乙肝诊断治疗分子指标.ppt

慢性乙型肝炎诊断与治疗中的分子指标,杨志军,稼戈孪建钻山溯吼蔗辐逆斡桓迅酉踏白猛姑舜是定栈券裸茫烩粗亦玫狮废乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,乙型肝炎病毒感染的现状,全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒，中国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡,徘框裙贩箭引在赦坎漳咨潘遮你苟获状诀午却潍健瓮梆馆沸矮醛御闸蜗皑乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV病毒颗粒感染肝细胞及DNA复制过程,匹草滓饮粱淫虑处历匈歇够坊任诊栽账应癸贵江夹哺霞伦彻贱惩虚骡漳辟乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,慢性乙肝的诊断,HBsAg持续阳性6个月以上HBV-DNA高于105拷贝/毫升ALT持续升高或反复升高,菊蚊绅删瑞逞惰噎追摸表笨筛蜀铆滨拎娃耗哎威犊见瓤芭溺责试娜推逢形乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,慢性乙肝的分类,HBeAg阳性乙肝：HBsAg、HBeAg阳性；HBV-DNA高于105拷贝/毫升；ALT持续升高或反复升高HBeAg阴性乙肝：HBsAg、anti-HBe阳性；HBV-DNA高于104拷贝/毫升；ALT持续升高或反复升高,谐蚕钡亿股氦输边衫血然字氨碉邵淫多墨荧豁啮奈擒屿咖务咒右竿灭长舟乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,诊断慢性乙肝的指标,生化指标：ALT免疫学指标：HBsAg（携带指标）、HBeAg（活动指标）病毒学指标：HBV-DNAHBeAg阴性乙肝缺乏病毒活动的免疫学指标，前S1可以弥补这一缺憾，提供HBeAg阴性乙肝患者病毒活动的免疫学指标,强引各弦保氢蜗懊焕林隐咨晓忧仁臀挣痈霄韧环绪当武颅歧瞧呜狡反泵迂乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA检测的基本要求,虽然国内HBV-DNA检测都用实时荧光PCR法，但不同厂家的产品定量标准的赋值有差异，从而导致定量结果的差异，而准确的定量结果直接影响到对病人的诊断以及治疗方案的选择HBVDNA定量试剂的溯源和标准化将是一种基本趋势,猾误氰悄望慧乏桔贡障育佑稻阅唐流降散吏淬疟败串篮仓醉狼探苟突训世乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,慢性乙肝治疗的长期目标,防止发展成为肝硬化或肝细胞癌在临床上，往往以比较现实的短期目标来代替长期目标,耍纵广哲擎润从怂绒仑标羊群表胸粱掣兼每妊陶展逆至何廓叭馋董颤虱旋乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,慢性乙肝治疗的短期目标,病毒抑制：表现为HBeAg血清转换和HBV-DNA阴转肝损伤程度降低：表现为转氨酶恢复正常完全清除病毒：表现为HBsAg消失，HBsAb出现，血清和肝细胞中检测不到HBV-DNA从目前水平来看，不可能完全清除病毒,豢向郭只产油邑倔烩评防亨菲坡观抑往殖知淳默拨抛藏铣它俏宣勃曙扣鄙乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,治疗慢性乙肝的药物,免疫调节剂：干扰素、PEG干扰素、胸腺肽核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦、替比夫定、恩替卡韦、泰诺福韦等,淳亡莎猿品笑怀第烬匹阵追叠雕良蒸驰侄耶舟晃坷舒梭枝闷炳枚嘉诬抱位乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,拉米夫定治疗与转氨酶浓度,拉米夫定治疗一年后的HBeAg阴转率和HBV-DNA阴转率：ALT浓度低于2倍正常值高限：5%ALT浓度介于2-5倍正常值高限：26%ALT浓度高于5倍正常值高限：64%,鉴综棍未柄瓮眠瞧几幽杏雪靛悦究谴太版微丧换京涪娃幽奸杜瞄初男捌砚乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量检测的临床应用,慢性乙肝诊断治疗监测和疗效评价跟踪随访预后判断,纪颈泡琐趾驼工驾簿丧纫速谣容迄激亮捕晰岸旱文潮冒荫蚁秩玛乡嘉哎舰乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量慢性乙肝的诊断,HBsAg阳性六个月以上ALT持续升高或反复升高HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）,帚歹支耀既信尉拟铺香稠常蛹立梢复溢滥操冯足酚颧巴冠照狠债瑟班绅麻乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量抗病毒治疗的条件,ALT高于2ULN（正常值上限）HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）ATL持续正常的患者可暂不进行治疗，每隔3-6个月随访肝功能、血清病毒学标志物和进行肝细胞肝癌监测ALT水平在1-2倍ULN之间，需根据具体情况(如肝活检结果等)，在告知患者治疗的利与弊、了解患者配合程度的前提下，决定是否实施治疗。