（植物学专业论文）野生夏葡萄erf基因的分离克隆、序列分析及转基因植株的筛选.pdf

摘要 干旱、高盐和低温等非生物环境以及生物胁迫严重影响了植物的生长发育 和限制作物的产量。在逆境胁迫条件下，植物首先要通过多种途径感应环境的 变化，然后将环境变化转变为细胞内部的信号，在接受了细胞的内部信号后， 转录因子等反式作用因子与顺式作用元件结合来启动抗逆基因的表达，从而提 高植物的抗逆性。许多植物逆境胁迫诱导基因的表达都在转录水平上受到转录 因子和顺式作用成分的调控，因此转录因子在植物抗逆信号传递过程中起着中 心调节的作用。 本文采用电子拼接结合的r t - p c r ，获得了野生夏葡萄的另外一个转录因子， 分别命名为v a e r f 4 1 ；序列分析表明，v a e r f 4 - 1 、v a e r f 4 - 2 两个基因大小分 别为8 2 5 b p 、8 3 7 b p ，分别编码由2 7 4 个、2 7 8 个氨基酸组成的分别含有一个a p 2 结构域的蛋白质。另外，通过g e n b a n k 获得两个基因的启动子区域的顺式作用 成分，发现在基因的启动子区含有许多与生物和非生物胁迫有关的顺式作用成 分。通过同源性分析表明，v a e r f 4 - 1 、v a e r f 4 - 2 两个基因与a t e r f 5 基因的同 源性较高，我们预测这两个基因在调节方面与a t e r f 5 转录因子具有相似的功 能，也能促进下游基因的表达。最后通过表达载体的构建以及转基因植物的筛 选为后续研究基因的生物学功能做准备。 总之，通过v a e r f 4 一l 、v a e r f 4 - 2 两个基因的获得、序列分析、v a e r f 4 - 2 基因表达载体的构建和转基因植物的获得，我们对这两个基因的结构有了进一 步的认识，也为后续基因功能的鉴定做好了基础。 关键词：转录因子；e r f ：转基因植株 a b s t r a c t a b i o t i cs t r e s s e ss u c ha sd r o u g h t ，s a l i n i t yo rl o wt e m p e r a t u r ea r em a j o r e n v i r o n m e n t a lf a c t o r st h a th a v ea d v e r s ee f f e c t so np l a n tg r o w t ha n dl i m i tc r o p p r o d u c t i o n u n d e rs t r e s sc o n d i t i o n s ，p l a n t sf i r s t l ys e n s et h ee n v i r o n m e n t a lc h a n g e s t h r o u g hm a n yw a y s ，a n dt h e nt r a n s f o r mt h e s ec h a n g e si n t ot h ec e l ls i g n a l s ，f i n a l l y , t r a n s f i p t i o nf a c t o r st h a ta c c e p tt h e s ec e l ls i g n a l sw i l la c tw i t hc i s - a c t i n ge l e m e n ta n d c h a n g et h ee x p r e s s i o no fs t r e s s r e s p o n s i v eg e n e s ，r e s u l t i n gi na ne n h a n c e m e n to f s t r e s s - t o l e r a n c ei np l a n t s m a n yg e n e sw e r er e g u l a t e da tt r a n s c r i o t i o n a ll e v e l ，a n d m o s t l yb yt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s t h e r e f o r e ，t r a n s c i p t i o nf a c t o r sp l a yap i v o t a lr o l ei n s t r s st o l e r a n c eo fp l a n t s i nt h i sp a p e r ，w ed e s c r i b et h ec l o n i n go ft h eo t h e rg e n ef r o mh t i s a e s t i v a l i s , a n d d e s i g n e dv a e r f 4 1 t h et w og e n e sa r e8 2 5 b p 、8 3 7 b pa n de n c o d e dp r o t e i no f 2 7 4 、2 7 8 a m i n oa c i d sw i t hat y p i c a l l yp l a n ts p e c i f i ca p 2d o m a i ni nt h ec e n t e ro ft h e p r o t e i