（化学工程专业论文）离子交换法从发酵液中分离提取谷氨酰胺.pdf

摘要 本文针对从谷氨酰胺发酵母液中提取分离谷氨酰胺作了系统研究， 研究探索了离子交换法分离发酵液中谷氨酰胺和谷氨酰胺的可行性。 以谷氨酰胺发酵生产中发酵液为研究体系，从树脂筛选入手，提出 了多柱分离谷氨酸和谷氨酰胺的工艺，论证了其可行性。工艺具有分辨 率高、操作容量大、容易控制等特点，具有良好的工业应用前景。 筛选出了除盐树脂柱，并对其试验过程进行了分析；对工艺申分离 谷氨酸和谷氨酰胺的柱操作，在试验范围内得出了最佳的操作条件，并 采用弱酸弱碱柱串联的工艺，大大改进了过程操作，提高了树脂的动态 操作容量；对工艺中用于提取谷氨酰胺的0 0 1 7 树脂用l 司歇法测定了不 同温度下的平衡数据，数据关联表明l a n g u m i r 方程可以很好的描述该体 系的平衡等温线。 经过工艺的改进，使得整个工艺操作中谷氨酰胺的收率大大提高， 可以达到8 0 以上，具有良好的工业应用前景。 关键词：离子交换，谷氨酰胺，分离，洗脱。 a b s tr a c t i nt h i sp a p e r ，t h er e c o v e r yo f g l u t a m i n ef r o mt h ew a s t eo ff e r m e n t s o l u t i o na f t e rc r y s t a l l i z a t i o nw a ss t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y t h ef e a s i b i l i t yo f t h ei o n e x c h a n g em e t h o dw a sa l s os t u d i e d s t a r t e dw i t ht h es e l e c t i o no f r e s i n s ，t h en o v e lt e c h n o l o g yo f m u t i - c o l u m nw i t hc h o s e nr e s i nw a ss u g g e s t e df o rt h es e p a r a t i o na n d r e c o v e r yo fg l u t a m i n e ，t h ee x p e r i m e n td e m o n s t r a t e di t sf e a s i b i l i t y t h i s t e c h n o l o g yh a ds u c ha d v a n t a g e sa sg o o ds e p a r a t i o na n d ，l a r g ec a p a c i t ya n d e a s yc o n t r o l ，w h i c hp r o m i s e d f o ri n d u s t r i a lu s e t h ei o n e x c h a n g e ru s e dt ow i p eo f ft h es a l ti nt h es o l u t i o nw a ss e l e c t e d t h r o u g he x p e r i m e n t s ，a n dw e a l s om a d es o m es t u d yo nt h ep r o c e s si nt h i s p a p e r i nt h et e c h n i c so fs e p a r a t i n gg l u t a m i n ea n dg l u t a m i ca c i d ，w eg o tt h e b e s tc o n d i t i o ni nt h ee x p e r i m e n t sa r e a t h ew e a ka c i dr e s i n sa n dw e a k a l k a l i n er e s i n su s e di ns e r i e sc a ni m p r o v et h eo p e r a t i o ng r e a t l ya n dc a n i n c r e a s et h er e s i n s d y n a m i cc a p a c i t ye n o r m o u s l y i nt h ep a p e r ，w ea l s og o t t h ee q u i l i b r i u md a t ao f0 0 1 7r e s i n st h r o u g ht h ec a p t i v et e s ta n dt h ed a t a a s s o c i a t e dw i t hl a n g u m i rm o d e lc a nw e l ld e m o n s t r a t et h ei s o t h e r m s u s i n gt h i sp r o c e s sd e s i g n e di nt h ep a p e r ，w eg o tas e p a r a t i o nr a t eo f a b o v en i n e t yp e r c e n t 。