（化学工程专业论文）猪胰脂肪酶催化制备光学戊醇的研究.pdf

四川大学硕士学位论文 6 5 4 3 1 7 猪胰脂肪酶催化制备光学戊醇的研究 化学工程专业 研究生雷永诚指导老师宋航教授 酶具有高效率和高度立体选择性，是一般催化剂所无法比拟的，它们在有 机合成中有极其重要的应用价值。近年来，随着非水相酶催化理论的发展，非 水介质中酶催化反应正获得越来越多的研究和应用，尤其是脂肪酶在非水有机 溶剂中催化拆分制备手性物质。 本文应用非水有机溶剂中脂肪酶催化酯交换反应的理论，用猪胰脂肪酶 ( p p l ) 分别催化外消旋2 甲基1 丁醇分别与三丁酸甘油酯、乙酸乙烯酯和三 乙酸甘油酯的酯交换反应，以获得( s ) 2 一甲基一1 丁醇。 在对以三丁酸甘油酯为底物来制备光学戊醇的进一步研究中，采用t l c 在 3 0 5 5 的拆分进度范围内快速、简便的监控拆分反应进度，其误差与用h p l c 相比不超过3 ；产品的分离提纯方面，精馏流程简单，可以直接得到产品， 易于工业化，但对于小规模实验难于得到高纯度产品；柱层析分离能力出众， 但处理量小，耗费试剂多，难以工业化，实验室研究宜二者结合，扩大规模宜 用精馏；通过实验，确定了反应至5 5 为最佳拆分点，以获得高纯度、高产 率的产品；温度和水分的升高不仅使p p l 酶活降低，而且会引起选择性降低 甚至可能使p p l 选择性整体表现出逆转。 在以乙酸乙烯酯为底物兼作有机溶剂的新体系中，通过实验研究，除去反 应副产物乙醛，保证拆分顺利进行；实验确定了游离p p l 在该体系拆分的较 佳操作参数：温度2 5 ，p h ；7 。5 ，底物浓度2 - 甲基1 一丁醇：乙酸乙烯酯为1 ： 1 6 ( m o l m 0 1 ) ，转速2 6 0 r p m 。在该条件下能获得光学纯度为7 2 3 的( s ) 一2 甲基一1 丁醇。催化拆分过程的能力方面，固定化酶优于游离酶，极性载体效果 好于疏水性载体，在考察的载体中，硅藻土固定化酶尤为出色。 通过实验，得到以三乙酸甘油酯为底物、p p l 催化制备光学戊醇的操作参 数条件：含水量o 4 ( v v ) ，温度4 0 c ，p h = 7 5 ，底物浓度2 甲基一1 丁醇： 四川大学硕士学位论文 三乙酸甘油酯为1 ：1 3 ( m o l m 0 1 ) ，转速2 6 0 r p m 。实验中获得了光学纯度为 6 2 6 的产品。催化拆分能力的比较实验证实，固定化酶效果优于游离酶，极 性载体好于疏水性载体，在考察的载体中，硅藻土固定化酶最佳。 尽管改变底物使得产品的纯度降低，但从经济上的、扩大生产规模的角度， 本文的研究有着一定的积极意义；同时，为寻找制备光学戊醇更好的途径提供 了重要的依据和经验。 关键词脂肪酶酶固定化酶催化酯交换( s ) 一2 一甲基- 1 - 丁醇 i i 婴业查兰堡主芏堡堡墨 s t u d y o f p r e p a r a t i v e p r o d u c t i o n o f ( s ) - 2 一m e t h y l - 1 - b u t a n o l v i ap o r c i n ep a n c r e a t i c l i p a s ec a t a l y s i s m a j o r ：c h e m i c a le n g i n e e r i n g g r a d u a t es t u d e n t ：l e iy o n g c h e n g s u p e r v i s o r ：p r o f s o n gh a n g l i p a s eh a sg r e a tp o t e n t i a la sc a t a l y s t sf o ru s ei no r g a n i cs y n t h e s i s ，b e c a u s eo f t h e i rh j 【g l lc a t a l y t i ce f f i c i e n c ya n ds t e r e o s e l e c t i v i t y a sr e s e a r c ho f l i p a s ec a t a l y z e d r e a c t i o ni nn o n a q u e o u sp h a s ep r o c e e d s ，m o r es t u d ya n da p p l i c a t i o na r er e p o r t e d b e c a u s eo ft h ei m p o r t a n c eo fc h i r a ld r u g s ，c o n s i d e r a b l ee f f o r t sh a v eb e e nm a d ei n d e v e l o p i n gb i o t r a n s f o r m a t i o nf o r t h e p r o d u c t i o no f c h i m ld m g s w i t ht h et h e o r yo fl i p a s e s c a t a l y z e dt r a n s e s t