（化学工艺专业论文）运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒载体的构建.pdf

中文摘要 运动发酵单胞菌属于革兰氏阴性细菌， 微好氧生长。由于其对糖的摄取速度和发 酵产醇速度均优于传统酿酒酵母， 被人们认为是极具开发潜力的乙醇生产菌。 但其可 利用的碳源仅为葡萄糖、 果糖和蔗糖。 为此人们在利用基因工程手段将外源基因导入 该菌种，进而拓宽其可利用碳源的范围等方面做了大量的工作。 本文介绍了一种 z m o b i l is - e . c o l i 之间的克隆型穿梭质粒的构建。将由 z m o b i l is a t c c 1 0 9 8 8 中分离出 的2 .7 k b 质粒p z m 2 ， 插入 大 肠杆菌载 体质粒p b r 3 2 8的s p h l 酶切 位点， 构建成大小约 为7 . 6 k b 的 重组穿 梭质粒 ( p z b t ) 。该 质粒具有却r 和c m , 两个抗性标记， 在其氨节青霉素抗性基因上有a h d l , p s t l , p v u l 插入位点， 在氯霉素 抗性基因上有 p s p , e c o r l , n e o l 插入位点。该质粒能 够成功转化 e c o l i d h 5 。 和 z m o b i l i s c p 4 菌株。 同时 ， 对该质粒在e . c o l i d h 5 。 和z m o b i l is c p 4 中的 稳定性进行 了考察。 另 外， 对z m o b i l is a t c c 1 0 9 8 8 和c p 4 在不同 培养 基中 的 生长 情况进行了 考察， 结果表明t培养基更适于试验菌株的生长。同时， 考察了s d s - 碱裂解法和n e s t e r 法 两种质粒提取方法，并对p z m 2 进行了限制内 切酶分析鉴定。 关键词:乙 醇 运 动 发 酵 单 胞 菌 穿 梭 质 粒 abs tract z y m o m o n a s m o b i l i s i s a f a c u lt a t i v e a n a e r o b i c g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i u m . b e c a u s e t h e r a t e o f s u g a r u p d a t e a n d e t h a n o l p r o d u c ti o n i s b e t t e r t h a n t h a t o f s a c c h a r o m y c e s c e r e v is a e , 为,m o m o n a s m o b i l is i s c o n s i d e r e d t o b e a s t r a i n o f p o t e n t i a l d e v e l o p m e n t i n e t h a n o l m a n u f a c t u r e . h o w e v e r t h e f e r m e n t a t i o n m a t e r i a l u s e d b y z y m o m o n a s m o b i l is i s l i m i t e d t o g l u c o s e , fr u c t o s e a n d s u c r o s e . t o e x p a n d t h e f e r m e n t a t i o n r a w m a t e r i a l r a n g e , e f f o rt h a s b e e n m a d e t o in t r o d u c e h e t e r o l o g o u s g e n e s r e l a t e d t o x y l o s e m e t a b o l i s m in t o z y m o m o n a s m o b il i s b y g e n e t i c m a n i p u l a t i o n . i n t h i s p a p e r , a n e w s h u tt l e v e c t o r b e 吸 w e e n z m o b i l is - e . c o h i s c o n s t r u c t e d b y i n s e r t i n g t h e 2 . 7 - k i l o b a s e p a ir ( k b ) c r y p t i c p l a s m i d p z m2 o f z y m o m o n a s m o b i l is a t c c 1 0 9 8 8 i n t o t h e e s c h e r i c h i a c o l i v e c t o r p b r 3 2 8 i n t h e s i t e o f s p h l d i g e s t s . t h e n e w v e c t o r , 7 . 