i tw i l lh a v eab r i g h tf u t u r ei ni n d u s t r y 。 k e yw o r d s ：i o n e x c h a n g e ，g l n ，s e p a r a t i o n ，w i p e o u t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得盘壅盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：氨j 最王 签字日期： ，日牛年) 月f7 日 。 f 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤注盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权基凄盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：癸堍玉 导师签名： i 暖己k 签字日期：w 口忙) 月c 7 日签字日期：山。睁月哆日 天津大学硕士学位论文 日u吾 谷氨酰胺是二十种合成蛋白质的基本氨基酸之”“，约占人体游离 氨基酸的一半以上，在生物体代谢中起举足轻重的作用。谷氨酰胺是一 种“条件必需性氨基酸”，近年来医学发现表明，谷氨酰胺缺乏将引发多 种疾病，所以谷氨酰胺在生命活动中起着重要作用。对于我们这样一个 13 亿人口的大国，药用氨基酸的需求量很大，有巨大的潜在市场。 目前日本等国家的药用谷胺酰胺已进入我国市场。现在国际市场上 谷氨酰胺价格约1 0 0 万元左右吨，生产成本大约只为谷氨酸的3 - 4 倍， 如果按谷氮酰胺年产量1 0 0 0 吨计，原料药产值约为l o 亿元人民币。如 果加工成制剂后将可以创造更大的经济效益，产品还可大量出口外销创 汇。因此谷氨酰胺的研究开发对我国的氨基酸事业及医疗保险事业将是 一个很大的贡献。 近年来在科技工作者的努力下，我国谷胺酰胺的发酵工艺已基本成 熟，如果在发酵液的提取分离工艺能够更上一层楼，使谷胺酰胺提取率 进一步提高，纯度进一步改进，那么谷胺酰胺将会给我国带来很大的经 济效益和社会效益。 由于离子交换法回收率高，不污染体系而且易于操作，它已成为生 化分离的一种重要方法。 本文针对谷氨酰胺发酵生产中的结晶母液，采用离子交换法，将谷 氨酸和谷氨酰胺加以分离，从而进一步提取谷氨酰胺。 笫一一章文献综述 第一章文献综述 1 1 所研究体系的来源及性质 本文研究的体系为谷氨酰胺的发酵母液，经测定：含谷氨酰胺( g i n ) 3 0 9 l 左右( 2 1 3 7 m m o l l ) ，谷氨酸( g l u ) i o g l 左右( 6 8 m m o l l ) ，硫酸 铵4 0 9 l ( 3 0 0 m m 0 1 l ) 。 1 1 1 谷氨酰胺的性质 谷氨酰胺是l 一谷氨酸的y 一羧基酰胺化物，英文名字：g 1 u t a m i n e 化学名：2 - a m i n og l u t a r a m i ca c i d ，g l u t a m i ca c i da m i d e ：结构式为 1 3 l ： 一c 1 一s _ ：- ! ：二一 h 空间构型： 谷氨酰胺的分子量1 4 6 15 ，分解温度1 8 5 c ，基本性状如下： 表l ll 一谷氨酰胺的基本性状 t a b l e1 1t h eb a s i cc h a r a c t e ro fg i n 解离常数比旋光度：【q 】”d 熔点 溶解性 p k ，( 一c o o h ) p k 2 ( - - n h 2 ) p i c = 2 6 nh c l ) c 2 1 79 13 5 6 5+ 6 1 1 8 5 - 1 8 6易溶于水难溶丁 乙醇、乙醚等有 机溶剂 篇。章文献综述 谷胺酰胺是白色方晶系晶体或结晶状粉末。无臭，稍有甜味。约 1 8 5 熔化分解。结晶状态下稳定，遇酸碱或热水不稳定，可水解成l 一 谷氨酸。溶于水( 4 2 5 9 1 0 0 m 1 ) ，几乎不溶于乙醇和乙醚，水溶液呈酸 性，属条件必需性氨基酸。占食品蛋白质量的1 2 4 谷胺酰氨作为氨基酸的一种，具有氨基酸的共性，既含有羧基又含 有氨基，在水溶液中发生两性电离，其电离情况取决于溶液p h 值，即： 女i k 2 g1 n + g1 n 营 p t ts p k tp h = p l k i = k 2= 斜 斜 gl n p h p k2 ：1 0 一球 ( 1 2 ) ：1 0 一p k z ( 1 3 ) 由式( 1 2 ) ( 1 3 ) 可以求得不同p h 值下的 g l n + g l n 一 g 1 n 的百分比，以此作图，得到谷氨酰胺在不同p h 值下的离子分配曲线，如 图( 1 一1 ) 所示： 图1 1 谷氨酰胺在不同p h 值下的离子分配曲线 1 1 2 谷氨酸的性质 白色鳞片状晶体，分子式n h 。