e r i f i c a t i o ni n n o n a q u e o u so r g a n i c m e d i a , r a c e m i c2 - m e t h y l - 1 - b u t a n o lw a sr e s o l u t e db yp o r c i n ep a n c r e a t i cl i p a s e ( p p l ) w i t h t r i b u t y r i n ，v i n y la c e t a t ea n dt r i a c e t i nr e s p e c t i v e l ys e r v e da ss u b s t r a t ea n d o r g a n i cp h a s e t h u s ，a no p t i c a la c t i v ea l c o h o l ，0 ) 一2 一m e t h y l 一1 一b u t a n o lw a so b t a i n e d i nt h ep r e p a r a t i v er e s e a r c ho ft h ea l c o h 0 1w i t ht r i b u t y r i ns e r v e da ss u b s t r a t ea n d o r g a n i cp h a s e ，at l c m e t h o df o r q u i c m y a n d c o n v e n i e n t i v e l ym o n i t o r i n gr e s o l u t i o n r e a c t i o nw a sd e v e l o p e d w h i c hi ss u i t a b l ei n m a g cf r o m3 0 t o5 5 r e a c t i o n p r o c e e d i n ga n dw i t h 士3 d e v i a t i o nc o m p a r e dw i t hh p l c ；p u r i t yo fp r o d u c tw a s i n c r e a s e db yc o m b i n i n gd i s t i l l a t i o nw i t hc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y i n s e p a r a t i o n p r o c e s s ；t h ea l c o h o lw i t hh i g hp u n t ya n dp r o d u c t i v i t yi so b t a i n e da t5 5 r e a c t i o n p r o c e e d i n g ；h i g h e rt e m p e r a t u r ea n dm o r ew a t e rn o to n l yd e n a t u r ep p l ，b u ta l s o d e c r e a s es t e r e o s e l e c t i v i t yo fp p l i nan e w s y s t e mw i t hv i n y la c e t a t es e r v e da ss u b s t r a t ea n do r g a n i cp h a s e ，t h e r e s o l u t i o n p r o c e e d e d s m o o t h l y a f t e r a c e t a l d e h y d e w a sr e m o v e d b y 4 as i e v e s u i t a b l eo p e r a t i o nc o n d i t i o n sf o rt h en e w s y s t e mi ne x i s t e n c eo ff r e ep p lw e r e i l 四川大学硕士学位论文 a c h i e v e d t h e c o n d i t i o n si n c l u d et 2 5 ，p h = 7 5 ，s u b s l r a t i o n p r o p o r t i o n d - 2 m e t h y l - 1 一b u t a n o l ：v i n y l a c e t a t e = 1 ：1 6 ( m o l m 0 1 ) s t i r r i n g r a t e 2 6 0 r m p ( s ) - 2 - m e t h y l - l - b u t a n o lw i t h7 2 3 o p t i c a lp u r i t yw a s o b t a i n e du n d e rt h ec o n d i t i o n s a b o v e a sf o r c a t a l y z i n ga b i l i t y , i m m o b i l i z e d p p l