0 0 1 1 0 ”e f u m l 。利用试剂盒全面测定了超浓缩培养过程中培养液中的氨基酸、葡萄糖、 蛋白质、甘油二酯、胆同醇、乳酸和乳酸脱氢酶以及菌体细胞内乳酸脱氢酶、脂肪酶活力的 变化规律，它们都与保加利亚乳杆菌的生长、微孔滤膜过滤和二次培养有关，随着菌数的增 火，营养物质分解增强，代谢产物增多。利负染色法和超薄切片法系统地观察了保加利 乳杆菌超浓缩培养过程中不同时期( 培养1 4 h 、2 2 h 、2 8 h 、3 2 h ) 菌体形态和内容物变化规律， 利用荧光细胞凋亡试剂盒研究了保加利弧乳杆菌超浓缩培养过程中不同对期( 培养1 4 h 、2 2 h 、 2 8 h 、3 2 h ) 的细胞凋亡情况，它们均与菌体生长、产酸规律和能量变化规律密切相关，从对 数生长前期到对数生长顶点，菌体浓度小、营养物质丰富和乳酸含量低的情况r ，菌体细胞 壁、内容物和凋亡情况基本没有变化；从稳定期到衰亡期，菌体浓度人、营养物质耗竭和乳 酸含量较高，出现了细胞壁的严重皱缩、溶鳃，内容物形状、数量发生了严重的变化和凋亡 的菌体数明显增多。 本研究实现了保加利亚乳杆菌的超浓缩培养，在超浓缩培养过程中的生化代谢规律与其 基本生化代谢规律相一致，菌体利h j 糖、蛋白质和脂肪供其生长所需，并产生代谢废物。超 微结构变化与菌体生长、产酸规律和能量变化规律密切相关。在超浓缩培养过程中可能存在 细胞凋亡。 关键词保加利亚乳杆菌：超浓缩培养；生化代谢；超微结构：细胞凋亡 v 东北农业大学农学硕十学位论文 s u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o na n db i o l o g i c a lc h a n g e so f l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s a b s t r a c t l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i e u s 犯b ) i sw i d e l ya d o p t e di nf o o df e r m e n t a t i o n ，t h ep r o d u c t i o no f l a c t i c a c i di ni n d u s t r y , a n i m a lf e e d sa n dt h ef i e l do f m e d i c a lc a r e t h ep r e p a r a t i o no f l a c t i ca c i db a c t e r i ai s d e p e n d e d o nt h et e c h n i q u eo fs u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o n t h e r ea r es o m em e t h o d so f s u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o n ，i n c u l d i n g m e t h o do fn e u t r a l i z a t i o n ，m e t h o do fb u f i e rs a l t m e t h o d ，m e t h o do f a d s o r p t i o n ，m e t h o do f d i a l y s i s ，c o n t i n u o u si n c u b a t i o n ，b i o r e a c t o ro f m e m b r a n e i n t h e s em e t h o d s ，t h eb i o r e a c t o ro fm e m b r a n ei san e w , h i 【g hp e r f o r m a n c em e t h o dd e v e l o p e di nt h e s e y e a r s ，b u tt h ea p p l i c a t i o ni sc o n f i n e db e c a u s eo fe x p e n s i v ee q u i m e n t sa n db e i n gc o m p l i c a t e dt o m a k e i fw ew a n tt oo b t a i nt h el a c t i ca c i db a c t e r i aw i t hh i g hd e n s i t ya n da c t i v i t y ，t h eb a c t e r i am u s t b ec u l t u r e di ns u i t a b l ec u l t u r ec o n d i t i o n s ，a d o p t e ds u i t