（化学工程专业论文）一种可注射水凝胶的制备及其生物相容性研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 组织工程的主要思路是将功能性种子细胞接种于生物支架材料( 细胞外基质 e x t r a c e u u l a rm a t r i x ，e c m s ) 替代物上，经过体外培养或构建后移植到体内受损组织处用以 修复受损的组织。本课题的主要目的是制备一种温敏型可注射的水凝胶支架材料，并检 测种子细胞与这种支架材料的生物相容性。 本文首先制备了一种新型可注射的温敏型壳聚糖甘油磷酸钠胶原 ( c h i t o s a n g l y c e r o p h o s p h a t e c o u a g e nc g p c o ) 水凝胶。将2 1 5 杈w w ) 的壳聚糖溶液与5 0 ( w w ) 的p 甘油磷酸钠( g p ) 溶液按一定比例混合得到壳聚糖甘油磷酸钠( c g p ) 溶液，然 后将配制好的2m g m l 以胶原溶液与壳聚糖甘油磷酸钠溶液混合得到壳聚糖甘油磷酸 钠胶原水凝胶。测定水凝胶在3 7 的成胶时间，扫描电镜观察c g p c o 水凝胶的微观 结构，并测量由水凝胶中提取培养基的渗透压值。为了检测所制备的c g p c o 水凝胶的 生物相容性，我们分离并培养人源脂肪间充质干细胞( a d i p o s et i s s u e d e r i v e ds t e mc e l l s a d s c s ) 作为种子细胞，检测其增殖和多向分化潜能。接着将人脂肪来源的间充质干细 胞接种在c g p c o 水凝胶表面培养，倒置显微镜观察细胞的黏附、生长和分布形态， c c k 8 试剂盒测定细胞增殖情况，l i v e d e a dv i a b i l i t y c y t o t o x i c i t y 试剂盒染色观察细 胞死亡状况。最后将a d s c s 包埋在水凝胶内部，采用c c k 8 试剂盒和扫描电镜检测细 胞在水凝胶内部的生长状况。 实验结果表明c g p c o 水凝胶3 7 的成胶时间为1 2 m i n ，电镜照片显示c g p c o 水凝胶内部呈海绵状多孔结构，孔径为1 0 0 1 5 0 p m ，渗透压仪测定提取培养基的渗透压 为3 1 0 3 3 0m m o l k f l ，各种指标均适合用于细胞培养和体外组织构建。人源脂肪间充质 干细胞作为种子细胞呈长梭形贴壁生长，具有良好的增殖能力，能够向脂肪细胞、成骨 细胞、软骨细胞分化。经过7 天的培养，c g p c o 水凝胶表面的a d s c s 能够呈长梭状 生长，并良好的增殖。通过死活试剂盒检测可知，水凝胶表面生长的a d s c s 分布均匀， 并且显示出良好的细胞活性。此外，c c k 8 试剂盒的测试结果及扫描电镜照片都表明 c g p c o 水凝胶内部包埋的a d s c s 同样能够在水凝胶内部孔道中黏附和增殖。以上结 果表明这种新型的c g p c o 水凝胶具有良好的细胞相容性，为组织工程提供了良好的新 型支架材料。 关键词：水凝胶；壳聚糖；胶原；脂肪间充质干细胞；组织工程 一种可注射水凝胶的制备及其生物相容性研究 p r e p a r a t i o na n db i o e o m p a t i b i l i t yo f a ni n j e c t a b l eh y d r o g e l a b s t r a c t t i s s u ee n g i n e e r i n gc o m b i n e st h et h e , o f i e sa n dm e t h o d so fl i f es c i e n c e sa n de n g i n e e r i n g s c i e n c e ，t od e v e l o pn e wc l i n i cs u b s t i t u t ef o rh u m a nt i s s u ea n da p p a r a t u s i t st y p i c a lm e t h o di s s e e d i n gc e l l si nt h ea r t i f i c i a le x t r a c e l l u l a rm a t r i x ( e c m s ) t of o r mc e l l s a r t i f i c i a le c m s c o n s t r u c t s t h em a i ni d e ao ft h i ss t u d yi st of i n dak i n do ft h e r m a l l ys e n s i t i v eh y d r o g e l ，a n dt o d e t e c tt h eb i o c o m p a t i b i l i t yo fi t an o v e li n j e c t a b l et e m p e r a t u r e - s e n s i t i v ec h i t o s a n g l y c e r o p h o s p h a