nr e s p e c t i v e l y i na d d i t i o n , w ef i n d a n da n a l y z et h ep r o m o t e rr e g i o no f v a e r f 4 - 1 、v a e r f 4 2g e n ea n ds e v e r a lc s - e l e m e n ti n v o l v i n gb i o t i ca n da b i o t i c s t r e s sr e s p o n s ew e r ef o u n di nt h i sr e g i o n v a e r f 4 - 1 、v a e r f 4 2 、g e n e sh o l dt h e h i g hh o m o l o g o u sw i t ha t e r f 5g e n eb yt h eh o m o l o g o u sa n a l y s i sa n dw ef o r e c a s t t h e yh a v et h es a m ef u n c t i o nw i t ha t e r f 5 i nr e g u l a t i o nt op r o m o t et h ee x p r e s s i o no f t h eb a c k w o r dg e n e s a tl a s t ，o v e r e x p r e s s i o nv e c t o r sc o n s t r u c t so fv a e r f 4 - 2g e n e w e r em a d ea n dt r a n s f o r m e di n t oa r a b i d o p s i sb ya g r o b a c t e r i u m - m e d i a t i o n p r e p a r i n gf o rt h ei d e n t i f i c a t i o no fb i o l o g i c a lf u n c t i o n s i nc o n c l u s i o n ，b ya b t a i n i n go ft h e s eg e n e s 、a n a l y s i so ft h es e q u e n c e 、 o v e r e x p r e s s i o nv e c t o r sc o n s t r u c t sa n dt r a n s f o r m a t i o ni n t oa r a b i d o p s i s ，w e k n o w a b o u tt h et w og e n e sf u t h e r l ya n dp r e p a r ef o rt h ei d e n t i f i c a t i o no fb i o l o g i c a l f u n c t i o n s k e y w o r d s ：t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ；e r f ；t r e n s g e n i cp l a n t s 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。 论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或 发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均 已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 一娩鸟岛寺 日期： 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文 被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 一躲移啼 指导教师签名： 日 期： 很争- 哆 v 铲酯、s 。 野生夏葡萄e r f 基因的分离克隆、序列分析及转基因植株的筛选 第一章绪论弟一早三：百t 匕 1 1 引言 葡萄已经成为世界上附加值最高，最重要的水果之一。在世界范围内，绝 大部分食用和酿酒葡萄都来源于一种欧亚种葡萄一欧洲葡萄 ( 圩t i s - v i n i f e r a ) 。尽管这个种的葡萄已经有多达6 0 0 0 个不同的栽培品种， 但由于来源于同一祖先，其遗传可变性非常有限。大部分葡萄栽培品种易感染 病毒、细菌和真菌病，对各种不良环境的抵抗和耐受能力较差。一些著名的酿 酒葡萄如赤霞株( c a b e r n e ts a u v i g n o n ) 白粉病和霜霉病发生比较普遍，流行 年份对果实品质和产量往往造成很大损失。同时还影响枝条的生长及葡萄植株 第二年的生长发育。但是欧亚葡萄间存在白粉病抗性的显著差异，野生葡萄如 夏葡萄( v i t i s a e s t i v a l i s ) 对白粉病、霜霉病具有很强的抵抗力，在同样的 处理条件下，感病的比率远远低于赤霞珠等栽培品种。 葡萄在生长过程中不可避免地会遭受到各种逆境因子( 干旱、高盐、低温 以及病虫害等) 的侵袭。