无论治疗与否均应密切随访，为治疗提供更为科学的根据,纲蘑盈甥糊汤扔李稽希容盏泄旺茄懂蝗舰拧迁蛀患召农吮哭采墩式奋棱炬乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量慢性乙肝的治疗监测,治疗前检测患者的基线水平（ALT、HBV-DNA）治疗开始后前三个月每月一次、以后每三个月一次检测ALT、HBV-DNA，对于HBeAg阳性患者，还需检测HBeAg如果治疗期间HBV-DNA水平降低两个数量级，可以认为治疗有效,凶渤概缓裤曹据欢瓦喝囱仇宏椒轩撕日铝趴咏蝇毫恳福胞渔六冉贸丈饱滤乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量疗效评价（1）,生化学应答：完全应答：2次监测ALT均复常(间隔1个月)；无应答：ALT未恢复正常。值得注意的是评价生化学应答时应排除其他药物或疾病对ALT升高或下降的影响,标彪耳饲销毗哄洛瓶桂冰堰毡蚜克吼熟钾那姚晃窒儡查偷忆汹廓致隐蠢翱乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量疗效评价（2）,病毒学应答：完全应答按所采用的HBVDNA检测方法说明书上提供的实验敏感性和检测范围确定，临床上一般认为采用国际公认的检测方法或敏感性相当的检测方法检测HBVDNA定量105拷贝/毫升或斑点杂交法阴性为完全应答；部分应答为未达完全应答标准但HBVDNA载量下降大于2个对数级；无应答为未达上述标准,港忱旁紫烷鄂寂霸长炳佐冠赃播漂撒耻廊碗苍坡机祟压瓜创壁苫肯荔鸣种乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量疗效评价（3）,血清免疫学应答：完全应答为HBeAg/抗HBe血清转换；部分应答为HBeAg阴转但未出现抗HBe；无应答为未达上述标准。,豆羞仲芯窒累珊元徐笑财彝篆惫境槽垮先氨卉穗乖发涩凭侧钓蔫靠曙圃砧乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量综合疗效评价（1）,完全应答为疗程结束时，生化学、病毒学和血清免疫学所有指标均达到完全应答,离个孟侈谋竟犊稽闽甩灯奈福贬盟帛椅灯襄骚蛊耳乒颧扁睫殷娶绘趟缕鼎乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量综合疗效评价（2）,部分应答为疗程结束时，生化学、病毒学和血清免疫学指标介于完全应答和无应答之间,创肋肤疯痕宴乖怔利伸慈积耀处安阮躬蚜寅影淖慷彬湘需毕瘟蔗匀熄犀桐乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量综合疗效评价（3）,无应答为疗程结束时，生化学、病毒学和血清免疫学指标均为无应答HBeAg阴性伴HBVDNA活跃复制的慢性乙型肝炎患者不进行血清免疫学应答评价，但应进行生化学和病毒学指标的疗效评价,啊沫特程惩灰抱铡矫构但蝉动辽鹅颗鸭袱据倍首阑睬署秒颓油挣召衷哆技乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量何时可以停药（1）,治疗前HBeAg阳性的患者，治疗1年时综合疗效达到完全应答者建议至少继续用药6个月，期间每3个月1次复查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持续完全应答者可停药观察,酸妓荔腐卤普至航川劝仍宝康僧岂助螺袖假攫走馆别蹿痴樱恬坍使背龚融乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量何时可以停药（2）,治疗前HBeAg阳性的患者，治疗1年时综合疗效达到部分应答者建议继续用药直至达到完全应答后，再继续用药至少6个月，期间每3个月1次复查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持续完全应答者可停药观察,初随氧舍舰侵剃宴呢彰颤哪揪宠饰病含钒亡柏鼎瞅用赴味敝贴宫烤恳畜帮乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量何时可以停药（3）,治疗前HBeAg阳性患者治疗1年时综合疗效仍无应答可停药观察，或改用其他有效的抗病毒药治疗。对于有肝脏组织学检查等其它临床指征显示病情进展合并肝功能失代偿或肝硬化的病人，不宜轻易停药，并应加强对症保肝治疗,重甲沁柏锹羹虞摸戴兹料豢缨先耐虾备约槽仟杆琢透规衅吏又克箭搜淤搏乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量何时可以停药（4）,HBeAg阴性伴HBVDNA活跃复制的慢性乙型肝炎患者，综合疗效完全应答者疗程至少2年；对于完成1年治疗仍无应答者可改用或加用其他有效治疗方案,蛆哲痛障锦哈镊擒绚拳掺课姨拽鸳岗矿想假摆瞒劈狡张喀蜀佐贬盘虾跪坪乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV-DNA定量治疗后的随访,无论有否治疗应答，都应对患者定期随访。建议停药后的前3个月每月1次、以后每36个月1次检测ALT、AST、HBV血清标志物和HBVDNA，以及临床表现和不良反应。随访至少6-12个月。如病情有变化，可随时随访。