6 5 6 k b p l a s m i d p z b l , h a s tw o s e l e c t i v e m a r k e r s , a p r a n d c m . t h e r e a r e s e v e r a l u n i q u e r e s t r ic t i o n s it e s o n e a c h s e l e c t i v e m a r k e r , a h d i , p s t l , p v u i s i t e s o n t h e m a r k e r o f a p a n d p s p , e c o r l , n c o l o n t h e m a r k e r o f c m . t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p z b i h a s b e e n c lo n e t o e . c o l i d h 5 a a n d z m o b i l i s c p 4 s u c c e s s f u l l y , a n d i t s i n b o t h h o s t s t r a i n s h a s b e e n e x a mi n e d . i n t h i s p a p e r , t h e g r o w t h o f zm o b i l is a t c c 1 0 9 8 8 a n d c p 4 i n d i f f e r e n t m e d i u m i s c o m p a r e d . t h e re s u l t s s h o w t h a t th e t m e d i u m g i v e s t h e b e tt e r c u l t u r e . t w o d i f f e r e n t m e t h o d s , s d s - a l k a l i m e t h o d a n d n e s t e r m e t h o d , f o r p r e p a r i n g p l a s m i d s o f z m o b i l i s h a v e b e e n c o m p a r e d i n t h i s p a p e r . t h e p l a s m i d p z m2 h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d b y r e s t r i c t i o n e n z y m e . ke y wor d s : e t h a n o l , z y m o m o n a s m o b i l is , s h u t t l e v e c t o r , 独创性声明 本 人声明 所呈交的学 位论文 是本人 在导师指导下进行的 研究工作 和取得的 研究 成果. 除了文中特别加以 标注和致谢之处外， 论文中不包含其它人已 经发 表或撰写过 的 研 究 成 果 ， 也 不 包 含 为 获 得 2继崖- 或 其 它 教 育 机 构 的 学 位 或 证 书 而 使 用 过 的 材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明 确的说明并 表示了谢意。 学 位 论 文 作 者 签 名 : 为卫 牢签 字 日 期 :乡 帷 月“ 日 学位论文版权使用授权书 本 学 位 论 文 作 者 完 全 了 解 a 进大有 关 保 留 、 使 用 学 位 论 文 的 规 定 。 特 授 权 户 孟建人生- 可 以 将 学 位 论 文 的 全 部 或 部 分 内 容 编 入 有 关 数 据 库 进 行 检 索 ， 并 采 用 影印、 缩印或扫描等复制手段保存、 汇编以供查阅和借阅。 同意学校向国家有关部门 或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学 位 论 文 作 者 签 名 : 扁卫 牟 导师签名: 了 脚今 签字日期: ， * 口 兮年 s 月 2 日签字日 期: 2 u v 汗年 了 月 见 日 天津大学硕士学位论文前言 前言 2 0 世纪， 人们利用石油作为主要能源及化学品生产的原料， 为人类社会的发展做 出了巨大的贡献。 到目 前为止， 石油在全球能源及化工原料格局中仍占据着主导地位。 然而， 石油作为一种矿物质能源， 具有地域分布的不均衡性和不可再生性， 其产量和 价格受国际政治、 经济形势的影响十分突出。同时，由于开采过快，已面临枯竭的危 险。因此， 利用可再生的生物资源 ( 生物质)替代石油资源， 用生物技术路线取代化 学合成路线进行生物燃料和化学品的生产， 己成为世界各国可持续发展战略研究的热 点之一。 乙醇作为人类最为古老的发酵产品之一， 具有悠久的生产历史。 在现代工业社会 中，乙醇是一种重要的工业原料， 广泛应用于化工、 食品、军工、日 用化工和医药卫 生等领域，同时还是能源工业的基础原料和燃料。