研究表明，培育抗逆葡萄新品种已经成为解决上述问 题有效的途径之一，近年来，随着植物抗逆分子机理研究的不断深入和细胞工 程、基因工程以及基因技术的日趋完善，已经为培育抗逆作物新品种开创了一 条崭新的途径，能够成功地利用这些基因提高了作物的抗逆能力。 转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，tf ) 又称反式作用因子，是一群能与 真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合，从而保证目的基因以 特定的强度、在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。自从1 9 8 7 年p a z - h r e s 首 次报道玉米转录因子基因的克隆以来，相继从高等植物中分离出的调控干旱、 高盐、低温、激素、病原反应及生长发育相关基因表达的转录因子以达数百种 ( l i uq i a n g ，2 0 0 1 ) 。 植物体内存在大量的转录因子，拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 仅含有 2 7 0 0 0 个基因，其中就有5 9 的基因是编码转录因子的。根据其d n a 结构域的特 点可把转录因子分成若干个家族，w r k y ，a p 2 e r e b p ，m y b ，b n i p ( h a n z h i p i n g ， 2 0 0 6 ) 。e r f 是a p 2 e r e b p 转录因子家族的一个亚家族。至今在拟南芥中发现1 2 4 个e r f 家族基因，在水稻中发现1 3 9 个e r f 家族基因，近年来还从其他植物中如烟 草、玉米、番茄等分离出这类家族基因( l i u x i n ，2 0 0 6 ) 。这类转录因子在植物 的生长发育以及多种生理生化反应的信号转导中发挥重要的作用。 野生夏葡萄e r f 基因的分离克隆、序列分析及转基因植株的筛选 由此可见，转录因子在植物逆境胁迫应答反应过程中起到了中心调控作用， 一个转录因子可以调控多个与同类性状有关的基因的表达，它们在高等植物的 生长、发育、形态建成以及在对生物和非生物逆境因子的反应中起着非常重要 的调控作用，因此在提高作物对胁迫的抗性中，改良或增强一个关键的转录因子 的调控能力，就可以促使多个功能基因大会作用，从而使植物的抗性得到全面 的提升，获得一个综合的改良效果。 1 2 植物转录因子的分类 r i e c h m a n ne ta 1 ( 2 0 0 0 ) 将拟南芥( a r a b i d o p s i s ) 全基因组的转录基因 与三种真核生物包括线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 果蝇( d r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ) 和真菌酵母( s a c c c h a r o m y c e sc e r v i s i a e ) 全基因组的转录调 控因子进行表较，来研究它们之间的差异和共同点。a t h a l i a n a 中已鉴定出的 转录因子共约有1 5 3 3 个( 不包含重复基因) ，占基因总数5 9 ，高于e l e g a n s ， 屈m e a n o g a s t e r 和& c e r v i s i a e 中转录因子个数在总基因数中所占的比例。有 几类转录因子是植物特有的，如a p 2 e r e b p 、n a c 、w r k y 、a r f 、t r i h e l i x s 和 a u x i a a 等。根据转录因子保守区的结构特点，将转录因子分为3 3 个大的家族， 有的家族又分为几个亚家族，如a p 2 e r e b p 包含a p 2 亚家族和e r e b p 亚家族， 锌指类转录包含多个亚类：d o f ，g a t a ，c 2 h 2 和c 2 c 2 等。而g u oe ta 1 ( 2 0 0 5 ) 将a t h a l i a n a 的已知和预测的1 7 8 9 个转录因子可被分为4 9 个组( f a m i l y ) 。 在a t h a l i a n a 的转录因子中锌指类转录因子的风度最高，其次是m u b 类转录因 子，再次是a p 2 、e r e b p 、b h l h 和n a c 。水稻主要的1 8 类1 3 3 6 个已知全场c d n a 转录因子占基因总数2 6 ，其中锌指类转录因子最多，约5 8 8 个，其次是m y b 基因( 1 5 8 个) ，e r e b p 和n a c 分别是1 4 3 个和7 5 个，与a t h a l i a n a 转录因子 分别情况相似。 转录因子在转录水平上与d n a 互作从而调节基因的表达，是基因表达、调 控中最关键的一步，其结构的多样性决定了调控功能的多样性。它们在高等植 物的生长、发育、形态建成以及在对生物和非生物逆境因子的反应中起着非常 重要的调控作用。 1 2 1a p 2 e r e b p a p 2 e r e b p 是植物中特有的一类转录因子，该家族包括调控植物细胞周期、 生长发育( 如花器官分化和叶表面细胞分化) 以及生物、环境逆境因子胁迫应 野生夏葡萄e r f 基因的分离克隆、序列分析及转基因植株的筛选 答反应等有关的一类转录因子。