s u r p a s s e s f r e ep p l p o l a r s u p p o r t s s u r p a s sh y d r o p h o b i c o n e si nt h ed i v e r s i t yo f s u p p o r t s i ts h o w s t h a tc e l i t ei sg r e a t e r t h a na n yo t h e r s u p p o r t a st oa n o t h e rn e w s y s t e mw i t ht r i a c e t i ns e r v e da ss u b s t r a t ea n do r g a n i cp h a s e a v a i l a b l ec o n d i t i o n sa r ea sf o l l o w ：t 4 0 ，p h = 7 5 ，s u b s t r a t i o np r o p o r t i o n d t - 2 - m e t h y l 1 - b u t a n o l ： 砸a c e t i n = l ：1 3 ( m o l m 0 1 ) ，s t i l t i n g r a t e 2 6 0 r m p ( s ) - 2 - m e t h y l 一1 一b u t a n o l 谢t h6 2 6 o p t i c a lp u r i t yw a so b t a i n e du n d e rt h ec o n d i t i o n s a sf o rc a t a l y z i n ga b i l i t y , i m m o b i l i z e dp p li s p r i o rt o f r e ep p l p o l a rs u p p o r t s s u r p a s sh y d r o p h o b i cs u p p o r t si nt h ed i v e r s i t yo fs u p p o r t s i ts h o w st h a tc e l i t ei s g r e a t e rt h a na n y o t h e rs u p p o r t o p t i c a lp u r i t yo f p r o d u c t sb e c o m el o w e ra f t e rr e p l a c i n gs u b s t r a t ew i t hn e w o n e s ， b u tt h er e s u l t sh a v et h e i rv a l u ef r o me c o n o m i c a la n di n d u s 埘a l v i e w p o i n t a n di tc a n p r o v i d es o m ee x p e r i m e n t a lb a s i sa n de x p e r i e n c ef o rf u r t h e rr e s e a r c h k e yw o r d s ：p o r c i n ep a n c r e a t i cl i p a s e ；i m m o b i l i z e de n z y m e ；( s ) - 2 - m e t h y l 1 - b u t a n o l ； l i p a s et r a n s e s t e r i f i c a t i o n 型型查兰塑圭兰竺堡兰一 1 1 手- 陡物的应用及发展 第一章前言 手性( c h i r a l i t y ) 是自然界的属性，是用来表达化合物分子由于原予的三维 排列引起的结构不对称的术语。手性物的重要特征是该物体与它的镜象不能互 相重叠，如同人的左右手关系，这一不对称现象取决于有机分子的立体结构。 不对称原子有两种立体结构，彼此间互为镜象关系并分别用r 和s 表征。同样 地存在着不对称分子，而一对互为镜象关系的分子则称为对映体( e n a n t i o m e r ) 。 不对称分子有一些独特的性质。在光学上，不对称分子能使平面偏振光产生偏 转，这种光学行为称作旋光性，它是测量手性化合物纯度的一种方法。但把两 种互为对映关系的手性化合物等量混合在一起时，对偏振光的作用便消失了。 因此，在化学上把这种混合物称为消旋混合物( m e e m a t e ) 。 手性化合物在有机化学、生物化学和药物化学等领域比较常见，是非常重 要的一大类化合物，尤其在生物化学和药物化学中，因为生物大分子几乎都是 手性的。例如，自然界构成生命的氨基酸都是l 氨基酸，d n a 和r n a 的 核糖和脱氧核糖都是d 型的，而蛋白质和d n a 的螺旋结构又都是右旋的，不 同的手性在生命中发挥着独特的功能1 2 】。手性化合物在生命活动中具有重要作 用，目前绝大多数化学合成药物都是以外消旋混合物形式生产销售。实际上，其 药物作用包括酶的抑制、膜的传递、受体结合等，均和药物的立体构型有关。故 对药物而言，通常并非两种异构体均具有相同的活性。