（化工过程机械专业论文）活性污泥中降解壬基酚聚氧乙烯醚的微生物菌群结构分析.pdf

at h e s i si nc h e m i c a lp r o c e s sm a c h i n e r y a n a l y s i so fm i c r o b i o l o g yc o m m u n i t y i n n o n y l p h e n o le t h o x y l a t e s - e n r i c h e d a v t i v e d s l u d g e b yl i uh u i s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep m f e s s o rz h ut o n g n o r t h e a s t e r nu n i v e r s i 够 j u n e2 0 0 8 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 ：也 思。 学位论文作者签名：嘶 日期：删7 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 学位 签字 作者和导师同意网上交流的时间为作者获得学位后： ，峨州 年 ： 1 两 名 期 签 日 币 # 师 字 导 签 口 半年 忏 口 、砂 年 “二- 一 名1 登以 者 加 口 储 御 年 文 期 半 论 日 东北大学硕士学位论文摘要 活性污泥中降解壬基酚聚氧乙烯醚的微生物菌群结构分析 摘要 壬基酚聚氧乙烯醚( n p l l e o ) 作为非离子表面活性剂，被广泛应用于造纸、纺织、橡 胶塑料、洗衣粉和洗涤剂等行业，与人们的日常生活关系密切。其进入水体后的主要降 解产物壬基酚属于内分泌干扰物，会干扰机体的生长、繁殖等生理机能。 本研究利用a o 工艺活性污泥反应器降解n p l o e o ，评价o 工艺对n p l o e o 的处 理效果，并培养出对n p l o e o 具有降解能力的活性污泥。 实验结果表明，在原水中逐步增加n p l o e o 浓度的这个过程中，活性污泥的性状会 受到影响，但随着活性污泥对n p l o e o 的逐步适应，其状态将逐步改善，污泥性状也趋 于稳定。n p l o e o 浓度的逐渐增大对各种水质指标也造成了影响，随着n p l o e o 浓度的 增大，c o d 去除率有所下降，当n p l o e o 浓度逐步稳定之后，c o d 的去除率有所回升 并趋于稳定。o 工艺中驯化后的活性污泥经过1 0 0 天左右的培养就可对n p l o e o 产生 良好的去除效果，但是n p l o e o 浓度的大幅度变化会导致去除率的明显下降。利用o 工艺处理n p l o e o ，n p l o e o 会发生最终生物降解，并在活性污泥吸附的共同作用下，对 其降解产物也具有有良好的处理效果。 本研究还通过以链式聚合酶反应一变性梯度凝胶电泳( p c r - d g g e ) 、荧光原位杂交 ( f i s h ) 等技术为主的一些分子生物学技术，对活性污泥中的微生物种群结构的进行了初 步探索，旨在分子生物学的水平上对具有降解n p l o e o 能力的活性污泥样品中的微生物 种群结构的变化情况进行研究。 研究结果表明随着原水中n p l o e o 浓度增加，d g g e 分析图谱中的谱带有所减少， 但随着n p l o e o 浓度的稳定，两个反应池中活性污泥的菌群的相似性程度也逐渐增大， 菌群结构相对稳定，最终得到了有利于降解n p l o e o 及其降解产物的微生物菌群；对 n p l o e 0 具有降解能力的活性污泥中的优势菌主要为p 阳纪d 6 口c 据，f 口( 变形菌) ，其中 鼻- p 加胞d 6 口c 纪r 砌在降解n p l o e o 的过程中最具优势。 关键词：壬基酚聚氧乙烯醚；活性污泥；链式聚合酶反应一变形梯度凝胶电泳；荧光原 位杂交；菌群结构 i i 东北大学硕士学位论文 a b s t r a c t a n a l y s i so fm i c r o b i o l o g yc o m m u n 时i nn o n y l p h e n o l e t h o x y l a t e s - e n r i c h e da v t i v e ds1 u d g e a bs t r a c t n o n y l p h e n o l 甜l o x y l a t ei sak i n do fn o n - i o m cs u r f a c t a n t ，w h i c hi s 晰d e l yu s e di nm e m d u s t r i e so fp a p e r - m a l ( i n g ，m b