在拟南芥基因组中约有1 4 4 个a p 2 e r e b p r a v 类基因，其中1 2 4 个a p 2 e r e b p 基因，1 4 个a p 2 基因和6 个r a y 。而水稻基因 组中预测约有1 4 3 个a p 2 e r e b p r a v 类基因其中已获得8 3 个e r e v p 基因的c d n a 克隆。根据所包含的a p 2 保守区的个数，将这类转录因子分为三个亚家族： a p 2 ，r a v 和e r e v p 。1 2 4 个只含有一个a p 2 e r e b pd n a 结合结构域的e r e v p 转录 因子当中有1 2 1 个在其a p 2 e r e b p 结构域的中部含有一个保守的w l g 基序 ( m o t i f ) ，根据结合d n a 结构域氨基酸序列的相似度，又可把这1 2 1 个基因分 为2 组：d r e b 小组，包含6 5 个e r f 类转录因子，以报道的参与抗病反应的e r e v p 基因都在这一组当中，另外还有3 个只含一个a p 2 e r f 结构域的转录因子，它 们的a p 2 结构域中部没有w a l 保守序列，其a p 2 结构域更与a p 2 亚家族基因的 a p 2 结构域相似，这几个可能属于a p 2 亚组。a p 2 亚类转录因子含有2 个a p 2 结 构域，调控细胞的生长分化，尤其在花的发育过程中其关键的调控作用；e r e b p s 亚类转录因子含有1 个a p 2 保守区，这亚类转录因子在调节植物对急速、病原 物、低温、干旱及高盐等逆境因子的应答反应及细胞的分化、发育等发挥重要 的调节作用，是乙烯、s a 和j a 信号传导途径的重要元件。 e r e b p 亚家族( s u b f a m il y ) 的转录因子能与二种顺式元件结合：g e e 盒( g c c b o x ) 或乙烯反应元件( e t h y l e n er e s p o n s ee l e m e n t ，e r e ) ，这类元件是在受乙 烯诱导的p r 蛋白启动子区发现的，其核心序列是a g c c g c c ，已报道的这类转录 因子有烟草的e r e b p l - 4 ，h r a b i d o p s i s 的a t e b p 和a t e r f l - 5 。以及番茄的 p ti4 6 ；c r t d r e ，即c r e p e a t ( c r t ) 或脱水反应元件( d e h y d r a tio nr e s p o n s e e l e m e n t ，d r e ) ，其核心序列是a g c c g a c ，已报道的能和这类顺式作用元件互 作的转录因子有c b f l ，c b f 2 ，c b f 3 ，d r e b i a ，d r e b 2 a 和o s d r e b 。有的e r e b p 蛋 白可以与g c c 盒及c r t d r e 元件都可以作用如t s i l 。 还有一类e r e b p 转录因子，如拟南芥的r a v i 和r a y 2 ，含有一个a p 2 结构 域和一个b 3 结构域，其作用的d n a 核心序列是c a a c a 和c a c c t g ( k a g a y ae ta 1 ， 1 9 9 9 ) 。n o l e - w ii s o n 等( 2 0 0 0 ) 发现含有两个a p 2 结构域的a p 2 类蛋白如a n t 能与5 l g c a c ( a g ) n ( a i t ) t c c c ( a g ) a n g ( c t ) - 3 d n a 片段特异性地结合，但其 中任何一个a p 2 结构域不能单独与该d n a 片段结合，说明2 个a p 2 结构域在与 d n a 结合的过程中协同作用，它们作用在这一共同序列中的相邻位点上 ( n o l e - w il s o n ，k r i z e k ，2 0 0 0 ) 。 野生夏葡萄e r f 基因的分离克隆、序列分析及转基因植株的筛选 1 2 2n a c n a c 转录因子在氨基酸序列的n 端含有一个非常保守的植物特有n a c 结构 域的一类转录因子，a i d ae ta 1 ( 1 9 9 7 ) 首先报道了n a c 结构域，发现在矮牵 牛n a y 基因和拟南芥的a t a f l 2 和c u c 2 基因编码的蛋白n 端包含一个保守的氨 基酸序列而命名为n a c ( n a m ，a t a f i 2 ，c u c 2 ) ，这类转录因子组成了植物中最 大的转录因子家族之一。从水稻( o r y z a s a t i v a ) 基因组中获得7 5 个n a c 基因 全长c d n a 克隆( k i k u c h ie ta 1 ，2 0 0 3 ) ，在拟南芥基因组中有1 0 5 个n a c 基因。 到目前为止，只研究其中较小一部分基因的功能。已经发现转录因子n a c 在植 物的发育、衰老过程和抗逆反应中起重要的调控作用( o l s e ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 n a c 基因编码的蛋白的n 端常含有一个非常保守的结构域即n a c 结构域， 该结构域由a 、b 、c 、d 和f 五个亚区组成，而其c 端具有高度的多样性，不包 含任何已知的蛋白功能区，但具有转录激活活性，n a c 转录因子的结构见图1 5 。 