2 0 世纪7 0 年代石油危机之后，人 们对可再生资源重视程度的日 益提高， 燃料乙醇因其具有清洁、 环保、 安全和可再生 等优点， 被视为可替代和节约燃油的最佳燃料。同时，作为一种生物能源，乙醇有望 取代日 益减少的化石燃料 ( 如石油和煤炭) 。 传统的乙醇发酵生产以谷物等粮食作物为主要原料。 然而，随着世界人口的迅猛 增长， 资 源危机、 食品 短缺等问 题越 来 越严 重地困 扰着人 类社 会， 以 粮食 作 物为原料 的酒精生产终将受到限制。 与此同时，自 然界中存在着大量的 木质纤维素， 它是自 然 界中分布最广、含量最大、 价格低廉而又未得到充分利用的可再生资源。 据统计， 木 质纤维素每年的总产量约占 所有生物资 源的5 0 % ， 合1 0 05 0 0 亿吨 u 。 这一廉价资源 除少量用于造纸、 建筑、 纺织等行业或用作粗饲料和薪柴外， 往往被当作工农业的废 弃物处理。 因此， 世界上许多经济发达国家都在加紧以木质纤维素等生物质为原料发 酵生产乙醇的生物技术研究与开发工作，并希望以此稳定能源供应，改善能源保障， 减少环境污染，拉动农业及其它相关产业的发展。 木质纤维素的组成和结构非常复杂， 主要由纤维素、半纤维素和木质素三大成分 组 成 ( 分别占 干重的4 5 % , 3 0 % 和2 5 % 。 其中 纤维 素是一 种由 成百 上 千个 - d - 毗喃型葡萄糖单体以0 - 1 , 4 一 糖奋键连接而成的直链多糖， 多个这样的多糖分子平行紧 密排列， 可形成丝状不溶性微小纤维。 半纤维素是由多种多糖分子组成的支链聚合物。 不同来源的半纤维素其单糖的组成各异， 一般为葡萄糖、 半乳糖和甘露糖等六碳糖和 木糖、阿拉伯糖等五碳糖，在五碳糖中以 d 一 木糖为主。木质素则是由芳香族混聚物 组成。 经过物理、 化学及生物方法处理， 纤维素和半纤维素可分别水解成为六碳糖和 大津大学硕士学位论文前言 五碳糖。 能直接以木质纤维素为原料发酵生产乙醇的微生物在自 然界中极为少见。因此， 人们一方面致力于寻求有效的水解方法， 使木质纤维素能够完全水解， 释放出其中的 可发酵糖: 另一方面则致力于构建适宜的工程菌种， 实现利用以 木质纤维素水解产物 为原料的发酵乙醇生产。 z m o b i l i s 是一种极具开发潜力的菌种，具有卓越的乙醇发酵性能，是目前乙醇发 酵能力最强的细菌之一。 其乙醇生产能力比酿酒酵母菌高3 0 5 0 %， 同时乙醇的收率 也可以高 达理论值的 9 7 % 。 另 外 z m o b i l i s能耐受高糖浓度 ( 4 0 0 g / l ) 和高乙醇浓度 ( 1 2 %) ，同时其生长的营养需求相对简单。这些优点使得z m o b i l i、 成为传统乙醇发 酵工业菌 种一 酿酒酵母菌的 有力竞争者3 与酿酒酵母相似， z . m o b i l i s 也存在着可利用碳源范围较窄的缺陷， 仅能利用葡萄 糖和果塘 部分菌株还可以利用蔗糖、 。为此，人们一直致力于运用基因工程手段对 其代谢途径进行改造， 以 拓宽其可利用碳源的范围。 本研究旨 在构建出能在z m o b i l is 中稳定存在和表达的质粒载体，为外源基因的引入以及代谢路径的改造打下基础。 天津大学硕士学位论文第一章 文献综述 第一章 文献综述 1 . 1 zm o b i l i s 介绍 运动发酵单胞菌( z y m o m o n a s m o b i l is ) 是发酵单胞菌属的 一个种， 由 于其具有很 强的运动性而得名。关于z m o b i l is 的记载始见于 1 9 2 8 年l i n d n 。关于从墨西哥的龙 舌兰酒中分离的一种微生物的报道。当时 l i n d n e n将其命名为嗜热运动细菌 ( t h e r m o b a c t e r i u m m o b i l e ) 。 后来， 此菌 株被命名为z y m o m o n a s m o b il is a t c c 1 0 9 8 8 4 1 a z m o b i l i s 一直用于果酒的发酵生产， 有着突出的发酵能力， 是极具开发潜力的菌 种之一。 随着人们对它独特的代谢途径和生理特点有了越来越多的了解， 加上二十世 纪七、 八十年代的能源危机， z m o b i l i s 开始被用于燃料乙醇的发酵研究并尝试进行工 业化生产。 z m o b i l i s 属革兰氏阴 性细菌， 微好氧生长。 它通过e d代谢途径将葡萄糖和果糖 转化为乙醇。 因其丙酮酸脱梭酶和乙醇脱氢酶基因能 够高效表达， 乙醇发酵能力非常 突出。同时z m o b i l i s 生长的营养需求相对简单。这些优点使得z m o b i l i s 在乙醇的工 业化生产领域具有广阔的 应用前景3 ,4 ,5 1 . 2 z . m o b i l i s 的内源质粒研究 为构建出合适的载体系统，以 便顺利的将外源基因引入 z m o b i l i s ，必须充分了 解z . m o b i l i s 的遗传学和分子生物学特性，这也是对z m o b il is 进行基因工程改造的首 要任务。 因为质粒是基因工程中最常用的载体之一， z m o b i l i s 中内源质粒的状况一直 是人们在这一领域最为关心的问 题。 