a b l em e d i aa n dm e t h o d s i ft h ec h a n g e so f b i o c h e m i c a lm e t a b o l i s mo fa 1 1k i n d so fm a t e r i a l sa n dt h eu l t r a m i e r o s t r u c t u r ec a nb em a s t e r e d ，t h e r e a ls u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o no f l 占c a nb e c o m el u r e t h ec o n d i t i o no fl6f o rs u p e r c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o nw a sa c h i e v e db ys i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n t ( t e m p e r a t u r e t h e n i t i a lp ha n dt h em e t h o d so f c u l t u r e ) a n dt h er e s u l t sw e r e ：4 1 、 t h ei n i t i a lp h6 6 ，f e wo x y g e n t h em a i nn u t r i t i v em a t e r i a l s ( g l u c o s e ，p e p t o n e ，p o w e r b e e f , p o w e r o f y e a s t ) ，s a l t s ( d i a m m o n i u mc i t r a t e ，d i b a s i cp o t a s s i u mp h o s p h a t e ，s o d i u ma c e t a t e ，m g s 0 4 。7 h 2 0 ， m g s 0 4 7 h z o ) a n dg r o w t hf a c t o r s ( g l u t a m i ca c i d ，m a s h ，t h e j u i c eo f t o m a t o ) i nm r sc u l t u r eo f l bf o rs u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o nw e r er e s p e c t i v e l yo p t i m i z e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，a n d t h er e s u l t sw e r e ( i n10 0 0 m l m e d i u m ) ：p e p t o n e1 5 9 ，p o w d e ro fb e e f1 0 9 , p o w d e ro fy e a s t7 5 9 ， g l u c o s e3 0 9 , d i a m m o n i u mc i t r a t e2 2 5 9 , d i b a s i cp o t a s s i u mp h o s p h a t e1 5 9 ，m g s 0 47 h 2 00 4 8 9 ， m n s 0 4 4 h 2 00 3 5 9 , s o d i u ma c e t a t e6 9 ，g l u m a t i ca c i do 5 9 ，m a s h8 0 m l ，t h ej u i c eo f t o m a t o5 0 m l ， t w e e n - 8 01 m l ，p h6 6 ，w a t e r1 0 0 0 m l ，s t e r i l i z i n ga t 1 2 1 f o rj 5 m i n t h em e t h o do f m i c r o - f i l t r a t i o nm e m b r a n ea n dt h es e c o n dc u l t u r ew e r es u i t f u lf o rs u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o n o f l ba t2 2 h a n dt h eg l u c o s ea n dp e p t o n ei nm e d i u mf o rt h es e c o n dc u l t u r ew a so p t i m i z e dt h e m a x i m a ld e n s i t yo fb a c t e r i aw a s1 0 0 1 1 0 。