（应用化学专业论文）云南热泉栖热菌产耐热碱性磷酸酶的研究及其菌株鉴定.pdf

摘要 摘要 碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，a p ) 是一种水解酶，能催化磷酸单酯的水 解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖，也能催化磷酸基团的转移反应，将 磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上，并产生对应的醇、酚或禧。 a p 广泛存在于微生物界和动物界，尚未发现存在于高等植物体内。在磷生物地 球化学循环过程中，a p 起了极其重要的作用。a p 广泛应用于诊断学、生物化学 及分子生物化学领域。应用较广的是小牛肠碱性磷酸酶c l a p ( c a l fi n t e s t i n e a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ) a nec o l ia p ，这两种酶的活力高，研究较为透彻，适于常 温反应，高温下比较容易失活。耐热碱性磷酸酶( t a p , t h e r m o s t a b l ea l k a l i n e p h o s p h a t a s e ) 是一种耐热的碱性磷酸酶，其催化机制与一般的碱性磷酸酶相同， 且适合高温下反应，常应用于高温环境，一般来源于高温微生物，有更广阔的应 用领域。 本研究从高温热泉中分离得到的非芽孢菌中筛选出3 1 株碱性磷酸酶阳性 菌，从中初步筛选到6 株活性较高的菌株，往复筛，筛选出一株菌株r h y l 2 2 ， 从该细菌得到的t a p 的活性最高和热稳定性最好。通过测定该菌株的形态、生 理、生化和基因方面的特性，鉴定该菌株可能为t h e r m u ss p 的新种，拟命名为 t h e r m u s y u n n a n e n s 括( a y 5 5 7 6 0 3 ) a 通过正交实验优化菌株r h y l 2 2 的发酵培养基和依照菌株的生长曲线调整 发酵时俐，收集菌体，获得的细胞上清液的t a p 比活为1 6 7u m g ，提高3 0 倍。 通过盐析、正丁醇萃取、阴离子交换层析和亲和层析，纯化后r t t y l 2 2t a p 的比活为3 2 2 3u r a g ，纯化倍数为1 9 3 ，经s d s p a g e 电泳检测蛋白质溶液为单 一条带。r h y l 2 2t a p 为亚基相同的二聚体蛋白，分子量为1 0 0k d a ，亚基的 分子量为5 2k d a 。通过亚基的n 末端氨基酸序列的比较，r h y l 2 2t a p 与已研 究的来源于t h e r m “ss p 的t a p 的相似性为8 0 。 在水解对硝基苯酚磷酸二钠( p n p p ) 的反应中，r h y l 2 2t a p 的作用温度域 和p h 域广。在6 5 8 0 之间，酶活性较高，不易失活，半衰期长，但在9 0 4 c 下会较快失活。m g ( i i ) 和c o ( i i ) 能提高酶的耐热性，c o ( i d 在高温下对酶 有激活作用。r h y l 2 2t a p 在2 m me d t a 溶液中作用1 8 h ，能够保留5 0 的活 摘要 力。这些特性使得r h y l 2 2t a p 具有很好的研究和应用前景。 关键词：栖热菌，耐热碱性磷酸酶，热稳定性 h a b s m a e t a b s t r a c t a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( a p ) i sak i n do fh y d r o l a s e ，w h i c hc a l lc a t a l y z et h eh y d r o l y s i s o f m o n o p h o s p h o e s t e r t op r o d u c e p h o s p h a t e o rt r a n s f e rp h o s p h a t e a pe x i s t sw i d e l yi n m i c r o b i a la n da n i m a lk i n g d o m ，b u th a s n tb e e nf o u n di na d v a n c e df r o n d a pp l a y sa v i t a li m p o r t a n tr o l ei np h o s p h a t ec y c l eo fw o r l dc r e a t u r e s ，a n dh a sb e e nu s e dw i d e l y i nt h ef i e l d so fd i a g n o s t i c s ，b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y t h ec o m m e r c i a l a l k a l i n ep h o s p h a t a s e sa r ec i a p ( c a l fi n t