（分析化学专业论文）光谱法研究小分子及其sm（Ⅲ）配合物与鲱鱼精dna的相互作用.pdf

西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 化学生物学是当今化学家与生物学家感兴趣的前沿领域。d n a ( d c o x y r i b o n u c l c i ca c i d ) 是生物体中重要的一类生物大分子，对生命遗传密码的翻译、 转录、复制起着非常重要的作用。关于d n a 与识别分子的相互作用研究已成 为化学与生命科学研究中的热门交叉领域之一。环境中大量有毒有害物质如重 金属、有机染料、农药等可通过饮食、呼吸、皮肤接触等途径进入机体，在体 内与d n a 发生直接或间接的作用，改变d n a 结构与构象或引起d n a 损伤，从 而影响其功能或改变其遗传特性。目前，以有机小分子为配体的稀土金属配合 物与d n a 作用方面的研究开始兴起，而且有一些新奇的发现。因此稀土金属 配合物与d n a 相互作用的研究不论是对阐述抗癌、抗病毒药物的作用机理和 药物的体外筛选，还是对致癌物的致癌机理的研究都有非常有重要的理论和现 实意义的。 本文采用u v - v i s 光谱法、f s 光谱法并辅以循环伏安法及流体力学法等， 以中性红和吖啶橙有机小分子作为光谱探针。分别研究苏木素( h e ) 一钐( ) 配合物、亚甲基蓝( m b ) 、灿烂甲酚蓝( b c b ) 一钐( ) 配合物、钙黄绿素( c a ) 一 钐( ) 配合物，血卟啉( h d ) 一钐( ) 配合物和甲基百里酚蓝( m t b ) 一钐( ) 配 合物与鲱鱼精d n a 生物大分子之间的作用，同时研究了酸度、盐效应和温度、 超声波等环境因素对它们间相互作用的影响，了解其相互作用机理，获得了有 机小分子及其稀土配合物与鲱鱼精d n a ( d n a ) 相互间的结合力、结合方式、 结合数、结合平衡常数、热力学函数等方面的有关数据和信息。为进一步探讨 和认识d n a 的结构，性质、构象、相关作用机理以及揭示生命科学中的某些 现象提供科学的理论和实验依据 关键词：u v - v i s 光谱法f s 光谱法循环伏安法流体力学法 稀土配合物鲱鱼精d n a 光谱探针作用方式 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 i 页 a b s t r a c t c h e m i cb i o l o g yi st h em o s tf o r m e rf i e l di n t e r e s t e db yc h e m i s t sa n db i o l o g i s t d n ai sak i n d o fk e yb i o l o g i cl a r g em o l e c u l e a n di tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nl i f e g e n e t i cc o d ei n t e r p r e t a t i o n ，t r a n s c r i p t i o na n dc o p y t h er e s e a r c ha b o u tt h e i n t e r a c t i o no fd n aw i t hd i s t i n g u i s h i n gm o l e c u l e si st h ep o pf i e l do fl i f es c i e n c e a b u n d a n ta m o u n t so fp o i s o n o u sc h e m i c a l si nt h ee n v i r o n m e n t , s u c ha sh e a v y m e t a l s ，o r g a n i cd y e s ，p e s t i c i d e sa n dh e r b i c i d e s ，e n t e ri n t ot h eb o d yb yi n h a l a t i o n ， i n g e s t i o no ra b s o r b t i o nt h r o u g hs k i n t h e yc a ni n t e r a c tw i t hd n ad i r e c t l yo r i n d i r e c t l yi nv i v o ，w h i c hm a yc h a n g ed n a s t r u c t u r ea n di n d u c eo x i d a t i v ed a m a g e t od n a ，a n dt h e na f f e c ti t sf u n c t i o no rg e n e t i cc h a r a c t e r i s t i c a tt h ep r e s e n t ，t h e r e i saf i r s ts t u d yo nr a r ee a r t hc o m p l e xi n t e r a c t i n gw