c h ( c h 。c h 。c o o h ) 一c o o h ，英文名g 1 u t a m i c a c id ，简称g l u ，分子量1 4 7 1 4 ，微溶于水，易溶于热水，水中溶解度 0 8 4 9 1 0 0 9 ( 2 5 。c ) ；p k 。( - - c o o h ) = 2 1 6 ，p k z ( 但0 链一c 0 0 h ) = 4 3 2 ， 3 一蚤elo=一c酋m扛eucoq 第一章文献综述 p k ，( 一n h 。) = 9 6 7 ，等电点p i = 3 2 4 。无臭，稍有特殊滋味和酸味， 微酸性，其中性水溶液呈鲜昧；几乎不溶于乙醚、丙酮和冷醋酸中，不 溶于乙醇、甲醇；2 0 0 升华；2 4 7 2 4 9 分解，；相对密度( d ”。) 1 5 3 8 。 比旋度 a = 1 0 。+ 3 0 + 3 3 。与盐酸形成l 一谷氨酸盐酸盐，与碱作用形 成l 一谷氨酸钠。外消旋谷氨酸为白色结晶，微溶于乙醚、乙醇和石油醚， 相对密度( d ”。) 1 4 6 0 l ，熔点2 2 5 2 2 7 ( 分解) ：右旋谷氨酸，由 水析出为片状结晶体，熔点2 4 7 2 4 9 ( 分解) ，相对密度( d ”。) 1 5 3 8 。 与谷氨酰胺同理，可求得不同p h 值时 g 1 u + g l u2 g 1 u 一 g l u2 。 所占 g 1 u 的百分比，以此作图，得谷氨酸在不同p h 值下的离子分配曲 线如图( 1 2 ) 所示。 图l 一2 谷氨酸在不同p h 值下的离子分配曲线 f i g l - 2t h e g u y v oo fg l ui o nd i s t r i b u t i o na tv a r i o u sp h 1 2 谷氨酰胺用途简介和生产分离现状 1 2 1 谷氨酰胺的用途 谷氨酰胺是二十种合成蛋白质的基本氨基酸之一【2 4 1 ，约占人体游离 氨基酸的一半以上，是机体含量最丰富的氨基酸，在生物体代谢中起举 足轻重的作用。谷氨酰胺是一种“条件必需性氨基酸”，近年来医学发现 表明，谷氨酰胺缺乏将引发多种疾病，所以谷氨酰胺在生命活动中起着 重要作用。 一枣耍。苫一co霉已1uucoq 第一章文献综述 1 ) 是一种有前途的药物 谷氨酰胺对于肌体各种机能都有广泛而重要的影响，它在细胞中除 作为构成蛋白质的氨基酸参与蛋白质合成外，谷氨酰胺的酰胺氮又能作 为氮源参与核酸与糖蛋白的合成【5 】，对创伤、化疗、放疗等引起的肠粘 膜损伤具有明显的保护作用【6 。谷氨酰胺在不同组织中有不同的代谢 功用，在肾脏是肾小管泌氨作用的主要氮源，在肝脏是糖异生和尿素合 成的原料，在神经组织又是神经递质的前体物质，在血液中有暂时解除 氨毒的作用。 人体的谷氨酰胺主要储存在骨骼肌肉 t2 1 中，它的浓度高于体内环境 的3 0 倍，需要时才释放出来。例如肠道是消耗g 1 n 的重要器官，但肠道 既不能合成也不能储存g 】n ，必需靠外部供应，在正常的生理状态下， 肠上皮细胞生长需要消耗大量g 1 n ，在病理状态下如创伤、应激、感染 及各种危重症时g l n 消耗增加，血液和组织中g 1 n 水平降低，就靠消耗 肌肉予以补充 13 1 。g l n 能促进葡萄糖胺的形成，而葡萄糖胺是肠胃消化 道中粘蛋白的成分，所以g 1 n 主要用途之一是作为抗消化道溃疡【】4 j 或作 为其主要原料。 另外，作为药物，g 1 n 有增进脑神经机能的作用，可以用来治疗神 经衰弱，改善脑出血后的记忆障碍，促进智力不足儿童的智力发育，防 治癫痫发作，治疗帕金森综合症等。谷氨酰胺也是胃溃疡、慢性胃炎的 有效药物。 日本已于1 9 7 9 年将其作为抗溃疡药物投放市场【1 5 1 ，疗效和经济效 益十分显著，其胃药制剂已进入我国市场，而我国药用谷氨酰胺的生产 尚属空白。所以我国药用谷氨酰胺长期以来一直依靠进口，价格昂贵。 因此谷氨酰胺的研究开发对我国的氨基酸事业及医疗保险事业将是一个 很大的贡献，其社会效益明显 1 9 9 2 年，消化道药物世界市场规模约1 0 0 亿美元，可分为美、日、 欧三个市场，各占i 3 。其中，抗消化道溃疡药占4 3 ( 约3 2 亿美元) ， 1 9 9 2 年和1 9 8 8 年相比，抗溃疡药销售上升1 3 5 。与g i n 有关的抗溃疡 药在日本称为麦滋林s ，销售量约3 亿美元。在日本生产的抗溃疡药物 ( h 2 阻害剂和防御因子强化剂) 中己迅速占到第四位。我国则有“谷参 肠安”，主要成分g i n ，辅之以人参、茯苓等中药，已纳入医保、公费医 疗系统。 2 ) 倍受青睐的营养保健品【1 6 , 17 谷氨酰胺有多种作用，例如可以增强免疫功能、维护酸碱平衡、增 第一章文献综述 加细胞体积、增强肌肉细胞蛋白质合成f ，1 外。谷氨酰胺是一种特殊的氨 基酸，在食品中是为迅速繁殖细胞优先选择的呼吸燃料，如粘膜细胞和 淋巴细胞；是组织间的氮载体；是核酸、核苷酸、氨基糖和蛋白质的重 要前体。在应急情况下，机体对谷氨酰胺的需要超过其合成能力。