o o k a 等( 2 0 0 3 ) 根据n a c 结构域的氨基酸序列的相似度将将已报到的和预测的 n a c 基因分为二组：i 组和i i 组。i 组又进一步分为t e r n 、o n a c 0 0 2 、s e n u 5 7 n a p ? a t n a c 37a t a f 、o s n a c 3 ，n a c 2 、a n a c o il 、t i p 、o s n a c 8 、o s n a c i 、n a c i 和n a m l 4 个亚组。但进一步分析发现五个拟南芥的n a c 转录因子包含2 个串联 的n a c 结构域，另外还预测有跨膜区或进出核信号( o o k ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 a r a b i d o p s i s 的n a c i 、a t n h m 和a n a c l 0 9 及b r a s s i c an a p u s 的几个n h c 转录因 子能与c a m v 的3 5 s 启动子结合。m y c l i k e 元件( c a t g t g ) 在拟南芥e a r l y r e s p o n s i v et od e h y d r a t i o ns t r e s s1 ( e r d i ) 干旱诱导反应应答过程中起重要 作用，t r a ne ta 1 ( 2 0 0 4 ) 用酵母单杂交方法分离到3 个能与含该元件e r d l p 启动子区6 3 b p 片断结合的n a c 转录因子即：a n a c 0 1 9 ，a n a c 0 5 5 和a n a c 0 7 2 ， 并验证c a c g 是a n a c 转录因子d n a 识别序列的核心基序。已证明n a c 结构域具 有d n a 结合能力，目前尚不清楚n a c 结构域识别d n a 序列的特异性机制。 1 2 3m y b i v l y b 是一类具有保守的d n a 结合结构域( m y b 结构域) 的转录因子家族，也 是植物中最大的转录因子家族之一，g o f fe ta 1 ( 2 0 0 2 ) 预测水稻基因组中有 1 5 6 个m y b 基因，现在已在水稻基因组中鉴定出1 5 8 个m y b 全长c d n a 克隆，而 在拟南芥基因组中有1 9 0 个m y b 基因 1 3 6 个m y b - ( r 1 ) r 2 r 3 基因和5 4 个 m y b r e l a t e d 基因 ( r i e c h m a n ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。m y b 的d n a 结合结构域即m y b 野生夏葡萄e r f 基因的分离克隆、序列分析及转基因植株的筛选 结构域是一段约5 1 5 2 个氨基酸组成的碱性的保守区，包含高度保守的氨基酸 残基和间隔序列，每隔约1 8 个氨基酸规则间隔一个色氨酸( w ) 残基( 图1 8 ) ， 它们参与空间结构中疏水核心的形成。有时色氨酸残基会被某个芳香族氨基酸 或疏水氨基酸所取代，尤其是在植物r 2 r 3 - m y b 转录因子中，m y b 3 r 结构域的第 一个色氨酸经常被亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸所取代。其次，在每个保守的 色氨酸前后都存在一些高度保守的氨基酸，例如在第一个色氨酸的c 端通常是 一簇酸性氨基酸。正是上述这些保守的氨基酸残基使m y b 结构域重复区域折叠 成螺旋一螺旋一转角一螺旋( h e li x - h e li x - t u r n - h e li x ) 结构。根据m y b 结构 域中相邻的重复区域( r e p e a t ，r ) 个数m y b 转录因子分为三个亚家族，具有一 个重复区为m y b i r ，具有二个重复区为r 2 r 3 - m y b ，具有三个重复区为m y b 3 r 。 与动物的m y b 因子相比，植物的m y b 亚家族成员多数含有r 2 r 3 类型m 1 b 结构域。 m y b 转录因子在许多类型细胞的分化和分裂中起重要作用。r 2 r 3 类型m y b 因子 成员数目众多，参与调控植物次生代谢的诸多方面或控制细胞的分化，或应答 激素刺激和外界环境胁迫以及抵抗病原菌的侵害( s t r a c k ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 第一个克隆到的m y b 基因是来自鸟类骨髓瘤病毒( a v i a nm y e b l a s t o s i s v i r u s ，a m y ) 的癌基因v m y b 。通过序列比较发现v m y 6 可能起源于一个脊椎动 物c 1 i i y b k 9 ，该基因成为a m y 的一部分后发生突变。所有的m y b 基因编码的 蛋白在n 末端具有一个高度保守的结合的d n a 结构域。