（植物病理学专业论文）拟南芥tdna插入突变体的蛋白质谱分析.pdf

摘要 转基因植物中非预期效应的产生有着复杂的遗传和环境因素，现有的检测方法主要依靠对己 知的营养因子、抗营养因子和毒素等成分进行广泛的化学分析，但这些方法还存在着严重的不足， 特别是在可能出现未知的毒素或抗营养因子，以及缺少有效的检测方法的情况下，这种方法具有 很多局限性。为了研究非预期效应产生的机理和增加检测出非预期效应的可能性，需要采用各种 不同的、更加有效的策略。为此，本文以蛋白质组学方法来研究拟南芥t - d n a 插入突变体中蛋 白质表达谱的变化，为蛋白质组学方法在非预期效应研究中的应用奠定基础。 以模式植物拟南芥为材料，对采用t - d n a 插入方法获得的拟南芥突变体进行t a i l - p c r ， 扩增出t - d n a 的侧翼序列并测序，经过与拟南芥基因组数据库进行比对，确定t - d n a 的插入位 点。 选择t - d n a 插入位点分别位于基因间、内含子区、外显子区、基因上游和基因下游5 种不 同t - d n a 插入位点类型的1 2 个拟南芥突变体，在开花结束、衰老之前提取全蛋白进行差异蛋白 质组学分析。 对拟南芥突变体的差异蛋白质组学分析基于双向电泳，为获得其蛋白质组表达谱的全貌，采 用了1 7 c mp h 3 1 0 的i p g 预制干胶条进行第一向等电聚焦，随后进行1 2 5 的s d s - p a g e 。经考 马斯亮兰r 2 5 0 染色的双向电泳凝胶可以稳定地检测到4 0 0 - 5 0 0 个蛋白质点。 在双向电泳专业分析软件p d o u e s tv e r 7 2 的辅助下，对拟南芥突变体的蛋白质组表达谱进 行分析，分析结果显示，在拟南芥个体的蛋白质表达谱之间存在着较大的个体差异，说明在确定 转基因植物自然变异的基线标准方面还需要做很多工作，这是进行各种分析的基础。在1 2 个突 变体中，共有1 0 2 个表达量发生显著变化的蛋白质点经胰蛋白酶胶内酶解后进行m a l d i - t o f 分 析，其中，5 9 个点表达量上调，4 3 个点表达量下调。共有6 6 个蛋白质点通过数据库检索得到了 鉴定，它们分别属于初级代谢，1 5 6 能量传递，6 2 ；细胞生长、分裂，3 2 ；转录调控， 4 7 ：蛋白质合成与降解，6 3 ：贮藏蛋白，4 7 ；结构蛋白，6 3 ；信号传递，9 4 ：植物 防御，1 7 。2 ；次生代谢，3 2 ；功能未确定，2 3 4 ，说明外源基因的插入和表达对植物的生命 活动有着广泛的影响。但没有发现新蛋白，未发现植物生理、生化和代谢过程中发挥重要功能的 蛋白质或致敏和毒素蛋白质。 部分蛋白质点在拟南芥突变体中以较高的频率出现，如1 号蛋白质点，在分属5 种t - d n a 插入位点类型的9 种突变体中出现，可能预示着转基因植物中某种共有的变化机制及其在非预期 效应检测中作为标志性分子的可能性。 蛋白质组学技术是转基因植物中非预期效应的很有前景的一种研究方法，但在技术平台的优 化、保证特异性、灵敏度和其结果有效性方面还需要进一步加强研究。此外。蛋白质组学方法的 成功应用需要建立相应的数据库，其中应包含对应于转基因植物不同开发阶段和环境条件下的自 然变异信息。 关键词：转基因，拟南芥，生物安全，非预期效应，蛋白质组学 a b s t r a c t a f t e rs e v e nc o n s e c u t i v ey e a r so fg r o w t h ，t h ee s t i m a t e dg l o b a la r e ao ft r a n s g e n i cc r o p sf o r2 0 0 3 w a s6 7 7 0 0 0 0 0h a t h o u i g hn ou n d e s i r a b l ea n dh a r m f u le f f e c t st oh u m a nh e a l t ha n de n v i r o n m e n th a s b e e no b s e r v e dd u r i n gt h ec o m m e r c i a lp l a n t a t i o no ft r a n s g e n i cc r o p s ，t h es a f e t yi s s u eo ft r a n s g e n i cc r o p s i ss t i l le x t e n s i v e l yc o n c e r n e d f o rt r a n s g e n i cp l a n t s , u n a n t i c i p a t e de f f e c t sm a ya d d i t i o n a l l ya r i s ef r o m t h ep r o c e s so fi n t r o d u c i n gf o r e i g ng e n e so ra sar e s u l to ft h ee f f e c t so fe n v i r o n m e n t a lf a c t o r s