o c f u m la t2 8 h t h ec h a n g e so fa m i n oa c i d ，g l u o s e ， p r o t e i n ，t r i g l y c e r i d e ，c h o l e s t e r o l ，l a c t i ca c i d ，l d hi nc u l t u r ea n dl d h ，l y p a s e ，a m i n oa c i di nc e l l s w e r ed e t e c t e db yk i t sr e s p e c t i v e l y a n dt h e s ei n d e x e sh a dt h er e l a t i o n sw i t ht h eg r o 州ho flb ，t h e m i c r o f i l t r a t i o nm e m b r a n ea n dt h es e c o n dc u l t u r e t h ec h a n g e so f f i g u r e sa n dc o n t e n t so f lbw e r e s y s t e m a t i c a l l yo b s e r v e db yn e g a t i v es t a i n i n ga n du l t r a m i c r o t o m yt e ma tt h ed i f f e r e n tt i m e ( 1 4 h ， 2 2 h ，2 8 h ，3 2 hi nc u l t u r e ) d u r i n gs u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o n t h ea p o p t o s i so flbw e r ed e t e c t e d b y ns i t uc e l td e a t hd e t e c t i o n 砌，f l u o r e s c e n ta tt h ed i f f e r e n tt i m e ( 1 4 h ，2 2 h ，2 8 h ，3 2 hi nc u l t u r e ) d u r i n gs u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o n t h e yw e r ec l o s e l y r e l a t e dt ot h eg r o ho f 三b ，e n e r g y c h a n g e sa n dt h er e g u l a r i t i e so fl a c t i ca c i dm a k i n g t h ec e l lw a l l ，c o n t e n t sa n da p o p t o s i so f t h ec e i l s h a dl i t t l ec h a n g e sw h e nt h el a c t i ca c i dc o n t e n tw a sl o w e r , p l e n t i f u ln u t r i t i v em a t e r i a l sa n dl o wc e l l d e n s i t yd u r i n ge a r l yl o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s e ；t h ec e l lw a l l sw e r es e v e r e l yc r i m p l e ，d i s s o l v a t i o n ， t h es h a p ea n dq u a n t i t yo ft h ec o n t e n t so f 三6h a ds e c e r e l yc h a n g e sa n dt h ea p o p t o s i so fb a c t e r i a w e r em o r ea n ds e r i o u sw h e nt h el a c t i ca c i dc o n t e n tw a sh i g h e rd u r i n gd e c l i n ep h a s e t h es u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o no flbh a s b e i n ga c h i e v e d i nt h i s e x p e r i m e n t t h e r e g u l a r i t i e so fb i o c h e m i s t r ym e t a b o l i s mo fl 6i ns u p e r c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o