t e c o l l a g e n ( c g p 伦o ) h y d r o g e l w a s f i r s t l y p r e p a r e d 2 15 ( w w )c h i t o s a ns o l u t i o na n d 5 0 ( w w ) 1 3 - g l y c e r o p h o s p h a t e s o l u t i o nw e r em i x e d 、析t l lac e r t a i n p r o p o r t i o n t o g e t c h i t o s a n g l y c e r o p h o s p h a t es o l u t i o n , a n dt h e n2m g m l 。1p r e p a r e dc o l l a g e ns o l u t i o nw a sm i x e d i n t ot h ep r e v i o u ss o l u t i o nt og e tt h ec g p c oh y d r o g e l 功eg e l f o r m a t i o nt i m ew a sm e a s u r e d a t3 7 ，t h em i c r os t r u c t u r eo ft h i s h y d r o g e lw a so b s e r v e du n d e rs c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e ，a n dt h eo s m o l a l i t yo ft h em e d i aw i t h i nt h eh y d r o g e l sw a sa l s oa s s a y e d i no r d e r t od e t e r m i n et h eb i o c o m p a t i b i l i t yo ft h ei n j e c t a b l ec g p c oh y d r o g e lp r e p a r e d ，a d i p o s e t i s s u e d e d v e ds t e mc e l i s ( a d s c s ) w e r ec u l t u r e da ss e e d i n gc e l l s t h e nt h ea b i l i t yo f p r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o nw e r ed e t e r m i n e d 1 1 1 ea d s c s w e r es e e d e do nt h es u r f a c eo f c g p c oh y d r o g e l s ，a n dt h ec e l lg r o w t hs t a t u sw a sa s s a y e du n d e ri n v e r t e dm i c r o s c o p e ，t h e c e l lp r o l i f e r a t i o nw a sd e t e c t e db yu s i n gc c k - 8k i t sa n dt h ec e l la p o p t o s i sw a so b s e r v e db y l i v e d e a dv i a b i l i t y c y t o t o x i c i t yk i t s f i n a l l y ，t h eg r o w t ho fa d s c sw i t h i nt h ec g p c o h y d r o g e l s w a sa l s oe v a l u a t e d b yu s i n g c c k 一8k i t sa n d s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( s e m ) 刀) er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg e l f o r m a t i o nt i m eo ft h ec g p c oh y d r o g e lw a sa b o u t1 2 m i na t3 7 ，t h ei n s i d eo fh y d r o g e lp r e s e n t e ds p o n g yp o r o u ss t r u c t u r ea n dt h ep o r es i z ew a s 1 0 0 1 5 0 岬，t h eo s m o l a l 匆o f m e d i aw a si nt h er a n g eo f 3 1 0 - 3 3 0m m o l k g 一a l lt h e s er e s u l t s i n d i c a t et h a tt h ec g p c oh y d r o g e l sa l ef e a