e s t i n ea l k a l i n ep h o s p h a t a s e ) a n dec o l ia p , w h i c hh a v eh i g hs p e c i f i ca c t i v i t ya n dh a v eb e e ns t u d i e di n t e n s i v e l yt h o s e w ok i n d s o fe n z y m e sa r eo n l yf i tf o ru s i n ga tr o o mt e m p e r a t u r ea n de a s yt ol o s sa c t i v i t ya ta r e l a t i v e l yh i 曲t e m p e r a t u r e t h e r r n o s t a b l ea l k a l i n ep h o s p h a t a s e ( t a p ) i so n ek i n do f a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ，w h i c hh a st h e s a l t t e c a t a l y s i s b u tg a l lk e e ps t a b l ea t h i g h t e m p e r a t u r e t h i sk i n do fe n z y m e h a sb e e ni s o l a t e df r o mt h e m o p h i l eb a c t e r i a , a n di t s a p p l i c a t i o n sa r em u c h m o r e w i d e l yt h a nc i a p a n dec o l ia p i nt h es t u d yo ft h et h e s i s ，w eh a di s o l a t e dt h e r m o p h i l eb a c t e r i aw i t h o u te n d o s p o r e f r o mt h ee n v i r o n m e n t a ls a m p l e s ，w h i c hw e t - ec o l l e c t e df r o mt h eh o ts p r i n g so fe r y u a n a n dt e n g c h o n gc o u n t y , y u n n a np r o v i n c e 31s t r a i n so fa l k a l i n ep h o s p h a t a s ep o s i t i v e w e l es c r e e n e df r o mt h o s es t r a i n s ，a n d6s t r a i n sw e r et a k e no u tf o rf l l v t h e rs t u d yf o rt h e r e l a t i v e l yh i g he n z y m ea c t i v i t y a c c o r d i n gt o t h ec r i t e r i ao fr e s u m i n gs c r e e n ，t h e s t r a i nr h y l 2 2w a sf i n a l l yc h o s e nf o rt h eh i g h e s ts p e c i a la c t i v i t ya n dt h e r m o s t a b l i t y i naw i d et e m p e r a t u r er a n g e t h eb a c t e r i u mr h y l 2 2m i g h tb ean o v e ls p e c i e so t t h e r m u ss p a c c o r d i n gt ot h em o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a la n dg e n i e c h a r a c t e r i s t i c s ，a n db ep r o p o s e d t oi l b 1 n ea st h e r m u s y u n n a n e n s i s ( a y 5 5 7 6 0 3 ) t h es p e c i f i ca c t i v i t yo fr h y l 2 2t a p w a si n c r e a s e df r o m0 5 6u r a gt o1 6 7u m g f o r3 0 f o l da f t e ro p t i m i z ee x p e r i m e n t s ，w h i c hw a sp r o j e c t e di na c c o r d a n c ew i t ht h e g r o w t h e u i v ea n do r t h o g o n a ld e