i t hd n a a n dl o t so fn e w p h e n o m e n o n sa r ef o u n d t h e r e f o r e ，t h er e s e a r c h0 nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h i s k i n do fc o m p l e x e sa n dd n ai sh i g h l ys i g n i f i c a n tt oe x p l a i nt h ef u n c t i o n a r y m e c h a n i s m ，t os e l e c ta n t i b a c t e r i a la n da n t i c a n c e rm e d i c i n e s ，a n dt ou n d e r s t a n dt h e r e a s o n sw h yt h ec a r c i n o g e n sr e s u l ti na l lk i n d so fc a n c e r t h i st e x ts t u d yt h ei n t e r a c t i o no fh e m a t o x y l i n ( h e ) 一s m ( i i ) c o m p l e x ea n d m e t h y l e n eb l u e ( m b ) a n db r i l l i a n te r e s y lb 1 u e ( b c b ) - s m ( 1c o m p l e x ea n d c a l c e i n ( c a ) - s m ( i h ) c o m p l e x ea n dh e m a t o p r p h y r i nd i h y d r o c h l o r i d e ( h d ) - s m ( i i i ) c o m p l e x ea n dm e t h y l t h y m o lb l u ec y m p l e x o n ( m t b ) - s m ( ) c o m p l e xw i t h h e r r i n gs p e r md n ab yu v - v i ss p e c t r a lm e t h o da n df l u o r e s c e n c es p e c t r am e t h o d a n de l e c t r o c h e m i c a la n dv i s c o m e t r i ca n ds oo n a tt h es a m et i m e ，w es t u d i e dh o w t h ei n t e r a c t i o no fc o m p l e x e sw i t hd n aw a se f f e c t e db yt h ec h a n g e so fp h ，s a l t n u m b e ra n dt e m p e r a t u r en u m b e ra n du l t r a s o n i ca n ds oo n ，a n dt h ei n t e r a c t i o n i n f o r m a t i o no fc o m p l e x e sw i t hd n aa b o u tb i n d i n ge n e r g y ，b i n a r yc o m p l e xr a t i o ， b i n d i n gc o n s t a n ta n da c t i o nm o d e a n dw ec a nm o r ec l e a r l yu n d e r s t a n dt h ef l a m e ， c h a r a c t e r ，c o n c e i v e r , i n t e r a c t i o nm e c h a n i s ma n dl i f ep h e n o m e n o n k e y w o r d s ：u v - v i s s p e c t r am e t h o d ；f ss p e c t r am e t h o d ；c y c l i c v o l t a m m o g r a m sm e t h o d ；v i s c o s i t ym e t h o d ；r a r e e a r t h c o m p l e x e s ：h e r r i n gs p e r md n a ：s p e c t r a lp r o b e s ；a c t i o nm o d e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：日期： 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可以公布该论文的全部 或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 签名：导师签名：e l 期； 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 1绪论 1 。