a t c c 1 0 9 8 8 , c p 4 , z m 4 等菌 株是z m o b i l i s 中乙 醇发酵性能较为突出、 有基因 工程改造价值的菌株， 人们对这些菌株的研究最为深入和全面， 对其质粒情况和遗传 背景的了解相对也最多。自 八十年代以来，日本、 希腊、 澳大利亚、 美国等国家的若 干研究小组已 对z m o b i l i s的 遗传物质及其质粒进行了 较为深入的 研究， 成功地构建 出一些具有使用价值的穿梭质粒。 z m o b i l is 内 源 质 粒的 报 道 始 见 于1 9 8 2 年， 且由 不同 的 实 验室 分 别 报 道6 ,7 ,8 ,9 ,10 总体而言， z . m o b i l i 、 的内 源质粒 情况非 常复杂， 不同 菌 株中 所含质粒的 情况差异很 大， 质粒大小也在1 .4 k b 到5 0 k b 的 范围内 变动 n 7 天津大学硕士学位论文第一章 文献综述 第一章 文献综述 1 . 1 zm o b i l i s 介绍 运动发酵单胞菌( z y m o m o n a s m o b i l is ) 是发酵单胞菌属的 一个种， 由 于其具有很 强的运动性而得名。关于z m o b i l is 的记载始见于 1 9 2 8 年l i n d n 。关于从墨西哥的龙 舌兰酒中分离的一种微生物的报道。当时 l i n d n e n将其命名为嗜热运动细菌 ( t h e r m o b a c t e r i u m m o b i l e ) 。 后来， 此菌 株被命名为z y m o m o n a s m o b il is a t c c 1 0 9 8 8 4 1 a z m o b i l i s 一直用于果酒的发酵生产， 有着突出的发酵能力， 是极具开发潜力的菌 种之一。 随着人们对它独特的代谢途径和生理特点有了越来越多的了解， 加上二十世 纪七、 八十年代的能源危机， z m o b i l i s 开始被用于燃料乙醇的发酵研究并尝试进行工 业化生产。 z m o b i l i s 属革兰氏阴 性细菌， 微好氧生长。 它通过e d代谢途径将葡萄糖和果糖 转化为乙醇。 因其丙酮酸脱梭酶和乙醇脱氢酶基因能 够高效表达， 乙醇发酵能力非常 突出。同时z m o b i l i s 生长的营养需求相对简单。这些优点使得z m o b i l i s 在乙醇的工 业化生产领域具有广阔的 应用前景3 ,4 ,5 1 . 2 z . m o b i l i s 的内源质粒研究 为构建出合适的载体系统，以 便顺利的将外源基因引入 z m o b i l i s ，必须充分了 解z . m o b i l i s 的遗传学和分子生物学特性，这也是对z m o b il is 进行基因工程改造的首 要任务。 因为质粒是基因工程中最常用的载体之一， z m o b i l i s 中内源质粒的状况一直 是人们在这一领域最为关心的问 题。 a t c c 1 0 9 8 8 , c p 4 , z m 4 等菌 株是z m o b i l i s 中乙 醇发酵性能较为突出、 有基因 工程改造价值的菌株， 人们对这些菌株的研究最为深入和全面， 对其质粒情况和遗传 背景的了解相对也最多。自 八十年代以来，日本、 希腊、 澳大利亚、 美国等国家的若 干研究小组已 对z m o b i l i s的 遗传物质及其质粒进行了 较为深入的 研究， 成功地构建 出一些具有使用价值的穿梭质粒。 z m o b i l is 内 源 质 粒的 报 道 始 见 于1 9 8 2 年， 且由 不同 的 实 验室 分 别 报 道6 ,7 ,8 ,9 ,10 总体而言， z . m o b i l i 、 的内 源质粒 情况非 常复杂， 不同 菌 株中 所含质粒的 情况差异很 大， 质粒大小也在1 .4 k b 到5 0 k b 的 范围内 变动 n 7 天津大学硕十学位论文 第一章 文献综述 可能是因为分离纯化和检测手段不同，加上 z m o b i l i ， 不同质粒相互之间以及质 粒与染色体之间同 源重组现象的存在 1 2 1 ， 即 使是同 一个菌株所含的质粒， 不同实验室 的报道也不一致1 3 ,1 4 见表1 . 1 ) 。 甚至是同一个菌 株的同一种质粒， 有关其酶切位点 的 报道彼此间也有一定的差异( 1 1 ,1 5 ,1 6 , 1 7 1 a t c c 1 0 9 8 8 是z . m o b i l is 中 质粒种类最多的 菌株之一 12 ,1 8 1 ，所含有的 若千小型质 粒在构建穿梭质粒方面有着很大的利用价值。因 此， 人们对a t c c 1 0 9 8 8 中 质粒的 研 究最为深入。 由于其内部质粒的复杂性以及研究方法的差异， 不同研究小组的 研究结 果不尽相同 ( 见表 1 - 1 ) 。希腊l o a n n i a n 大学以d r a i n a s 为首的研究人员用电镜 ( e m) 分析质粒 发现a t c c 1 0 9 8 8 至少含有六种质粒( 1 3 ) 。 随后借助电泳分离出 不同的 质粒 条带，并对其进行了酶切分析，证明a t c c 1 0 9 8 8 中的确含有六种质粒， 其大小和数 目 与电 镜 研究 结 果 能 很 好 吻 合 1 2 1 。 