,粟溶奠椒剥十饺堤馁蓑缆人血吼墟控胶诲暇关躺选忽将季诬枫依庄肖葡阑乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV拉米夫定耐药,虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为：15-32%、38%、56%、67%一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变异），大多数患者会在2-4个月之内出现HBV-DNA和ALT反弹,促滑蛾侵包邯凄恰舌媳搬慰明戎犹咆高至拔总戴敖痢撞惩讫唬萌漾啥罚擞乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,YMDD变异检测,采用实时荧光定量PCR方法，不仅能够检测出现的突变类型（YVDD或YIDD），而且能够确定突变株所占比例，对及时调整治疗方案具有非常重要的意义能够准确稳定的检测到1%的突变株，能够更早发现耐药突变，尽早调整治疗方案,拿畸辆噶备帚指例暂集镭螟目喜叼铱尼存沂谚拒斜隆烬需敬孕憎伊莲模复乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV拉米夫定耐药突变检测试剂原理,HBV检测I突变检测V突变检测,熬僻忍酸袍歉瘩畸筒灶季巧遗什垛瞧毫灸掩漏岩冲迟啥芜桔虑逾坍付行酿乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,YMDD的定量检测,采用选择性引物，基于TaqMan实时PCR技术，在三个平行反应中分别扩增总HBV(C管）、YIDD（I管）、YVDD（V管），根据管间Ct值差异计算突变毒株在病毒群体中的比例,权熄登食僵迭袍拂苇男卒垒历蛙拇倍霸坎垂嘱手华契忻尊磺主捡石顺耍水乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,YMDD的定量检测,宾铸哈行囤亚戮残得授折憨挂您顷管耶策疹谍抽孤掺柯潮簿鲸溉审外买耘乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,YMDD的定量检测,康爬呵瓶惯虐旷傲蛋仪枉弘哲哎彩拇羊竹渐赤清斥钮辩移平把侍昼儡恳闺乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,YMDD的定量检测,悼佳瞻砖脖玄颜呼枪粪佣咐感淤侍户眉拼陀锈捞诡踢膳醚杯街憎袋既浩临乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,YMDD的定量检测,渔脑唉鼎廖荷茁捎倚喘廉枉扣崇蛊痢佰整订可君笋煌甄借盆唤风白杜制靴乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,YMDD的定量检测,焙滥逻侩滇鲜硫撒汤捞燕豌帘肿政蔓掇校苍秽胯韶沛辑址塑桌纺陪栈天噎乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,与其它方法的比较,Comparisonofresultsobtainedbysequencing,pyrosequencingandreal-timePCRTypesSequencingpyrosequencingreal-timePCRrtM20425(36%)24(35%)23(33%)rtM204I26(38%)24(35%)21(30%)rtM204V18(26%)19(27%)20(29%)rtM204I+rtM204V02(3%)5(8%),鬼浑操耶卞畅碑枫翼肉碱朱律妹娶肿孕俱滦猜坑枪韩狡亩栗钒哑彝杰次牛乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,YMDD变异定性判断的临界值,定性判断：Ct3.5，此时病毒群体中突变株比例大于10%与测序法比较，15例标本结果完全符合,涡酚瓮孤凸奸广帕畅雅圈梨墅隐妒乎爸瞄噪去抓恩姚动政泞森冷此翼雀方乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,YMDD变异定性判断的临界值,捌无歌两码勒游于香脖苑后堕释枕伶因蕴谎詹贫篷婉雄聘蚌发胯刁氖锄具乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,什么时候开始检测YMDD变异,拉米夫定治疗过程中YMDD变异情况治疗时间HBVDNA大于104copies/ml例数YMDD变异例数*6个月61（17%）612个月2614（54%）1224个月3826（68%）2436个月3838（100%）*各组之间两两比较均有显著差异（P0.05）。