例如心得安的( 固一( 一) 异构体的疗效是纽) 一( 十) 一异构体的1 0 0 倍，又如沙利度胺( t h a l i d o m i d e 又称反 应停) 是一种外消旋的手性药物，其( 尺) 一异构体具有镇静作用，而一异构体则 具致畸功能，故妊娠妇女服用此药后，多例出现了海豚状畸变胎儿。惨痛的教训 使人们认识到对手性药物的立体异构体必须分别进行考察，慎重对待。正是由予 上述原因，与手性技术有关的科学研究得到了蓬勃发展。从1 9 8 9 年起欧洲每年 召开一次c h i r a le u r o p e 会议；美国也于1 9 9 3 年开始每年召开一次c h i r a lu s a 会议；近年来还出版了两本专以手性为名的杂志：c h i r a l i t y 和t e t r a h e d r o n 四川大学硕士学位论文 a s y m m o r y 。据统计咖至1 9 8 2 年为止大部分的合成药物是以消旋体形式上市的， 合成的消旋体与光学纯药物的上市比例为7 ：l ，到1 9 8 5 年仍未有多大的变化， 而到2 0 0 0 年合成的手性药物中以单一对映体上市的比例估计可达8 0 。促使 这一数字发生惊人变化的原因有：药物管理部门要求产品开发商除了应提供 消旋药物的药理和毒性状况外，还应对每一对映体的情况作出详细描述。近 年来在光学纯化合物合成上取得了很大的进展，使得大量制备单一对映体成为 了可能。由此可见，手征性成为生命科学中一个关键要素 4 , 5 3 。 手性的重要性不仅表现在与生物相关的领域，由于旋光纯化合物所具有的 特殊性质和潜力功能，所以在功能材料领域、分子电子学、分子光学、特殊材 料等方面得到愈益广泛的关注，如液晶、非线性光学材料等方面开始显示出诱 人的前景”。因此，作为生产旋光性物质的手性工业在现代科学技术中占有 突出的地位。 在环保方面，只含单一对映体的各类手性物质势必极大地减少其对环境的 污染，这也是环保方面所提出的重要课题。不对称合成是绿色化学的重要组成部 分，生物催化制各对映体条件温和、低能耗、低污染甚至无污染符合现代绿色 化工发展方向。 因此，光学活性化合物的制备已成为众人注目的焦点，世界各国许多著名 大学和研究机构纷纷致力于该领域的研究 1 2 手性物的制备方法 随着人们对手性作用认识的不断深入，对具有光学活性手性物质的需求越 来越大，对其纯度的要求也越来越高。广阔的应用前景和巨大的市场需要推动 了探索新的更有效的获得手性物质方法的研究唧3 。目前获得光学纯( o p t i c a l 咖l 时) 化合物的主要方法8 ，1 n 1 43 有：手性源合成法、不对称合成法、外消旋 体拆分法。 1 手性源合成法 以手性物质为原料合成其他手性化合物。这种方法是有机化学家最常用的 方法。但是由于天然物质的种类有限，要合成多种多样的手性产物会遇到很大 的困难，而且步骤繁多韵合成路线也使得最终产物成本十分高昂。 2 型型查兰堡主堂垡堡壅 2 不对称合成法 在催化剂或酶的作用下合成得到的手性物质的方法。化学不对称合成及生 物不对称合成近2 0 年来取得了长足进步，并且已开始进入工业化生产。但是化 学不对称合成高光学纯度( 如e e 9 0 以上) 的反应仍然有限，即使如此，所 得产物的光学纯度对于多数应用仍不够高。生物不对称合成具有很高的对映选 择性，反应介质通常为缓冲溶液，反应条件温和，但对底物的要求高，反应慢， 产物的分离困难，因而在应用上也受到定的限制。 3 外消旋体拆分法 是在手性试剂的作用下，将外消旋体拆分成纯对映体。这种方法已被广泛 使用。据统计，大约6 5 的非天然手性药物是由外消旋体或中间产物的拆分得 到的。对映体的存在是自然界的一种普遍现象，然而这些对映体大多以外消旋 体的形式存在。外消旋体是由相等数目的对映分子组成的。外消旋体“拆分” 是指将一个外消旋体的两个对映体分开，使之成为单一旋光体。拆分外消旋体 的方法很多，目前主要有以下几种方法c 3 , 9 ： ( 1 ) 结晶法拆分在晶态的情况下，对映体分子之间的晶间力的相互作用 是有明显差别的。若外消旋体所形成的晶体是外消旋混合物，则可直接在其过 饱和溶液中加入单一对映体晶种进行诱晶得到该对映体。依加入晶种方式的不 同，可分为同时结晶和有择结晶两类。同时结晶是在过饱和溶液两个区域分别 加入相反手性的晶种，同时得到两种对映体结晶。有择结晶是轮流加入两对映 体晶种以更迭诱导其结晶。 ( 2 ) 化学拆分法与纯手性试剂形成非对映体盐或共价衍生物，然后利用 非对映体的性质差异进行分离( 如分级结晶) ，再将衍生物还原为纯对映体。 虽然这种古老的方法现在仍在广泛应用，但费时，消耗大，适用的化合物种类 也多限于酸、碱物质。 ( 3 ) 生物催化剂作用下的拆分可分为酶法和微生物法，利用酶或微生物 对手性对映体具有专一识别的特性，消耗掉一种对映体而得到另一种对映体。 本质上，微生物法属于酶法，其催化作用是通过微生物细胞内的酶来实现的。 酶可以被认为是生物化学反应的具有专一陛的非对称催化剂，一般存在于生物 体内。但这些酶既可以在生物体内，也可以在生物体外起作用，因此微生物的 作用，也就是酶促的作用。 ( 4 ) 色谱分离法的拆分可分为气相色谱法和液相色谱法，气相色谱仅适 用于分子量低且对热稳定性好的化合物的分析：液相色谱法的适用范围大，且 可用于制备分离。 ( 5 ) 膜拆分法又可分为液体膜拆分法和手性固体膜拆分法。前者基于 选择性萃取，后者基于对映体间亲和性的差异。从大量制备的角度看，膜法具 有优势，但目前选择性和效率还比较差。 上述外消旋体拆分方法各有其特点和适用对象。物理法利用两种对映体的 结晶形态不同，直接进行结晶机械分离，此法生产效率低，只适用于极少数产 品：化学拆分利用手性试剂与两种对映体形成复合物的热力学和动力学、反应能 力、反应速度、物理性质不同进行合成或拆分，需要手性试剂，工艺复杂，成 本高，环境污染严重但已有工业应用，但在合成中，由于有的手性催化荆含有重 金属，在医药上应用受一定限制。色谱分离法膜拆分法拆分快速，产物纯度高， 简便，但需要手性分离介质，处理量小，成本高。 1 3 脂肪酶拆分外消旋化合物的发展 1 3 1 脂肪酶拆分外消旋体的发展概述 在制备拆分外消旋体的的过程中，利用生物催化来制备光学纯对映体的方 法正愈来愈显示出它的重要性。1 9 8 4 年，美国的k l i b o n a v ”】成功的实现了猪胰 脂肪酶在9 9 的有机溶剂中催化三丁酸甘油酯与醇的转酯反应，并证实了酶在 1 0 0 ( 2 高温下，不仅保持稳定，还显示出很高的催化转酯活力。这一发现带来了 一次革命性飞跃，并成为生物化学和有机合成研究中一个迅速发展的领域。 有机介质中酶催化反应具有以下新特征和优势【1 4 】： ( 1 ) 可进行水不溶性化合物催化转化，使酶的作用底物范围大大拓宽； ( 2 ) 改变反应的平衡点，使水溶液中不能发生的反应向所期望的方向进行： ( 3 ) 由于酶在有机溶剂中结构上“刚性”的增加，对底物的区域专一性和对 映体专一性都大大提高，从而使实现对酶催化选择性的有目的调控成为可能； ( 4 ) 酶的热稳定性大大提高： ( 5 ) 酶不溶于有机溶剂，反应后易于回收和重复利用； 4 四川大学硕士学位论文 ( 6 ) 可避免长期反应中微生物的污染； ( 7 ) 减少和防止由水引起的副反应； ( 8 ) 可方便的利用对水分敏感的底物进行反应； ( 9 ) 当使用有机挥发溶剂作为介质时，反应后的分离过程能耗降低。 目前，用于拆分外消旋化合物的酶多数是水解酶，而且绝大多数为脂肪酶。 随着非水介质酶学的发展，为解决外消旋化合物的拆分，特别是外消旋醇的拆分 这一难题带来了希望。有关脂肪酶在有机溶剂中的应用的研究报道很多【1 5 | 1 6 l ， a m k l i b a n o v 1 6 17 j 在有机溶剂中拆分制备了大量的光学活性酯、酸。在有机溶 剂中拆分醇的第一篇报道也是来自于a m k l i b a n o v 1 如小组的工作。他们将外消 旋的醇溶解在无水乙醚或庚烷中，以猪胰脂肪酶为催化剂通过立体选择性的酯 交换反应达到拆分的目的。其中s 一醇及r 一酯的对映体过量( e e ) 在9 0 1 0 0 之间。还有g e r a l dk i r c l m e r 【1 6 】等人用猪胰脂肪酶和酵母脂肪酶在非水相有机溶 剂中催化醇与酸的酯化和醇与酯的酪交换反应，所获得产物的光学纯度多数达 9 0 e e 以上。a l e x a n d e rm k l i b a n 0 4 ”】报道猪肝羰基酯酶在两相水一有机溶剂 的系统中可用于拆分许多一级及二级手性醇，如3 一甲氧基一卜丁醇，3 一甲基一1 一 戊醇，香茅醇等。曹淑桂l 8 1 等人通过调控因素( 如温度、p h 、水分等) ，尝试了 提高酶的活性和立体选择性的方法，在无溶剂体系中对2 一辛醇进行了拆分。这 种无溶剂体系不仅增加了底物浓度，提高了转化率，而且简化了产物的后处理， 避免了溶剂的毒性，降低了生产成本，使大规模制备单一手性的2 辛醇成为可 能。 脂肪酶成功地应用于生产精细化工产品的一个代表性例子是，日本田边制 药用脂肪酶拆分外消旋的3 甲基( 4 一甲氧基苯基) 一环氧丙醇酯，制备了 ( 一) 一( 2 足3 固一3 一( 4 一甲氧基苯基) 环氧丙酰胺【1 9 1 ，它是一种心血管药物的单一手 性中间体目前，利用该技术可以达到年产数百吨规模另外，脂肪酶拆分外消旋 丁酸缩水甘油酯，制各一丁酸缩水甘油酯也已经达到了工业水平刚。紫杉醇 ( t a x o ! ) 是一种有效的抗瘤药物，此药物最初由太平洋紫杉树干中提取制备，但是 含量极低，而且来源有限由于它也是一种单一手性药物，如果采用化学方法合 成，在引入手性源时，通常要使用重金属催化剂，容易造成严重污染p a t e l 等利 用脂肪酶催化拆分外消旋的氮杂环丁酮衍生物，然后以此为前体合成单一手性 紫杉醇【2 ”他们把脂肪酶吸附在聚丙烯树脂珠上，这种固定化酶在该水解条件 下能反复使用l o 次以上而未见酶活损失 1 3 2 脂肪酶结构及催化性能概述 脂肪酶1 2 2 1 ( l i p a s e ，甘油三酯酰基水解酶，e c 3 1 1 3 ，) 是分解脂肪的酶， 是一类特殊的酯键水解酶。在非水介质中，脂肪酶具有以下特点p j ：( 1 ) 在非 极性溶剂中特别稳定，( 2 ) 对大小、构象及立体不同的多种底物具有催化活力， ( 3 ) 在非极性溶剂中催化酯化反应的对映体选择性比常规水解反应。