因此 可以通过肠外营养或饲料中添加谷氨酰胺以营养调控的方式加速动物体 的康复。 近几年欧美、日本更推崇g 1 n 在肌肉强壮、提高机体生长荷尔蒙水 平、增强免疫力20 1 、消除自由基延缓衰老方面的作用，g 1 n 和其他动物 营养剂如核糖精氨酸等配伍，可以发展成安全的运动员营养剂而不必服 用类固醇类的禁药。欧美已大量使用g l n 作为肌肉强壮剂。另据介绍只 需服用2 9 g 1 n ，其生长荷尔蒙水平可提高至4 0 0 。 3 ) 生化制剂 g 1 n 另一种用途是用作细胞培养生产的生化药物( 包括抗癌药) ，而 且其本身在抗艾滋病、抗癌症上就具有潜在功能。 对g i n 在医药及营养保健方面目前最全面最权威的介绍是美国人朱 迪、夏波特医师( j u d ys h a b e r t ) 和南希、厄利什( n a n c y e h r l i c h ) ，1 9 9 5 年所著t h eu l t i m a t en u t r i e n tg l u t a m i n e ) ) ，该书称g i n 是二十一世纪人 类最重要的营养物质并感叹：“在高科技发达的今天，一种营养物质能在 科学和医学领域掀起这么大的波澜是令人难以置信的。全美、欧洲乃至 同本( 以及中国) 的科学家正越来越认识到这种营养物质的重要性，它 的名字就叫谷氨酰胺。”这本约十万余字的专著有如下几个标题： ( 1 ) 谷氨酰胺，健康的必须 ( 2 ) 防止肌肉分解 ( 3 ) 促进肠胃愈合 ( 4 ) 谷氨酰胺支持肝脏 ( 5 ) 谷氨酰胺强化免疫系统 ( 6 ) 抑郁愤怒、疲劳感 ( 7 ) 人类抗癌的武器之一 ( 8 ) 让老年人的生活过得容易些 ( 9 ) 让谷氨酰胺进入你的生活 1 2 2 目前谷氨酰胺的生产现状及主要生产方法 随着g l n 销售量的逐年增长，其产量也呈逐年递增的趋势，据统计， 1 9 8 6 年全世界产量仅9 0 0 吨，到1 9 9 6 年全世界产量近1 8 0 0 吨，g 1n 国 第一章文献综述 际市场价格3 0 万元吨。目前国际市场价格已达t 0 0 万元吨。可见谷氨 酰胺的销售价格比较高，经济效益非常可观。9 4 年时，国内用化学合成 法生产谷氨酰胺，供作试剂用，产量十分有限。日本用发酵法生产谷氨 酰胺，年产量l o o o 吨，还有逐年增加的趋势。近年来在我国科技人员的 努力下，我国发酵法生产g 1 n 的上游技术也取得长足进步，基本达到了 可进入工业化水平。目前主要的生产方法如下； 1 发酵法1 2 1 - 2 4 1 ： ( 1 ) 用谷氨酸( g 1 u ) 产生菌野生菌株通过改变发酵条件来生产谷 氨酰胺 通过改变发酵条件，实现发酵转化的机理是：发酵条件的变更，创 造了有利于合成g l n 的环境，谷氮酸产生菌内的g 1 n 合成酶活力增加， 而催化g l n 分解为谷氨酸的谷氨酰胺酶活力受到抑制，从而g 1 n 大量积 累生成，谷氨酸的生产量减少。另一方面，由于细胞外环境的影响，g 1 n 易于从细胞分泌出来，积累在发酵液中。而谷氨酸渗透性减少，滞留在 细胞内，从而使发酵转化得以实现。 ( 2 ) 采用谷氨酸产生菌的变异菌株来生产谷氨酰 k o ic h in a k e 等人从里加黄杆菌f e k n 一3 5 5 6 诱变得一株高产g 1 n 的 青霉素抗性菌株里加黄杆菌7 0 3 ，该菌的显著特点是不需要生物素，但 需t r p 作为基本的营养物质和硫胺素作为刺激物。 吉田文弦和土田隆康等报告：以黄色小a t c c l 0 3 4 0 为出发菌株，用 通常的诱变方法( 例如紫外线、x 一射线、亚硝基胍等化学诱变剂处理， 或者通过含磺胺药物的培养基来选育) 得到一株高产谷氨酰胺的磺胺抗 性变异株a j 3 6 8 4 。 纸屋治司等用黄色短杆菌1 4 0 6 7 作为发菌株a j l l 2 0 0 。在此基础上 进一步赋予磺胺抗性，选育出一株高产g 1 n 的双重抗性变异株a j l l 2 0 1 。 它能生成对糖收率为4 3 的谷氨酰胺。国内上海科技大学王福源等人， 江西科学院微生物研究所徐剑华等人也用类似的诱变方法获得了g l n 的 高产菌株i ”1 。 由于此方法具有普遍性，同时诱变剂也易得到，因此目前常用此方 法获得g l n 高产菌株。 2 合成法 合成法f 2 6 艺8 】生产g l n 目前主要有以下几种方法j ( 1 ) l - 谷氨酸甲酯经缩合、加成、成盐、水解、活性炭脱色、然后 重结晶得到成品。 第一章文献综述 具体流程如下1 ： c h 3 0 h ，、。 h c o o h c h ( n h 2 ) ( c h 2 ) c o o h _ 二h c o o h c h ( n h 2 x c h 2 ) c o o c h 扣旦王+ l ( + ) 一谷氨酸 h 2 s 0 4 “+ ) 一谷氨酸一丫一甲酯 n h 3 n h ， n h 4 0 0 c c h ( n h c s s n h 4 ) ( c h 2 ) 2 c o o n h d - h 2 n o c ( c h 2 ) 2 c h ( n h c s s n h 4 卜- - - 卜h 2 n o c ( c h 2 ) 2 c h ( n h 2 ) c o o h l ( + ) 一谷氨酰胺 ( 2 ) l 一谷氨酸合成甲酯后。