s i b l ef o rc e l lc u l t u r e t h ea d s c sa p p e a r e dt o a d o p tau n i f o n ns h u t t l es h a p ea n da t t a c h e dt ot h ef l a s k t h e yc 锄d i f f e r e n t i a t ei n t oa d i p o c y t e s ， o s t e o b l a sa n dc h o n d r o b l a s t s a f t e r7d a y sc u l t u r e ，t h es t e mc e l l ss e e d e do nt h es u r f a c eo ft h e c g p c oh y d r o g e l ss h o w e dt y p i c a lc e l lm o r p h o l o g ya n dp r e s e n t e dg o o dp r o l i f e r a t i o na n d v e r yh i g hc e l lv i a b i l i t y n l ea d s c sw e r ea l s oe n c a p s u l a t e dw i t h i nt h eh y d r o g e l sa n d d e m o n s t r a t e dn o r m a ls h u t t l em o r p h o l o g y i ti sc o n f i r m e dt h a tt h en o v e lc g p c oh y d r o g e l p o s s e s s e se x c e l l e n tc e l lc o m p a t i b i l i t y ，a n dt h u si saf a v o u r a b l es c a f f o l df o rt i s s u ee n g i n e e r i n g 大连理工大学硕士学位论文 k e yw o r d s ：h y d r o g e l s ；c h i t o s a n ；c o l l a g e n ；a d s c s ；t i s s u ee n g i n e e r i n g m 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：二盘旦遣庭盛划盘鹾笾量圭继丝亟盘 作者签名：耋遗日期：型年二z - 月蔓日 大连理工大学硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目：兰盘要堇麴尘蛐熊睦匡塞坌丝盘蝗逝 作者签名：耋i 鸯日期：麴翌年上月卫日 导师签名：垒臼垒日期：单年1 ：乙月二日 大连理工大学硕士学位论文 己i喜 丁i口 组织工程最早是在1 9 8 7 年美国科学基金会在华盛顿举办的生物工程小组会上提出， 1 9 8 8 年正式定义为：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常 及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进 人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。 组织工程的主要思路是将功能性细胞接种于具有特定性能的生物支架材料( 细胞外 基质替代物) 上，然后移植到体内受损组织处用以修复受损的组织，种子细胞、支架材 料、复合方法是组织工程的三要素。 目前对于种子细胞的研究，大部分集中在骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。 2 0 0 1 年，z u k 等从脂肪抽吸物中成功分离培养出具有向骨、软骨、脂肪、肌肉等多向分 化潜能的细胞，g r o n t h o s 等进一步证实脂肪来源细胞中的确存在具有间充质干细胞特性 的细胞。对比骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞( a d i p o s et i s s u e d e r i v e ds t e mc e l l s a d s c s ) 具有体内分布广，取材创伤小，细胞获得量大等特点，还能对病人进行体形重 塑等优点，最近已成为新的研究热点。 在组织工程研究中，寻找能充分发挥组织再生潜力的细胞外基质材料是核心内容。 它要求支架具有三维立体结构，并且具有良好的生物相容性、生物可降解性。组织工程 三维支架主要分为多孔支架( “硬”支架) 和可注射性支架( “软”支架) 。可注射水凝胶支架具 有原位成胶、操作简单、塑型随意、创伤小及不需要手术等优点，因而越来越受到人们 的关注。c h e n i t e 等将壳聚糖溶液与1 3 甘油磷酸钠溶液混合制成具有生理p h 值、并且 可以在室温下保持液态体温下转变为凝胶状的水凝胶，这种水凝胶由于加入过多的甘油 磷酸钠溶液使体系的离子浓度过高，使它的细胞相容性变差。