他们 对 其中 的p z m 0 3 做了 进一 步的 深 入 研究 。 通 过对p z m 0 3 和a t c c 1 0 9 9 8 中 其它 质粒以 及p z m 0 3 和其它z n :0 b i l is 菌株中 存 在质 粒 的酶切和杂交分析表明， p z m 0 3 与a t c c 1 0 9 8 8 , n c i b 1 1 1 6 3 和c p 4 菌株的 质粒或染 色体间不存在同 源性。另外， 通过对不同 酶切片段的分析表明， p z m0 3的复制起始 区 位于i 5 4 k b 的s a u 3 a 酶 切 片 段 上 1 s 1 基 于 这 些 研究 结 果， 他 们 认为p z m 0 3 等 同 于 由日 本n o ri h i k o m i s a w a和k a t s u m i n a k a m u r a 分离并首先测序的2 .7 k b 质粒p z m 2 , 二 者都 具有o r f 1 和o r f 2 ， 且o r f 2 是p z m 0 3 进 行 复 制 所 不 可缺 少的 19 ,2 0 ,2 1 1 0 2 0 0 0 年 他们又 报道了p z m 0 1 , p z m 0 2 的 核昔酸 序列 测定 及复 制区 鉴定结 果2 2 1 表1 - 1 a t c c i d 9 8 9 天 然 质 粒 数目 和 大 小 的 报 道 t a b l e 1 - 1 n u mb e r a n d s i z e o f t h e o l a s mi d - i n z v mo mo n a s mo b i l i s at c c 1 0 9 8 8 参考文献 四9一l3j一l1一洲 -2 种: 质粒数目 1 . 6 5 , 2 . 4 , ( 种) 、 大小 ( k b ) 及 相 应命 名 1 2 0( 为未鉴定质粒的总量) 土公一e 辞-g 丈-a a g e 一 5 #e m 1 6 # 1 .9 5 , 2 . 8 5 , 4 .0 5 , 2 5 . 4 , 1 . 6 , 1 . 9 , 27，7 . 3 , p z m0 4 , 1 6 7， 3 1 . 9 * 3 1 . 8 ( 依次命名为p z m 0 1 , p z m0 2 , p z m0 3 , p z m0 5 , p z m0 6 ) * * a g e age 全 g e 什 : 5 种:1 .5 , 2 .3 , 3 .4 , 3 4 , 4 0 1 .7 , 1 .7 , 1 . 7 ( 分 别为p z m 8 1 a , p z m 8 1 b , p z m8 1 c ) , 2 .7 , 4 . 2 * * * 2 . 7 ( p z m2 ) , 3 . 9 ( p z m3 ) 1 6 ) a g e 为琼脂糖凝胶电泳分析: e m为电子显微镜分析 * 其中的 1 .9 5 k b , 2 .8 5 k 6 质粒同时有e m分析 *全部为e m分析 * 只研究5 k 6 以下 的小质粒，不 包括a t c c 0 9 8 8 中的其余 质粒: 日 本以n o ri h i k o m i s a w a 为首的研究人员对a t c c 1 0 9 8 8 中的小型质粒进行了 详细 的 研究1 4 ,1 5 1 。 他们利用这些小 型质粒构建了 一系列e .c o l i 和z m o b i l is 之间的穿梭质粒， 并于1 9 8 9 年首次 报道了a t c c 1 0 9 8 8 中2 .7 k b 质粒p z m 2 的序列测定结果和复制必需 天津大学硕士学位论文第一章 文献综述 区酶切鉴定结果。 通过s o u t h e rn 杂交证实了p z m 2 是唯一的与a t c c 1 0 9 8 8 中 其它质 粒、细胞染色体乃至 c p 4中的质粒都不具有同源性的质粒，这对于构建稳定的穿梭 质 粒 具 有 重 要 的 意 义 l 9 1 到目 前为止， e m b l 数据库中 有关a t c c 1 0 9 8 8 质粒的条目 如下( 见表1 - 2 ) : 表1 - 2 e mb l数据库中 有关a t c c 1 0 9 8 8 质粒记录 t a b l e l - 2 i n f o r ma t i o n o f t h e n l a s mi d s i n a t cc 1 0 9 8 8 e i v e n b 质粒名称 p z m01 p z m01 p z m0 2 p zm2 e m b l数据库中的序列号 af 0 3 0 6 2 4 z m00 0 9 9 7 5 z m00 0 9 9 7 6 zm p2 7 相关研究人员、 emb l/ ge n ba n k 年份和参考文献 k a n g , h工.; j i n , s . j . ; k a n g , h . s ., 1 9 9 7 ; d r a i n a s , c , 1 9 9 8 ; d r a i n a s , c , 1 9 9 8 : mi s a w a , n . ; s u b m i tt e d , 1 9 9 5 ; 2 0 1 1 . 