1引言 生物分子是生物体的重要组成成分，分子量大，其结构较为复杂，因而， 决定它们具有特殊的性质，即它们在生物体内的运动和变化体现着的重要的生 命功能如进行新陈代谢供给维持生命需要的物质与能量、传递遗传信息、控 制胚胎分化、促进生长发育、产生免疫功能等等。随着生命化学的发展和现代 分析技术的广泛应用，人们正从化学的角度来解析一些生命化学现象，在分子 水平上研究生物体内与有机分予和无机元素( 包括生命金属和大部分生命非金 属) 有关的各种相互作用。以邻菲咯啉、联吡啶、卟啉、碱类配体和席夫碱等 为代表的有机分子与生物大分子的作用更是引人注目“，。无机元素特别是金属 元素在人的体内起着非常重要的作用是众所周知的，它们是一些蛋白质完成其 生物功能的活性部位，包括血红蛋白( h e m o g l o b i n ) 、肌红蛋( m y o g l o b i n ) 、 血蓝蛋1 3 ( h e m o c y a n i n ) 、叶绿素( c h l o r o p h y l 1 ) 等。所以化学与生物学相互渗 透，对于研究生物体的生命特征将具有十分重要的意义，预计它将使人类在研 究生命科学的过程中很可能有新的突破。 1 2 有机小分子及其稀土金属配合物与核酸的相互作用研究 的意义 如何采取简便有效的手段对d n a 序列等进行识别是生命科学研究的一个 重要课题。它对于实现人类基因组计划以及理解生命原理都具有深远意义目 前，已有两种化学生物学方法可用于双螺旋d n a 的序列识别：一种是通过合 成可与特定序列双螺旋d n a 形成三螺旋的寡聚核苷酸；另种方法是用合成 的含吡咯咪唑的多酰胺与d n a 形成配合物。对于d n a 大沟结合配体寡聚核苷 酸来说。其识别机制在于它的碱基t 可与双螺旋d n a 的a t 碱基对通过 h o o g s t e e n 氢键形成t - a t 三碱基体，而质子化的碱基c ( c + ) 可与g c 碱基对形成 c g c 三碱基体对于小沟结合配体n - 甲基咪唑或n 甲基吡咯多酰胺来说，由 于吡咯碳酰胺和眯唑碳酰胺对双螺旋中不同类型的碱基具有不同的亲合势，因 此可由吡咯碳酰胺和咪唑碳酰胺的线性序列判断其结合位点的碱基排列情况。 尤其是后者( d n a z j , 沟结合配体) 的研究，近年来随着固相合成手段的改进及配 西南科技大学硕士研究生学位论文第2 页 合规律的深入揭示，已取得令人瞩目的结果。 随着人类基因组被破译，将进一步加深对生命现象及过程的理解，促进基 因选择药物的研究n ，。新一代的基因选择药物是基于分子水平针对特定基因序 列的识别、切割和修复的生物活性分子，这种介入活细胞基因表达的新疗法是 治疗由于基因变异引起的疾病的有效疗法。 近年来，国内外许多科学家都在研究d n a 分子的识别模式，以期能找到 识别d n a 分子的新型化合物，已经取得了一定成就。通过将有机小分子化合 物与d n a 相互作用n ，现在发现的它们之间的作用模式有以下三种：插入模式、 沟槽模式、静电作用模式，但化合物的功能基团、结构特征及其作用所引起的 相应核酸分子结构变化的关系及作用机制还存在许多亟待研究的问题“，。因此， 进一步设计和研究对d n a 分子有显著识别作用的新型化合物m ，不仅在理论 上，而且在应用上都具有十分重要的意义 d n a 是遗传信息的载体。读取d n a 序列进而破译遗传密码是无数生物学 家孜孜以求的目标。人工合成分予以识别d n a 的特定序列不仅是d n a 人工测 序的一个重要补充，面且由于它与d n a 特定位点的结合在客观上能起到标示 功能，从而提供了识别和操纵d n a 特定位点的可能例如，可以采用原子力 显微镜( a f m ) m 力曲线技术研究小分子与d n a 的相互作用力或直接操纵特定 的d n a 序列等等，对进一步研究和理解d n a 的行为和功能具有深刻的意义。 德国的t i e t z e 以及美国s c r i p p s 研究所的b o g e r 设计了一系列c c l 0 6 5 类似 物，寻找药物的先导化合物及新型抗肿瘤药物。t i e t z e 选择了c c l 0 6 5 的s e c o c b i 类似物( 1 - 氯甲基5 - 羟基1 ，2 一二氢3 h 苯基吲哚) 以及甲基化的s e c oc b i 类似物【l - ( i - 氯乙基) 5 - 羟基1 ，2 二氢3 h 苯基吲哚】。由于它们对正常人体细 胞有一定毒性，t i e l z e 合成了它们的半乳糖苷。这类化合物毒性很小，但在肿 瘤细胞表面可被b d - 半乳糖苷酶切割释放出有效的s e c oc b l 分子抑制肿瘤 细胞，是较好的药物先导化合物。在抗支气管肿瘤细胞的体外实验中，s e c oc b i 类似扬显示了中等的活性，而甲基化的s e c o c b i 类似物则显示了极高的抗肿瘤 细胞活性。 从1 8 世纪中叶发现普鲁士蓝开始，化学家对配合物的研究主要集中在c o 和p t 等金属配合物上1 9 世纪末，w e r n e r 的配位理论提出后，金属配合物的研 究和发展进入新时期m 。