动物的c m 1 bd n a 结合 结构域含有3 个由5 1 5 3 个氨基酸组成的串联的不完全重复m y b 区序列 ( r i ，r 2 ，r 3 ) ，每个重复区有3 个高度保守的被1 8 或1 9 个氨基酸间隔开的色氨 酸( w ) ，并在螺旋一套环一螺旋三维结构中形成一个色氨酸簇( k 6 n i gp 等，1 9 9 9 ； o g a t ak 等，1 9 9 2 ) ，其中r 2 和r 3 特异结合d n a 序列( o g a t ae ta 1 ，1 9 9 4 ) ， m y b 蛋白结构。m y b 重复区是根据与e - m y b 的r 1 、r 2 、r 3 同源性来分类。在植 物和酵母中，多数m 1 b 含有两个重复区，即r 2 和r 3 ( m a r t i n ，p a z - a r e s ，1 9 9 7 ： j i ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 。此外在植物中叶发现了含有一个( f e l d b r n g g e ，1 9 9 7 ；k i r i k e ta 1 ，1 9 9 6 ；b i l a u de ta 1 ，1 9 9 6 ) 或三个重复区的m y b 因子( b r a u n 。g r o t e w o l d ， 1 9 9 9 ；k r a n ze ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 转录因子的d n a 结合功能域由两个同源的m y b 结构域( r 2 ，r 3 ) 组成双部位 结构，通过r 2 和r 3 m y b 结构域的协同作用完成与顺式元件的特异结合，是一种 比较独特的d n a 结合功能域的组织方式。植物的r 2 r 3 - m y b 转录因子与动物m y b 3 r 亚类c - m y b 结合d n a 方式相似，但是它们识别的d n a 序列却有较大的差别；甚 野生夏葡萄e r f 基因的分离克隆、序列分析及转基因植株的筛选 至不同的植物r 2 r 3 一m y b 识别和结合的顺式元件不同，这可能与d n a 结合结构 域的结构有关( m a r t i n ，p a z - a r e s ，1 9 9 7 ) 。j i n 和m a r t i n ( 1 9 9 9 ) 还认为r 2 r 3 - m y b 转录因子的d n a 结合功能域与其它转录因子家族不同，由于含有由两个同源的 m y b 结构域组成的双部位结构，其自身存在固有的柔韧性和灵活性，使得结合 的d n a 序列具有不确定性。植物的r 2 r 3 - m y b 的结构特点与c - m y b 的非常类似。 在r 2 和r 3 中的第三个螺旋是识别螺旋，r 2 和r 3 插入到靶d n a 序列的大沟， 这样两个识别序列活作并结合到特异的碱基碱基序列上( o g a t ae ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 在r 2 r 3 一m y b 转录因子的c 端的转录激活区也是富含酸性氨基酸，多数m y b 转录 因子是转录激活子，但从水稻中克隆的a t m y b 4 具有转录抑制功能( j i ne ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。 1 2 4w r k y w r k y 蛋白也是植物特有的一类转录因子，在拟南芥基因组中有7 4 个 ( r o b a t z e k ，s o m s s i c h ，2 0 0 2 ) ，预测在水稻基因组有8 3 个( g o f fe ta 1 ，2 0 0 2 ) ， 以获得c d n a 的水稻w r k y 基因4 6 个( k i k u c h ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。w r k y 转录因子构 成了植物中较大的转录因子家族之一。w r k y 转录因子具有多种功能，尤其在植 物的防卫和抗逆反应中起重要的调控作用。 w r k y 家族的转录因子在植物防卫反应信号传导和发育过程起重要的作用。 多种植物w r k y 家族的转录因子表达是受伤害、病原菌侵染和其它逆境因子上调 控。烟草花叶病毒( t m y ) 、病原细菌、病原真菌、s a 和过氧化氢( h ：0 。) 能强 烈快速诱导烟草的w r k y 基因表达。p s e u d o m o n a ss y r i n g a e 无毒菌株侵染和s a 处理能诱导拟南芥的7 2 个w r k y 基因其中的4 9 个表达。k a l d e 等用不同的病原 菌侵染拟南芥突变体诱导第三组( g r o u pi i i ) w r k y 基因瞬时表达。一些胁迫 因子如伤害、干旱、低温、冷激和热激能诱导植物w r k y 基因表达，还有一些基 因在衰老过程中表达。已有报道w r k y 因子参与m a p k ( m i t o g e n a c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e ) 防卫反应，另外已经证明a t w r k y 2 2 和a t w r k y 2 9 是抗病原真 菌和细菌m a p k 信号途径重要的下游组成元件。瞬时表达w r k y 2 9 的拟南芥叶片 能减轻病害症状。