g e n e t i c b a c k g r o u n do nt h ee x p r e s s i o no ft h et r a n s g e n e ( s ) t h ep o t e n t i a lo c , c u r r e n c eo fu n a n t i c i p a t e da l t e r a t i o n s i nt h ec o m p o s i t i o no fg e n e t i c a l l ym o d i f i e dc r o p sa sar e s u l to ft h eg e n e t i cm o d i f i c a t i o np r o c e s si so n eo f t h ek e ye l e m e n t so ft h es a f e t ya s s e s s m e n tp r o c e d u r e u n i n t e n d e d e f f e c t s m a y b ei d e n t i f i e d b y a n a n a l y s i s o ft h e a g r o n o m i c a l m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c so ft h en e wp l a n ta n da ne x t e n s i v ec h e m i c a la n a l y s i so fk e yn u t r i e n t s ，a n t i n u t r i e n t sa n d t o x i c a n t st y p i c a lf o rt h ep l a n t l i m i t a t i o n so ft h i sa n a l y t i c a l ，c o m p a r a t i v ea p p r o a c ha l et h ep o s s i b l e o c c n t r e n c eo fu n k n o w nt o x i c a n t sa n da n t i - n u t r i e n t s ，i np a r t i c u l a ri nf o o dp l a n ts p e c i e sw i t hn oh i s t o r yo f ( s a f e ) u s e ；a n dt h ea v a i l a b i l i t y o fa d e q u a t ed e t e c t i o nm e t h o d s s e v e r a ln e ws t r a t e g i e sh a v eb e e n d e v e l o p e dt oi d e n t i f yu n i n t e n d e da l t e r a t i o n si nt h eg e n e t i c a l l y m o d i f i e dc r o p st h a tm a yo c c u ra sar e s u l t o ft h eg e n e t i cm o d i f i c a t i o np r o c e s s t h e s ei n c l u d ec o m p a r a t i v ec h e m i c a la n a l y s i so fs i n g l ec o m p o u n d s i ng m c r o p sa n d t h e i rc o n v e n t i o n a ln o n - g mc o u n t e r p a r t s , a n dp r o f i l i n gm e t h o d ss u c ha sd n a r n a m i c r o a u a yt e c h n o l o g i e s ，p r o t e o m i c sa n dm e t a b o l i t ep r o f i l i n g t h e r e b y , w ee x a m i n et h ep o t e n t i a lo f p r o t e o m i c st op e r f o r mc o m p a r a t i v ea n a l y s e so fp r o t e i np a t t e r n sm a y b eo fi m p o r t a n c ef o rt r a n s g e n i c p l a n t ss a f e t ya s s e s s m e n t i no r d e rt os e a r c hf o ru n i n t e n d e dc h a n g e sd u et ot h eg e n e t i cm o d i f i c a t i o n ，t h ec o m p a r i s o n so ft h e s a