与水合阱反应生成酰阱，再用r a n e y 镍 将其还原为g 1 n 。g l n 阱法流程如下： h c o o h c h ( n h 2 ) ( c h 2 ) c o o h 二要h c o o h c h ( n h ：) ( c h 2 ) c o o c h 。型匕 卜 ，) ( c h ，! ：! 竺! h2s04。 。 h o o c c h ( n h 2 ) ( c h 2 ) 2 c o n h n h 2 h c o o c c h ( n h 2 ) ( c h 2 ) 2 c o n h 2 由上面的流程可以看出，化学合成法使用了浓硫酸和大量的二硫化 碳，条件苛刻不易控制，而且因为操作步骤太多收率不高；另外方法二 中还使用了催化剂，工艺更加复杂：再者合成法中使用了大量的化学试 剂在产品中不可避免的会有一定程度的残留，而g i n 是一种药用氨基 酸，对其纯度有较高的要求，所以合成法限制了产品的质量和使用范围。 ( 3 ) 用生物酶合成法生产谷氨酰胺 用n h 。及g 1 u 作原料，经g i n 合成酶催化生产g l n ，其转化机理如图 l 一3 ： g l u 合成酶 洲4 + g i u 7 寸g i n a t pa d p 图卜3 酶法生产谷氨酰胺机理 在上述反应中，a t p ( 三磷酸腺苷) 是必需的。然而，因为a t p 价格昂贵， 难以在工业上应用。同时，酶反应底物n h + 。、副产物a d p ( 二磷酸腺苷) 都明显抑制g l n 的生成。反应终了时仅有微量的g i n 生成。因而此法不 具有工业意义。 日本木村光等人利用微生物发酵产生的化学能可使a d p 转换成a t p ， 同时控制糖和无机磷酸的浓度，由氨及谷氨酸来合成谷氨酰胺获得成功。 第一章文献综述 在发酵过程中，果糖一1 ，6 一二磷酸发酵产生的化学能，通过a d p _ a t p 反应，能连续被用于从谷氨酸合成谷氨酰胺的反应中，因此不须再大量 加入a t p 。同时因为没有付产物a d p 的生成，所以谷氨酰胺的生成不受 抑制而能够顺利积累。 为了完成上述反应，使用的微生物必须：具有从果糖一1 ，6 - - - 磷 酸生成a t p 的能力：有a t p 存在，具有从氨和谷氨酸合成谷氨酰胺的 能力。 通过比较上述各种生产方法的优缺点，考虑到发酵法反应条件温和， 操作简单，得到的产品纯度较高，符合g l n 的药用性能标准，所以在目 前工业生产中主要是以发酵法生产g i n 。 1 2 3 谷氨酰胺发酵液的分离提取 众所周知，以糖质原料转化为谷氨酰胺的发酵过程是一极为复杂的 生物化学反应过程，谷氨酰胺作为发酵的目的产物，溶解于发酵液中， 而发酵液中还存在谷氨酸、其他氨基酸、菌体、残糖、色素、胶体物质 等，要从发酵液中将目的产物谷氨酰胺提取出来，必需根据谷氨酰胺和 杂质之间物理、化学性质上的差异，采用适当的提取方法，以达到分离 提取的目的。 目前已报道的g 1r l 提取分离工工艺有直接浓缩等电点法【29 1 、冷冻浓 缩等电点法【如，3 1 】、离子交换法、电渗析、溶媒萃取法、制备型液相色谱 分离等。 从表面上看，直接浓缩等电点法较之离子交换法操作简单，g 1 n 分 解损失少、省酸碱、能源等优点，其实则不然。因为发酵培养基中使用 的硫铵浓度较高，浓缩结晶时硫铵含量可高达3 0 以上，因此母液中g l n 残留浓度很高，约占发酵液总量的1 3 ，不好回收；另外粗晶中s 0 4 ”含 量很大，给粗晶精制带来麻烦，产品质量差，提取收率低。 随着电渗析法分离提纯柠檬酸、乳酸及利用等电聚焦原理分离蛋白 质与酶等生物化工领域中的广泛应用【3 0 ，研究电渗析及等电聚焦法分离 氨基酸技术也越来越受到人们的关注 3 。但是电渗析法：( 1 ) 需要消耗 大量的碱，中和时产生大量的可溶性盐，使废液量增加；( 2 ) 对p h 要求 苛刻，由于阴阳膜交替排列，氨基酸被夹在阴膜和阳膜之间，一旦溶液 中的p h 值大于或小于等电点，就会使氨基酸带负电或正电而通过阳膜或 阴膜，造成氨基酸的损失。且在实际操作中，在等电点附近，只要有极 第一章文献综述 少的酸或碱存在，都会使p h 值变动很大。另外，用于脱盐的氨基酸水溶 液中，通常含有各种酸性或碱性的有机杂质，因其量不一定，也可通过 膜。因而要控制p h 值使氨基酸不带电是很困难的。 用溶媒萃取法分离氨基酸不断有新的报道【3 2 】，因该法具有选择性高 的特点，引起了许多人的兴趣，尤其是针对中性氨基酸，因其化学、物 理性质更为接近，使得分离提纯困难，往往在纯度上达不到一些制药行 业的要求，采用磷类、磺酸类和硫酸类和硫代磷酸类萃取剂是非常有效 的 33 】，文献 3 4 1 中的液氨萃取技术，对于中性氨基酸和酸性氨基酸的分 离有效，即酸性氨基酸和氨作用形成一种特殊液体物质，是一种包含化 合物，而中性氨基酸溶于氨中形成氨溶液，保留于上层而且有明显的界 面，很容易将两者分开。