c h o 等将异丙基丙烯酰胺 接枝到水溶性壳聚糖上合成出水溶性壳聚糖g 聚异丙基丙烯酰胺共聚物，3 2 形成不透 明的松散凝胶，但异丙基丙烯酰胺的体内降解性和生物相容性还需要进一步研究。另一 种水凝胶是聚( 氧化乙烯一氧化丙烯氧化乙烯) 体系，但这种聚合物不能生物降解，鼠体 内实验显示它还具有一定毒性。 为了得到一种具有良好的生物相容性的可注射支架材料，本研究将壳聚糖溶液与b 甘油磷酸钠溶液按一定比例混合，制得壳聚糖甘油磷酸钠溶液，接着将该体系与胶原 溶液按一定比例混合制得壳聚糖甘油磷酸钠胶原( c g p c o ) 水凝胶。通过扫描电镜观察 微观结构，测量水凝胶中提取培养基的渗透压，并将脂肪间充质干细胞分别接种于 c g p c o 水凝胶表面和内部进行培养及检测，证实这种新型的c g p c o 水凝胶具有多孔 的三维结构，良好的细胞相容性，为组织工程提供了良好的新型支架材料。 一种可注射水凝胶的制备及其生物相容性研究 1文献综述 1 1 组织工程简介 组织和器官的缺损或功能衰竭在日常生活中非常常见。临床上，一般采用器官移植、 外科修复、人工取代物、医疗器械以及药物来进行治疗。其中，常用的自体器官移植 ( a u t o l o g o u st r a n s p l a n t a t i o n ) 虽然效果显著，无免疫排斥，但必须从健康部位取材，造成 新的缺损，而且供区有限；而同种异体移植( a l l o g e n i ct r a n s p l a n t a t i o n ) 避免了自体器官移 植中产生新创伤的缺点，但会长期存在免疫排斥反应，而且供体并不能满足大量患者的 需要。人工取代物一般为生物惰性材料，不能与受损的组织和器官愈合形成一个整体。 医疗器械不能替代器官的全部功能，也就不能很好地修复受损的组织和器官。因此，需 要采用一种新概念、新方法进行受损组织和器官的修复和再生，组织工程技术应运而生。 在2 0 世纪8 0 年代，y a n n a s 等采用可降解胶原多孔材料作为模板进行皮肤再生的 研究1 1 j 。1 9 8 7 年美国国家科学基金委员会举行的关于生物工程的小组讨论中提出了组织 工程的术语。1 9 8 8 年在美国加州塔霍湖举行了第一次组织工程会议，并定义组织工程的 概念。1 9 9 3 年l a n g e r 和v a c a n t i 在科学上发表关于组织工程的综述，将组织工程的 研究推向新的高潮，并逐渐形成组织工程学这一新学科【2 】。 组织工程的概念是应用生命科学与工程学原理及方法构建一个生物装置，增进人体 细胞和组织的生长，以恢复受损组织或器官的功能【3 】。目前，组织工程的主要思路是将 功能相关的活细胞接种于细胞外基质替代物上，这种替代物可为细胞提供一个空间结 构，使细胞在上面生长，体外培养一定时间后形成细胞与替代物的复合物，再将所得复 合物移植到体内受损组织处，以修复受损组织。图1 1 为组织工程思路的示意图。组织 工程中的替代物材料一般为可生物降解的人工合成的高分子支架材料或天然生物大分 子支架材料，植入体内的材料经过一定时间后可完全降解并被人体所吸收，不会在体内 留下异物。由此可见，种子细胞、支架及其复合方法是组织工程的三要素。近年来，组 织工程的研究内容主要集中在生物材料研制、种子细胞培养、生长因子以及细胞与支架 材料的复合及塑形等方面。组织工程发展迅速，在皮肤、角膜、肝、胰、软骨、骨、血 管、尿道、神经系统等领域均取得了一定成果，其中骨和软骨组织工程的研究开展最广 泛。 一2 一 人连理1 人学碘十学傅论文 2 组织工程中的种子细胞 121 种子细胞的分类 组织i ：程的最终日的是让细胞在体外生长分化为助能性的组织器官，采集少量的自 体细胞加以培养，在体外大规模地增殖，再运用于体内器官的修复l 。凼此细胞是组织 再生的戈键。理想的种了细胞应当其有以下特点：取材方便，对机体影响小；体外 培养简便、 殖快；能够向特定的组织方阳笈育、分化；免疫原性低，无潜在致瘤 性。种子细胞按束源不同大致上可分为两种：已分化完全的成体细胞，以及具有分化成 其它细胞能力的十细胞。 成体细胞的来源f 要分为自体及同种异体细胞，当然自体细胞自然是最为理想的细 胞柬源，因为不会产，l 免疫排斥的问题。虽然近几十年问，体外培养细胞的技术己有令 人瞩日的进展，但仍有r l ：多盖键性的难题尚未突破。例如，如何有效地促进成体细胞存 体外的增殖能力，以及细胞取得柬源受限和传代的去分化等问题，这些都是成体细胞存 组织工程应川发展的一大障碍。 c e l i i s o l a l i o n e x p l n ，i o n 。激穗： 蜷骚蓖卜叠 ”| i j 。 i 、i p l 、i t l f ，、 p a i ；e i 剐1 1 组纵【科邢意幽 s c h e m a t i c i l l u s t r a t i o no f t y p i c a l t i s s u ee n g i n e e r i n ga p p r o a c h 日 鲨 o 一种可注射水凝胶的制备及其生物相容性研究 1 2 2 干细胞简介 近几年兴起了研究干细胞的热潮，为组织工程的前景带来一线曙光。藉由诱导干细 胞分化的研究，可以解决细胞来源不足的问题。在一定条件下，干细胞可分化成机体内 的各种功能细胞，形成任何类型的组织和器官，以实现机体内部建构和自我康复。