s i g nf o rt h ef e r m e n t a t i o ni n g r e d i e n t s f o l l o w i n g t h e s t e p s o fn i 山s 0 4f f e a t m e n t ，n - b u t a n o le x t r a c t i o n ，i o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p ha n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ，t h ec e l l e x t r a c to fs t r a i nr h y l 2 _ 2w a s p u r i f i e df o r 19 3 一f o l da n dt h ep u r i f i e de n z y m eh a s9 9p e r c e n tp u r i t yw i t ht h ef i n a l s p e c i a la c t i v i t yo f 3 2 2 3 u m g t h ep u r i f i e dr h y l 2 - 2 t a ps h o w e das i n g l eb a n di nt h e i i i s d s p a g eg e l r h y l 2 2t a pw a sah o m o d i m e r , a n dt h em o l e c u l a rw e i g h t so ft h e p r o t e i na n di t ss u b u n i ta r e1 0 0k d a a n d5 2k d a ，r e s p e c t i v e l y i nt h ec o m p a r i s o no f n t e r m i n i n a la m i n oa c i d s e q u e n c e s o ft h e r m o s t a b l ea l k a l i n e p h o s p h a t a s e s f r o m t h e r m u s s p ，t h es i m i l a r i t yo f r h y l 2 2 t a pi s8 0 p e r c e n t t h ek i n e t i c sp a r a m e t e r sw e r ed e t e r m i n e di nt h eh y d r o l y s i sr e a c t i o no fp n 1 1 1 1 h c e n z y m ea c t i v i t ya n dt h e r m o s t a b i l i t yc a nr e m a i nr e l a t i v e l yh i 曲i nab r o a dt e m p e r a t u r e a n dp h r a n g e s i tw a sq u i t ea c t i v ea n ds t a b l eh6 5 8 0 c ，b u tq u i t eu n s t a b l eb e y o n d 9 0 。c m g ( i i ) a n dc o ( i i ) i o n sc a ni n c r e a s et h et h e r m o s t a b i l i t yo f t h ee n z y m e ，a n dt h e e n z y m ec a l l b ea c t i v a t e di nt h ei n c u b a t i o nw i t l lc of i i ) a th i g ht e m p e r a t u r e t h e e n z y m ec a ne n d u r e2 m m e d t af o r18h o u r sa n dr e m a i nh a l fo fi t sa c t i v i t y t h e s e c h a r a c t e r i s t i c sg i v eaw a yt ot h ee n z y m ef o raw i d ef o r e g r o u n do fr e s e a r c h e sa n d p r a c t i c e s ， k e yw o r d s ：t h e r m u s ，t h e r m o s t a b l e a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ，t h e r m o s t a b i l i t y i v 昆明理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文“云南热泉栖热菌产耐热碱性 磷酸酶的研究及其菌株鉴定”是本人在导师的指导下进行研究工作所 取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本声明 的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：蕉雪评 日期： 。