b e r ，p l a s t i c sa 1 1 dc l e a i l s e r ，a n di sc l o s e l yr e l a t e dt oo u rd a i l y l i f e a r e ri t sa c c e s st ow a t e r ，i t sm a i nd e g r a d a t i o np m d u c t si sn o n y l p h e n 0 1 ，、) ，：h i c hi sak i n do f e n d o c r i n ed i s n l p t i n gc h e m i c a lw h j c hc a i lc a u s ea d v e r s ee 能c t st oo r g a n i s m s i nt h ee x p e r i m e n t ，op r o c e s si su s e d 1 1 1o p t i m a lc o n d “i o n s ，m i c r o - b i o l o g i c a l d e 掣a d a t i o no fn pi o e ob ya op r o c e s si se v a l u a t e d ，a sw e u a sn p l o e od e g r a d a t i o nn o r ai s c u l t i l r e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wm a tt h es t a t eo fa c t i v a t e ds l u d g ew i l lb ea f i e c t e dw i t h i n c r e a s eo fn p lo e oi nr a ww a t e r b u t 、析t ht h ea d a p t i o no fa c t i v a t e ds l u d g e ，t h es t a t ew i l l 伊a d u a l l yb ei m p r o v e da n di n d i c a t o r so ft h es t a t eo fa c t i v a t e ds l u d g ev m lb em o r es t a b l e w h e nt 1 1 ed e n s i 锣o fn p l o e ob e c o m e sl l i g h e r ，v a r i o u si r l d i c a t o r so fw a t e rq u a l i t yw i ua l s ob e i m p a u c t e d r e m o v a lr a t eo fc o d 谢ud r o p m l i l et h ec o n c e n t r a t i o no fn p l o e ob e i n gs t a b l e ， r e m o v a lr a t eo fc o dw i ur e b o 吼d r e m o v a lo fn p l o e ob y op r o c e s si so b v i o u sa r e ra s h o r t - t e r n la c c l i m a t i o n b u tc h a l l g eo fc o n c e n t r a t i o no fn p lo e ow i l ll e a dt os u b s t a n t i a l c h a n g eo fr e m o v a lr a t e d u r i n gt h ec o u r s e ，u l t i m a t em i c r o - b i o l o g i c a ld e 伊a d a t i o no fn p l o e o w i l l h a p p e n a i l dt h es t r u c t u r eo fb e n z e n e曲gw i l lb e d e s t r o y e d b o t hu l t i m a t e m i c r o - b i o l o g i c a ld e g r a d a t i o na 1 1 da d s o 叩t i o no fa c t i v a t e ds l u d g el e a dt os a t i s 黟i n gr e m o v a l r a t e i nt h i s s t u d y ，p o l y m e r a s e c h a i l lr e a c t i o n - d e n 籼i n g铲a d i e n t g e l e l e c t r i