随着配位化学与生命科学、材料科学等学科的结合、 交叉和渗透的日趋深入，金属配合物的研究已向更复杂更广泛的层次发展，研 究对象包括各种金属与多种配体所形成的螯合物、混配体的和多核的配合物 n m ”、金属有机物w 、原子簇合物“、大环配体以及超分子配合物“，。近年热门 西南科技大学硕士研究生学位论文第3 页 的研究还包括许多有特殊结构或特殊功能的配合物，如微型和巨型原子簇，模 拟生物酶的超分子、混合价态、非常氧化态、非常配位数配合物等n 一”另外， 纳米科学与技术的出现及相关研究的不断深入，也给金属配合物带来了新的发 展机遇“”。分子器件是近年来兴起并正在迅速发展的研究领域“”。 金属配合物也可作为d n a 结构和构象的探针，金属配合物与d n a 相互作 用和相互识别是一个非常引人注目的研究课题。由于金属配合物与d n a 具有 良好的反应活性及丰富的谱学性质，为探测与d n a 的反应提供了方便的手段。 非特异性键合的金属插入剂的氧化还原性，可用在印迹技术上分析与d n a 键 合时的序列倾向性，第一个用此方法的印迹试剂是由溴化乙锭与f e e d t a 形成 的复合物m p e f e ( i i ) 国内外在d n a 的靶向化合物无机金属离子配合物研究 中，主要集中于p 区金属和过渡金属离子配合物“”的研究方面，获得了部分具 有较好抗癌活性的生物活性金属离子配合物一m 一如金属卟啉配合物、铂配合 物m “m 、其它过渡金属配合物，顺铂类金属药物可以共价地与某些肿瘤的d n a 结合，破坏其遗传和表达，从而起到治疗癌症的作用。这些研究为设计人工核 酸酶，从而实现对d n a 链上某些位点的特异性剪切n 圳以及设计并合成出性能 优良的抗肿瘤药物m ，或抗病毒剂作出了重要贡献。 一般来说，配合物中因为有无机的金属离子和有机的配体，因此配合物不 仅可能兼有无机和有机化合物的某些特性，而且还可能会出现无机化合物和有 机化合物中均没有的新的性质。一方面，配合物中的金属离子可以有不同的配 位数和配位构型。另一方面，有的金属离子有可变的化合价，从而有氧化还原 等性质。因此，作为新型材料的配合物的某些性能可以通过人工设计、晶体工 程等方法进行调节。过渡金属配合物作为材料有其独特的优势，相关研究近年 来越来越受到人们的重视，并呈现出迅猛发展的势头n 一m 例如，越来越多的 具有优良非线性光学性能的新型过渡金属配合物被设计并合成出来作为新的 材料。除此之外，稀土配合物以及稀土一过渡金属配合物在配位催化、发光材 料、磁性材料等方面有着广阔的应用前景，相关研究工作引起了人们的极大兴 趣，。单分子磁体、单链磁体和自旋交叉磁性配合物也是分子及磁性材料研究 中的热点课题。另外，在研究天然催化剂一酶时，发现己知的众多酶中约有l 3 涉及到各种金属元素。那些金属元素以酶的活性中心或者酶活性的激活剂的形 式存在。在讨论生物物质的结构和性能的关系、探讨生物体内化学反应的规律 的过程中，人们也逐渐认识到金属元素和无机物的重要性在生物领域中，存 在许多具有重要生理功能的过渡金属配合物，如血红素、各种金属蛋白、金属 离子载体金属酶和金属辅酶等。另外，还有许多重要的生物过程涉及过渡金履 西南科技大学硕士研究生学位论文第4 页 配合物，如固碳、固氦、电子传递、载氧、细胞调节、生物催化等。在金属蛋 白酶和金属蛋白方面，所涉及的金属已从常见的镁、钾、钙、钠、铁、钻，锌、 铜等发展到了钒、镍、铝、钨等。所涉及的功能也己从物质传输发展到了能量 和信息传输，包括各种氧化还原酶、与核酸起作用的蛋白和电子传递蛋白【，6 1 。 离子载体方面，着重研究金属离子的膜的通透机理。在配合物的药理方面，特 别受关注的是能致癌和治癌的金属配合物当前，生物无机化学在医学上的应 用，至少包括了三个方面，即补充缺乏的无机元素，排除金属中毒和以无机元 素作为探针或药物m 一。另外生物无机化学在金属离子与细胞的作用、生物矿 化、环境生物无机化学等方面也取得了显著发展c t 具有识别和断裂功能的金属插入剂已在许多方面得到应用，如作为d n a 的荧光探针w 、r n a 的结构探针、胸腺嘧啶二聚体修复的光化学试剂等。金属 插入剂m ，是少数几种能从大沟处特异性地识别d n a 的配合物中的一种，加大对 这一领域研究的益处不言而喻。目前，已着眼于设计能识别d n a 链的多个位 点的金属插入剂，通过形状选择、直接读出等方式实现特异性地识别d n a 。 但是配合物能否进入细胞并在体内阻止翻译? 能否使用d n a 的电子转移化学 来探测并阐明体内d n a 的损伤和修复? 对这些问题的研究将会有广阔的应用 前景且充满新的机遇和挑战! 稀土金属配合物作为d n a 等生物大分子的靶向化合物的合成及其识别生 物分子方面的研究，目前不多“”我国作为稀土金属储量最大的国家，稀土金 属化合物及其应用的研究处于优先考虑的地位。因此，研究开发稀土金属手性 配合物及其识别生物分子方面的研究，不仅具有化学生物学方面重要的理论意 义，而且不论是对阐述抗癌，抗病毒药物的作用机理、设计新的抗癌药物，还 是对进一步指导人工核酸酶的合成以及对致癌物的致癌机理的研究都是具有 重要的应用意义。 稀土金属离子具有丰富的化学、光学、磁等方面的性质，致使稀土金属配 合物在分子器件方面具有广阔的发展前景。