年牛月? p 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解昆明理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留、送交论文的复印件，允许论文被查阅，学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印或其他复制手段保存论文。 ( 保密论文在解密后应遵守) 导师签名：隍浊论文作者签名：至童臣 日 期：2 娃芷生兰自主! 旦 第章一j i 罱 1 1栖热菌的研究 第一章引言 1 11 栖热菌种群的发现及确认 栖热曲是地热高温菌的典型代表，是高温生物学基础研究和应用研究的重 点菌群，j7 k 热环境关系密切，呈世界性分布，除各地地热温泉外，人工水热环 境如热水管道及白热的堆肥，海底火山口附近都分离到栖热菌株。已分离得到 n 菌种菌株1 0 0 多个，其中已鉴定为有效公布确认的种有1 4 个，涉及4 个属5 0 多个菌株，已经龄定但未获得有效公布确认的种以及末鉴定的栖热菌菌株5 0 多 个。 1 9 6 9 年b r 。c k 从美国黄石公园首先分离出真正与地热环境有关的高温茼 劢川m 惦鲫蝴“川s ，最高生长温度达8 0 ，并据此建立栖热菌属( t h e r m u s s d 1 。此后越来越多更高生长温度的栖热菌被分离出来。1 9 8 4 年，l o g i n o v a 分离 并有效公布确认砌p r m “sr u b e r 3 1 。1 9 8 7 年，h u d s o n 有效公布砌p r 卅郴芦垣加r m 如1 4 o 19 9 2 匀- ：蔡妙英等从7 东阳江、电白和韶关等地的温泉分离到t h e r m u s o n p ，o l e o ，1 一t i c 圳【“。1 9 9 4 年，k r i s 日a n s s o n 从冰岛分离得至：l j t h e r m u s s c o t o d u c t u s ”1 。 1 9 9 5 q ：，f e n r e i r o 等有效公布确认t h e r m u ss i l v a n u s 1 t h e r m u sc h l i a r o p h i l u s 1 a k o b a v a s h i 从深海火山1 5 1 分离得至l j t h e r m u s p r q f u n d u s i q ow i l l i a m s 有- 效公布确认 2 h e ，m “sb r o c k i a n “5 并有效命名t h e r m u st h e r m o p h i l u s ( e x o s h i m am a di m a h o r i ) ”。 1 9 9 6 q ：n o b r e 等根据菌株的表型及生理生化特征，特别是部分菌株生长温度相 对较低，提议将f ，“抛r 、丁s i l v a n u s 和丁幽，j n ，o p f ，“s 另立新属，即亚栖热菌属 ( m e i o t h p ，“ss p ) 1 0j ，使栖热菌属成为含两个属的栖热菌群( t h e r m u s g r o u p ) 。 1 9 9 6 b w i l l i a m s 等从葡萄牙、冰岛和亚述尔群岛分离得鲥j t h e r m u s o s h i m a i ，2 0 0 0 年，c h u n g 从冰岛分离得至j i t h e r m u s a n t r a n i k i a n i i 和t h e r m u si g n i t e r r a e 1 1 2 1 。，2 0 0 1 年r a i n e y , 1 1 d ac o s t a ：l , 奇栖热菌群命名为栖热菌目( t h e r m a l e s ) ”“，2 0 0 2 年s a k oe ，n ，【”i , t l m i r o s h n i c h e n k oe la 1 分别新设海洋栖热菌( m a r i n o t h e r m u s ) 和 深海栖热菌属( ( ) c g “月砌p r “s ) us o 我国陈朝银、林连兵等在2 0 0 2 年从云南省 腾冲县热海公园的热泉中分离并经形态、生理生化、分子生物学鉴定得 到热海栖热菌新种( rr e h a is p n o v ) 1 6 1 和玫瑰弧栖热菌新利1 ( m e ，o s “c 。u s s pn o v ) d 7 2 0 0 2 年m rc h e n 从台湾分离到台湾弧栖热菌新种( 姚t a i w a n e n s i s ) 。 日前，俩热菌目有1 个科、4 个属、2 0 个种、1 0 0 多个菌株。