na r et h es a m ea st h e f u n d a m e n t a lb i o c h e m i s t r ym e t a b o l i s m t h e ya l ld e c o m p o s eg l u c o s e ，p r o t e i na n dt r i g l y c e r i d ea n d f o r mt h eb a c t e r i a , g e n e r a t em e t a b o l i cw a s t e ，t h ec h a n g e so fu l t r a m i c r o s t r u c t u r eo flbh a sc l o s e l y r e l a t i o nt ot h eg r o w t ho flb ，t h el a c t i ca c i dm a k i n ga n dt h ee n e r g ym e t a b o l i s m t h ea p o p t o s i so f bp r o b a b l ye x i s td u r i n gs u p e r c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o n k e yw o r d sl a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u ss u p e r c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o mb i o c h e m i c a lm e t a b o l i s m u l t r a m i c r o s t r u c t u r e ：a p o p t o s i s v p o s 咯r a d u a t e ：l ix i a s p e c i a l i t y ：b a s i cv e t e r i n a r ys c i e n c e s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f g a ox u e j u n 1 1 保加利亚乳杆菌简介 1 1 1 保加利亚乳杆菌在细菌分类学上的地位 保加利亚乳杆菌在细菌分类学上的位置属丁裂殖菌纲真细菌目( e u b a c 把r & l e s ) 、乳杆 菌科( l a c t o b a c i l l a c e a e ) 、乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、德氏乳杆菌种( l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i i ) 中的德氏乳杆卤保加利亚亚种( l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s ，三6 ) ，本菌以前的 分类名称为保加利亚乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s ) 、嗜热发酵菌( b r e e dr s 等，】9 5 7 ) 。 1 1 2 保加利亚乳杆菌的特征 保加利亚乳杆菌里棒状，一般呈k 、人链。不运动无芽孢，革兰氏染色阳性，保加利 亚乳杆菌的透射屯镜照片见图1 一l 。生殖方式为裂殖。微蚶氧。在同体m r s 琼脂平扳上生k ， 翦落呈白色半透明菜花状大菌落，边缘旱锯齿状，见图1 - 2 。专性同型发酵，通过糖酵解途 径产生乳酸，且8 0 以上为d ( + ) 型乳酸。 图1 1 三b 的透射电镜照片图1 2e6 的曲落形态照片 f i g l - 】t h et e mp h o t oo f l 6f 培1 - 2t h ep h o t oo f c o l o n i a lm o r p h o l o g yo f l b 不发酵乳酸盐，不液化明胶，不分解酪素，不产生吲哚和硫化氢，接触酶阴性，无细胞 色素，联苯胺反应阴性( 凌代文，1 9 9 9 ) 。保加利亚乳杆菌的营养要求复杂，需要氨基酸、肽、 盐类、脂肪酸或脂肪酸脂类和可发酵的碳水化合物。 保加利亚乳杆菌的最适温度3 7 - 4 2 c ，2 0 隧f 不能生长，6 0 6 c 就可以被杀死- 耐酸， 通常生长所需的p h 值为5 , 5 6 ，2 ，一般在p h5 或更低的情况f 可生长，在碱性条件下生艮 不良或不能生长( 郭本恒，2 0 0 1 ) 。 1 2 国内外研究概况、研究水平及发展趋势 保加利亚乳杆菌对人体健康起至关重要的作用，近年来保加利弧乳杆菌的分离鉴定、菌 种选育、人工诱变以及对它的应用研究都受到广泛重视。 在保加利亚乳杆菌的分离鉴定方面，传统的保加利亚乳杆菌的鉴定方法土要依赖丁表型 东北农业人学农学撷j j 学位论文 分析，包括形态学观察( 如菌体细胞观察和菌落观察) 、生长需要及特- 胜、发酵图谱、细胞壁 蛋白分析等。