3 外源基因 导入z . m o b i l i s 的载体系统的构建与研究 对目 的菌株进行基因工程改造的关键环节之一， 是构建能够有效地将外源基因引 入目的菌株的载体系统。外源基因进入运动发酵单胞菌的载体系统的构建研究情况， 与人们对运动发酵单胞菌的遗传特性尤其是质粒状况的了 解紧密联系在一起。 上世纪 八十年代初， 在人们对运动发酵单胞菌的 质粒、 转座子等染色体外遗传物质的了 解还 很有限时， 基于对其它菌株尤其是大肠杆菌的质粒特性和基因转移手段的经验， 人们 首先尝试将一些其它菌株 ( 如大肠杆菌和假单胞杆菌) 的宽宿主质粒用接合转移的方 法引入运动发酵单胞菌。 1 9 8 0 年， m a ry l .s k o tn i c k i 等 人将在 革 兰氏 阴 性 细 菌中 具 有宽 宿主 特性的 质 粒 ( p r d i , p j b 4 j i , 8 6 8 .5 4 以 及r i d r d 1 9 ) ， 用接合转移的方法转化到z m o b i l i s z m 6 , z m 4 , z m 1 1 等 菌 株 2 3 1 。 通 过 对转 化菌 株的 抗 性 检 测 表明， 这 些 质 粒的 转 化率 在1 0 -1 - i t 之间。 但这些质粒在z . m o b i l is 内的 稳定性欠佳， 容易发生丢失。 1 9 8 3 年， c a r e y等人利用同 样的方法， 将来源于大肠杆菌的质粒p g c 9 1 . 1 4 转化 到z m o b i l is c p 4 中 ， 转 化 率 达到9 .6 x 1 0 -3 / 受 体 细 胞 2 4 1 。 该 质 粒含 有的 四 环 素 抗 性 标 记 和乳糖操纵子都能够在z m o b i l is c p 4 中 表达， 但是转化菌株在以 乳糖为唯一碳源 的培养基上培养时不能生长。另外，3 0 下此质粒能稳定存在于z m o b i l is c p 4中， 但当培养温度由3 0 上升到 3 7 时，质粒会迅速丢失。 最初的直接用宽宿主质粒引入外源基因的研究没有取得理想的效果， 随着对运动 发酵单胞菌质粒状况的了 解日 益深入， 人们开始致力于利用运动发酵单胞菌的天然质 拉和大肠杆菌已知质粒， 来构建运动发酵单胞菌与 大肠杆菌之间的穿梭质粒， 同时对 天津大学硕士学位论文第一章 文献综述 区酶切鉴定结果。 通过s o u t h e rn 杂交证实了p z m 2 是唯一的与a t c c 1 0 9 8 8 中 其它质 粒、细胞染色体乃至 c p 4中的质粒都不具有同源性的质粒，这对于构建稳定的穿梭 质 粒 具 有 重 要 的 意 义 l 9 1 到目 前为止， e m b l 数据库中 有关a t c c 1 0 9 8 8 质粒的条目 如下( 见表1 - 2 ) : 表1 - 2 e mb l数据库中 有关a t c c 1 0 9 8 8 质粒记录 t a b l e l - 2 i n f o r ma t i o n o f t h e n l a s mi d s i n a t cc 1 0 9 8 8 e i v e n b 质粒名称 p z m01 p z m01 p z m0 2 p zm2 e m b l数据库中的序列号 af 0 3 0 6 2 4 z m00 0 9 9 7 5 z m00 0 9 9 7 6 zm p2 7 相关研究人员、 emb l/ ge n ba n k 年份和参考文献 k a n g , h工.; j i n , s . j . ; k a n g , h . s ., 1 9 9 7 ; d r a i n a s , c , 1 9 9 8 ; d r a i n a s , c , 1 9 9 8 : mi s a w a , n . ; s u b m i tt e d , 1 9 9 5 ; 2 0 1 1 . 3 外源基因 导入z . m o b i l i s 的载体系统的构建与研究 对目 的菌株进行基因工程改造的关键环节之一， 是构建能够有效地将外源基因引 入目的菌株的载体系统。外源基因进入运动发酵单胞菌的载体系统的构建研究情况， 与人们对运动发酵单胞菌的遗传特性尤其是质粒状况的了 解紧密联系在一起。 上世纪 八十年代初， 在人们对运动发酵单胞菌的 质粒、 转座子等染色体外遗传物质的了 解还 很有限时， 基于对其它菌株尤其是大肠杆菌的质粒特性和基因转移手段的经验， 人们 首先尝试将一些其它菌株 ( 如大肠杆菌和假单胞杆菌) 的宽宿主质粒用接合转移的方 法引入运动发酵单胞菌。 1 9 8 0 年， m a ry l .s k o tn i c k i 等 人将在 革 兰氏 阴 性 细 菌中 具 有宽 宿主 特性的 质 粒 ( p r d i , p j b 4 j i , 8 6 8 .5 4 以 及r i d r d 1 9 ) ， 用接合转移的方法转化到z m o b i l i s z m 6 , z m 4 , z m 1 1 等 菌 株 2 3 1 。 通 过 对转 化菌 株的 抗 性 检 测 表明， 这 些 质 粒的 转 化率 在1 0 -1 - i t 之间。 