但若使溶剂萃取法走上工业化，需要解决好如 下几个障碍问题：1 萃取过程乳化问题( 针对发酵液) ；而且萃取前将 菌体和低分子蛋白质除去这也很困难；2 萃取剂对产品的污染：低毒萃 取剂的选择和萃取剂残留物对于产品质量的影响，这是人们使用高沸点 溶剂所关注甚至是忧虑的问题。它涉及到后续氨基酸精制工艺、药品检 验标准、临床实验等。这是因为氨基酸通常是作为输液用药物这一特殊 用途加以考虑。 制备型液相色谱是当今分离学科中一个十分活跃的研究领域p ”，文 献 3 6 1 中报道了以离子交换树脂作为固定相水作为洗脱剂，分离丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸等氨基酸的中试规模的离子交换色谱，国内武汉大学【3 7 】 研究了公斤级规模的氨基酸制备色谱其利用自己合成的d p s c 大孔型 离子交换树脂对发酵液中l 一缬氨酸( 含丙氨酸) 进行分离纯化。有一 定效果。但目前制备型液相色谱存在的问题是如何保证在一定的分离度 前提下进一步扩大上柱规模。 用吸附树脂提取氨基酸，近年也有研究部，3 叭，但由于树脂吸附量低， 使应用受到限，文献f 3 9 就此方面做了一些有意义的研究工作。 目前研究比较多的是用离子交换法 4 0 j 对g 1 n 发酵液进行分离提取， 但由于在树脂种类的选择和阴阳树脂柱组合等使用方法上各有不同，提 取收率也相差很大国外8 0 年代为3 0 ，但近来有专利报道实验室试验 达到7 0 以上，而国内最近报道的提取收率在6 0 左右。下面是目前用离 子交换法对g l n 发酵液进行分离提取的进展情况； ( 1 ) 最早用于分离提取谷氨酰胺是用单一强酸型阳离子树脂交换柱 ( 7 3 2d 0 0 ld 6 1 # s d 0 1 2 3 ) ：试验证明，谷氨酰胺在酸性条件下容易 向谷氨酸转化1 4 1 , 4 2 】，而且酸性越强，转化率越高；另外，由于谷氨酰胺 第一章文献综述 和谷氨酸在用氨水洗脱时洗脱峰重叠现象严重，所以不能达到有效的分 离效果。 ( 2 ) 强碱型阴离子树脂交换柱：尽管谷氨酰胺发酵液在室温条件下 能够耐较强碱性【4 3 1 ，但强碱性阴离子交换树脂在室温下仍有催化谷氨酰 氨分解的现象。对于谷氨酰胺、谷氨酸和强碱性离子交换树脂为主组成 的系统中，可能发生：( 1 ) l 一谷氨酰胺的消旋，( 2 ) l 一谷氨酰胺转化 成l 一谷氨酸，( 3 ) l 一谷氨酸进一步发生消旋或者转化成其他物质1 4 4 1 。 ( 3 ) 强酸性阳离子树脂柱和强碱性阴离子树脂柱串联：王福源等和 徐建华 4 5 , 4 6 等都对这种串联分离方法做了研究，具体做法如下： 发酵液菌体7 3 2 ( h + ) 树脂吸附_ 氮水洗脱_ 7 1 7 ( o h 一) 树脂吸附 _ 盐酸洗脱_ 减压浓缩_ 乙醇沉淀 这种方法存在的缺点是阳柱中不可避免谷氨酰胺向谷氨酸的转化：另外 用赫酸洗脱会使谷氨酰胺和谷氨酸的洗脱峰重叠，影响分离效果。而且 最终收率也很低，没有超过3 5 。 ( 4 ) 沈亚玲、许平等1 4 7 提到了用两个强碱性( o h 一) 阴离子交换柱 串联的方法，里面仍然有好多问题值得商榷。 ( 5 ) 另外日本味之素公司1 4 8 提到一种用n h + ，型阳离子交换树脂柱 的方法，发现当谷氨酰胺水溶液中含有谷氨酸和硫酸根杂质时，通过这 种树脂处理可以很好的加以分离，所用的树脂为s k 一1 0 2 、s k 1 0 4 、s k 一1 0 6 、s k i b 、x f s x l 、f i c r w r 、c 一2 0 、s 1 0 0 、s p 一“2 、i r 1 1 8 等， ( 6 ) 最近王浩【4 9 】等人提出离子交换树脂柱串联的方法，具体做法 如下： 浓缩结晶得到粗品嘲解脱色_ 阴离子树脂柱i _ p h 5 谷胺酰胺 i p h 五5 一阴离子 _ 阴离子 二次粗晶交换柱l i交换柱i 该方法在处理二次粗晶时也采用了两个阴离子树脂柱串联的方法，先采 用阴离子交换树脂i i 将二次粗晶中的谷氨酸去除，以避免二次粗晶溶解 液直接上阴离子交换树脂i 时洗脱峰重叠过大给分离带来的损失。由于 碱性水溶液中，谷氨酸主要以二价阴离子形式存在，与阴离子交换树脂 有较大的结合能力，而谷胺酰胺主要以一价阴离子形式存在，与阴离子 交换树脂结合能力较弱。因此，在上柱过程中，谷氨酸结合在树脂上而 大部分谷胺酰胺则随流出液流出，这样就可以在上阴离子交换树脂i 前 第一章文献综述 即将杂质谷氮酸完全去除。 ( 7 ) 强酸和弱碱型树脂串联的方式：沈金玉 5 0 l 等人系统的研究了 7 3 0 ( h + ) 型强酸树脂柱和d 3 0 1 ( a c 一) 弱碱树脂对发酵液中谷胺酰胺的 动态和静态吸附性能及影响因素，并对洗脱条件进行了研究，该方法一 个重要的创新是对于阴离子交换柱的洗脱采用了分步洗脱的方式。实验 结果表明，在阳离子交换柱上有效的降低了谷胺酰胺向谷氨酸的转化， 在阴离子交换柱上谷胺酰胺和谷氨酸实现彻底分离，谷胺酰胺的总收率 达5 6 6 。 ( 8 ) 弱碱型阴离子树脂交换柱：徐卫林等【5 ”介绍，采用单根弱碱 性阴离子树脂柱来分离提取谷氨酰胺发酵液可以大量减少酸碱用量，但 是p h 对分离的影响特别明显。