m ep r o t e o m ei nw i l dt y p ea n dm u t a n ta r a b i d o p s i st h a l i a n aw a su n d e r t a k e n a r a b i d o p s i sp l a n t s ， c o l u m b i aw i l d - t y p es t r a i n ，w e l et r a n s f o r m e dw i t ha c t i v a t i o n - t a g g i n gv e c t o rp s k l 0 1 5b yf l o r a ld i p s e q u e n c e sf l a n k i n g t - d n ai n s e r t i o n sw e r ea m p l i f i e d u s i n g at h e r m a l a s y m m e t r i c i n t e r l a c e d p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o np r o t o c o l ( t a i l - p c r ) a n ds e q u e n c e da n dt h e ns u b j e c t e dt ob l a s t s e a r c h e s o ft h ep u b l i cd a t a b a s e st oi d e n t i f yt h et - d n a i n s e r t i o ns i t e at o t a lo f1 2m u t a n t sr e p r e s e n t5d i f f e r e n tt - d n ai n s e r t i o ns i t et y p e si n c l u d ei n t e r g e n i c ，i ni n t r o n ， i ne x o n ，u p s t r e a mo fag e n ea n dd o w n s t r e a mo fag e n ew e r es e l e c t e di nt h i ss t u d y t h ew h o l ep l a n t so f lg e n e r a t i o no f p p th e r b i c i d e r e s i s t a n t a r a b i d o p s i sm u t a n t w e r eh a r v e s t e db e t w e e nt h eg r o w t hs t a g eo f f l o w i n gc o m p l e t e a n ds e n e s c e n t ，a n ds t o r e da t - 7 0 cf o rt h ee x t r a c t i o no ft o t a lp r o t e i n t h e2 - dp a g eo ft h es a l n e p r o t e o m e i nw i l d t y p e a n dm u t a n ta r a b i d o p s i st h a l i a n aw a s u n d e r t a k e n w ec h o s eap hi n t e r v a l3 - 1 0i nt h ef i r s td i m e n s i o ne l e c t r o l p h o r e s i sf o ra no v e r v i e wo f t o t a l p r o t e i nd i s t r i b u t i o n ，a n dt om o n i t o rg l o b a lc h a n g e s t h a to c c u ri nt h ep r o t e i n sd u et og e n e t i cm o d i f i c a t i o n m a n yp r o t e i ns p o t sw e r eo b s e r v e do na2 - d p a g e g e l i m a g ea n a l y s i sd e t e c t e d4 0 0 - 5 0 0p r o t e i ns p o t s o n2 - dp a g e g e la f t e rs t a i n i n gw i t hc o o m a s s i e b r i l l i a n tb l u e 2 - d eg e l so fw i l d - t y p ea n dm u t a n ta x a b i d o p s i s p r o t c o m ew e l er b na n d4r e p l i c a t e sw e r ec a r r i e d o u t w i t ht h eu s eo fp d q u e s tv n7 