栖热菌属有8 个 有效公布的种：水生栖热菌( za q u a t i c u s ) 、嗜热栖热菌( 丁t h e r m o p h i l u s ) 、 锺状柄热菌( r ，? ，咖r m i s ) 、水管致黑栖热茼( rs c o t o d u c t u s ) 、布氏栖热菌( 丁 b r o c k i d 胛“y 、r o s h i m a i ，ri g n i t e r ，盘e 、r “胛t r a n i k i a n i i l 1 9 1 ，3 个未获有效公布的 科l ：热海栖热菌( rr e h a i ) ，非解酰栖热菌( tn o n p r o t e o l y t i c u s ) 和7 1 k a w a y e u n e n s i s ， r 打v i y j 和r c a l d o p h i l u s 己分别并入rt h e r m o p h i l u s 和， “t i c “s ，各种群亲缘父系的系统树分析如图1 1 所示，另有未定种的菌株5 7 个，均列卜茛1 一l 。皿栖热菌属有5 个有效公布的种：m er u b e r 、m ec h l i a r o p h i l u s 、 埘ps i f v 口、m ec e r b e r e u s l 2 叭、台湾亚柄热菌( m et a i w a n e n s i s ) ，1 个未获有效 公御确认的种：玫瑰弧栖热菌( m er o s a c d u s ) 。海洋栖热菌属目前只有m a v d r o t h g r a l i s 个种，深海柄热菌属目前只有0p r o j u n d u s - - 个种。 幽1 1 栖热菌曰l j 已知1 6 sr d n a 的各种群亲缘关系的系统树分析结果 第一章引言 注：各菌株1 6 sr r n a 基因序列取2 8 1 4 5 5 区间进行分析，软件采用v e c t o rn t i5 0 。标尺表示 每1 0 0 个碱基有1 个碱基差异，括号中为n c b i 基因库序列号。 表1 - 1 栖热菌目的科、属种及其部分未鉴定的菌株 t h e r m a l e s ( 栖热菌目) + t a x o n o m y 1 d ：6 9 3 3r a n k ：o r d e r ( 1 | ) o t h e rn a m e s t h e r m u sg r o u p 【e q u l v a l e n tl l a l i l e 】 t h e r m a e e a e ( 栖燕菌辩) i 劢锄“s ( 栖热菌属)m e i o t h e z m u s ( 亚栖热菌属) 己获有效公布确认的栖热菌属的种：获得有效公柱确认的亚栖热菌： f a q u a t j c u s ( 含zc a l d o p h i l u s ) m e r u b b e r zt h e r m o p h l u s ( 含7 = ：l a v u s )a e c h l i a r o p h i l u s 1 f i l i f o r m i st i e s i l v a n u s j r s c o t o d u c t u s n e ，c e r b e r e u s 厂b c o c k y a n u s来获有效公布确认的亚栖热菌： ，o s h i m a j帕斤o s a c e u s f i g n i t e r r a e 毪e ? t a i w a n e n s i s za n t r a n i k i a n i i 未获有效公布确认的栖热菌： m a r i n i t h e r m u s ( 海洋栖热菌属) rr e h a i未获得有效公枢确认的海洋栖热菌： t l k a w a y e u n e n s i s腑h y d r o t h e r m a l i s tn o n p r o t e o i y f i c “s 帕，p r o f u d u s i vu n i d e n t i f i e d 劢口s ( 栖热菌未箍定种) 1 7 8 w z 口s p - 2 8 砌e r m t , 口s p e o h l3 9 刁* 册淞s p m a a i k a r a 墒 27 ms m7 1 2 17 ，匆，m l 岱s d e o h 24 0t h e r r n u ss p s r i d e l 3砀暑聊l 搏s 口a 4 2 2t h e r r n u ss 口e o h 34 it h * r r n u as o i b - 3 3 5 42 犰，研z 啦s 口c a 2 3 t h e r r a 埘s d e p a l 4 2 t h e r t n l $ s p o 旧3 4 3 5t h e ，m s d o h l 2 4t h e r m u ss p e p a 24 37 h e n n u ss p 1 i 7 2 5 4 6t h e r n b ts d o i d ,2 5t h e r m u ss p e p a 3 “ 豫e r m i 印s r l 2 4 8 7t h 洲l 口s d o h 3 2 6t h e r m u s e o h 54 5t h e n n u ss 口s r i - 9 6 8t h 洲i 巧s 口。