国内的研究主要集中于表型分析鉴定。2 0 0 2 年，斩淼等人用r a p d 对直投式酸 奶发酵剂中的保加利亚乳杆菌和嗜热链球幽进行了分离鉴定，是国内最早对乳酸菌进行的分 子生物学方面的鉴定( 祈淼等，2 0 0 3 ) 。而国外这方面的研究很早，也比较成熟。表型试验的 常规技术并不能对某一菌株作出明确的鉴定( c l a i r ep 等，1 9 9 8 ) 。近年来发展起来的核酸技 术如d n a 杂交和特定靶序列的扩增技术，对乳酸菌的鉴定是一种改善和补充。迄今，晟佳 辨识力的遗传探针是种特异性的；而p c r 技术以及以p c r 为基础的遗传指纹技术和群落分 析技术甚至可以进行高度菌株特异性的乳酸菌鉴定。 在超浓缩培养方面，国内的研究起步较晚。1 9 9 1 年内蒙占轻工研究所高松柏等首次发表 了高效嗜酸乳杆菌发酵剂的研究报告随币人们才开始对其进行具体的探讨和研究。国外的 这方面研究较早，也很深入，已由原来的缓冲盐培养发展剑现在的比较成熟的膜生物反应器 的应用。 在应用方面的研究国内外的研究都很多，也都很具体。从传统的食品发酵剂、饲料青贮、 饲料添加剂等到现在的医疗保健承j 业乳酸生产等方面的应用，都有了十分具体的研究。现 在研究的热点是集中于在这些方面应用过程中的安全性问题，尤其是在饲料和医疗保健方面 的安全性研究的最多，土要集中在乳酸菌与别的药物绒免疫制剂的配伍使尉等方面( 刘一尘 等，2 0 0 2 ) 。 关于乳酸菌的代谢方面的研究是很早也很全面的，但是都是在常规培养条件下的生化代 谢规律。而对于超浓缩培养过程中的生化代谢规律的研究主要集中在乳酸的产生规律上。这 也与乳酸 ：业上的重要作用分不开( f r e i d m a ne r 等，2 0 0 0 ； s u n h o o o nk 等，2 0 0 1 ：c h i a r a s 等，2 0 0 2 ) 。保加利亚乳杆菌的超微结构的研究主要是细菌细胞凋亡的研究，在国内和国外 都有一定的研究，研究的对象是大肠杆菌( k i ml ，2 0 0 0 ；成大荣等，2 0 0 3 ) 。而乳酸菌细胞 捅亡的研究国外还未见报道，国内仅见本试验室发表的关丁 嗜热链球菌的超浓缩培养过程中 细胞凋亡的报道( 高学军等，2 0 0 4 ) 。 关于保加利亚乳杆菌基因组学的研究还不多，迄今为l r ，g e n e b a n k 只收录了保加利亚乳 杆菌a t c cb a a 3 6 5 菌株的不完整的基因组序列，主要的分解代谢、合成代谢、遗传复制的 主要酶的基因组序列都已经确定，但是一些功能性基因组序刘有特避一步舵验究。确定了保 加利亚乳杆菌质粒p l b b l 完整的基因组序列，它的基因组由6 1 2 7 个碱基对组成，g c 含量 为4 4 8 ，不含s s d n a ，不能进行滚环复制。存在4 个均大于1 0 0 个氨基酸残基的开放的阅 读框架( o p e nr e a d i n gf r a m e s ，o r f s ) ，o r f a 与解螺旋酶的功能相似，o r f b 和o r f c 分 别与流动蛋白和转座酶的功能有一定的相似性( a z c a r a t e - p e r i lm a 等，2 0 0 2 ) 。 1 3 超浓缩培养的研究 超浓缩培养，就是采用合理的实验技术和方法，在合适的培养基中，在适宜的条件f 进 行微生物的培养，最终使菌体的浓度达到超出正常培养的i 2 个数量级的培养方法( 陈坚等。 2 0 0 3 ) 。从理论上讲，只要营养物充足、无生长抑制物的积累，微生物的生长在空间上不受限 制时微生物将持续生& 。导致微生物生长减速或停i r 的原闪是营养物的枯竭、生长抑制物的 积累或二者兼有。若能克服这两方面的影响，就可是实现菌体的超浓缩培养。 1 3 1 物理条件的研究 对物理条件的研究主要是培养温度、对氧气的需求和初始p h 值三方面。对温度的研究 很多，由于来源不同、菌株不同和培养基等不同，所以最合适的培养温度方面有一定的著异。 吕加平等( 1 9 9 9 ) 研究了来源于酸奶的保加利亚乳杆菌的虽适合的培养温度为3 t c ：黄良吕 等、c h i a r a s 等( 2 0 0 2 ) 研究的培养温度为4 0 ；吕兵等( 2 0 0 2 ) 研究的保加利弧乳杆曲最 适合的培养温度为4 2 * ( 2 ；熊晓辉等( 2 0 0 4 ) 研究了来源丁泡菜发酵的保加利证乳杆菌最适合 的培养温度为3 7 。 从国内外的研究报道可以看出，保加利弧乳杆菌超浓缩培养过程中对氧气的需求均是在 微氧条件下( 张兰威，2 0 0 2 ：c h i a r as 等，2 0 0 2 ) ，菌数能达到最高。 在初始p h 值方面的研究，存在一定的差异。可能是由丁- 菌株来源不同、培养温度不同、 培养基不同和种子活性不同等引起的。