新型稀士金属配合物，或具有仿生 功能和治疗作用，或具有优异的分离分析性能，或具有独特的催化活性，或具 有特殊的光电热磁学性质，因而应用广泛。该类配合物在分子识别、核酸探针、 抗肿瘤药物、分子催化及自组装等领域都有广泛的应用前景。二十一世纪是生 命科学的世纪，d n a 作为生命中遗传物质的重要携带者，已经成为人们研究 的焦点。另外更重要的是，现代医学研究表呀金属元素在人体内的功能与它们 与核酸的作用密不可分，因为d n a 复制、遗传密码转录和翻译的过程中必须 在金属离子的存在下才能完成。由于其具有良好的反应活性及丰富的谱学性 西南科技大学硕士研究生学位论文第5 页 质，为探测与d n a 的反应提供了方便的手段。 可以预见，在设计与合成d n a 识别分子例如稀土金属配合物的领域中， 将为今后设计d n a 识别分子提供新途径。在不远的将来一定会找出更多高选 择性、高亲合力的d n a 识别分子，而这些分子将成为新一代基因选择药物的 先导化合物。因此，稀土金属配合物的合成及其与d n a 的相互作用和相互识 别的研究，无论在理论上还是在应用上都具有极为重要的意义。 1 2 1 生物大分子d n a 的结构与性质 核酸( n u c l e i ca c i d s ) 是生物体的重要组成物质，是生物承载和传递信息 的载体，是基因表达的物质基础。携带着指令蛋白质中氨基酸的顺序的信息。 它在生物的生长、发育和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用。因此核酸是 现代生物学、医学研究的重要课题之一在生物体内，核酸通常与蛋白质结合 成核蛋白。核酸是多聚核苷酸，其基本结构单位是核苷酸。核苷酸由碱基 ( b a s e ) 、戊糖和磷酸基组成，x 射线衍射分析法己经证明核苷酸中的碱基与 d 2 脱氧核糖环平面互相垂直t a ，核营酸的戊糖有两种；e d - - 核糖和尽一d - 2 一 脱氧核糖。根据核酸中的戊糖种类的不同，将其分为脱氧核糖核酸( d n a ) 和核糖核酸( 1 矾a ) 两大类。一切细胞都同时含有这两类核酸，d n a 主要集 中于细胞核内。 d n a 是由大量脱氧核塘核苷酸组成的、极长的大分子，其中的戊糖和磷 酸基起结构作用，而碱基则携带遗传信息。d n a 含有四种碱基，其中二种为 嘌呤碱，即腺瞟呤( a d e n i n e ) 和鸟嘌呤( g u a n i n e ) ，二种嘧啶碱是胸腺嘧啶 ( t h y m i n e ) 和胞嘧啶( c y t o s i n e ) ，如图卜l 所示。 1 9 5 0 年c h a n g a f f 发现，在所有物种的d n a 中，碱基的摩尔比有一定的 关系，即o = - c ，a = t m ，碱基对与糖环的连接不是在碱基对的相反两侧是在同 侧，这种不对称的连接导致双螺旋表面形成两个凹下去的沟，宽的称为大沟， 窄的穆为小沟。大沟携带了其它分子能够阅读的信息( 碱基顺序) ，沟足够大。 能允许蛋白质分子进入，相比之下，小沟的信息较少一些。d n a 的结构可分 为一级结构和空间结构一级结构是指核酸通过3 ，5 一磷酸二酯键按照特定 的顺序连起来形成单链，而空问结构则多指核苷酸链内或链与链之间通过氢键 折叠而成的结构空问结构又可分为二级结构和三级结构。d n a 的二级结构 是指其双螺旋结构d n a 的三级结构是在双螺旋二级结构的基础上形成的， 它分为双链环型d n a ( d o u b l es t r a n d e dc y c l i cd n a ) 的超螺旋型( s u p e r h e l i c a lf o r m ) 和开环型( o p e nc i r c u l a rf o r m ) 许多 d n a 是双链环型的，其中 西南科技大学硕士研究生学位论文第6 页 鸟嘌呤 胞睦碇 腺嘌呤 胸腺嘧啶 图1 - 1d n a 中四种碱基的结构式 f i g 1 1t h es t r u c t u r e so ff o u rk i n d so fb a s e si nd n a 超螺旋型d n a 具有更为紧密的结构，更高的浮力密度，更高的熔点和更大的 s 值。当超螺旋d n a 的一条链中出现一个缺口( n i c k ) 时，超螺旋结构就被 松开，形成开环型结构。1 9 5 3 年，w a t s o n 和c r i c k 在前人工作的基础上，提 出了著名的d n a 分子双螺旋结构模型该模型认为d n a 是由两条反向平行 的多核苷酸链，围绕同一个中心轴构成的双螺旋结构。两条链都是右手螺旋， 嘧啶和嘌呤的碱基层叠于螺旋内侧，碱基平面与纵轴相垂直。两条单链之间由 氢键连接起来，形成两种特定的碱基配对：a t 和g c 。相邻碱基对平面之间 间隔为0 3 4n l n ，两个核苷酸的夹角为3 6 0 ，因此碱基平面上分布的丌电 子云系统之间的吸引力、碱基上永久性偶极之间的作用力和诱导偶极的相互作 用等分子间作用力使碱基之间存在着堆积作用。堆积作用的大小表现出如下趋 势：嘌呤一嘌呤 嘌呤一嘧啶 嘧啶一嘧啶，同时还受碱基排列顺序的影响。