提取收率在5 7 7 一6 1 7 之间。 离子交换作为经典而有效的工业规模氨基酸分离手段，至今仍有其 他新近发展起来的分离技术难以取代的优势，研究g l n 离子交换工艺， 在理论实践中都有重要意义。 1 2 4 离子交换法分离氨基酸的理论研究 离子交换法是通过带电的溶质离子与离子交换荆中可交换的离予进 行交换而达到分离目的方法 52 1 ，氨基酸是一类含有氨基和羧基的两性化 合物。通式为 r d 一一c 。一，r 的不同形成不同的氨基酸，在不同的p h 值条件 下。能以正、负离子或者两性离子存在，当p h p i 时，也即将溶液调p h 到等电点碱性一边，氨基酸就以负离子形式存在：当p h p k l 时( k l 阳离子同偶极离子平衡所对应的解离常数) r s 0 3 - h + + h 3 + n r l c o o 一苗r s 0 3 一h 3 + n r l c o o h 式中：r 一一聚合组分的基团 r 一一偶极离子的基团 2 ：当p h p i 时易于洗脱。对于吸附氨基酸 的阳离子柱进行洗脱时，从理论上讲，既可以用强酸靠顶替来洗脱，也 可以利用氨基酸的两性性质，即在不同的p h 值下氨基酸呈不同的离子状 态，用碱通过转性来洗脱。 1 强酸顶替洗脱( 以阳离子柱为例) r s q a + r s q 一+ 4 + r s q 一+ h + 亡r s q h + h c l h + + c e 综上三式有 r s a 。a + + h c l 营r s c z h + + a + c r 2 用碱转性洗脱 由于用阳离子交换树脂提取氨基酸时是在p h p i 则易于洗脱，所以，一般采用碱转性洗脱6 7 ，6 趴。 r s o i a + 营r s o i 一+ 彳+ r s o j 一+ n h ：r s 0 1 。n h ： n h 3 h 2 0 n h 4 + + o h o h a + + o h 甘a 营a p h s p tp h 吖 即p p l r s 0 3 一a + + n h 3 h 2 0 营r s o i n h 4 + + a p h p m s 0 3 一a + + 2 n h 3 h 2 0 r s q n h 4 + + a n h 4 + 第二章树脂的筛选 2 1 引言 第二章树脂的筛选 本文研究的是具有工业背景的体系，是含有酸性氨基酸( 谷氨酸) 、 中性氨基酸( 谷氨酰胺) 和无机盐( 硫酸铵) 的发酵液。 由于酸性氨基酸与中性氨基酸的阳离子随p h 值分布基本一致( 如 图1 1 、l 一2 ) ，所以，用阳离子交换树脂分离酸性与中性氨基酸时，单 纯依靠吸附很难将两者分开。由图1 - 1 、1 2 可知，在一定的p h 值范围 时( 3 4 ) ，谷氨酸( 酸性氨基酸) 呈阴离子状态，而谷氨酰胺( 中性氨基 酸) 呈中性状态，则有可能用阴离子交换树脂将二者分开，所以用阴离 子交换树脂分离酸性、中性氨基酸时，何炳林等 60 1 和王寿亭等 53 】曾作过 这方面的研究工作，结果表明弱碱阴离子交换树脂对酸性与中性氨基酸 具有良好的分离性能但必需借助于选择合适树脂交换基团型式或有缓 冲液存在，这样往往使欲分离的物系复杂化，增加了后续分离的难度。 综上，在借鉴前人的研究成果及理论研究的基础上，提出了多柱分 离提取纯度较高的谷氨酰胺的工艺。发酵液首先通过柱i ，使得谷氨酸 和谷氨酰胺被吸附而硫酸铵不被吸附从而进行脱盐处理：柱i 的洗脱 液通过树脂柱i i 使得谷氨酸和谷氨酰胺分离；最后用树脂柱i i i 对谷氨 酰胺进行浓缩提取。本章节重点研究树脂柱1 i 的筛选。 2 2 材料与方法 2 2 1 原料与试剂 1 原料 谷氨酸( g l u ) ：天津味精厂工业品，含g l u 9 7 9 8 谷氨酰胺( g i n ) ：江西诚志生物工程有限公司，含量 9 6 硫酸铵( c ，p ) 盐酸( c ，p ) ，氢氧化钠( c p ) ，氨水( c p ) 2 分析试剂 d l 谷氨酰胺( 生物纯) ，l 谷氨酸( 生物纯) ，苯酚( a r ) ，无水 乙醇( a r ) ，丙酮( a r ) ，水合茚三酮( a r ) l s 第二章树腊的筛选 2 2 2 试验仪器与设备 7 2 1 型分光光度计上海第三分析仪器厂 h s d d 型水浴振荡器哈尔滨东联电子技术开发公司 p h s 一2 c 型精密酸度计 上海雷磁仪器厂 k f 4 型低温浴槽辽阳市恒温仪器厂 d h t 型搅拌恒温电热套山东鄄城华鲁电热仪器有限公司 自制1 2 15 c m ，1 5 2 0 c m ，2 2 5 c m 型离子交换玻璃柱 1 0 微量进样器 新华1 号，三号层析滤纸 自制1 6 3 2 e r a 层析缸 2 3 分析方法 纸上层析法f 5 】 2 3 1 方法和步骤 1 展开 采用新华3 号滤纸，每个样品点样4 ul 。在室温下用不饱和法展开， 展开剂用苯酚：水( 4 ：1 ) 上行法展开。 2 定量 称取一定量的谷氨酰胺标准样品，配成1 2 5 ，2 5 ，3 7 5 ，5 o 等几 种不同浓度的溶液，每种溶液点样4ul 。