在烟草中，m a p k 蛋白k i n a s e i ( n t m e k i ) n t n t f 6 和3 个w r k y 基因都参与抗病基因n 芥导的抗性反应( l i ue ta 1 ，2 0 0 4 ) 。最近发现拟南芥 w r k y 7 0 是s a 和j a 信号途径的共同调控元件，也是两个彼此拈抗的信号途径交 叉点( l ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 超量表达a t w r k y 7 0 能增强转基因植株抗病能力，并使一 野生夏葡萄e r f 基因的分离克隆、序列分析及转基因植株的筛选 些s a 诱导的基因组成性表达。 w r k y 基因在植物的发育过程中也发挥重要的调控作用。a t w r k y 4 4 时是第一 个被确认参与毛状体发育的w r k y 基因( j o h n s o ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。水稻o s w r k y 7 1 作为g a 反应的抑制因子( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 总之，转录因子这类调控蛋白在植物细胞分化，形态建成起重要作用，另 一方面转录因子在植物防卫反应和抗逆应答等过程中扮演非常重要的调控因子 的角色。近几年来在植转录因子基因克隆和功能研究方面取得了很大的进展， 同时也鉴定出于多类转录因子识别作用的顺式元件。转录因子通过与其调控的 下游基因启动子区的顺式元件互作而直接调控靶基因的表达，或形成同源、异 源二聚体，或与其他蛋白( 如p r o 等激酶) 互作成为某种活化形式而参与j a 、s a 、 a b a 等信号传导途径，形成基因表达的调控网络。根据对a p 2 e r e b 、w r k y 、n a c 、 b z i p 、m y b 和锌指等几大类植物转录因子家族成员的研究，结果表明转录因子 问、转录因子和其他蛋白间存在调控识别机制，形成一个调控子之间的多重组 合在调控植物生长、发育和适应环境过程中发挥重要作用，但这也是一个信号 传导网络，各信号传导途径间有的存在交叉。有的转录因子具有多种功能，既 参与细胞分化和形态建成，也参与抗病抗逆应答，另外还有证据表明，转录因 子不仅参与抗逆反应还能调控与抗逆相关的次生代谢。因而转录因子的多功能 性，不同的转录因子之间、不同的顺式元件与转录因子功能区域识别互作等许 多不被人所知的领域，依靠高通量的研究蛋白一蛋白互作、蛋白一互作的技 术，以因芯片技术，更精细的启动子分析技术，使我们将来能更深入了解逆境、 防卫相关基因的综合调控、信号传导途径、植物生长发育调控以及植物激素的 作用机理。 1 3e r f 转录因子功能 乙烯应答元件结合因子e r f 最先是o h m e - t a k a g i 等从烟草中作为g c c - b o x 结合蛋白分离出来的e r f 蛋白具有一个高度保守的含5 8 或5 9 个氨基酸的d n a 结合域( 如图1 1 ) 1 3 1e r f 转录因子在植物防卫反应信号传递途径中的作用 e r f 基因在植物防卫信号传递途径中起关键的作用。近几年植物防卫信号传 递途径方面的研究表明，针对不同的病原物的诱导防卫反应相应地受到不同的 野生夏葡萄e r f 基因的分离克隆、序列分析及转基因植株的筛选 叫。删- 嘲褰瞪然鹕z 驴夏口塞w k 糖黻黼黻m ，聃冀g - n r 1 f f t l - = ii - c = = = 】_ _ 墨鬟薯文誓譬譬鬟寨麓黼 8 , 蜘e e t( i 蚓随 图1 1 不同来源的e r f 蛋白d n a 结合域的比较 信号传递途径的调控。水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ，s a ) 、乙烯( e t h y l e n e ，e t ) 和 茉莉酸( j a s m o n i ca c i d ，j a ) 在防卫信号传递途径中起着重要的作用。大量证据 表明，依赖于s a 、e t 或j a 的信号传递途径( s a ，j a a n de td e p e n d e n ts i g n a l i n g p a t h w a y s ) 之间存在着一定的交叉作用( c r o s s - t a l k ) 。它们之间可能是相互促 进，也可能是相互拮抗，从而实现对防卫反应的精确调控。而一些e r f 基因常是 上述信号途径交叉( c r o s s - t a l k ) 处的重要成分( 图1 3 ) 。前面已经提到一大类 e r f 蛋白能够与g c cb o x 特异性地结合，而g c cb o x 在大量的碱性p r 基因的启动子 中起着乙烯应答元件的作用。番茄基p t i 4 和拟南芥基e r f l 的表达均受外源乙烯 处理的诱导。它们在拟南芥中的超表达都能够使一些含有g c c 盒的基因( 如p r 3 、 p r 4 、p d f l 2 和t h i 2 j ) 的组成型表达，而且其植株表型与乙烯所处理的野生 型植株以及乙烯组成型应答突变体( c o n s t i t u t i v et r i p l e r e s p o n s e ，c t r ) 相似， 说明e r f i 和p t i 4 参与了e t 信号传递途径。