干细 胞有以下特点：干细胞本身不是处于分化途径的终端。干细胞能够增殖分裂。干 细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。干细胞通过两种方式生长， 一种是对称分裂，即形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂，即由于细胞质中的 调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的 分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前 干细胞的数目和分裂次数控制。 干细胞按其分化潜能的大小，干细胞可分三种类型：全能性干细胞( t o t i p o t e n ts t e m c e l l ) ：具有形成完整个体的分化潜能，如胚胎干细胞可以无限增殖并分化成为全身2 0 0 多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织器官。多能性干细胞( p o l y e n e r g e t i cs t e m c e l l ) ：这类干细胞失去发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定限度，如骨髓多能干 细胞可分化出至少屹种血细胞，但不能分化出造血系统以外的细胞。单能干细胞：这 类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织的基底层干细 胞、肌肉中的成肌细胞。根据细胞的发育阶段，干细胞可分为胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e m c e l l s ) 和存在于成熟个体组织器官内的成体干细胞( a d u l t s t e mc e l l s ) 。成体干细胞则可根据 来源不同分为神经干细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等。 1 2 3 脂肪间充质干细胞 2 0 0 1 年，z u k 等【4 1 从脂肪抽吸物中成功分离培养出具有可以向骨、软骨、脂肪、肌 肉等多项分化潜能的细胞，o r o n t h o s 等【5 】迸一步证实脂肪来源细胞中的确存在具有间充 质干细胞特性的细胞。此后人们对脂肪干细胞( a d i p o s e - d e r i v e ds t e mc e l l s ，a d s c s ) 作了大 量研究，尤其是它的多向分化潜能及表面抗原。这些研究都旨在明确a d s c s 能否用作 构建特定组织的种子细胞。而a d s c s 的分化潜能直接决定了它的应用范围。 脂肪干细胞由于存在于脂肪组织内，提供脂肪组织终生的自我更新，在脂肪代谢的 过程中保持着一种动态平衡，因此是脂肪移植合适的靶细胞，受到人们的关注。d eu g a r t e 等指出，在原代培养所获得的细胞数量、细胞生长动力学、细胞衰老、多向分化能力以 及基因转染效率等方面人脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞( b m s c s ) 并无显著差异【6 j 。而 j a s o n 等则在文章中指出，相对于通过骨髓穿刺获取b m s c s ，从单位体积脂肪组织中可 一4 一 大连理工大学硕士学位论文 以分离出更多的干细胞( 1 1 0 5 个b m s c s 3 0 毫升骨髓v s4 x1 0 7 a d s c s 1 0 0 毫升脂肪) f 7 】 o 在组织工程方面，相对于a d s c s ，有报道指出骨髓问充质干细胞( b m s c s ) 的体外培 养状态会受到血清批次的影响并且有时需要在生长因子的辅助下促进增殖【8 l 。并且通过 骨髓穿刺术所获得的b m s c s 的数量有限，短时间内不能提供足够数量的种子细胞。而 加大骨髓抽取容量频次则会增加机体创伤，并有一定的并发症【9 】。此外，随着骨髓采取 量的增加，原代培养细胞中红细胞的掺杂比例也会相应增加，而a d s c s 则不存在这种 情况。更为重要的是，b m s c s 的成骨潜能会随着年龄的增加而显著降低 z o - l l 】。因此， 基于以上几点，a d s c s 是较b m s c s 之后更有应用前景的组织工程种子细胞【1 2 d 3 1 。 1 2 4 脂肪千细胞的表面标记 由于目前尚无鉴定脂肪干细胞的特异性标志，对脂肪干细胞的特征描述及其分化都 是以一个细胞群体的形式进行的。脂肪干细胞的细胞形态呈纤维样，可聚集成均匀的集 落。一般认为脂肪干细胞体积小，核浆比值大。c o l t e r 等1 1 4 】人对人脂肪干细胞生物学特 点的研究发现，脂肪干细胞的生长可分为三个时期：延缓期、快速生长期和稳定期。流 式细胞术分析显示稳定培养的细胞有两种类型，一种是数量较多的含中等量颗粒的大细 胞，另一种是数量较少的无颗粒的小细胞。前者被认为是成熟的脂肪干细胞，而后者为 再循环脂肪干细胞。 