但这些质粒在z . m o b i l is 内的 稳定性欠佳， 容易发生丢失。 1 9 8 3 年， c a r e y等人利用同 样的方法， 将来源于大肠杆菌的质粒p g c 9 1 . 1 4 转化 到z m o b i l is c p 4 中 ， 转 化 率 达到9 .6 x 1 0 -3 / 受 体 细 胞 2 4 1 。 该 质 粒含 有的 四 环 素 抗 性 标 记 和乳糖操纵子都能够在z m o b i l is c p 4 中 表达， 但是转化菌株在以 乳糖为唯一碳源 的培养基上培养时不能生长。另外，3 0 下此质粒能稳定存在于z m o b i l is c p 4中， 但当培养温度由3 0 上升到 3 7 时，质粒会迅速丢失。 最初的直接用宽宿主质粒引入外源基因的研究没有取得理想的效果， 随着对运动 发酵单胞菌质粒状况的了 解日 益深入， 人们开始致力于利用运动发酵单胞菌的天然质 拉和大肠杆菌已知质粒， 来构建运动发酵单胞菌与 大肠杆菌之间的穿梭质粒， 同时对 大津大学 硕十学 位论文第一章 文献综述 提高转移效率的方法也进行了广泛的研究。 1 9 8 4 年， 澳大利亚b r o w n e 等人利用大肠杆菌的质粒p s u p 1 0 1 1 ( 1 5 k b ) ， 和取 自 于z m o b i l is z m 6 菌株的一个隐性质粒p n s w i ( 1 3 k b ) ， 构建成一个大小为2 8 k b的 穿梭质粒p n s w6 0 1 ， 采用c a c 1 2 转化法将该 质粒顺利转化到z .m o b i l is 中， 转化率 达 到5 x 1 0 3 受 体 细 胞 / g g d n a z 5 1 a p n s w 6 0 1 在z m o b i l is 内 具 有良 好 的 稳 定 性， 但 是 该 质粒较大，无法有效地将外源基因携带到z m o b i l i s 中，故实际应用价值很小。 1 9 8 6 年， 日 本k e n z o t o n o m u r a 等人将z m o b il is a t c c 1 0 9 8 8 中3 .9 k b 大小的质粒 p z m 3 分别插入到大肠杆菌质粒p a c y c 1 8 4 的e c o r l , h i n d h l 和b a m h i 酶切位点， 构 建 成 的 三 种 穿 梭 质 粒 分 别 命 名 为p z a 3 1 , p z a 3 2 , p z a 3 3 ， 且 均 为7 .9 k b 大 小2 6 1 其中p z a 3 1 含 有四 环 素 抗 性 标 记 简 记 为t c r ) , p z a 3 2 和p z a 3 3 含 有 氯 霉 素 抗 性 标 记 ( 简 记为c m r ) 。 利 用 辅 助 质 粒p r k 2 0 1 3 将 这 三 个穿 梭 质粒 分 别 转 化 到z . m o b il is c p 4 中， 然后 采用四 环素 ( t c , 3 0 g g /m l ) , n a l ( 1 0 0 g g / m l ) 对p z a 3 1 转化子进行筛选， 采 用氯霉素 ( c m , l 0 0 g g / m l)、 n a l ( 1 0 0 p gj m l ) 对p z a 3 2 转化子和p z a 3 3 转化子进行筛 选。 三 种 质粒的 转化率分别为4 .2 x 1 0 7 / 供体 细胞、 3 . 1 x 1 0 匆 供体细 胞、 2 .5 x 1 0 -7 / 供 体细胞。将转化菌株在未加抗生素的r m培养基中培养 1 3 小时，适当稀释菌液后涂 布到r m平板上，待菌落长出后影印到含有抗生素的r m 平板上，比较两个平板上 长出 的 菌 落数 量， 从而 计算出p z a 3 1 , p z a 3 2 , p z a 3 3 的 保持率分别为7 7 % , 5 6 % , 3 8 %，故稳定性较差。 以上述工作为基础，1 9 8 6 年，日本mi s a w a等人将来源于z m o b i l is a t c c 1 0 9 8 8 的 质粒p z m 2 ( 2 . 7 k b ) 插入到大肠杆菌质粒p a c y c 1 8 4的a v a l 位点，构建成穿 梭质 粒p z a 2 2 1 5 。 该质 粒具 有氯 霉素 和四 环素两 个抗 性标记， 并且 在 抗性 标记内 具有 e c o r i , e c o r v , b a m h i 以 及s a l l 单酶切位点。 通过以p r k 2 0 1 3 为 辅助质粒， 用接 合转移的 方法将p z a 2 2 导入z m o b i l is n r r l b - 1 4 0 2 3( 即c p 4 )中， 转化率为1 .0 x 1 0 -6 / 受 体 细 胞。 进一 步 检 测表明 ， p z a 2 2 在n r r l b - 1 4 0 2 3 内 的 拷贝 数 是p z a 3 2 的 1 9 8 7 年，mi s a w a 等人将从c e l l u l o m o n a s u d a c b 4 分离出的纤维素酶 ( c mc a s e ) 基因 通 过 不同 的 位点 插入到p z a 2 2 中， 分 别 构成p z a c m 2 1 , p z a c m 2 2 ， 并 对p z a 2 2 进行了 进一步的改造，将来自z m o b i l is n r r l b - 1 4 0 2 3染色体 d n a 的 0 . 