绝大部分情况下，依赖于e t 的信号传 递途径与依赖于j a 的信号传递途径间存在着协同促进的作用。外源e t 和j a 都能 够迅速诱导e r f i 表达，而且两者之间存在协同促进作用。另外，因为在e t 信号 途径突变体( e i n 2 ，e t h y l e n ei n s e n s i t i v e 2 ) 、j i 信号途径突变体( c o r o n a t i v e i n s e n s i t i v e l ) 或者它们的双突变体中，e r f i 的表达均不受外源的e t 和j a 的诱 导，因此e r f l 的激活需要e t 和j a2 条信号途径的共同参与。而且，e r f j 的超表 已 皇3 j 最，l 1 3墨3，耋l l!， 弘t，簟l，i i e 3 s l l 口e ， 三三j 矗o o矗p铲弘哇五。矗4矗靠哇哇吐-ii 邕5 l t 2 i 2 l l s 1 7，霉3 剖i，o口 7 s ，l a，75 鼻王毒 1 r _ 1 1 i 2 3 s 窜f r r p 箩 2 1 藏冀2 矗1 3矗嚣日5崩，若t蛋1麓警嚣霉亨l攀-基嚣霹i鬟亨主!嚣r兰n撇黼腓眦蝌蝌臌一一嗽一珊獬蚍娥聪啾燃 野生夏葡萄e r f 基因的分离克隆、序列分析及转基因植株的筛选 达能够恢复e i n 2 和c o i l 突变体的防卫反应能力。通过e r f l 转基因拟南芥的转录 组分析和野生型拟南芥在e t 和j a 处理下的转录组分析，说明e r f l 在体内能够调 控那些应答e t 和j a 的基因的表达。总的实验结果表明e r f l 是e t 和j a 信号途径中 的下游成分，而且在2 个防卫反应基因调控信号途径交织点处起着重要的作用。 图1 3e r f 转录因子在植物防卫反应中的作用模型 1 3 2 诱导基因表达调控 e r f 基因表现出广泛的环境调节表达模式。e r f 基因对疾病相关刺激，如 乙烯、茉莉酸、水杨酸和致命与弱毒病原菌等信号都有响应，伤害和非生物因 子也能诱导e r f 基因的表达。g b e r f i 在乙烯脱落算黄萎病菌高盐干旱和冷处理 时，其表达量都增加，而水胁迫则能减少g b e r f i 的表达。 ( s u s a ny ，2 0 0 0 ) 等人的实验表明e r f 类转录因子能特定的结合到启动子区 域含有g c c 盒的基因，调控基因的表达，这种调控是双方向的，其中a t e r f i 、 a t e r f 2 和a t e r f 5 能够促进基因的表达，而a t e r f 3 、a t e r f 4 能够抑制基因的表 达，如果将a t e r f 5 和a t e r f 3 同时转到拟南芥中，试验结果表明他们表现一种 剂量的效应，就是随着a t e r f 3 量的增加就会减弱a t e r f 5 的转录激活的能力。 启动子区域含有6 c c 盒的基因是调控的目的基因，这一点已经被广泛证实。 但p t i 4 超表达的拟南芥的s a g e ( s e r i a la n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n ) 分析 发现，在5 0 个表达量增加基因中，大多数的启动子区域都没有g c c 盒，并且体 外染色质免疫沉淀表明，p t i 4 能直接或间接地结合到这些启动子上，这表明 野生夏葡萄e r f 基因的分离克隆、序列分析及转基因植株的筛选 p t i 4 结非g c c 合盒存在多种可能的方式。对棉花g b e r f l 的烟草分析也有类似 的结果，g b e r f l 也能调控非g c c 盒基因表达，如果能发现其他的e r f 基因也 具有相同的功能，那么将会拓展e r f 所调控基因的范围，体现因子更多的功能。 尽管目前有很多报道证明e r f 能调控目的基因的表达，p t i 4 和e r f l 在拟 南芥中的超表达只能激活一部分启动子中含g c c 盒的基因。但对这样的大家族 基因来说，目的基因可能存在重叠或分工，即若干个基因调节一个或某个e r f 专一调控某些目标基因，但目前对这方面还不是很清楚。 1 3 3 调节植物的生长发育 h u is h e n 等利用酵母单杂交方法从水稻e d n a 表达文库克隆了e r f 类蛋白 一o s e b p 8 9 基因o s e b p 一8 9 不但在胚乳中表达，维管束韧皮部也有表达，而且在 靠接r s t ( r o o ta n ds t e mt r a n s i t i o nr e g i o n ) 茎节和居间分生组织部分表达 水平比较高。由此推断o s e b p 8 9 可能会在胚乳细胞和茎部组织的淀粉积累中发 挥重要作用。目前已分离的e r f 类转录因子有t i n y 、a p 2 、a n t 等基因，它们 都参与植物生长和发育的调控。 1 3 4 参与对环境因子或胁迫的应答 在转基因烟草中，t s i 基因的超表达激活一些p r 基因的表达，从而提高了 植株对盐胁迫和细菌的耐受能力。刘文奇等利用渗透调节蛋白基因启动子中含 g c c 盒的序列，采用酵母单杂交的方法获得了一个e r f 类基因o p b p l ，经过对转 入o p b p l 基因的烟草分析发现增强o p b p l 的表达能提高烟草的抗盐能力。拟南 芥的c b f l 基因参与抗冷反应，长春花的o c r a 3