p a l2 7 邪 m 瑚s p e o h 64 6 锄e 丌，1 ws p t o k 6 a 1 9t h e v 7 1 js d p a 2 2 b砌e m w s p e p a 4 4 7 刀缸w s p f d 3 0 4 1 1 0t h e r m t l , fs 口p a 32 9t h e r r n u ss p e p a 5 4 87 h e r m ws d 【m 6 5 0 i 11t h e r m u ss 口他 3 0豫e r f t l t l ss p e p a 64 9 拍e r m z s p n t u - 0 2 4 1 2t h e r m z s d t b l31t h e r m t s d e o h 4 5 0 7 施e t m z z $ s p a k l 3 d 2 1 1 3t h p r n u $ s 口z - l 3 2 强e r t t l l $ s p s a - 0 1 5 lu n i d e n t i f i e dt h e r r n u so p s l 5 1 4t h e r m t g o h 43 3t h e ，7 再；博s 口p a 5 5 2u n i d e n t i f i e d7 h t r m u so p s 8 a 1 st h e 7 l 岱s d 0 1 - t 53 4 t h e r m u ss p j p a 65 3u n i d e n t i f i e d r m u so p t 6 0 t 6 t h e r m u $ s 。 o h 6 3 5t h e r m u ss p s m 3 25 4u n i d e n t i f i e d7 h e r r n u so p b l 9 1 77 孺o m ws 口p a 4 3 62 ”r m u ss d r t 4 1 a5 5u n i d e n t i f i e d 刀k r # l i do p b 3i 18 7 h e r m s j v i l 3 3 7t h e r m u s s p y s 4 5 5 6u n i d e n t i f i e d7 h e 册l 螂o p b 3 2 197 h p t t a z t j 卵h r l 3 3 8抛珊螂如a k l 6 d5 7t m l d e n t t f i e d2 n n u so p $ 2 5 p h o t o t r o p h i cb a c t e r i a ) ( d r b o o n ea n dr w 。c a s t e n h o l z , e d s ) ，s p r i n g e r v e r l a g ，n e wy o r j ( ( 2 0 0 0 p 4 0 3 v a l i d a t i o n l i s t n 。8 5 ( 2 0 0 2 ) i n t 。j s y s t e v 0 1 m i c r o h l o ，5 2 ：6 8 5 - 6 9 0 3 第一章j 引言 1 1 2 栖热菌的分类鉴定方法 栖热菌的分类鉴定方法总体上和其它细菌类似，由于它的发现和研究处于 分子生物学和分子遗传学兴盛时期，其分类学研究充分体现了现代分类鉴定方 法的发展。1 9 6 9 年确立栖热菌群第一个种ra q u a t i c u s 的主要依据是生长温度达 8 0 、好氧、革兰氏阴性、嗜热非芽孢杆菌，形态学上具有特殊的细胞壁结构。 此后主要通过许多生理生化特征比较，特别是多种碳源的利用试验，进行聚类分 析来确定分类地位。8 0 年代后d n a - d n a 分子杂交同源性分析在新种的确定中 起重要作用，同源性6 0 - - 7 0 可视为同一种内不同亚种，同源性5 0 6 0 之 间可视为属内紧密相关的种，同源性5 0 以下为不同属。1 9 9 0 年以后随着核酸 测序技术的发展，核糖体r n a 的序列分析成为系统进化分析的主要手段，它从 分子水平揭示细菌间的亲缘关系。已成为当今研究生物间亲缘关系和各生物i 训 进化关系的不可替代的方法，一般认为，菌株之间1 6 sr r n a 基因序列差异达3 时，很可能属不同的种，这对确定新属、新种无疑非常重要。随着5 sr r n a 和2 3 s r r n a 以及它们之间连接部分的序列分析和二级结构分析引入细菌的分类鉴定， 这些方法也将随之引入栖热菌的分类鉴定【1 7 2 “。化学分类方面。g + cm 0 1 含量 测定是应用较普遍的化学分类指标之一，栖热菌属菌株d n ag + cm 0 1 介于 6 0 7 0 之间，总体上体现了同种内菌株差异不大于4 5 ，同属内菌株差 异不大于1 0 的基本规律。脂肪酸分析也是栖热茵分类研究的重要指标f 博】，分 离自冰岛的新种t i g n i t e r r a e 在表型上区别于其他菌株主要在于脂肪酸组成中 i s o - 1 5 ：0 含量很高、i s o 1 6 ：0 含量很低，新种z a n t r a n i k i a n i i 脂肪酸组成却是 i s o - 1 7 ：0 含量很高。脂肪酸含量成为这两个新种的主要鉴别特征。总之，g + c m o t 含量、d n a - d n a 分子杂交、1 6 sr r n a 寡核苷酸序列分析、脂肪酸分析 己成为栖热菌分类鉴定研究的手段和方法【2 。 