2 s o f t w a r e q u a n t i t a t i v ev a r i a t i o no fp r o t e i ns p o t sb e t w e e n w i l d t y p e a n dm u t a n ta r a b i d o p s i si n2 - d eg e l sw e r ec o m p a r e d n l er e s u l t ss h o w e dt h e n a t u r a l v a r i a t i o n si np r o t e i np a t t e r n so fi n d i v i d u a lp l a n tw a so b v i o u s ，t h i si n d i c a t e dt h a tm o r ew o r ka r en e e d e d t od e f i n et h eb a s e l i n eo fn a t u r a lv a r i a t i o n s i t st h eb a s ef o rf u r t h e r a n a l y s i s o ns u m m a r yo ft h e c o m p a r i s o n s ，d i s t i n c tv a r i a t i o n sw e r es o r t i n t ot w oc a t e g o r i e s ：( i ) h i g h e ra c c u m u l a t i o nl e v e li nt h e m u t a n tp l a n t st h a ni nt h ew i l d t y p eo n e s ；( i i ) l o w e ra c c u m u l a t i o nl e v e li nt h em u t a n tp l a n t st h a ni nt h e w i l d - t y p eo n e s at o t a lo f1 0 2s p o t sw e r ec h o s e nf o ra b o v et w oc a t e g o r i e s p r o t e i n sw e r ec h a r a c t e r i z e d a f t e ri n g e lt r y p s i nc l e a v a g eb ym a s ss p e c t r o m e t r ya n dp e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t i n g 6 6p r o t e i n sw e r e i d e n t i f i e db ys e a r c h i n gs w i s s p r o t d a t a b a s e a c c o r d i n gt ot h e i rf u n c t i o n ，t h e s ep r o t e i n sw e r ed i v i d e d i n t ot h e f o l l o w i n gc a t e g o r i e s ，m e t a b o l i s m ，1 5 ，6 ；e n e r g y , 6 2 ；c e l lg r o w t h d i v i s i o n ，3 ，2 ； t r a n s c r i p t i o n ，4 7 ；p r o t e i ns y n t h e s i s ，6 3 ；p r o t e i n d e s t i n a t i o na n ds t o r a g e ，4 7 ；c e l ls t r u c t u r e ， 6 3 ；s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，9 4 ；d e f e n s e ，1 7 ，2 ；s e c o n d a r ym e t a b o l i s m ，3 2 ；u n c l e a rf u n c t i o n ， 2 3 4 t h e r ew e r en on e w p r o t e i n s ，p r o t e i n so f c r u c i a lf u n c t i o n ，a l l e r g i co rt o x i cp r o t e i n sd e t e c t e d s p o t sn o 1 w a sd e t e c t e di n9m u t a n t so fa l l5d i f f e r e n tt - d n ai n s e r t i o ns i t e t y p e s ，t h i sm a y i n d i c a t et h i s s p o t c o u l db e u s e da sb i o m a r k e rf o ru a n s g e n i ca r a