脂肪酶可 催化的底物范围很广，这说明其蛋自骨架富有很好的柔性，从而可容纳许多大 小不同、构象各异的底物分子。脂肪酶的氨基酸顺序可能有较大的差别，但却 具有相似的折叠方式和活性中心。脂肪酶均为s e r 酯酶，蛋白链中含有d 1 3 水 解酶的典型折叠结构，即大部分平行的1 3 片段围绕在t 1 螺旋核心的周围。活 性中心s e r 周围具有共同的五氨基酸序列：g l y - x s e r - x - g l y 。这种折叠结构使 得所有的脂肪酶催化中心的三个- s e r , h i s ，g i u a s p 一具有相同的排列方式：s e r 处于1 3 一片段与a 螺旋之间的发夹结构弯角处，其他的两个氨基酸h i s 和 o l u a s p 位于s e r 的一侧，形成的氧离子空洞位于s e r 的另一侧，从而形成了所 有的脂肪酶的共同催化机制：在水溶液中，一个“盖子”覆盖在活性中心位点 上，在底物( 如醇、酸或酯等) 存在的情况下，酶的构象发生变化，“盖子”打开， 暴露出活性中心，催化底物进行转化。 脂肪酶的天然底物是三酸甘油酯，三酸甘油酯的醇部分是甘油，而酸部分 是水不溶的1 2 个碳原子以上的长链脂肪酸 2 4 l 。脂肪酶重要的特征是他们只能 在异相系统，即在油( 或脂) 一水的界面上作用，对均匀分散的或水溶底物不作 用，即使作用也极缓慢，而酯酶却能水解可溶的或完全均匀分散的底物，因此 脂肪酶也可以说是专门在异相系统，或水不溶系统的油( 脂) 一水界面上水解酯 的酶瞄1 。8 0 年代后期以来，界面酶学和非水酶学的研究与应用取得了突破性的 进展，极大地促进了脂肪酶多功能催化作用的开发跚。 脂肪酶是水解酶，它能催化不同大小的分子和不同结构的底物进行不对称 水解或不对称酯化。脂肪酶容易得到，反应时不需要昂贵的辅因子，拆分反应 操作简便，并可以应用在无水有机溶剂中。脂肪酶催化不对称合成可制各具有 光学活性的醇、脂肪酸及其酯、内酯等医药和农药中间体，还可以合成抗生素 6 型型查堂堡主兰篁堡苎一 和香料等大环内酯、有医药价值的糖酯和固醇酯等。近几年来，利用脂肪酶进 行拆分引起国际上的广泛重视，它己成为制备手性化合物的有效手段之一1 。 脂肪酶在拆分醇或酸的旋光异构体时，曾采用的方法是先通过化学处理将 其转化成酯，然后再用脂肪酶进行水解，这时酯的一种旋光异构体会以快得多 的速度被酶水解，反应完成后，把未水解的酯除去，即可得到具有光学活性的 醇或酸。 实际工作中，常用下列手段来优化脂肪酶的拆分效果b 8 j ： 1 ) 改变底物或酶的结构，脂肪酶可以通过改变其自身结构( 如化学或物 理修饰) 来提高拆分效果。 2 ) 改变反应条件，特别是通过改变溶剂系统，可提高酶的手性识别能力。 3 ) 两次拆分，是指通过对外消旋体的第一次拆分反应进行到转化率约为 5 0 时，分别回收底物和产物，然后将光学活性的底物和产物作为第二次拆分 的底物，并选择适当的酶体系，使其选择性地作用于底物中反应快或慢的异构 体以提高其中比例高的对映异构体的光学纯度。二次拆分可选择同一种酶， 通过改变反应条件或选择二种不同的酶体系进行。 1 4 固定化酶 1 4 1 固定化酶的目的 固定化酶又称固相酶。其是通过物理或化学的方法把酶束缚在一定空间内 仍具有酶活性的一种酶制剂2 9 1 。它能够以固相状态作用于底物进行催化反应。 固定化酶的主要优点是1 3 0 】：在催化反应以后很容易从反应系统中分离出来，不 仅固定化酶可以反复使用，而且产物不受污染容易精制：固定化后的酶大多数 情况下其稳定性增加，仅有少数的稳定性下降；固定化酶有一定的形状和机械 强度，可以装填在反应器中长期使用，便于实现生产的连续化和自动化，可适 用于工业化大规模生产。固定化酶在生产中的应用逐渐增多，为酶催化的应用 开辟了新的途径。 1 4 2 固定化酶的方法 固定化酶的制备方法主要有吸附法、共价法、交联法和包埋法四种刚。 四川大学硕士学位论文 根据酶的性质和使用目的，可以从中选择一种方法进行固定化。 ( 1 ) 吸附法3物理法、离子交换法【3 3 】等。物理法使酶直接吸附在载体 上，常用的载体有有机载体和无机载体。离子吸附法是将酶吸附在含有离子交 换基团的水不溶性载体上，常用的载体有阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。 ( 2 ) 包埋法将酶包埋于凝胶或其他聚合体格内，这种结构可以防止酶渗 出，但是底物能渗入格子内与酶相接触。包括：聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射 包埋法、卡拉胶包埋法和微囊法等。 ( 3 ) 共价键结合法将酶蛋白分子上的非必要基团和活化的载体表面上的 反应基团之间形成化学共价键而将酶固定在载体上。 ( 4 ) 肽键结合法在酶蛋白与水不溶性载体间形成肽键而被固定的方法。 此类方法包括：酰基迭氮衍生物法、溴化氢活化的多糖法、碳酸纤维素衍生物 法、马来酰衍生物法、异氰衍生物法和硫酰胺结合法等。 ( 5 ) 交联法又称架桥法借助与双官能或多官能试剂与酶分子中的氨基 酸或羧酸发生反应，使酶蛋白分子之间发生交联，结成网状结构而支撑的固定 化酶。由于酶蛋白的官能团如氨基等参与此反应，所以酶的活性中心构造可能 受到影响而使酶失活。