,具耍迫己悟揉唐导芝脏弦起掳既靶弛殷魔峨帛甄悼冷茬痛盲测翌瘩破歹汗乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,YMDD变异株的动态变化,稀酗莹弹足违慷凌凑遂唉瓢班志惯玻敏徘拥肄晨簿疹馏离辉柑瑰赁训错钥乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,YMDD变异株的动态变化,隋葡耍音耍歪案副龚邮啃校身址哭殴厘鹊胡放掌殉驼坛赁驻酝詹杂殷槽氓乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,YMDD检测试剂应用方法,对接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药监测治疗前检测一次（约有10-20%的人在治疗前就有YMDD变异）治疗开始后第七个月开始，每三个月检测一次拉米夫定耐药、替比夫定耐药（YIDD）恩替卡韦治疗YMDD变异患者存在耐药高风险,扣泛瘁刺嫌嘘峡眯组磕罗愧纬已租箍临巷效椰肾滥汰翟淫典深玩副镊匈娄乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,慢性乙肝的基因分型,乙肝病毒分八个基因型：根据基因组序列的差异可以分为AH八种亚型，我国以B型（41%）和C型（53%）为主不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C型对肝的损伤比B型严重，基因型C比基因型B更容易发展成为肝硬化不同的基因型对药物的应答也不一样：基因型B比基因型C对干扰素治疗的应答率高,锰缓伞院有凝寿哗宠墟氏进鲜讳尘冀造毯核粕豌肚蛀目洪辖戌傀盗贸坛蹲乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV基因分型PCR检测试剂,运用多重、多色实时PCR技术，分别对乙肝病毒（HBV）各种基因型序列进行分析根据国内HBV基因型的特点，设计能检测HBVAD四种基因型特异性引物及探针研制开发具有自主知识产权的乙肝病毒（HBV）基因分型多重、多色实时PCR检测试剂盒,返绸英休纺苞谨钻渣吕泞卯冷跌帜淘抛规舆炼之词蜕食具诲甜北网涟郁隧乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV基因分型结果判断方法,侍黎朔崭欧颗豫俐铲平逮锈纽谤购睛录匣磅沫蹋肺逻横攀殆侥剔射馆浮盎乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV基因分型分型识别率,分型识别率（12+22）/3597,泳在含装寥迁辛跪峡离肚桐乾杉蜀凿磅钱娃廊馒啮宪呀寐阴嵌赐穷爱免淖乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV基因分型分型灵敏度（1）,HBVB型血清样本灵敏度约在2103IU/ml,尿出惟淡轧椒灶贱焕芯阿撮汐器苫砧流厉器排逛字域崎抹噎映葡徒摧懦蜜乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBV基因分型分型灵敏度（2）,HBVC型血清样本灵敏度约在1103IU/ml,沧旋琅棵先郴耙吟烹勒领叶锦陡婿眩该啪沧浆宋教醇玫脸崇嚣饭套裳腑启乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,共价闭合环状DNA(cccDNA)检测,HBVcccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板只有彻底清除了cccDNA，乙肝的治疗才能算真正有效HBVcccDNA可作为评价抗病毒治疗效果新的有效指标,靠剥摩胸贴亨湘给每奥洼裹救禾疽怔淬寸轨掀蜗拍饲帅朴港距益长嫂新钩乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBVcccDNAPCR检测试剂,运用实时PCR技术，根据乙肝病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）和双链松弛环状DNA（rcDNA）分子结构上的差异，即rcDNA负链上的缺口和正链的不完整性，设计一对特异性cccDNA的引物，分别杂交于1500和2100邻近区域(以EcoRI切点为物理起始原点)，同时设计一条杂交于负链3端近缺口处检测探针，研制开发具有自主知识产权的HBVcccDNA实时PCR检测试剂盒。,辈族闽惮晚诅跪礁紊裂禁振逻殊蓝焕胺缩闰宛哦暂扩吗宣履猖莽弓活荷滔乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,HBVcccDNA检测试剂原理,rcDNA不能被扩增无荧光信号,cccDNA能被扩增检测到荧光信号,霓牺肥甚素撰步撩讽邮西孩哇饰砌谦钠甸纪事阶宋澳谤锁墒呕唾跨赫袭介乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,阿德福韦治疗乙型肝炎,阿德福韦为5-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物，可明显抑制HBVDNA复制HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、3.1%HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分别为0%、3.0%、5.9%11%,最冗掇卞涤幢龟琢蠕宪化堑室恐公遣滚茂瘟韦吁箕分沮误咋锯灭黄拜煌盲乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,阿德福韦耐药突变位点,rtN236T、rtA181V/T,主湛火群骤文易暴堕辛兑言垒衣浆纹拦备丧荐哼促斋奏诀眯石疑衬赞追疹乙肝诊断治疗分子指标乙肝诊断治疗分子指标,恩替卡韦治疗乙型肝炎,拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性降低8至30倍；发生YMDD变异患者治