b i d o p s i sd e t e c t i o na n ds a f e t y a s s e s s m e n t a tp r e s e n t ，t h ea p p l i c a b i l i t yo fp r o t e o m i ct e c h n i q u e si sb e i n gs t u d i e d ，t h ep o t e n t i a lo fp r o t e o m i c m e t h o d sj so b v i o u s , b u tf u r t h e r e x p l o r a t i o no fs p e c i f i c i t y , s e o s i t i v i t y a n dv a l i d a t i o na r cn e e d e d m o r e o v e r , t h es u c c e s s f u la p p l i c a t i o no fp r o t e o m i ct e c h n i q u e st ot h es a f e t ye v a l u a t i o no fg m f o o d sw i l l r e q u i r el i n k e dd a t a b a s e st ob eb u i l tt h a tc o n t a i ni n f o r m a t i o no nv a r i a t i o n si np r o f i l e sa s s o c i a t e dw i t h d i f f e r e n c e si nd e v e l o p m e n t a ls t a g e sa n de n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s k e yw o r d s ：t r a n s g e n i c ，a r a b i d o p s i s ，b i o s a f e t y , u n i n t e n d e de f f e c t ，p r o t e o m i e s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：三 运 时间：。妒丛年月名口日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 青 时间：工一么年6 月 。日 导师签名谰亏和 帆华年肪日 ! 里窒些坠兰璧篁圭兰竺墼兰 叁= 兰! ! 童 第一章引言 1 现代农业生物技术的发展及生物安全 近三十年来，生物技术的发展在农业领域取得了重大的成果，并逐渐发展成为强大的现代生 物技术产业，给人类社会和经济的发展带来了深远的影响。生物技术的应用可以减少生产成本， 提高作物产量，降低病虫害防治的农药使用量，减少对环境的破坏，开发更富营养、更安全的新 食品，是满足日益增长的人口对更高品质的食品需求的重要方法之一。 据不完全统计，目前至少已在1 0 0 多种植物中成功获得了转基因植物包括水稻、玉米、马 铃薯等粮食作物，棉花、大豆、油菜、亚麻、向日葵等经济作物，以及番茄、黄瓜、荠菜、甘蓝、 花椰菜、胡萝b 、茄子、生菜、芹菜、苜蓿、白三叶草、苹果、核桃、李、木瓜、甜瓜、草莓、 矮牵牛、菊花、香石竹和杨树等；所涉及到的性状从最初的抗虫、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗 除草剂、抗旱、抗盐渍等，到现在的品质改良、生长发育的调控和提高产量等。 迄今为止，世界各国已试种的转基因植物超过4 5 0 0 种，已批准商业化种植的近9 0 种。自1 9 9 6 年转基因植物开始商品化以来，经过7 年的持续增长，2 0 0 3 年全球转基因植物的种植面积已达6 7 7 0 万公顷( i s 2 0 0 3 ) ，全球市场价值4 5 - - 4 7 5 亿美元。近6 年来，全世界共有几亿人在食用转基 因食品，美国市场上已有近4 0 0 0 种食品来自基因工程生物。经过5 年严格的论证，对转基因植物 持相对保守态度的英国最早将于2 0 0 5 年春季开始商品化种植转基因玉米( g r e t c h e n ，2 0 0 3 ) 。 但另一方面，随着基因工程产品日渐商品化有关重组d n a 技术潜在危险性的争论发自欧 盟继而波及全世界。生物安全是指现代生物技术的开发和应用可能产生的负面影响，及所采取的 有效预防和控制措施，目的是保护生物多样性、生态环境和人体健康。其研究的主要内容包括转 基因生物的环境安全和食品安全。 转基因产品可能对人体健康产生的潜在影响主要有以下几个方面， 外源基因是否会通过异源重组进入人的遗传体系中。目前普遍认为这种可能只是在理论 上具有极小的概率( c h o w d h u r y , 2 0 0 4 ；n e t h e r w o o d ，2 0 0 4 ) 。 由于重组和水平基因转移产生具有“超级抗性”的病原微生物会危害人类健康。