交联的试剂有很多种，最常用的是戊二醛。 酶用各种固定方法固定后，依所用方法的不同，酶的活力及稳定性都有 所不同，每一种方法都有其优点和缺点，如表1 1 所示。由于酶在有机溶剂中不 同于在水中，不存在脱落流失问题，因此吸附法最为常用。 表1 1 各种固定化方法的优缺点比较表 ! 垒垒：! ：! 删! 鲤2 1 垡i 璺塑坐巴宝! 垒2 坐2 f 些垫磐2 垒! 韭型i 2 翌 性能吸附法 包埋法共价键结台法 交联法 物理吸附法离子吸附法 8 四川大学硕士学位论文 1 5 制备( 一2 一甲基一卜丁醇( 光学戊醇) 的意义 ( s ) 一2 - 甲基- 1 - 丁醇( 又称光学戊醇) 是重要的药物中间体，在药物合成 中有重要的作用。同时，在新型材料开发上也显示出其广阔的前景。用它作为 添加剂参加合成的旋光液晶 ”，是光活型液晶，色泽鲜艳。性能稳定，可用 来做新型彩色电视。由其做成的超薄型彩电驱动电压仅需6 伏，不仅省电而且 响应速度快，因此开发这种新型低驱动电压液晶材料，对于电视机、显示器等 产品的换代具有重要的意义。目前，国内无光学戊醇的生产厂家。随着我们人 民生活水平的提高，高科技技术在民用工业上的应用，以光学戊醇为原料合成 的产品的应用将越来广泛，如液晶、香料、特殊增塑剂、农药等。因此从市场 前景来看，具有极大的开发价值。 1 6 本文的工作 在以猪胰脂肪酶( p p l ) 催化拆分d l - 2 一甲基- 1 - 丁醇的进一步研究探索中， 本文主要进行阻下工作： ( 1 ) 在前述研究成果的基础上，对以三丁酸甘油酯为底物拆分制备光学 戊醇作迸一步的研究探索。具体包括拆分监控手段、产品的分离和反应最佳点 的确定、影响酶催化部位构象转变的因素： ( 2 ) 以较廉价的乙酸乙烯酯为底物，猪胰脂肪酶( p p l ) 催化拆分d l 2 甲 基一1 - 丁醇工艺的操作参数研究； ( 3 ) 以同样较廉价的三乙酸甘油酯为底物，猪胰脂肪酶( p p l ) 催化拆分 d l 2 一甲基- 1 一丁醇工艺的操作参数研究。 9 四川大学硕士学位论文 第二章e 2 - - - j - 酸甘油酯为底物制备光学戊醇的进一步 研究 近年来，酶在有机相中行为是手性拆分技术研究的一大热点。很多重要的 光学活性醇、卤代酸、酯都通过酶在有机相中转酯得以完成。光学戊醇通过酶 法在以三丁酸甘油酯为底物的有机相中进行拆分获得已有文献报道 3 5 3 引。本实 验以猪胰脂肪酶( p p l ) 为生物催化剂，以三丁酸甘油酯( t b t ) 为底物兼作 有机相，来完成对( 优，) 一2 甲基1 - 丁醇的拆分。反应原理如下： ( ) r 3 + 0 h + r i c o o r 2 - 生斗( r i c o o r 3 + + r 3 * o h ) + r i c o o h 外消旋醇光学活性产物 在已有的基础上 3 2 。州，本实验从拆分过程的监控手段、产品分离提纯、拆 分最佳点的确定、酶构象转变的影响因素几个方面进行了进一步研究探索。 2 1 拆分过程的监控 根据拆分动力学，为了获得高光学纯度、高产率的光学活性产物，需要对 拆分进程进行监控；酶作为一种生物催化剂，其活性易受温度、含水量、p h 值等诸多因素的影响，这也决定了需对拆分适时监控。同时有效的监控手段是 研究酶反应动力学不可缺少的手段。 常用的拆分进程的监控手段有g c ，h p l c 。对于本反应体系，存在高沸点 的三丁酸甘油酯和二丁酸甘油酯，用g c 分析需要对样品进行预处理，把这两 种高沸点的酯甲酯化处理，然后用一有机相萃取转化后的产物进行分析，但这 样要引入大的误差。用h p l c 监控，精确度商。但也存在对样品的预处理，除 去引入此体系的酶及其他生物大分子( 加入的是粗酶) ，否则，会对色谱系统的 性能造成损害以及影响分析结果。同时，h p l c 投入过高。 t l c 是一种重要的分离、分析手段，其具有操作简单，投资少，分离快等 优点。本实验采用了t l c ，约8 r a i n 即实现对反应体系样品中的丁酸异戊酯、 三丁酸甘油酯、二丁酸甘油酯的分离，通过扫描和软件分析获得了定量的结果。 0 四川大学硕士学位论文 通过与h p l c 监控结果的对比，证实了此法的可行性。 2 1 1l p k c 对拆分过程的监控 2 1 1 1h p l c 的概述 高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上发展而成的分离分析方法， 具有分离效率高、分析速度快、应用范围广等特点。 1 色谱工作原理 色谱是一个建立在吸附、分离、离子交换、亲和力和分子尺寸等基础上的 分离过程，它利用不同组分在相对运动、相互不溶的两相中，其中相对静止的 一相称固定相，而另一个相对运动的相称为流动相，利用吸附能力、分配系数、 离子交换能力、亲和力或分子大小等性质上的微小差别，经过连续多次在两相 的质量交换，使不同组分得到分离。不同组分性质上的微小差别是色谱分离的 根本或必要条件；而性质上微小差别的组分之所以能得到分离是因为它们在两 相之间进行了上千次甚至上百万次的质量交换，这是色谱分离的充分条件p 7 o 2 影响h p l c 分离的因素 大多数的h p l c 分离优化的策略都是基于分离方程3 8 1 r 。