d p h o r e s i s ( p c r - d g g e ) a 1 1 dn u o r e s c e n c ei ns i t eh y b r i d i z a t i o n ( f i s h ) w i t ho l i g o n u c l e o t i d ep r o b e s 、v e r e u s e dt oi n v e s t i g a t em i c r o b i a lc o m m 疵t ) ，s t r u c t u r ei na c t i v i t i e ds l u d g eo f a or e a c t o r i ti sf o u n dn l a tw i t hc o n c e n t r a t i o nc h a n g e so fn p l o e oi i lr a ww a t e rs t n l c t u r eo f m i c r o b i a ln o r aw i l lc h a n g et o o t h en u m b e ro fb a n d si nd g g e 埘ud e c r e a s e h o w e v e r ，w i t h t h es t a b i l i t ) ，o fc o n c e n t r a t i o no fn p i o e o ，d i c ec o e 街c i e n to ft h et w op o o l sw i l li n c r e a s e t h e s t r l j c t u r eo fm i c r o b i a lf l o r a 晰l lb er e l a t i v e l ys t a b l e 加1 du h i m a t e l y 、v eg e tt h ei i l i c r o b i a ln o r a t h a ta d a p tf o rd e g r a d a t i o no fn pl o e oa n di t si n t e n n e d i a t ep r o d u c t s m e m b e r so fg 跗u n a t t t 东北大学硕士学位论文a b s t r a c t s u b c l a s so f 尸加胞d 6 a c 胞r 砌、v e r ep r e s e n ti nl o wn u m b e r si na l la c t i v a t e ds l u d g es 锄p l e s e x 锄i n e d ，s u g g e s t i n gt h a to i l l yb a c t e r i aa m l i a t e dw i t ht h eb e t as u b c l a s so f 办d 胞d 6 口c 纪厂施 m a yh a v eas p e c i f i cr o l ei nn p l o e od e 铲a d a t i o n ， k e yw o r d s ：n o n y l p h e n o le t h o x y l a t e ；a c t i v e ds l u g e ；p o l y m e r 2 l s ec h a i nr e a c t i o n d e n 枷n g 铲a d i e n tg e le l e c 仃o p h o r e s i s ；f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ；c o m m u l l i t ys t m c t u r e i v 东北大学硕士学位论文 目录 目录 独创性声明。i 摘要 a b s 缸a c t i 第l 章绪论1 1 1 环境激素概述1 1 1 1 环境激素的危害1 1 1 2 壬基酚聚氧乙烯醚附p i 正o ) 2 1 2 活性污泥及其微生物群落对n p n e o 的降解一2 1 2 1 活性污泥法2 1 2 2 活性污泥指标3 1 2 3 活性污泥对n p i l e o 的降解5 1 3 分子生物学技术在环境微生物群落结构分析中的应用6 1 4 选题背景和研究内容7 第2 章n p n e o 及其生物降解9 2 1n p n e o 的结构和性质9 2 2n p n e o 的初级生物降解1 0 2 3n p n e o 的最终生物降解1 2 2 4n p i 也o 的生物降解途径13 2 5 降解n p i l e o 的微生物1 4 第3 章活性污泥的培养及其对瑚o 的降解1 5 3 1 实验装置与仪器1 5 3 1 1 实验装置1 5 3 1 2 实验主要仪器1 5 3 2 实验内容及步骤1 6 3 2 1 活性污泥培养一1 6 3 2 2n p n e o 的降解1 6 3 3 实验检测项目及方法17 3 3 1 水质指标检测17 东北大学硕士学位论文 目录 3 3 2 活性污泥状态的检测1 8 3 4 实验结果及分析18 3 4 1 活性污泥培养阶段1 8 _ 3 4 2n p n e o 降解阶段2 2 第4 章降解n p n e o 的活性污泥中优势菌群的检测2 7 。 