脂肪干细胞不表达与分化相关的标志物，如碱性磷酸酶( a l k a l i n e p h o s p h a t c ， a l p ) ，细胞贴壁后均一的表达h l a a b c 、c d 9 、c d l 0 、c d l 3 、c d 2 9 、c d 3 4 、。 c d 4 4 、c d 4 9 、c d 5 4 、c d 5 5 、c d 5 9 、c d l 0 5 、c d l 4 6 、c d l 6 6 。a d s c s 和m s c s 具有 相同的表现型，对c d 2 9 、c d 4 4 、c d 7 1 、c d 7 0 、c d l 0 5 s h 2 和s h 3 为阳性反应，对 c d 3 1 、c d 3 4 和c d 4 5 为阴性反应。有两个特征性表达分化抗原c d 4 9 d 和c d l 0 6 ，前 者肯定存在而后者肯定没有，与m s c s 情况相反。虽然脂肪干细胞与造血干细胞共同存 在，但脂肪干细胞不表达造血谱系的标志，包括c d 3 4 和白细胞共同抗原c d 4 5 ，也未 在扩增的脂肪干细胞中鉴定出造血干细胞来u 引。因此这些细胞明显不同于其它c d 3 4 表 面抗原阳性的细胞。 1 2 5 脂肪间充质干细胞的诱导分化潜能 细胞分化不是单个细胞的孤立行为，是在一定条件下的，有多种因素的参与，如细 胞与细胞之间相互作用、细胞的数量、细胞所处的微环境。对多潜能基质干细胞的最初 认识，可以追溯到1 9 8 6 年f d e d e n s t c i n 的研究，他发现中存在能够分化为成纤维细胞和 其它类型间充质细胞，最明显的特点是它们能够分化成类似骨和软骨组织的克隆，通过 一种可注射水凝胶的制备及其生物相容性研究 其对塑料培养板表面的粘附可以分离这些细胞。不同的诱导剂可诱导骨髓间充质干细胞 向不同方向分化，如地塞米松、维生素c 、骨形态发生蛋白、转化生长因子b 、b f g f 、 胰岛素等，分别使同样阶段间充质干细胞向成骨、成脂肪或肌细胞等方向分化。当然， 其中所用诱导剂的种类、浓度及有无其他因子的共同作用均对诱导结果产生影响。 ( 1 ) 成骨分化潜能 早在1 9 9 4 年，k a p l a n 等1 6 j 就发现了皮下脂肪组织具有异位成骨现象，提出脂肪组织 中具有成骨分化潜能细胞的推测。之后，随着a d s c s 概念的明确提出，大量研究均证实 了其具有成骨分化潜能1 1 7 - 1 9 1 。h a l v o r s e n 等【1 7 1 经体外实验证实，成骨诱导的人a d s c s 可 以分泌矿化基质并表达成骨特异性基因，包括c b f a - 1 、碱性磷酸酶、骨桥蛋白降钙素和 i 型胶原等。在体内试验中，将b m p 2 转基因诱导的a d s c s 以i 型胶原海绵为支架，植 入免疫缺陷小鼠肌肉后可形成骨样组织【1 8 】。c o w a n 等【1 9 】进一步证实未经成骨诱导的 a d s c s 与羟基磷灰石支架复合，可以成功修复小鼠颅骨缺损，而且经原位荧光素杂交试 验证实新形成的骨组织中9 0 以上的细胞来源于供者( 脂肪) 。 鉴于以上肯定的骨缺损修复效果，a d s c s 已成为继b m s c s 之后最具前景的组织工程 骨构建的种子细胞。因此，目前的研究重点主要集中在应用领域，包括如何进一步提高 a d s c s 成骨效果，a d s c s 为基础的组织工程骨产品研发，同种异体骨缺损修复及远期修 复效果观察等。 ( 2 ) 成软骨分化潜能 a d s c s 的软骨分化潜能目前也已得到了广泛证实1 2 0 1 ，但由于软骨定向诱导条件要求 较高，一般需要多种因子共同参与，诱导方案复杂多变，各研究小组报道不一。事实上， 探讨特异性的软骨诱导方案一直是近年来a d s c s 软骨分化研究的热点。在早期的研究 中，多数学者都沿用b m s c s 成软骨诱导的方案。近年来，许多国内外学者通过比较a d s c s 和b m s c s 对各种软骨诱导因子反应的不同，试图找到更适合a d s c s 的诱导方案。例如： 部分学者认为仅仅t g f bl 即可达到较好诱导效果，无需其他因子参与。有些学者则认 为t g f 1 3 超家族成员b m p 6 对a d s c s 成软骨分化至关重要l z 。 尽管上述研究充分证实了a d s c s 的软骨分化潜能，但其定向分化效率及组织构建结 果还远未达到临床应用要求。目前a d s c s 体内构建软骨研究仅在关节原位软骨缺损修复 中获得了成功【4 】，但体外的软骨构建效果却远不如b m s c s 。主要的可能原因在于a d s c s 的不均质性。很多研究证实目前方法得到的a d s c s 中确实含有脂肪前体细胞、成纤维细 胞、内皮细胞、平滑肌细胞、血管周皮细胞等混杂细胞i 冽。近期有报道发现，a d s c s 大连理工大学硕士学位论文 中c d l 0 5 + 细胞具有更强的软骨分化能力，可以形成相对均质的软骨样组织。因此，对 软骨分化潜能细胞进行富集和纯化将是a d s c s 软骨分化研究的另一重要方向。 ( 3 ) 成脂肪分化潜能 许多研究显示，a d s c s 经体外成脂诱导后可表达脂肪细胞特异性标记，包括脂蛋白 脂酶( l p l ) 、脂肪酸结合蛋白a p 2 、p p a r 2 、l e p t i n 、g l u t 4 等 2 3 - 2 4 。