同 时由于此结构存在互补碱基对之间的氢键，由芳香族堆积( s t a c k ) 碱基上的 电子之甸的相互作用产生的力即碱基堆积力( b a s es t a c k i n gf o r c e ) ，也是主要 的力量，d n a 分子中碱基层层堆积，在d n a 分子内部形成了一个疏水核心( h y d r o p h o b i cc o r e ) ，核心内部几乎没有水分子，所以使互补的碱基之间也较易 形成氢键，以及磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间的静电作用力因而相 当稳定，由于d n a 在生理p h 值条件下带有大量负电荷，如果没有阳离子与 它形成离子键，d n a 链由于自身不同部位负电荷的斥力，会使d n a 结构不 西南科技大学硕士研究生学位论文第7 页 稳定。研究发现，与d n a 结合的离子如n a + ，k + ，m 9 2 + ，m n 2 + 等在细胞内大 量存在。另外，d n a 还可与精胺及亚精胺酸残基或组蛋白相结合。 d n a 为白色纤维固体，微溶于水，其溶液粘度极高。d n a 是两性电解质， 通常表现为酸性。小分子与d n a 键合常会诱发许多生物效应。如阿霉素和柔 霉素分子的芳基部分嵌入d n a 碱基对间，水合顺铂和d n a 链上鸟嘌呤碱基 配位而使它们具有抗癌作用。溴化乙啶因能嵌入d n a 分子而成为研究d n a 结构以及药物与d n a 结合的探针w 。此外，d n a 具有不同于蛋白质的独特的 结构特点，即由碱基对捧列的双链结构，造成整齐的耳电子堆积，从而使得 d n a 具有好的电导性因此，有机分子及其稀土配合物和d n a 的键合作用 的机理研究具有重要的意义。 1 2 2 靶向分子与d n a 相互作用模式 生物大分子d n a 靶向分子与核酸作用的部位是核酸的碱基、磷酸骨架和 戊糖环，其相互作用方式归纳起来有三种：非共价结合、共价结合和剪切作用。 1 2 2 1 非共价结合 非共价结合包括静电作用( e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g ) 、嵌插作用( i n t e r c a l a t i v e b i n d i n g ) 和沟区作用( g r o o v e b i n d i n g ) ，另外还有氢键、离子键、范德华力，疏 水键等一些弱作用键。可以通过实验方法测得d n a 与靶向分子间的亲和力， 即平衡常数k ，由此判断作用键的强弱，从分子水平的生命现象角度分析，上 述弱作用键起着不可忽视影响，形成了各种生物大分子功能特定的空间结构， 因而主导着靶向分子与d n a 作用的特异性。 ( 1 ) 静电结合，即分子通过非特异性的的相互作用结合于带负电荷的 d n a 双螺旋外部。一般认为，静电结合没有选择性，作用于磷酸骨架。有报 道认为核酸分子表面由静电力形成的水化层中的水分子的排列与碱基有关。通 常认为这种作用模式在药物的应用上意义不大，但事实并非如此。例如， t m p y p 金属卟啉带正电的侧链与d n a 磷酸酯骨架间的静电作用对它能嵌入 且结合在g c 碱基对之间起了必不可少的稳定作用。 ( 2 )嵌插结合，即具有平面或近似平面的芳香环系化合物嵌入双螺旋 d n a 的碱基对之间。嵌插作用的结合力来自芳香环的离域靠体系体系与碱基 的丌体系间的一、偶极一偶极相互作用及疏水相互作用，这是有机小分子 及其金属配合物分子与d n a 发生作用的最重要的模式之一m 。通常稠和芳环 体系都倾向于结在g c 富集区m - ，而对于一些含有庞大取代基的分子，如吡 西南科技大学硕士研究生学位论文第8 页 啶取代的卟啉分子在与d n a 作用时，毗啶环取代基会尽量旋转，以保持与母 环的共平面，从而优化堆积形状，较好地嵌入d n a 的碱基对间。当嵌入d n a 碱基对之间后，令d n a 构象发生改变，削弱或删除了其复制和转录的功能， 而显现出抗肿瘤、抗病毒的活性“。由于嵌插造成的d n a 双螺旋的解链和伸 长是嵌插结合方式的一个重要特征。另外，由嵌插引起的靶向分子方面的变化 特征也是非常明显的。这是由嵌插剂与d n a 双螺旋内碱基对之间的次级键作 用造成的。嵌插入d n a 的靶向分子与碱基对形成有序的堆积，嵌插化合物表 面紧挨着d n a 碱基的芳香杂环，在双螺旋中以一丌、偶极一偶极相互作用 在电性上达到稳定。有些则是d n a 靶向分子在经过进一步活化后如光照下产 生羟基自由基、单线态氧、超氧化自由基、超氧化阴离子自由基等活性物质， 使d n a 断裂、受损，从而影响其功能。近期也有研究表明，小分子与d n a 相互作用形式还有。半嵌插作用”不同于经典嵌插作用。利用d n a 嵌入剂嵌 入d n a 后引起d n a 拓扑结构的变化，进而影响拓扑异构酶对d n a 的识别和 作用这一特点，大量的d n a 嵌入剂，如l 。8 一萘酰酞亚胺类、毗啶并咔唑类、 葸醌类、棘霉素类、吖啶类，放射菌素类、苯并咪唑 1 ，2 一e 喹啉类等，都被 用作抗肿瘤研究，并取得了一些进展。 ( 3 )沟区结合，即d n a 靶向分子与d n a 的大沟( m a j o rg r o o v e ) 或 小沟( m i n o rg r o o v e ) 的碱基对边缘直接发生相互作用，小沟区、大沟区在电 势能、氢键特征、立体效应、水合作用上都有较大差别。