展析完毕用热风吹干滤纸，喷 上o ，5 茚三酮无水乙醇溶液，1 0 5 烘干5 m i n ，滤纸上立即出现紫红色 的氨基酸斑点。用丙酮( 3 7 5 m 1 ) ：水( 1 2 5 m 1 ) ：茚三酮( o 5 9 ) 溶液浸 泡3 0 m i n ，然后在5 1 0 n m 处测定光密度，从标准曲线上可求得溶液中谷 氨酰胺的含量。 展开剂：苯酚：水( 4 ：1 ) 显色剂：o 5 茚三酮( 2 5 9 溶于5 0 0 m 1 9 5 乙醇中) 洗脱液：丙酮( 3 7 5 m 1 ) ：水( 1 2 5 m 1 ) ：茚三酮( o 5 9 ) 洗脱3 0 m i n 后在5 1 0 r i m 下测定c o d 值 2 3 2 仪器和材料 1 0 微量进样器，新华i 号、3 号层析滤纸1 6 3 2 e m 层析缸，7 2 i 第二章树脂的筛选 型分光光度计，l c m 玻璃比色皿 2 4 所用树脂的各种性能参数的测定 2 4 1 试验所用树脂 ( 1 ) 试验所用的弱碱性阴离子交换树脂见表2 1 表2 1 弱碱型阴离子交换树脂 t a b l e 2 1w e a kb a s i ci o n e x c h a n g er e s i n su s e d 交换容量 树脂牌号名称功能基m m o l m来源 m m o l g ( 千) l 大孔弱碱苯乙 南开大学化工 d 3 9 0烯基阴离子交 一n h 2 4 51 2 厂丁：业品 换树脂 弱碱性阴离子一n h 或华北制药厂 d 3 3 09 o3 0 交换树脂一n h ， ：业品 大孔弱碱伯济宁树脂厂 d 3 l3 一n h 2 4 51 4 氨基树脂实验品 大孔弱碱性苯 一n南开大学化工 d 3 0 1乙烯系阴离子4 01 4 ( c h ，)厂工业品 交换树脂 第二章树脂的筛选 ( 2 ) 实验所用的阳离子交换树脂及强碱阴离子交换树脂见表2 2 表2 - 2 刚离子交换树脂及强碱性阴离子交换树h t a b l e 2 - 2c a t i o ni o n e x c h a n g er e s i n sa n ds t r o n gb a s i ci o n - e x c h a n g er e s i n su s e d 交换容蛰 树”旨牌号名称功能基 m m o l g m n l o l m爿源 ( 千)l 强酸性苯乙 0 0 l 7烯系i j | = l 离子一s o 、h44 n a1 8 n a 交换树j i 旨 强碱性苯乙 烯系阴离子n h ( c h 、) 3 4 c l1 3 c l 2 0 1 7 交换树脂 丙烯酸系弱南开人学化j 1 1 0酸刚离子交一c o o h1 2 h 4 h厂下业晶 换树脂 火孔丙烯酸 d 】5 1系弱酸| j | _ | 离c o o h 8 o h3 h 子交换树脂 2 4 2 树脂的预处理 各种树脂在使用之前，需经过常规预处理【69 1 ，即先用水充分溶胀 再经过酸洗、碱洗、水沈，最后转型为所需的型式。 2 4 3 树脂转换参数的测定 为了试验的方便与精确，先对树脂做转型处理后，处理成空干树脂 然后将其转化成相应的g 干和m 1 单位。 驳l g ( 两份) 空干树脂，一份使之在水中充分溶胀，测定体积：一 份放入6 0 恒温箱充分干燥后测定质量。 第二章树脂的筛选 对树脂转型后，测定其转化参数如表2 3 表2 - 3 树脂的转化参数 溶胀前体积水充分溶胀后体积 树脂型号 g 千g 空千 m l g ( 千)m l g ( 干) d 3 3 0 ( 南开)o 7 1 4 82 7 8 9 63 9 0 2 9 d 3 0 l0 7 2 3 93 0 3 9 14 9 18 l d 3 l3o 6 9 2 l3 4 8 4 9 5 0 3 5 1 d 3 9 00 5 6 5 22 4 7 0 84 3 7 1 7 d 3 3 0 ( 华约)o5 8 0 72 7 6 184 7 5 6 3 dl 5 l0 7 8 151 ，4 1 0 918 0 5 4 d 1 1 0o 9 5 0 71 7 1 1 13 5 2 2 9 2 44 树脂交换容量的测定 树脂的离子交换性质不仅取决于离子化基团的数量，而且取决于在 给定的介质的p h 值下，其电离度以及溶液中所有离予的特性和浓度。 所以，为了对各种不同离子的交换能力进行比较，就必须严格遵守试验 条件不变。树脂的活性可用在一定条件下被单位重量( 或体积) 的树脂 吸附的可溶性电解质数量即树脂交换容量表示。 在静念条件下所确定的容量大小取决于离子交换树脂的类型。静态 条件下的试验可以表明离子化基团的性能、数目和建立吸附平衡的速度。 静态容量是在保证离子交换树脂和电解质溶液之间建立了离子交换 平衡的条件下确定的。为了测定弱碱树脂静态交换容量，将预先处理过 的树脂在6 0 7 0 烘箱中烘干到恒重，并称取约1 9 重的试样放在圆锥形 烧瓶中，加入5 0 m 1 0 1 m o t l h c l 溶液，恒温搅动2 4 h ，然后耿1 0 m l 清液， 用0 1 m o l l n a o h 溶液滴定。根据滴定结果，按照溶液和试样消耗的碱 第二