a d s c s 与海绵状透明 质酸支架材料复合，经体外成脂诱导后有脂质蓄积，检测到脂肪形成的标志酶甘油3 磷酸脱氢酶1 2 5 1 。在体内，a d s c 的成脂能力也已得到证实。h e i m b u r g t 2 6 j 等将a d s c s 与海 绵状胶原复合后植入免疫缺陷小鼠体内，形成了脂肪样组织。 a d s c s 无论在体外还是体内都有很强的成脂肪能力，因此在脂肪组织工程中将有很 好的应用前景。但是，脂肪组织中本身就存在大量的脂肪前体细胞，目前还没有足够的 证据证明所形成的脂肪是来源于干细胞还是脂肪前体细胞。而体内试验中所形成的脂肪 组织也不能排除局部脂肪细胞增殖形成、来源于远处脂肪组织或骨髓中的祖细胞所形 成。尽管如此，这并不影响a d s c s 在脂肪组织工程中的应用。因此，a d s c s 成脂分化潜 能的研究主要集中在应用方面及进一步明确诱导形成的脂肪组织的细胞来源问题。 ( 4 ) 成神经分化潜能 a d s c s 在体外经成神经诱导，细胞形态可发生神经细胞样改变：胞体小、有多个神 经细胞样突起，同时还表达幼稚神经细胞表面标记，包括巢蛋白( n e s t i n ) 、胶质纤维酸性 蛋白( g f a p ) 和神经元特异性核蛋i 兰t ( n c u n ) t 2 7 j 。然而，a d s c s 在体外的分化潜能受到质 疑，有研究者认为那是毒性试剂引起基因表达紊乱和细胞形态改变。其他研究组则采用 了更符合生理的诱导剂，在没有明显毒性的条件下进行较长时间的诱导，发现n e s t i n 、 n e u n 、n g f 受体及t r k a 的表达仍都增加【2 引。但到目前为止，还没有文献报道a d s c s 在 体外能分化诱导成成熟的、有功能的神经细胞。k a n 9 1 2 9 】等发现，经成神经诱导的人 a d s c s 注入大鼠脑室后表达n e s t i n 、微管相关蛋白2 、神经元特异性烯醇酶等，并可产生 神经营养因子及生长因子。但也没有足够的证据证明a d s c s 转化成了神经细胞，因为它 未能形成神经细胞关键的功能性特质形成突触接头处、产生或传递动作电位。 脂肪间充质干细胞的多能性是肯定的，a d s c s 还具有向成肌( 骨骼肌、心肌) 、内皮、 肝等1 3 0 3 2 】细胞的分化能力，其它诱导分化的细胞种类和分化能力尚处于探索之中。由于 其取材方便，可取自病人自身而避免抗原性，所以，对其多能性的研究具有重大意义。 一种可注射水凝胶的制备及其生物相容性研究 1 3 组织工程中的支架材料 1 3 1支架材料的分类 在组织工程中一般将种子细胞种植在具有可降解性和良好细胞相容性生物材料构 建的三维支架中，期望三维支架能够提供细胞所需的力学和化学信号，促进细胞的薪连、 增殖与分化，最终形成三维组织。由此可见三维支架在组织工程中的重要性。理想的组 织工程细胞外机制材料必须具备如下特征【3 4 j ：良好的生物相容性：除满足生物材料 的一般要求，如无细胞毒性、不致敏、无刺激、无遗传毒性等性能以外，材料对人体组 织、血液和免疫系统等无不良反应，而且要利于种子细胞粘附、生长和分化。良好 的生物降解性。即材料能在体内自行降解，且降解产物对人体及移植周围组织无毒害作 用，并能代谢出体外。材料的降解速率能够与细胞的生长速率相匹配，降解时间能够根 据不同组织生长所需进行调控。具有三维立体多孔结构，材料应应为三维立体结构， 空隙率最好达9 0 以上，具有较高的面积体积比，为细胞和组织生长提供足够的生长 空间和营养与氧气交换通道。 组织工程三维支架主要分为多孔支架( “硬”支架) 和可注射性支架( “软”支架) 。“硬支 架主要是指在体外采用技术手段制备的具有多孔和固定形状的三维支架，体外预先细胞 培养后移植到体内。多孔支架的制备方法很多，最广泛的是致孔剂法，如n a c l 晶体致 孔法1 3 5 】和石蜡微球致孔剂法【3 6 j 。“软”支架是将材料前趋物与细胞混合液直接注射到受损 部位，在物理或化学作用下原位形成一定形状和强度的支架。相对“硬”支架，“软”支架 具有一定优点见表1 1 ，可注射支架在体内原位成胶、操作简单、塑型随意、创伤小及 不需要手术、可以减少患者痛苦与风险等优点7 。3 9 】，因此可注射性支架越来越多受到人 们的关注。 表1 1 多孔支架与可注射支架的对比 t a b1 1t h ec o m p a r i s o nb e t w e e np o r o u ss c a f f o l d sa n di n j e c t a b l es c a f f o l d s 一8 一 大连理工大学硕士学位论文 1 3 2 可注射性水凝胶支架 可注射性支架是将细胞与一种具有流动性的、生物相容性好的材料复合，直接通过 注射器注射到机体缺损部位。材料能在原位形成具有一定机械强度、一定形状并且可与 体液进行交换的支架：细胞在支架中生长并最终形成组织。也可将材料直接注入体内，利 用注射物周围组织的细胞扩展生长增殖形成组织。细胞生长所需营养是由机体体液交换 提供，同时其体内环境也利于其分化和功能的表达，组织的形成。