吕兵等( 2 0 0 1 ) 研究的晟适初始p h 值为6 3 ：黄良昌 等( 2 0 0 2 ) 研究的撮适初始p h 值为5 8 ：张兰威( 2 0 0 2 ) 研究的最适初始p h 值6 2 ；熊晓辉 等( 2 0 0 4 ) 研究的最适初始p h 值为6 5 ；c h i a r as 等( 2 0 0 2 ) 研究的最适初始p h 值为6 5 。 1 3 2 培养基的研究 培养基是提供超浓缩培养过程中的营养物质，所以它对超浓缩培养的影响也是很人的。 由于超浓缩培养基的研究较多，也有很大差异，表i 1 列出了近儿年国内芙丁二超浓缩培养基 组成的研究和达到的最高菌数。从表1 - 1 可以看出，以m r s 培养基为基础培养基进行优化， 菌数都在1 0 9 以上，而以脱脂乳为基础培养基的优化培养基，培养的曲数均在1 0 8c f u m l ， 史嫒英等( 1 9 9 9 ) 以脱脂奶粉为基础培养基培养的保加利砸乳杆菌虽高茁数达剑2 5 8 1 0 c f u m l ，是由于在培养过程中采用了补料( 培养4 h 后添加2 乳糖) 培养的方法。国外对培 养基的研究很少，基本上都是在m r s 培养基础上进行的改良，研究其中的一种或者儿种特 定的成分 表1 - 1 国内对适合保加利亚乳杆菌超浓缩培养基的研究 t a b l e l - 1t h er e s e a r c ho f m e d i ao ns u p e r - c o n c e n t r a t e di n c u b a t i o no f lbi nc h i n a 东北农业人学农学碗i ：学位论文 对菌体生长的影响，如c a t e r i n e t w ( 1 9 8 3 ) 研究了c a 2 + 和m 9 2 + 对保加利皿乳杆菌生长的促 进作用：j u i l l a r dv d ( 1 9 9 5 ) 研究了在保加利亚乳杆菌培养过程中寡肽是其主要利用的氮源； g a u d r e a uh ( 1 9 9 9 ) 研究了酵母浸出物对保加利亚乳杆菌生跃促进作i 喟的本质：l a h ap 等 ( 2 0 0 1 ) 研究了脂肪和脂肪酸作为生k 闪子促进保加利亚乳杆菌生长。 1 3 3 培养方法的研究 保加利弧乳杆菌是产物抑制型发酵，发酵产生的乳酸严重影响保加利砸乳杆菌的进一步 增殖，要想实现保加利弧乳杆菌的超浓缩培养，必须除去发酵液中的乳酸，国内外关于保加 利亚乳杆菌的超浓缩培养的方法，都是围绕着除去发酵液中的乳酸来进行的。关于保加利亚 乳杆菌的浓缩培养，国内外一般采用如r 儿种方法。 1 3 3 1 化学中和法 保加利乳杆菌在生长繁殖过程中，代谢葡萄糖产生乳酸。随着酸度的升高p h 值的降 低，菌体生氏受到抑制。为了解除乳酸对保加利弧乳秆凶的生长抑制作瑚，通常采_ l 中和剂 来中利培养液中的乳酸。常用的中年剂有n a o h 、n h 3 h 2 0 、c a ( o h ) 2 、n a c 0 3 等。l o u b i e r e p 等认为n h 3 - h 2 0 的效果最好( l o t t b i e r ep 等，1 9 9 7 ) 。在中和培养过程中，由丁乳酸盐浓度 的不断增加，当它达到一定水平时，仍会抑制菌体的生跃繁殖。 1 3 3 2 缓冲盐法 向培养基中添加缓冲盐，调节培养液中的酸在一定范围内变动，不致酸度过高，可促进 菌体生f 受及繁殖。缓冲剂，有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐和c a c 0 3 等，国际上也有人利用乳 本身蛋自质和磷酸盐。在缓冲盐法浓缩培养的研究中，美国和意人利处于领先地位，但其缓 冲盐配方属于专利保密。t i n e k e h 等人曾用质量分数为2 0 2 9 的超滤浓缩奶和脱脂乳作 为培养液，利用高浓度的蛋向利磷酸盐达到缓冲效果( 山丽杰等，2 0 0 2 ) ：高松柏等人曾在质 量分数为5 的脱脂乳水解液培养基中和质量分数为1 2 脱脂乳培养基中分别加入缓冲盐a 和缓冲盐b ，4 0 培养8 h 和6 h 乳酸菌活苗数分别达剑22 1 0 9 c f u m l 和6 5 1 0 c f u m l 娃不加缓冲盐培养基的3 倍和6 倍( 高松柏等，1 9 9 1 ) ；吕兵等人在含有质昔分数为0 3 的 酵母膏、质量分数为0 1 的吐渝8 0 的1 2 ( 质繁分数) 脱脂乳培养基中，加入质量分数为 o 5 的k 2 h p 0 4 作为缓冲盐，4 2 培养4 h ，乳酸菌活凶数达到2 9 1 0 c f u m l ，是起始培 养基的2 倍以上，在此基础上，添加质量分数为3 0 的n a z c 0 3 作为中雨剂，控制培养基p h 值为6 3 ，4 2 培养6 h ，乳酸菌活菌数达到5 8 9 x1 0 。c f u m l ，较起始培养基的活菌数提高 4 5 倍( 吕兵等，1 9 9 6 ) ；冯友军等( 2 0 0 3 ) 应用】o 柠檬酸( 钠) ，5 乙酸( 钠) 和2 丙 酮酸钠按一定比例复合而成的缓冲体系使lb 菌体培养的发酵终浓度从22 2 1 0 s c f u m l 提高 到1 3 2 x1 0 c f u m l 。