= ( 1 4 ) 心一1 ) n o5 ( 1 + 女) 】 ( 2 1 ) 由上式可见，要提高分离度可以有三个途径，即增加n ( 色谱柱理论塔板 数) 、a ( 流动相选择性) 及k ( 溶剂强度) 值，n 值主要由色谱柱的性能上 所决定，按照动力学理论制备高效的色谱柱即可获得最大的n 值。提高分离度 的较为简便的途径是改变a 和k 值。在h p l c 中，流动相的种类和配比显著 影响着溶质的a 和k 。值，因此，h p l c 分离优化的关键是流动相的最优化。 3 流动相的选择的原则 在液相色谱中，选择合适的溶剂作流动相是提高分离选择性的关键因素。 通常先确定合适的溶剂强度( 使k 在1 1 0 之间) ，然后改变溶剂的种类及配比， 直到分离改善为止。另外合适作流动相的溶剂，其物理性质必须符合高效液相 色谱分离操作的基本要求，能够保证分离过程重复地、证常地进行。因此选择 流动相时应注意下列几个因素【3 9 】。 四川大学硕士学位论文 ( 1 ) 溶剂与检测器匹配首先要考虑溶剂的物理性质对检测效果的影响。 例如使用示差检测器，应尽量选择与试样的折射率相差较大的溶剂，以便提高 检测灵敏度。在使用紫外检测器时，要求所选溶剂在检测波长处没有强吸收。 ( 2 ) 流动相的纯度由于大量溶剂流经色谱柱，一旦带入杂质，日积月累， 将导致检测器噪声增加，柱效降低，同时也影响所收集馏分的纯度。因此一般 采用分析纯试剂，必要时可采用蒸馏等预处理进一步提纯溶剂。 ( 3 ) 所选溶剂不与固定相起作用流动相应与固定相尽量互不相溶，否则 会使固定相流失，柱效降低。 ( 4 ) 溶剂对试样的溶解能力流动相应能很好地溶解试剂( 否则在柱头易 产生部分沉淀) 。但极性范围宽的多组分样品，往往很难找到各组分溶解性能都 好的溶剂，只能采用再分离或采用梯度洗脱技术来提高分离度。另外，为了得 到强度合适的溶剂，常常将两种或两种以上不同强度的溶剂混合起来，此时必 须考虑它们是否互溶。尤其是在液固色谱中，当极性差异较大，强溶剂比例较 小的混合溶剂进入柱子后，柱头会优先吸附强溶剂，分析结果重现性差。解决 的办法是用足够的溶剂通过柱子，使其达到平衡。 ( 5 ) 溶剂的粘度和脱气处理溶剂的粘度高会降低试样组分的扩散系数，造 成传质速度缓慢、柱效下降。同时柱压随溶剂粘度增加而增大，因此所选溶剂 的粘度低些好。但低粘度溶剂易挥发，在色谱过程中会出现气泡而干扰检测器， 而且混合溶剂中挥发性大的组分一旦挥发，溶剂配比发生改变，使分析结果重 复性差。通常选择沸点比分析温度高3 0 c 的溶剂作流动相。溶剂脱气处理也是 不可少的一步。常用的脱气方法有：加热回流法、抽真空脱气法、超声波处理 法及用惰性气体驱赶法等。 4 分离度 h p l c 法的基本条件应达到多组分的相互分离。要分离得好，有两条途径： 一是谱带窄，即柱效高；再就是谱带间距离大。分离度和溶剂的强度( k ) 有 关，并且随着k ( k + 1 ) 的增加而增加。分离的质量用分离度( r e s o l u t i o n ) 。 即两谱带分离的程度来表示。如下式所示【4 0 】： r = ( t 2 - - t 。) ( 1 2 ) ( w 。+ 毗) ( 2 2 ) 式中t l 和t 2 为二相邻谱带的保留时间，w 和w ：为它们基线处的峰宽。r 即 2 四川i 大学硕士学位论文 为谱带l 和2 的分离度。重叠严重的谱带，其分离函数r 很小。所需涪峰的基 线分离( 即r 1 5 ) 对定量分析是十分必要的。由于靠近峰的基线位置易于测 量，基线分离简化了谱峰面积或峰高值的测量。分离度超过r = i 5 ，会使分离 更彻底。 2 1 1 2 实验部分 1 仪器及试剂 高效液相色谱仪：w a t e r s 5 1 5 型高效液相泵，4 4 1 型紫外吸收检测器，高效 液相色谱工作站，w a t e r s c l8 柱( 3 9 1 5 0 m m ) ：高效液相色谱仪，w a t e r s 5 1 5 ： 气相色谱仪，北京分析仪器厂；电子天平 甲醇、四氢呋哺( 分析纯，重新蒸馏并经0 4 5 9 m 纤维酯滤膜过滤) ，h 2 0 ( 蒸 馏水，并经0 4 5 p m 纤维酯滤膜过滤) ，三丁酸甘油酯，丁酸异戊酯。 2 反应标准进度图的绘制 ( 1 ) 标准反应系列的配制 以d l 一2 一甲基- 1 丁醇：三丁酸甘油酯为1 ：1 3 ( 摩尔比) 为始反应体系，分 别计算出d l 2 甲基1 丁醇在酶催化作用下其质量的转化率分别为1 0 、2 0 、 3 0 、4 0 、5 0 、5 5 时体系中三丁酸甘油酯和丁酸异戊酯的质量比，按照此 比例用电子天平配制标准系列。 ( 2 ) h p l c 检测分析 用高效液相色谱仪对标准系列进行分离分析，本实验使用反相色谱法。其 条件如下： 色谱柱：r p c i 8 尺寸：3 9 1 5 0 m m 流动相：甲醇水四氢呋喃( v ，v ) 1 6 0 ：3 5 ：5 流速：0 7 0 0 m l m i n 温度：3 0 检测波长：2 3 8 n m 反应达至u 4 0 时的谱图见图2 1 。 四川大学硕士学位论文 图2 i 两种酯的分离谱图 f i g 2 1t h ec h