这种情 况在使用抗生素标记基因时有很小的可能性( b e n n e t t , 2 0 0 4 ) ，但随着标记删除技术及更安全的标记 基因的使用，这个问题可以被彻底解决( d ev e t t c n ，2 0 0 4 ；m i h a l k a ，2 0 0 4 ；m i k i , 2 0 0 4 ) 。 转基因食品是否具有毒性、能否引起人体的过敏反应、营养价值是否与传统对应食品有 差异及转基因食品中出现非预期效应的可能性( p r y m e ，2 0 0 3 ) 。关于毒性问题只有一些相关的动物 试验报道，尚无关于人体的研究报告( b r a k e ，2 0 0 4 ) 。转基因食品引起人体过敏性反应的发生概率 相对可能高一些，在大豆中表达巴西坚果( b e r t h o l e t t ae x c e l s a ) 的2 s 白蛋i ；i ( n o r d l e ee t 以，1 9 9 6 ) 和 美国s t a r l i n k 玉米事件( e p a ，2 0 0 0 ) 均与过敏原有关，但在造成明显的危害之前即被终止。目前过 敏源检测和安全管理更加完善和严格，如仅就技术上讲是安全的( b a n n o n ，2 0 0 2 ；f a o w h o ，2 0 0 1 ； l a c k 2 0 0 2 ) 。化学分析和动物试验证明在营养成分上，转基因植物与常规品种没有差异( c h r e n k o v a ， 中国农业科学院博士学位论文 第一章引言 2 0 0 2 ；c l a r k ，2 0 0 1 ) 。对于非预期效应则争论较大，且在研究手段上有一定的难度。 转基因技术的商品化目前主要是在转基因植物上，主要问题有： 出现具有多种抗性基因的超级杂草，这类问题发生的可能性相对大一些，并已经有了一 些相关报道( m u t h ，2 0 0 3 ；o r s o n ，1 9 9 9 ) 。 出现具有高度抗药性的农业害虫，这是一个关系 经济、生态和公众健康的重大问题， 关于此类问题的报道具有一定的实验依据，例如，试验室研究表明，棉铃虫对c r y l a c 产生抗性 的时间是1 2 代( m e n g , 2 0 0 4 ) ，但田问尚未产生明显的抗性。而且需要说明的是：具有抗性的害 虫出现不仅仅是由于抗虫转基因作物的种植，农药的使用也同样会使害虫的抗药性增强。 病毒重组或异源包装会产生新的农作物病原物。此类现象在自然界可以发生，在实验室 中也曾获得验证，但在田间试验中尚无报道。有些风险如异源包装很容易通过改进转化策略而消 除，但有些问题还需要进行深入研究和长期跟踪调查( t e p f e r , 2 0 0 2 ；v a r r e l m a n n ，2 0 0 0 ) 。 基因漂流导致的转基因向非转基因植物和野生亲缘种中扩散。在栽培作物和其野生近缘 种具有共同分布的区域，转基因逃逸到野生种群的可能性较大( a m a u d ，2 0 0 3 ；c h e n ，2 0 0 4 ； w i l k i n s o n ，2 0 0 3 ) 转基因在自然界的命运取决于转基因作物与近缘种间杂交后代的适合度，且适 合度可能有一个动态的过程( g u e r i t a i n e ，2 0 0 2 ；l u ，2 0 0 2 ) 。对于转基因在环境中保留和不断扩散 将会导致怎样的生态后果，目前所掌握的资料和知识均非常有限。由于花粉漂移造成的转基因扩 散，受到作物种类、释放面积和环境条件的影响( r i e g e r , 2 0 0 2 ；v a c h e r , 2 0 0 4 ) ，在进行距离隔离 时应加以考虑。目前，不断有新的生物技术手段被采用来降低或杜绝花粉漂移造成的转基因扩散 ( d a n i e l l ，2 0 0 2 ；k u v s h i n o v , 2 0 0 1 ；s t e w a r t ，2 0 0 3 ) 。 水平基因转移导致转基因向植物病原微生物扩散。这种现象只在带有与植物基因同源序 列的土壤微生物中发现且其频率极低( d ev a l e s ，2 0 0 1 ；k a y , 2 0 0 2 ；t e p f e r , 2 0 0 3 ) 。 转基因植物的大面积释放也有可能会对生物多样性产生不利影响： 转基因植物具有野生植物没有的各种抗性，可能会迅速成为新的优势种群，从而影响生 态平衡。不少作物已被人类驯化到没有人类的耕作就生存不了的程度，个别性状的遗传改良并不 会增加其侵袭性等( c r a w l e y , 2 0 0 1 ) 。但由于转基因作物的大面积释放时间尚短，对它的长期效应 还需要进行系统的研究( f r e c k l e t o n ，2 0 0 4 ) 。 对非目标生物的危害将不利于生物多样性。但到目前为止，在实验室内观察到的对非目 标生物的影响在田间极少发生( b a r t s e h ，2 0 0 2 ) 。不同基因对不同生物的影响是不同的，对该问题 更长期和更具体地进行研究将是十分必要的( b u r g e s s , 2 0 0 2 ；c o u t y , 2 0 0 1 ；c o w g i l i ，2 0 0 3 ；g r o o t , 2 0 0 2 ；r o m e i s ，2 0 0 3 ) 。 