由此看出，利用缓冲盐和化学中和法进行乳酸菌的浓缩培养，菌体的增 殖效果显而易见，但是要想达到很高的浓度也很困难，囡为缓冲盐的缓冲的作用是有一定范 围的，况且高浓度的盐也会抑制菌体的生k 。 1 3 3 3 吸附法 用合适的吸附剂通过吸附除去培养液中的乳酸等小分子有机酸来维持p h 值的稳定。 a r a d h a n as 等用离子交换树脂来除去培养液中的乳酸，但是它也除去了培养基中重要的阴离 子，对菌体生k 不利( a r a d h a n as 等，1 9 9 2 ，d a v i d s o nb h 等，1 9 9 2 ) 。c h e nc c 等利用聚 4 引言 乙烯吡啶( p o l y v i n y l p y r i d i n e ，p v p ) 和活性碳来除去培养基中的乳酸，但是p v p 很昂贵，同 收一次活性就丧失1 4 。活性碳不但吸附乳酸，而且也吸附少量菌体细胞。采用活性碳杜固 定化，可以避免对菌体细胞的吸附( c h e nc c 等，2 0 0 2 ) 。张兰威则试验了用d 3 0 1 叔胺型树 脂来吸附培养液中的乳酸盐( 张兰威，2 0 0 2 ) 。 1 3 3 4 渗析法 渗析法，也称过滤培养法，是利用膜技术，选择合适的膜孔径来浓缩菌体。原理是向培 养液中添加新的营养液，乳酸菌代谢产物则通过膜除去，促使乳酸菌繁殖。此法培养的乳酸 菌浓度可达到1 0 ”c f u m l ( r i e s e n b e t g d 等，1 9 9 9 ) 。这种方法尽管达剑了较高的齿体浓度， 但设备投资人，对滤膜材料的要求比较严格，同时在培养过程中易感染噬菌体一r 业上应用 并不广泛。 1 3 3 5 连续培养 连续培养又称连续发酵，是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同 的速度流出培养基，从而使发酵液总量维持恒定，使培养物在近似恒定状态下生长的微生物 培养方式( 陈坚等，2 0 0 3 ) 。法国b i l i lb 等人于1 9 9 2 曾对乳脂链球菌( s t r e p t o c o c c u sc r e m o r i s ) 进行了连续培养，指出菌的生长情况受乳酸的抑制作捌及营养物提取的影响，菌体浓度达不 到很高。h a y a k a w a 等( 1 9 9 0 ) 年报道t s l 酪乳杆菌的浓缩培养基和抗熟的有机膜交叉流过滤 和发酵连续补料率为0 3l 1 ，3 4 h ，需要2 1 4 l 新鲜的培养基，细胞干重达到4 0 9 l 。 1 3 3 6 膜生物反应器 膜生物反应器( m e m b r a n eb i o r e a c t o r ) 是高效膜分离技术，是由膜组r 陶j 生物反应器构 成。用于乳酸菌超浓缩培养的膜生物反应器实质上就是个发酵灌，偶联麒过滤系统、在线 的葡萄糖检测、乳酸检测、蛋白质检测、p h 值检测和氧通量等检测装置，通过计算机来整体 控制。这些反应器允许培养基交换，并在阻i r 乳酸积累引起的生长抑制方面起到了很好的作 用。用搅拌陶瓷膜生物反应器可以使乳酸乳杆菌的产率达到1 4 0 9 l ( 每g 干细胞重相当于1 , 9 o d 6 0 0 ，4 0 9 ，l 于细胞重相当于1 0 ”c f u m l ) 。c h i a r as 等( 2 0 0 3 ) 应用偶联了葡萄糖、氧通量、 p h 值、蛋白质检测期的生物反应器，在3 7 。c 、p h 值6 5 、初始搅拌速率为1 0 0 2 0 0 r m i n 、 氧通量为o ，2 o 5 l m i n ，使氧的分压保持在4 的条什f 对保加利亚乳杆菌进行了培养，使 细胞干重高达2 8 0g ，l ( c h i a r as 等，2 0 0 3 ) 。 膜生物反应器是目前效果最理想的超浓缩培养方法。但是由于设备昂贵技术复杂一般 的中小企业是承担不起的。国内还没有发现这方面的研究报道。 1 4 保加利亚乳杆菌培养过程中的变化 1 4 1 生化代谢规律的研究 在普通培养条件一f $ l 酸菌的分解代谢和合成代谢的研究都很透测、全面，己清楚了糖、 蛋白质、氮基酸和脂类等的分解代谢和合成代谢。葡萄糖是保加利亚乳杆菌体| l 最重要的碳 源和能源。因而分解葡萄糖产生能量在保加利亚乳杆【誊细胞代谢中是极为重要的。保加利亚 乳杆菌对葡萄糖的分解是通过发酵来实现的。发酵的起始阶段是糖酵解，是氧化葡萄糖产生 丙酮酸的过程，糖酵解中的醛缩酶催化六碳葡萄糖裂解生成3 - 磷酸甘油醛和磷酸- 二羟丙酮两 东北农业大学农学烦1 学位沦文 个三碳糖，这些糖然后进一步被磷酸甘油酸激酶等一系列酶氧化秆放能龉，同时在丙酮酸激 酶作用下进行原子的重排而形成两分子丙酮酸，然厉在乳簸脱氢酶作用下生成两分子的乳酸。 在超浓缩条件f 的糖代谢的研究主要集中在其转变成乳酸规律的研究上，研究的很深入、具 体。