1 2 碱性磷酸酶的研究和应用 1 2 1 碱性磷酸酶的生理功能 碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s ee c3 1 3 1 简称为a p ) 是一种水解酶，能 催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也 可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体 4 第一章引言 上，并产生对应的醇、酚或糖。在磷生物地球化学循环过程中，a p 起了极其重 要的作用。 在生物体内a p 与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌 以及骨骼的形成等生理生化过程。磷酸盐在细胞内不能合成，当磷酸盐数量受限 的时候，细胞必须通过a p 的水解从核酸、磷酸化糖和蛋白质中得到有机体所需 的磷酸盐。碱性磷酸酶和酸性磷酸酶是两种性质和功能不相同的酶，它们催化所 依赖的p h 不同，前者作用环境的p h 在碱性区域( p h9 0 1 0 5 ) ，而后者作用环 境的p h 在偏酸性区域( p h 4 5 - 6 o ) 。 a p 广泛存在于微生物界和动物界。尚未发现存在于高等植物体内2 羽。 1 2 2 动物界的碱性磷酸酶研究 动物界中主要有：环节动物蚯蚓田j ，软体动物的牡蛎【2 4 】、蜗牛口孔，棘皮动 物的海星口6 j ，节肢动物的蜘蛛口训，甲壳动物长毛对虾【2 8 】等无脊椎动物，脊索动 物文昌鱼2 9 1 ，以及鱼类【3 0 】、爬行类【3 1 】、鸟类吲、哺乳类 3 3 - 3 7 1 包括人类3 8 - 4 1 等脊 椎动物的组织器官来源的a p 均有不少的研究报道。 1 2 3 微生物界的碱性磷酸酶研究 最早的关于微生物a p 研究是从中温微生物开始的，如e s c h e r i c h i a c o l i 【4 2 1 、 b a c i l i u ss “b t i l i s l 4 3 、a s p e r g i l l u sn i d u l a n s 4 4 并1 1m i c r o c o c c u ss d 如以p 雕括【4 5 】。随着极端 微生物的研究发展，m i n - f u n gy e h e la 最先于1 9 7 6 年分离纯化耐热a p 是来源 于砌p r 。凇口口“口f f 船娜l ，到了二十世纪九十年代掀起了研究耐热a p 的热潮，研究 来源于t h p ，m “st h e r m o p h i l u s 4 ”、t h e r m u sc a l d o p h i l u s l 4 8 - 4 9 1 、t h e r m o t o g a m a r i t i 州e 1 5 0 1 、t h e r m o t o g an e a p o l i t a n a 5 ”、p y r o c o c c u sa b y s m 【5 2 】、m e i o t h e r m u s r “b e r f 5 3 1 、s c y t a l i d i u mt h e r m o p h i l u m 5 4 1 和b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s 5 卯。由于特 殊应用的需要，也研究了来源于嗜冷微生物的不耐热a p ，如来源于p s y c h r o p h i l i c a r t h r o b a t e r 【s 6 】和l i b r os p 【5 7 】的热不稳定性a p 。 1 2 4 碱性磷酸酶在诊断学上的研究 最早发表关于磷酸酶研究的文献记载是1 9 1 1 年l e v e n e m e d i g r e c e a n u 峥“ 和1 9 1 2 年g - r o s s e r & h u s l e r l 6 2 】，他们分别从哺乳动物的肠粘膜和肾脏分离提取一 第一章引言 种能使磷酯键水解的酶。1 9 1 3 年p l i m m e r l 6 3 1 发现这种酶能水解核苷酸、己糖磷酸、 甘油磷酸等多种磷酸化合物。r o b i s o n 6 4 1 于1 9 2 3 年发现骨化的软骨组织富含磷酸 酶，由此提出磷酸酶直接参与骨化过程的假说。r o b i s o n & s o 锄e s 6 5 1 在1 9 2 4 年 再次报道了这种磷酸酶在偏碱性条件下( p h 8 4 9 4 ) 有最适酶活力。1 9 2 6 年 m a r t h a n d r o b i s o n 【“ 也发现在动物的肾脏、肠粘膜和血液中，具有相同的催化 性质的同种酶，其酶活力的表现在偏碱区域。1 9 3 4 年r a v i e s 6 7 1 却发现在另外的 一些组织器官如脾脏、肝脏，除了具有较高偏碱性磷酸酶外，还有一种最适活性 在偏酸性( p h 4 5 6 o ) 的磷酸酶。因此他们建议把这两类酶分别取命名为碱性磷 酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ) 和酸性磷酸酶( a c i ap h o s p h a t a s e ) 。这个命名至今仍然 被采用。 