可注射性支架目前主 要用于骨组织和软骨组织再生修复治疗，但将是今后组织工程支架发展的重要方向之 一。可注射性支架材料应具备以下几个条件： 生物相容性。材料应无炎症反应、免疫发生和生物毒性；材料如在体内可降解， 其降解产物也必须具有生物相容性。且要考虑可注射支架中前驱物、交联剂、官能团、 引发剂及其副产物对细胞活性和功能的影响。 机械强度。材料植入体内初期的机械强度非常重要，并且希望机械强度尽可能 与组织原有强度相近。机械强度主要考虑压缩、拉伸和扭曲。 温和的固化成型条件。前驱物通过物理或化学刺激在体内固化成型时，其条件 必须保证细胞的活性及对周围组织无损害。因此，要仔细考虑所采用的溶剂体系、固化 机理等。其溶剂体系一般采用生理盐水、缓冲液或培养基。固化过程中无大量热生成和 p h 变化等。 促进组织形成。原位形成的支架应具有合适的材料空间和降解时间，可促进组 织的生长和血管形成。通过降解速率和组织形成的配合来协调组织的承载能力是非常重 要的。 消毒。材料应方便消毒来防止感染。消毒方法不能破坏前驱物和材料的生物活 性和改变化学组成，影响其生物相容性和降解性能。 时间温度变化的设定。在材料固化之前应设定适当时间使手术者有足够时间来 进行操作，而注射到受损部位，需要快速固化，以保证细胞均匀分布和支架形状的固定。 如果固化过程有温度变化，要尽可能降低温度变化对周围组织的破坏。 可注射性支架主要分为两类：可注射性水凝胶支架和可注射性细胞微载体。前者研究 广泛，后者则较少。水凝胶是介于固体和液体之间通过共价键、氢键或范德华力等作用， 相互交联构成三维网状结构，是一种能溶胀于水，但在水中又不能溶解的亲水聚合物凝 胶【4 0 】。众所周知，水占人体体重的6 0 7 0 ，水凝胶聚合物具有良好的生物相容性，原 因在于该聚合物大量吸收水分的特性，水凝胶含有大量的结构水，由于水分充斥于聚合 物网络中，使整个材料具备了一种流体的性质，增加了与组织的亲和性，大大减少了刺 激性，也正是因为与组成人体的大分子化合物结构相似，因而具有较好的生物相容性。 一9 一 一种可注射水凝胶的制各及其生物相容性研究 目前研究报道中使用的凝胶材料种类繁多，根据不同的种类、性质、用途划分的方式也 不同。 从原料来源方面划分，包括合成、半合成和天然三大类。其中人工合成的水凝胶主 要包括聚乙烯醇类水凝胶、聚丙烯酞胺类水凝胶；半合成主要是合成高分子与天然多糖 共混交联，如聚乙烯醇一壳聚糖水凝胶，聚乙烯毗咯烷酮壳聚糖共混水凝胶等；天然水 凝胶主要有壳聚糖以及壳聚糖衍生物类、胶原类、透明质酸类、藻酸盐类、琼脂糖类等。 人体就是含大量的天然高分子水凝胶，从这一点来讲，天然高分子水凝胶与人体组织具 有相似性，很多的研究也证明了这一点。现在水凝胶的发展方向主要是在提高其力学性 能、可降解性能、增强水凝胶在活体组织中神经、血管的长入以及加强其对组织细胞刺 激信号的响应性等方耐4 。水凝胶的应用主要集中在药物释放系统和人体组织工程。 1 3 3 人工合成水凝胶研究进展 聚乙烯醇( p v a ) 可由聚醋酸乙烯醋经醇解、水解或氨解制得。聚乙烯醇水凝胶是一 种具有良好生物相容性和力学性能的高弹性材料。由于其化学性能稳定、易于成型，对 眼、皮肤无毒、无刺激，无副作用及与人体组织良好的相容性【4 2 】，是一种良好的凝胶材 料1 4 3 1 ，该材料已在生物医学领域获得了诸多的用途。但是，在大多数条件下，p v a 也 是不可降解的，况且单一的p v a 材料表面光滑、力学强度不足，且无生物活性、与生 物体组织的结合性能较差，因而也影响其在生物体内的应用。在制备方面，p v a 的亲水 性和溶解性很大程度上依赖于水解程度和分子量，且可和戊二醛或环氧氯丙烷通过化学 交联而形成水凝胶。为了避免其毒性和化学交联剂的过滤问题，采用反复冷冻溶解方法 形成水凝胶【4 4 1 。这些经反复冷冻溶解方法形成的水凝胶，虽然在室温或高伸长率的条件 下稳定。但是，就临床应用而言，这些方法并不可取。在大多数条件下，p v a 也是不可 降解的，因此，这些凝胶最有可能被用作长期和永久载体。 聚n 异丙基丙烯酰胺( p n i p a a m ) 是典型的升温型水凝胶。在水溶液中的相变温度 为3 2 左右。由于p n i p a a m 凝胶为物理交联，在体内不稳定，易解离。h e a l yi c e 研 究_ 维i t 4 5 l 制备了聚异丙基丙烯酰胺丙烯酸共聚物( p o l y ( n i p a a m c o a a c ) ) ，该凝胶不仅可 通过温度进行相转变，而且存在共价键交联，因此凝胶体系稳定。将软骨细胞直接注射 到该凝胶内部进行体外培养，结果表明细胞能在凝胶内部保持表型，且有g a g 分泌， 细胞在凝胶发生一定的聚集。在此基础上，该研究组将r g d 和f h r r a 分别弓l 入到 p o l y ( n i p a a m c o a a c ) 凝胶上，将人颅骨成骨细胞注射到该凝胶内观察其生长。成骨细 胞能在该凝胶内保持活性、铺展和增殖l 蚓。并发现细胞在不含r g d 的凝胶中为圆形， 而在含r g d 的凝胶中铺展变平，这是因为细胞表面受体与多肤之间的相互作用引起的。 大连理工大学硕士学位论文 p n i p a a m 最大的缺点在于不能降解，因此作为可注射支架应用比较少。但可以接 枝在生物大分子上，以改变生物大分子