超浓缩条什下乳酸的产生规律是伴随着超浓缩培养技术发展而发展的，田为耍想实现超 浓缩培养晟必须的条件就是除去发酵液中的乳酸，所以对乳酸的产生规律研究的很深入，包 括各种不同条件r 的乳酸产生规律( c h i a r as 等，2 0 0 2 ) 。对合成乳酸的关键酶乳酸脱氢酶研 究很深入，对其蛋白质结构、基囚结构、生成乳酸时的调控机制、乳酸脱氢酶基因的克隆与 表达、以及选育乳酸脱氢酶的高产菌株等都进行了详细的研究( 李健等，2 0 0 4 ) 。 乳酸菌的蛋白质和氨基酸的代谢与它的蛋白水解系统是密不可分的。乳酸菌的蛋白质水 解系统已经从遗传、生化和超微结构方面详细地研究过( p r i t c h a r dg g 等，1 9 9 3 ) 。蛋白水解 系统由胞外定位的丝氨酸蛋白酶、特殊的三肽和寡肽的转运系统和人晕的胞内的肽酶组成。 近年来点突变技术的发展使在体内研究这些单个酶和多酶组合体成为可能。蛋白水解系统主 要的特征是：( 1 ) 蛋白水解酶的特异性不强，能释放人量不同的寡肽，大部分是4 - - 8 个氨基 酸残基的寡肽；( 2 ) 寡肽的运输是氮源进入细胞内的主要途径：( 3 ) 所有的肽被定位，积累 的肽被完全降解( k u n j ie r 等，1 9 9 6 ) 。从保加利孵乳杆茁b 1 4 菌株中分离纯化得j f o ) l 十肽 链内切酶、氨基酸肽酶。从保加利弧乳杆菌和嗜热链球曲中分离得到了具有活性的1 谱性的 金属离子依赖型氦基酸肽酶，这包括_ 二肽酶、二肽酶和呃氨基肽酶等( s h i h a t a a 等，2 0 0 0 ) 。 脂肪酶，即甘油酯水解酶，是分解脂肪的主要酶。保加利砸乳杆菌与其它细菌( 如假单 照菌属、芽孢杆菌属等) 相比，其酯水解能力很弱。在乳制品中主要是提高产品的性质、形 成风味物质、加速奶酪的成熟等。迄今为止还没有芙丁保加利乳杆菌脂肪酶的研究报道。 k a t zm 等( 2 0 0 2 ) 等测定了从羊奶和奶酪中分离的乳酸菌的脂肪酶的活力：a d a m i t s e hb f 等 ( 2 0 0 3 ) 研究了高密度培养条件f 扩展短杆菌的脂肪酶结构组成；m e d i n ar b 等( 2 0 0 4 ) 年 研究了益生菌中的脂肪酶水解三酰甘油使z 成为短链或中链的脂肪酸( 主要是c a c ，4 ) ，可 被一些代谢紊乱、营养不良的老人和婴儿吸收。 1 4 2 超微结构观察 国内外对乳杆菌的电镜学观察主要集中在观察细胞膜的完整性上，很少提到细胞器和细 胞内容物变化。甲- 期对保加利乳杆菌的超微结构的观察是通过扫描电镜来进行。扫描电镜 只能看到菌体形态、表面的结构和细胞的完整性方面。对细胞膜的研究已经很详细、具体， 包括细胞膜的结构、组成、流动性、通过细胞膜进行的物质转运和排泄等。刘振明等人( 2 0 0 2 ) 研究了在添加冻干保护剂时乳酸菌在冻干情况下的形态变化，发现在冻干状态f 菌体细胞发 生了断裂、细胞膜破损等现象；u m e d aa 等人1 9 9 9 用扫描电镜观察了酿脓链球菌 ( s t r e p t o c o c c u s p m o 咖斑) 细胞分裂时细胞擘合成的限定部位和合成过群。但是戈丁卣体 内部结构的研究很少，龙小海( 2 0 0 2 ) 利用磷钨酸悬滴法负染色法观察链球菌形态变化和细 胞壁和核物质的变化；s t a n l e yc h 等人2 0 0 0 通过超薄切片电镜观察了大肠杆菌分裂期的细 胞膜、细胞壁和核物质：t u r n e rf r 等人2 0 0 1 用超薄切片电镜观察了细菌内部的一种能量贮 存物质聚b 羟丁酸( p o l y - 1 3 一h y d r o x y a l k a n o a t e ，p h b ) 的存在，它是一种由1 3 一羟基丁酸单 位组成的类似于脂类的复合物。这个酸的单体以酯键联接形成一条长的p h b 多聚体，这些多 6 聚体聚集起来形成颗粒，它是细菌体内常见的能量贮藏复合体( m a d i g nm t 等，2 0 0 4 ) k e l l e n b e r g e re 等人2 0 0 1 用超薄切片电镜观察了人肠杆菌细胞内拟核的分布和形状，并对拟 核进行了染色( j e r e m ym 等，2 0 0 2 ) 。迄今为i i - ，国内外尚没有见到采片j 透射电镜系统地观 察保加利亚乳杆菌在超浓缩培养过程中菌体细胞形态和内容物变化的研究报道，另外对茵体 形态变化的原冈及规律的探讨也很欠缺。 1 4 3 细胞凋亡的研究 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 或“细胞程序陛死亡”( p r o g r a m m e d c e l ld e a t h ，p c d ) 是细胞在伤 失生理功能或严重受损时，细胞古| 有生理、生化反应或者某种酶的活化导致细胞北亡。在多 细胞真核生物中，程序性的细胞死亡是由细胞表面的死亡受体介导，通过一系列的、p 胱氮酸 蛋白酶( c a s p a s e s ) 作用而启动，维系个体结构稳定、功能平衡和生艮菱育所必需的基本生物 学过程。一般存在于个体的发育过程