3 3 k b h in c i i - b a m h i片段引入 p z a 2 2而构成新的质粒 p z a 2 3 , p z a 2 6( 注:0 . 3 3 k b h i n c i i - b a m h i 片段上含有一个启动子、 一个核糖体结合位点和一个起始密码子) ， 纤 维素酶 ( c m c a s e ) 基因 插入p z a 2 6 后的重组质粒命名为p z a c m 2 6 。通过使用有辅 助 质 粒p r k 2 0 1 3 的 接 合 转移的 方 法， 分 别 将p z a c m 2 1 , p z a c m 2 2 和p z a c m 2 6 引 入z .m o b i l i s n r r l b - 1 4 0 2 3 ，对相应的转化子进行的c mc a s e 酶活测定结果显示，有 天津大学硕士学位论文第一章 文献综述 p z a c m 2 6 的 转化子c m c a s e 的酶活水平显著高于前两 个转化子c m c a s e 的酶活水平， 达 到0 .7 8 u / m l 培养 物n 1 。 证明 以p z a 2 2 为 基 础 改 造构建 而 成的 质 粒p z a 2 6 是 较理 想 的表达型载体。 1 9 9 2 年，日 本o k a m o t o 等人较早采用电穿 孔转化法， 将前述质粒p z a 2 2 转化到 a t c c 1 0 9 8 8 和z m o b il is n r r l b - 1 4 0 2 3 中， 转 化率 分 别达 到1 x 1 0 ， 转 化 子 / ji g d n a 和2 x 1 0 3 转 化 子 乍 g d n a 2 8 1 0 1 9 9 5 年， m in z h a n g 等 人在 对z m o b il is 进 行 基因 =i 一 程 改 造的 过 程中， 亦利用了p z a 2 2 。 他 们将大肠杆菌与 木糖 代谢相关的x y la , x y l b基 因 以 及t a l , tk t 基因 插入到穿 梭 质 粒p z a 2 2 中 构 建 成p z b 5 2 9 。 用 该 质 粒转 化z . m o b i l is c p 4 菌株后， 对转化子c p 4 ( p z b 5 ) 和未转化菌株c p 4 进行的 粗酶液酶活 测定显示， c p 4 ( p z b 5 ) 粗酶液酶活水平分别为木糖异构酶0 . 1 1 u / m g 、 木酮糖激酶1 . 5 u / m g 、 转 醛醇酶0 . 8 8 u / m g 、 转酮醇酶0 . 1 6 u / m g , c p 4 粗酶液中 相应的各种酶的酶活水平儿乎 为。 。同 时， c p 4 ( p z b 5 ) 菌株可以 在以 木糖为唯一碳源的 培养基上生长， 乙醇的产 量 可 达理 论值的8 6 % ， 证明p z b 5 所 携带的 外 源 基因 在c p 4 中 可以 很好表达。 1 9 8 7 年， 希腊a f e n d r a , d r a i n s 等人将a t c c 1 0 9 8 8的内 源质粒p z m 0 2 插入到 大肠 杆菌质粒p b r 3 2 5 的e c o r l 酶切位点， 构建出穿梭质粒p d s 2 1 2 ( 7 .9 k b ) ,具有 四 环 素( t c ) 和 氨节青 霉素 ( a p ) 两 个 抗 性 标记3 0 1 。 实 验结 果 证明， p d s 2 1 2能以 类 似于p b r 3 2 5 的 频率 转化大 肠杆菌r r l 菌 株 分别为1 x 1 0 1 个 / p g d n a , 3 . 3 x 1 0 1 个1 w g d n a ) ， 转化子在非选择压力下 经6 0 代细胞分裂后， 抗性标记仍以9 8 % 的频率 保持。 在有p r k 2 0 1 3 存在的 情况下， p d s 2 1 2 能 从大肠杆菌r r l 接合转 移到z m o b i l is 的c u i - r i 。菌株 ( 注:为a t c c 1 0 9 8 8 的 诱变株，已 丢失至少一种质粒， 具 有对利福 平的 抗性)中。 在无选择压力的培养条件下， 转化子经6 0 次分裂后仍有9 3 % 的细胞 含有抗性标记。 但未见此穿梭质粒后续使用的 相关报道。 1 9 8 7 年， 美国c o n w a y , b y u n 等 人以 宽 宿主质粒r s f 1 0 1 。 和r n为 基 础， 构建 出若干个质粒载体。 这些载体可从大肠杆菌接合转移至运动发酵单胞菌， 转化率接近 1 0 - 2 / 受体的高频率。 这些载体在运动发酵单胞菌中能稳定存在， 在没有选择压力的 情 况 下5 0 代以 后仍没 有 质 粒 丢失 。 其中 有 代 表 性的 质 粒 之一 是p l o i 2 0 4 , p l o 1 2 0 4 含有一个