随着越来越多的转基因产品进入市场，转基因植物中可能出现的非预期效应也逐渐引起人们 的关注。在相关文献中，虽然非预期效应较多的与转基因食品安全性联系在一起，但它的研究意 义不仅仅在于此，外源基因的插入会对植物的生命活动会产生深刻的影响，各种效应的产生是基 因之间相互作用、代谢网络综合调控的结果，因此，非预期效应产生机制的揭示会对基因功能、 基因问相互作用、网络调控等诸方面提供参考，对转基因植物安全性评价具有重要的理论和实践 意义。 2 中国农业科学院博士学位论文 第一章 3 1 言 2 转基因植物可能产生的非预期效应 目前，在实验室条件下可以非常精确地对d n a 实施剪接。但现有的技术仍然无法精确控制 和预测遗传信息插入植物基因组的位置和拷贝数，况且植物体是一个复杂的生物系统，无数的细 胞、代谢途径和生物分子都是相互影响、相互作用的，当一个d n a 分子导入植物体后，它对整 个植物的影响是无法完全预测和控制的，除了产生预期的结果外，还可能产生其他非预期的变化， 甚至是有害的结果，这就是非预期效应。如引发基因突变或改变代谢途径，致使其最终产物可能 含有新的成分或改变现有成分的含量等也有可能以不可预测的方式改变受体植物的细胞代谢， 从而使食品中产生新的毒素或过敏源，这些改变也可能抑制植物体内一些重要营养物质产生，使 食品中缺乏这些重要的营养物质。 对于转基因植物的非预期效应进行安全评价，主要基于以下几个方面的理由： 转基因植物中的的外源基因来源不同于常规育种。常规育种由于受有性亲和性的限制， 其基因均来自于同一物种内；而建立在重组d n a 技术基础上的植物基因工程技术，可以克服常 规育种技术的不足，打破物种间的天然屏障，实现基因在动物、植物、微生物之间的转移，甚至 可以将人工合成的基因导入生物体内。因此，转基因植物的基因既可来于种内，更多的来自于不 同的物种问。由于遗传背景不同，目前还不可能完全精确地预测一个外源基因在新的遗传背景中 会产生什么样的相互作用，且转基因植物中基因的表达受环境等多种因素影响( m e y e r , 1 9 9 9 ) ，在 转基因植物中有可能出现一些在常规育种中不曾遇到的新组合、新性状，它们是否会影响生态环 境和人类健康，目前还缺乏知识和经验。 基因多效性( p l e i o t r o p i ce f f e c t ) ，一个基因可能具有多种不同的性质和功能从而对植物发育 的多个方面产生影响，在试图改良一个性状时，由于外源基因的插人而对宿主体内某些基因的表 达产生影响，导致其他性状也随之发生了变化( u p s ，1 9 9 8 ) 。基因的多效性有的可预测，有的不可 预测，其效应可有利或不利。 转基因作物中外源转基因的插入位点和插入的拷贝数存在很大的差异。一般情况下，在 农杆菌介导的转化( a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e d g e n et r a n s f e r ) 植株中，外源转基因的拷贝数多为1 个， 但有时也会出现多个，在一些双子叶植物中t - d n a 的拷贝数平均为3 个，偶尔高达2 0 5 0 个。 位点效应( p o s i t i o ne f f e c o ，t - d n a 在染色体上的插入位点是随机的，它可以插入到任何一 条染色体。由于基因插入的位置不同，因周围基因的影响，可能使外源转基因在转化植株中的表 型和遗传学特性有所不同。根据现有的知识，基因的插入的位置确实会影响基因表达的强度和稳 定性( k o p r e k ，2 0 0 1 ) 。 插入突变( i n s e r t i o n a lm u t a g e n e s i s ) ，由于基因整合的随机性，外源基因可以插入宿主基因 组的非编码区、结构基因区或调控区，引起插入突变。最常见的情况有2 种，一是由于外源基因 的插入引起宿主体内某一基因的失活。一般来说这种情况比较常见，因为通常基因在转录活跃 区的整合机率大于静止区。如果插入发生在植物基因组中一个或多个重要酶基因之中，这些基因 可能不再表达重要的蛋白酶，这些酶所催化的代谢就会被阻断，从而使植物体内可能聚合某些毒 性复合物或者不能产生重要的营养物质：如果插入发生在某个重要基因附近，可能会改变这个重 3 皇里登兰墼茎璧堡圭兰堡兰兰 量= 兰! ! 童 要基因的表达，而这种表达水平的改变可能会使这个基因产物成为毒素或过敏源也可能使细胞 代谢发生改变，导致毒素或过敏源的产生或重要营养物质的缺乏；如果插入发生在功能未知的 d n a 序列之中，由于这段d n a 的序列功能还不清楚，它的突变带来的危害也无法预料，但不能 完全否定这种危害的存在。另一种情况是由于外源基因的插入使阻抑基因失活，则可以使原来沉 默的基因激活。虽然目前的科技水平还难以预测一个外源基因在新的遗传背景下会发生什么样的 相互作用，但目前尚无随机插入激活毒性代谢途径的报道。 转入植物中的许多转基因的产物是高水平表达的酶，来催化各种生物化学反应，这可能会 导致一系列的次级效f 盘( c o n n e r , 1 9 9 9 ) 。