4 1 实验中采用的1 6 sr d n a 分子生物学分析技术2 7 4 1 1d n a 的提取和纯化2 8 4 1 2 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 技术2 9 4 1 3 琼脂糖凝胶电泳分析技术3 3 4 1 4 变性梯度凝胶电泳( d e n a n l r i n gg r a d i e mg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 3 3 4 1 5p c r 产物克隆技术3 5 4 1 6d n a 测序及微生物分类鉴定3 5 4 2 实验内容及技术路线3 6 4 3 实验材料与方法3 6 4 3 1 污泥样品的采集及预处理3 6 4 3 2 样品中d n a 的粗提、检测与纯化3 6 4 3 3p c r 扩增3 7 4 3 4d g g e 分析3 8 4 3 51 6 sr d n a 片段的克隆4 0 4 3 6 测序及后续分析4 2 4 3 7 主要实验仪器4 2 4 4 实验结果及分析4 3 4 4 1 取样条件4 3 4 4 2 总d n a 的提取与纯化4 3 _ 4 4 3p c r 扩增结果4 5 4 4 4d g g e 分析结果4 5 4 4 4 5 部分优势菌群的l6 sr d n a 片段测序结果及入库比对4 8 第5 章活性污泥中微生物茵群结构变化4 9 5 1 实验中应用的荧光原位杂交( f i s h ) 技术4 9 5 1 1f i s h 技术的基本原理4 9 5 1 2 探针选择5 0 i 东北大学硕士学位论文目录 5 1 3 荧光染料5l 5 1 4 显色和检测5 l 5 2 实验内容和技术路线5 2 5 3 实验材料与方法5 2 5 3 1f i s h 实验方法。5 2 5 3 2f i s h 所用试剂5 3 5 - 3 3f i s h 结果检测一5 6 5 4 实验结果及分析5 6 5 4 1 样品的选取5 6 5 4 2f i s h 实验结果与分析5 6 第6 章结论、讨论与建议“l 6 1 结论6 1 6 2 讨论与展望6 1 参考文献6 3 致询 7 1 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 1 1 环境激素概述 第1 章绪论 早在1 9 7 7 年，日本学者就提出了“环境激素”这个词，但没有引起广泛的注意。 直到1 9 9 6 年，美国波士顿环境报记者安达玛诺斯基在所著的被夺去的未来 一书中才把环境激素这一概念明确提出来【l 】。但是，环境激素的产生却始于2 0 世纪3 0 年代，当时人们采用人工合成的方法生产雌性激素用作药品，这种合成雌性激素在诞生 的同时就被指出有导致恶性肿瘤的危险。随着工业的发展，大量环境激素在制药、塑料 制品添加剂生产、除草剂的使用和垃圾处理等过程中不断释放，对生态环境造成了巨大 危害。环境激素不易分解，可在食物链中循环，又可随风飘散。因此，不管其原生地在 哪里，都会形成区域性或全球性的威胁，让人闻之色变的二恶英，就是环境激素中的一 种。 1 1 1 环境激素的危害 环境激素不仅作用于动物，而且也能够影响人体健康。人类合成的许多化学品都具 有致癌、致畸、致突变的毒性，8 0 的人类肿瘤与化学品致癌有关。环境激素对动物体 及人类健康的影响主要表现为【2 ，3 】： ( 1 ) 影响机体正常的内分泌功能：环境激素进入机体，作用于生物体的生殖腺，造成 生殖器官异常，其后果是生殖力降低，特别是母亲在怀孕和哺乳的过程中，只需要“超 微量”的剂量，对于婴幼儿的危害就将可能是毁灭性的和无可挽回的，所以欧美各国将 防治环境激素物质污染的主要保护人群确定为婴幼儿。它们还可能通过干扰生殖系统和 内分泌系统的激素分泌，造成雄性生物体的雌性化，如精子数减少、精子质量下降、睾 丸发育中断、永久性性功能障碍、性别的自我认知障碍等。 ( 2 ) 影响机体的免疫机能：免疫系统在环境激素的长期作用之下，会发生免疫失调和 病理反应，表现为生物体胸腺重量减少、t 细胞介导的免疫功能下降。还可能造成儿童 的免疫能力、智力和运动能力的永久性障碍，表现为多动症、痴呆、免疫功能低下等。 ( 3 ) 对生物体的神经系统产生毒害：直接作用于神经系统，可引起行为、精神的改变， 表现为生物体出现行为、学习及记忆障碍，影响注意力、感觉功能和精神发育异常，影 响大脑皮层、下丘脑、脑垂体等对激素分泌的调节作用。 ( 4 ) 致畸、致癌作用：环境激素作用于细胞的染色体，使染色体的数目或结构发生变 】- 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 化，从而改变携带遗传信息的某些基因，使一些组织、细胞的生长失控，产生肿瘤，造 成d n a 的不可修复性损伤，如它会导致雌性生物体的子宫、乳腺癌变畸形等。 ( 5 ) 蓄积和生物放大作用：环境污染物进入机体的速度和数量超过机体消除的速度或 ， 数量，造成环境污染物在体内不断积累的作用，在机体内的浓度会随着营养级的提高而 逐步增大。 ， 1 1 2 壬基酚聚氧乙烯醚仆田n e o ) 含羟基的酚类化合物是具有代表性的一类环境激素。到目前为止，已经列入环境激 素的典型酚类化学物质主要为：烷基酚( a 1 k y l p h e n o l s ，a p s ) 、氯酚( c l l l o r o p h e n 0 1 s ， c p s ) 、双酚a ( b i s p h e n o la ，b p a ) 、羟基联苯( h y d r o x yb i p h e n y l ) 等。这些酚类环境 激素有些是表面活性剂，有些为农药中除草剂类化学物质。其中烷基酚大量用于合成非 离子表面活性剂烷基苯酚聚氧乙烯醚，烷基苯酚聚氧乙烯醚广泛应用于洗涤用品和工业 加工助剂中，毒理实验证明烷基酚具有雌激素效应【4 】。 壬基酚聚氧乙烯醚( n o n y l p h e n o lp o l y e m o x y l a t e ，n p l l e o ，n _ 1 2 0 ) ，作为全球第二 大商用表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚的主要品种，广泛应用于人类生活与生产活动中 【5 6 】。废弃的n p i l e o 通过城市排水管网进入市政污水处理厂或自然水域，经排水管网中 的微生物、污水处理厂中的活性污泥以及自然水域中的生物降解后，转化为壬基酚二乙 基氧醚( n o n y l p h e n o ld i e t h o x y l a t e ，n p 2 e o ) 、壬基酚一乙基氧醚( n o n y l p h e n o l m o n o e t h o x y l a t e ，n p l e o ) 和壬基酚( n o n y l p h e n o l ，n p ) 【7 卅，而这三种聚合物则较难 被进一步降解，且容易被生物富集。研究显示上述三种物质均属于环境内分泌干扰物 ( e n v i r o n m e n t a le n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s ，e d c s ) 。此类聚合物在结构上与内源性 雌激素的1 7 p 雌二醇相似，可以直接与生物组织中的雌激素受体结合，产生雌激素样作 用1 0 m 】。然而由于n p i l e o 高效的去污能力及低廉的价格，目前全球范围内仍将其作为 主要的非离子表面活性剂而大量生产和使用，从而在自然界产生了大量的n p 2 e o 、 。 n p l e o 、n p 。因此，如何无害化处理n p i l e o 是近年来环境领域研究的热点。 ， 1 2 活性污泥及其微生物群落对n p l l e o 的降解 1 2 1 活性污泥法 活性污泥法是利用悬浮生长的微生物絮体处理有机废水的一类处理方法。这种生物 絮体叫做活性污泥，它由微生物( 包括细菌、真菌、原生动物和后生动物) 及其代谢的 2 - 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 和吸附的有机物、无机物组成，具有降解废水中有机污染物( 也有些可部分利用无机物) 的能力，显示生物化学活性。如果向一桶粪便污水连续鼓入空气，经过一段时间，由于 污水中微生物的生长与繁殖，将逐渐形成带褐色的污泥状絮凝体，即活性污泥，在显微 镜下观察，可见到大量的微生物。 活性污泥法的发展与应用已有近百年的历史，发展了许多行之有效的运行方式和工 艺沉程，但其基本流程是一样的，如图1 1 所示。 进水一韧次沉淀池雌曝气池一二次沉淀池一出康 jfi 流程中的主体构筑物是曝气池，废水经过适当预处理( 如初沉) 后，进入曝气池与 池内活性污泥混合成混合液，并在池内充分曝气，一方面使活性污泥处于悬浮状态，废 水与活性污泥充分接触；另一方面，通过曝气，向活性污泥供氧，保持好氧条件，保证 微生物的正常生长与繁殖。废水中有机物在曝气池内被活性污泥吸附、吸收和氧化分解 后，混合液进入二次沉淀池，进行固液分离，净化的废水排出。大部分二沉池的沉淀污 泥回流入曝气池进口，与进入曝气池的废水混合。污泥回流的目的是使曝气池内保持足 够数量的活性污泥。通常，参与分解废水中有机物的微生物的增殖速度，都慢于微生物 在曝气池内的平均停留时间。