通常非稠环的芳香体 系能通过一定的旋转而优化其空间后结合在小沟中a - t 富集区w ，并且在d n a 靶向分子的供体基团与小沟中的a 的3 _ n 或t 的2 一o 这些受体间常常有氢键 形成。纺锤菌素和h o e c h s t 3 3 2 5 8 两种经典的小沟结合分子与d n a 切割剂( 如 阳离子卟啉) 连接后，可以得到亲和性及对a t 序列选择性都明显增强的人工 核酸酶m 一，。近年来发展起来的反义寡聚核营酸，因其能按照严格的碱基对互 补原则，通过h o o g s t e e n 氢键结合在双螺旋d n a 的大沟中而形成局部的三螺 旋结构，因而可精确识别核酸所携带信息的特异性序列，因此一方面可通过将 一些具有特定功能的活性基团缀接于寡聚核苷酸末端，而得到高度选择性的人 工核酸酶或药物分子原型；另一方面则有可能根据反义寡聚核苷酸的碱基序列 直接写下抑制物的化学结构，这点十分有利于药物分子的合成。王素芬等发现 双苯并咪唑衍生物与d n a 的相互作用就是以沟结合的方式进行的 1 2 2 2 共价结合及剪切作用 共价结合是指小分子及其金属配合物与d n a 中的碱基、糖环或磷酸酯键 西南科技大学硕士研究生学位论文第9 页 形成共价键，主要表现为d n a 的烷基化及d n a 的链间交联、链内交联。与 非共价结合相比，d n a 靶向分子与d n a 共价结合的序列特异性识别能力要 强得多。例如d u o c a r m y c i n 及其衍生物只能在d n a 小沟中对a t 富集区识别， 分子中活泼的环丙烷与小沟内特定碱基序列中a ( 腺嘌呤) 的n 3 共价结合后导 致该位点脱去嘌呤m ”“，晶体衍射及其它一些方法也都证实了顺铂中的p t 原子 能够与d n a 小沟中同一条链上相邻鸟嘌呤 d ( o p o ) 的n 7 共价结合形成链内 加成物，并使d n a 双链解旋及产生弯曲，以便于含有高淌度基因结构的蛋白 质的结合。b l m ( b l e o m y c i n ，博来霉素) 是一种典型的d n a 切割化合物， 分子结构的特殊性使其能够识别并结合在d n a 中5 一g c 一3 序列的鸟嘌呤上， 然后经一系列活化反应最终导致d n a 链断裂。这种双功能性对于设计人工核 酸酶及发展有效的抗肿瘤药物都具有非常重要的指导意义。事实上，已有大量 研究根据这一原理把对d n a 具有剪切功能的分子与能对d n a 序列进行特异 性识别的分子连接起来，以合成特定选择性更高的人工核酸酶或肿瘤毒药物。 影响靶向分子与d n a 相互作用的因素很多，靶向分子的结构不同，整个 分子与核酸的结合方式也不同“”，小分子与d n a 相互作用的研究是新型药物 设计及一些癌症和病毒性免疫化疗的理论基础，特别是嵌插作用，它诱导了核 酸的一些生理与物化性质的改变，在核酸的识别、分离及分析中有很大的应用 潜力许多药物与核酸之间存在着可逆的相互作用，并且核酸是当代新药发展 的首选作用目标。其中，在小分子肤及寡聚核苷酸在作为特效药物及特异核酸 序列识别方面己取得了令人鼓舞的成果m ”尽管小分子化合物与核酸的亲和 力及核酸序列的选择性都不太高，但从药物设计原理看，对核酸高亲和力及选 择性并不是具有生物活性的药物所必须的。因此，开发一些具有特殊功能的小 分子化合物将在未来的核酸研究中越来越受到重视【6 2 】，尤其在新型药物设计 方面。 1 3 本论文研究的内容和期望的目标 1 3 1 本论文研究的内容 1 3 1 1有机小分子探针的选择和与d n a 作用机理的研究 根据生物体生理环境的要求，选择在生理条件下与大分子d n a 作用较强 的有机小分子，通过筛选，确定几种杂环类有机小分子化合物。研究杂环类有 机化合物与d n a 作用的机理、选择性结合活性部位及一些物理参数和化学参 数。 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 0 页 1 3 1 2 稀土金属配合物探针识别生物分子研究 利用筛选出的杂环类有机小分子化合物作为稀土金属离子的有机配体，研 究它们之间的相互作用的物理和化学方面的参数以及形成的稀土配合物的结 构。稀土配合物作为生物大分子d n a 的靶向分子，研究它们之间的相互作用、 相互识别机理。利用紫外一可见光谱、荧光光谱、流体力学法和循环伏安法等 技术研究缓冲溶液中稀土金属配合物与d n a 作用的方式、作用比、作用平衡 常数、作用位点、，作用力、作用机理、作用前后d n a 的结构和构象( 包括解 链情况等) ，通过研究多种杂环类有机小分子化合物及其稀土配合物与d n a 的作用效果，以期对新型d n a 断裂试剂的设计、合成以及筛选有机小分子或 稀土金属配合物型的高活性抗癌药物提供一定的理论和实验参考。 1 3 2 本论文研究期望的目标 选择几种杂环类有机小分子化合物及其s m ( i i i ) 稀土金属配合物，通过紫 外一可见光谱、荧光光谱、流体力学法和循环伏安法等实验技术研究它们与d n a 的相互作用，了解其对d n a 的声动力效应，相互作用的方式、结合比、 结合位点、结合常数等信息和数据。确定有机小分子及其s m ( 1 1 1 ) 稀土金属配 合物与d n a 的不同结合模式和作用机理。 