通过表达转基因来提高酶的生物合成，会发生耗尽酶底物 和酶反应产物积累的情况。而在代谢途径中改变代谢物流动导致非预期的增加或降低其他物质含 量的情况也有相关报道。在植物细胞中表达的新酶活性也可以导致某种代谢物从一个次生代谢途 径转换到另一个途径。 目前，对这些情况还所知甚少，估计在不同作物之间同一种作物的不同品种、品系都会存 在差异。这种转基因表达所带来的次生效应发生的可能性取决于植物生化途径的关键调控点和限 速步骤。 载体骨架序列，载体的骨架序列整合到植物染色体上是t - d n a 转移过程的一部分。是不 可避免的。载体骨架序列整合到植物染色体上所导致的安全问题及其在植物中的遗传命运尚不清 楚，但是人们担心这些序列会表达产生有负作用的蛋白质，而且载体骨架序列可能会影响植物正 常基因的表达和促进转基因的重排等( 董志峰等。2 0 0 1 ) 。 此外，还有体细胞变异( s o m a c l o n a lv a r i a t i o n ) 等问题，因此要完全精确地预测转基因植物可能 产生的所有效应是不可能的； 在科技文献中对于非预期效应并没有系统的记述，可能是因为如果因非预期效应丽导致劣化 的农艺性状，则通常在研究阶段就会被淘汰。但随着基因工程技术的发展对作物的农艺性状和 营养特性的遗传修饰会越来越复杂，如插入更大的d n a 片段，进行数量性状改良等，非预期效 应可能会更容易发生，因此，对基因工程植物的潜在变化进行筛选变得越来越重要。 需要说明的是，非预期效应的发生并非是重组d n a 技术所特有的，所有的作物育种方法， 无论是常规育种中的杂交育种、突变育种( 辐射育种或化学诱变) 还是现代生物技术( 原生质体融 合、重组d n a ) ，都有产生非预期效应的可能。表1 中列出在传统作物育种中出现的非预期效应， 表2 中列出了在现代生物技术育种中出现的由于体细胞变异、基因多效性等引起的非预期效应， 这些对于植物的生理和农艺性状有重要意义。 4 ! 堡垒些坠兰些堡圭兰堡篁圣量三兰! ! 童 表1 传统作物育种中的非预期效应 作物性状非预期效应参考文献 玉米高赖氪酸产量l t r u s k aa n ds e d i a k 1 9 8 6 人麦白粉病抗性产量lt h o m a se te 1 1 9 9 8 抗病谷粒硬度ts w a n s t a ，1 9 8 7 马铃薯抗性产量l z i t u a ka n dj o h n s t o n e ，1 9 7 9 高淀粉含量 g l y c o e l k e l o i d sth a r v e ye ta 1 ，1 9 8 5 芹菜抗虫呋喃香豆素tb e i e r , 1 9 9 0 西葫芦抗虫葫芦素tc o u l s t o na n dk o l b y 1 9 9 0 表2 在转基因植物中出现的非预期效应 作物性状非预期效应参考文献 c a 0 1 a 过表达八氢番茄红 多种代谢改变( 维生素e 、叶绿素、s h e w m a k c r c t e l ( 1 9 9 9 ) 索台成酶脂肪酸、八氢番茄红素) 马铃薯 表达酵母庶糖酶 糖生物碱含量降_ f f f , ( - 3 7 - 4 8 )e n g e l e ta 1 ( 1 9 9 8 ) 表达大豆球蛋白糖生物碱含量升高( + 1 6 - 8 8 ) h a s h i m o t o e te 1 ( 1 9 9 9 a ) ； h a s h i m o t oc le 1 ( 1 9 9 9 b ) 表达细菌来源的蔗破坏块茎组织；削弱碳水化合物在1 i l r l 【a n d s m e , c k c n s ( 1 9 9 9 ) ； 蕉曼：墨蕉董壁整堡 塑堡竖盟重整旦竺! 然! ! 坐：f ! 塑! ) 至鲞壅垄堡薹固 堇堑! 查堕茎鱼星塑堕! 坚! 望墼型：q 盟! 】 水稻 表达大豆球蛋白维生素b 6 含量增加( + 5 0 )m o m m ae te 1 ( 1 9 9 9 ) 维生素原a 生物合生成非预期的娄胡萝h 素衍生物y e e la 1 ( 2 0 0 0 ) 盛堡垂f ! ：塑蔓茎! 堕重壅：至鲞垫璺2 大豆 表达g l y p h o s p h a t e 在正常土壤温度( 2 0 。c ) 下高木质索 g e r t ze ta 1 ( 1 9 9 9 ) ( e p s p s ) 抗性 含量( 2 0 ) ；高土壤温度下( 4 5 。q 茎 部开裂和减产( 最高至4 0 ) 油菜3 5 s 启动子趋动下的受c a m v 侵染后除草剂敏感 a i k a f f e ta 1 ( 2 0 0 0 ) b a r 基因 小麦表达葡萄糖氧化酶 植物毒性 m u r r a ye ta 1 ( 1 9 9 9 ) 表达磷腊酰丝氨酸坏死斑d e l h a i z e e ta 1 ( 1 9 9 9 ) 对于某些非预期效应可以在掌握转基因插入位点、导入的性状的功能及其参与的代谢途径 等信息后进行预1 铡，而对某些非预期效应，由于对基因调控和基因问相互作用( 基因多效性) 方面 5 中国农业科学院博士学位论文 第一牵引言 知识的局限性，目前还无法对其进行预测。随着越来越多的基因工程