1 9 2 9 年k a y 6 嚣l 发现某些骨骼病如佝偻病，患者血清a p 活力有显著提高， 1 9 3 0 年h u n t e r 6 9 1 和k e y 7 0 l 予以证实。1 9 3 3 年r o b e , s 7 1 1 报告了肝胆病患，特 别是阻碍性黄疸病的患者血清中a p 水平也有大量增加的现象，从此开始认识到 a p 在临床诊断中的重要性，测定a p 成为一项鉴别肝胆疾患以及诊断骨质增生 疾病不可缺少的指标。现已证实，不仅在肝胆疾病和骨质增生疾病时血清a p 活 性增高，而且在妊娠和某些癌症患者血清a p 活性也有极大的提高。由此，建立 了一系列灵敏的检测a p 酶活力的方法，并开始进行了酶分子性质的系统研究。 1 9 5 0 年代以来，随着科学的发展，先进的研究手段的应用，对a p 的认识不断深 入。到目前为止，在a p 的性质、结构与功能、作用机理、活性调控等方面均有 不少的探讨研究，并得到了可喜的成就，这些工作对研究生物进化和临床鉴别诊 断都具有重要意义。 1 2 5 碱性磷酸酶在免疫学、生物化学和分子生物学上的应用 a p 在酶联免疫标记试验( e l i s a ) 中用作的标记酶，将碱性磷酸酶与显色剂 或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在 7 2 - 7 3 1 。a p 作为非同位素标记被广泛应用于s o u t h e r n 和n o r t h e r n 印记分析和d n a 序列分析 等各个方面 7 3 - 7 5 1 。a p 能催化除去d n a 、r n a 、三磷酸核糖核苷和三磷酸脱氧 核糖核苷的5 磷酸基团，切除r n t p s 及d n t p s 的5 末端磷酸基团，为5 末端标记准 备模板，防止d n a 片段的自连接或克隆载体自环化连接，蛋白质的去磷酸化，蛋白 质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的去磷酸化。用a p 处理后的d n a 片段缺少连 6 第一章引言 接酶所要求的5 磷酸末端，使得它们不能进行自连接，利用这个特性可以降低克隆 时载体d n a 的背景。 1 2 6 碱性磷酸酶酶学性质的研究 a p 是一种底物特异性较低的磷酸酶，几乎可以水解生物体所有的磷酸酯化 合物。早期测定酶活力以定磷法为主，后来改为用芳香磷酸单酯测定释放出来的 酚更为方便。现在测定的方法一般采用以苯磷酸、对硝基苯磷酸、酚酞单磷酸、 麝香草酚酞单磷酸酯为底物，用分光光度计测定所释放的酚。许多能发射荧光的 物质，如b 萘磷酸、4 甲基伞形酰磷酸、3 - 0 ，甲基荧光素磷酸也已用来磷酸酶的 研究，其主要优点是荧光灵敏度比分光光度计法更高，可以用于更微量分析。 酶催化反应动力学研究指出，酶表现最大活力的p h 范围在9 1 1 ，可随不同 生物来源和不同测定体系而变。在测定体系中，许多种金属离子、效应物对酶催 化作用有很大的影响。在不同来源的a p 观察到m 9 2 + 、m n 2 + 等离子对天然酶有 激活作用，c u 2 + 、z r l 2 + 则为抑制作用。无机磷酸和金属螯合剂表现为较强的抑制 作用。几种氨基酸可以通过对酶分子中的z n 2 + 螯合而起抑制作用。 1 3 耐热碱性磷酸酶的研究 1 3 1 耐热碱性磷酸酶的定义 耐热碱性磷酸酶( t a p , t h e r m o s t a b l ea l k a l i n ep h o s p h a t a s e ) 是一种耐热的碱性 磷酸酶，其催化机制与一般的碱性磷酸酶相同，适合于高温下反应，常应用于高 温环境，一般从高温微生物中分离得到。 研究较为深入的有来源于t h e r m u s 属、t h e r m o t a g a 属、m e i o t h e r m u s 属和 p y r o c o c c u s 属的t a p ，其中包括t h e r m u st h e r m o p h i l u s 、t h e r m u sc a l d o p h i l u s 、 t h e r m o t o g am a r i t i m e 、t h e r m o t o g an e a p o l i t a n a 、p y r o c o c c u sa b y s s i 、m e i o t h e r m u s r u b e r 、s c y t a l i d i u mt h e r m o p h i l u m 和b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s 。研究内容有：研 究耐热碱性磷酸酶在细胞磷代谢中的作用，酶学特性以及酶的结构与功能的关 系，以t a p 为材料研究耐热蛋白的结构，比较耐热蛋白和间源中温蛋白结构的 差异性揭示蛋白的耐热机制。 7 第一章引言 1 3 2 耐热碱性磷酸酶的特性 酶的耐热特性与微生物生长温度有很大关系。一般说来，出发菌株生长温度 高，从该菌株分离得到的碱性磷酸酶的作用温度也高，如从t h e r m u sa q u a t i c u s 的培养温度为8 0 。c ，其碱性磷酸酶最适作用温度为7 5 8 0 4 c 4 6 1 ；t h e r m o t a