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 1 页 2 苏木素及其配合物s m ( ) ( h e ) s 与d n a 的光谱研究 2 1苏木素与鲱鱼精d n a 相互作用的光谱研究 d n a 是生物遗传信息的载体，d n a 的分子结构和特性与温度、p h 值、 溶液的盐浓度等环境因素密切相关，当环境条件改变时，d n a 的碱基的堆积、 氢键相互作用以及磷酸基团之间的斥力都将随之改变，从而导致药物分子与 d n a 的相互作用发生改变。d n a 与小分子相互作用的研究对于阐明小分子对 核酸的复制和转录的影响、d n a 靶标药物与d n a 的相互作用机制以及疾病 的起源具有重要意义，为寻找抗肿瘤和抗病毒药物研究提供了理论和物质基础 w 。由于光谱探针e b 有强烈的致癌性，不符合我们社会创造和谐环境的思想， 所以实验中我们采用毒性弱的探针吖啶橙。吖啶橙( a o ) 是一种碱性染料，在 生物化学方面作为核酸的光谱探针，可以进行核酸的定量m “、结构分析t 一、 肿瘤诊断m ，、抗癌药物的筛选n n 。我们通过以吖啶橙为探针，应用紫外可见和 荧光光谱等方法初步研究了苏木素( h e ) 与d n a 相互作用的机理及作用方式。 得到了一系列很有价值的信息。 2 1 1实验部分 2 1 1 1 仪器与试剂 u v - 3 4 0 0 分光光度计( 日本，日立公司) ；u v - 2 1 0 2 p c s 分光光度计( 上海 尤尼柯有限公司) ；p h s 2 c 型酸度计( 成都方舟科技开发公司) ；乌贝路德粘 度计( 上海青蒲县前明玻璃仪器厂) ；恒温水浴槽( 丹麦，h e r o c b n g 3 0 ) ； 电子分析天平( a l l 0 4 型，梅特勒托利多上海有限公司) 鲱鱼精d n a ( a r s i g m a 公司) ；苏木素( h e ，a r ，成都科龙化工试剂厂) ； 吖啶橙( a o ，a r 中国医药集团上海化学试剂公司) ；三羟甲基氨基甲烷( a r ， 天津科密欧化学试剂开发中心) ；t r i s ( 0 0 5m o l l ) 一h c i 缓冲溶液为临时配制； 其它试剂均为分析纯，水为二次重蒸水。 2 1 ，2 实验方法 ( 1 )紫外一可见光谱法 在一系列1 0m l 比色管中，分别加入一定量的h e 溶液、d n a 溶液， h e - d n a 溶液( - - 种溶液均分别用系列t r i s h c i 缓冲溶液配制) ，以相应 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 2 页 t r i s - h c i 缓冲溶液定容，摇匀，放置5m i n ，以试剂空白为参比，扫描吸收光 谱，选定适当的p h 缓冲溶液。 在lc m 比色皿中加入3 5 0 m l h e 溶液，用d n a 溶液进行滴定，或在比 色皿中加入3 5m l d n a 或h e d n a 溶液，用a o 溶液进行滴定( 各种溶液均 用p h = 7 8 0 的t f i s - h c i 缓冲溶液配制) ，摇匀，放置5m i n ，以试剂空白为参 比，扫描吸收光谱或测定吸光度。滴定时每次加入体积为l opl ，因此可忽 略体积效应。 ( 2 ) 荧光光度法 在lc m 比色皿中，加入3 5 0 m l d n a 溶液或h e 溶液，用a o 溶液滴定， 摇匀，放置5m i n ，扫描荧光光谱或测定荧光强度。滴定时每次加入体积为1 0 i il ，因此可忽略体积效应。激发和发射光谱扫描狭缝宽度均为5 0 衄。 在7 只2 5 m l 容量瓶加入等量d n a 溶液和等量a o 溶液后，分别加入不 同量的h e 溶液，摇匀，放置5m i n ，测定荧光强度。 用t r i s h c l 缓冲溶液配d n a 、a o d n a 和h e d n a 配合物溶液，放置在 恒温水浴槽中，在2 5 一1 0 0 每间隔5 测其荧光强度。 ( 3 ) 粘度法 用t r i s h c i 缓冲溶液配制a o d n a 和h e d n a 配合物溶液，放置4 8h ， 在2 5 恒温水浴槽中用乌贝路德粘度计测其粘度。 2 1 2 结果与讨论 2 1 2 1 紫外一可见光谱 ( 1 )吸收光谱与结合比 苏木素的分子结构如图2 1 所示。 h o h o h h 图2 - 1 苏木素的分子结构 f i g 2 - 1s t r u c t u r eo fh e m a t o x y ii n 在p h = 7 8 0 的t r i s - h c i 缓冲溶液中，扫描苏木素与d n a 作用的吸收光谱， 随着苏木素中d n a 的加入，在6 5 2 蛐附近出现了新的h e d n a 复合物的吸 西南科技大学硕士研究生学位论文第13 页 收峰。同时5 6 3n m 附近的特征吸收峰逐渐减小，d n a 对苏木素在5 6 3n l r t 处 具有明显的减色效应，在波长4 9 5n n l 和5 8 0n m 两处出现了等色点。如图2 2 所示，说明苏木素与d n a 之间发生了作用，形成了新的复合物“