因此，如果不将浓缩的活性污泥回流到曝气池，则具有净 化功能的微生物将会逐渐减少。污泥回流后，净增殖的细胞物质将作为剩余污泥排入污 1 2 2 活性污泥指标 活性污泥法处理的关键在于具有足够数量和性能良好的活性污泥。活性污泥的数量 通常用污泥浓度表示，活性污泥的性能主要表现在絮凝性和沉淀性上。絮凝性良好的活 性污泥具有较大的吸附表面，废水的处理效率较高；沉淀性能好的污泥能很好地进行固 液分离，二沉池出水挟带的污泥量少，回流的污泥浓度较高。 实践表明，絮凝性好的污泥，沉淀性不一定良好。象处于膨胀阶段的活性污泥，由 于絮凝体内含水能力特别强，密度小，因此难以沉淀和压缩。但是，通常可以说，沉淀 性良好的污泥，絮凝性一定良好。因为沉淀性良好就意味着活性污泥内分散的微生物和 3 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 细小的有机颗粒能够较好的凝聚成大的颗粒，这样的活性污泥的絮凝性一定良好。 衡量活性污泥数量和性能的指标主要有以下几项： ( 1 ) 污泥沉降比( s v )指一定量的曝气池混合液静置3 0 m i n 后，沉淀污泥与原混 合液的体积比( 用百分数表示) ，即 污泥沉降比c s v ) = 塑堕塑丝垒塑凑霎要磊蔫乒燮 ( 1 ) 活性污泥混合液经3 0 m i n 沉淀后，沉淀污泥可接近最大密度，因此，以3 0 m i n 作为 测定污泥沉淀性能的依据。沉降比同污泥絮凝性相沉淀性有关。当污泥絮凝性与沉淀性 良好时，污泥沉降比的大小可间接表示曝气池混合液中污泥数量的多少，故可以用沉降 比作指标来控制污泥回流量及排放量。但是，当污泥沉淀性差时，污泥不能下沉，上清 液混浊，所测得的沉降比将增大。通常，曝气池混合液的沉降比正常范围为1 5 3 0 。 ( 2 ) 污泥浓度指1 l 混合液内所含的悬浮固体( 常表示为m l s s ) 或挥发性悬浮固 体( m l v s s ) 的重量，单位为g l 或m g l 。污泥浓度的大小可间接地反映混合液中所 含微生物的浓度。一般在活性污泥曝气池内常保持m l s s 浓度在2 “g l 之间，多为 3 4 9 l 。 m l s s 表示微生物量是不准确的，因为它包括了活性污泥吸附的无机惰性物质，这 部分物质没有生物活性。m c k t 皿e y 指出，在生活污水活性污泥法处理中，m l s s 中只有 3 0 5 0 为活的微生物体，而在延时曝气法中此比例降为1 0 以下。采用m l v s s 来表 示，也不能排除非生物有机物及已死亡微生物的惰性部分。然而，在正常的运转状态下， 一定的废水和废水处理系统，m l s s 与m l v s s 之间以及m l s s 与活性微生物量之间具 有相对稳定的相关关系。因而在没有更精确的直接测定活细胞量的方法以前、用m l s s 或m l v s s 间接代表微生物浓度还是可行的。目前用得最多的是m l s s 。 ( 3 ) 污泥容积指数( s v i ) 指曝气池混合液经3 0 m i n 沉淀后，lg 干污泥所占有沉淀 污泥容积的毫升数，单位为m l 儋，但一般不标注。s v i 的计算式为： s 玎：兰堕亘坌垫兰：! q( 1 2 ) m l s s ( 矶) 、7 例如，曝气池混合液污泥沉降比( s v ) 为2 0 ，污泥浓度为2 5 l ，则污泥容积指 数为： s 玎：丝坐：8 0 2 5 在一定的污泥量下，s v i 反映了活性污泥的凝聚沉淀性。如s v i 较高，表示s v 值 较大，沉淀性较差；如s v i 较小，污泥颗粒密实，污泥无机化程度高，沉淀性好。但是， 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 如s v i 过低，则污泥矿化程度高，活性及吸附性都较差。通常，s v i 2 0 0 时，沉淀性较差，污泥易膨胀。 一般常控制s v i 在5 0 1 5 0 之间为宜，但根据废水性质不同，这个指标也有差异。 如废水溶解性有机物含量高时，正常的s v i 值可能较高；相反，废水中含无机性悬浮物 较多时，正常的s v i 值可能较低。 1 2 3 活性污泥对n p n e o 的降解 活性污泥的结构和功能的中心是能起絮凝作用的细菌形成的细菌团块，称为菌胶 团。其上生长着其他微生物，如酵母菌、霉菌、放线菌、藻类、原生动物和其他某些微 型后生动物( 轮虫、线虫等) 。因此，曝气池内的活性污泥在不同的营养、供氧、温度 及p h 值等条件下，形成由最适宜增殖的絮凝细菌为中心，与多种多样的其他微生物集 居所组成的一个生态体系。活性污泥的主要细菌( 优势菌) 来源于土壤，水和空气。它 们多数是革兰氏阳性菌，如动胶菌属和从毛单胞菌属。 性能良好的活性污泥中的原生动物主要有钟虫属、累枝虫属、盾纤虫属、盖虫属、 聚缩虫属、内管虫属、各种轮虫类以及吸管类的固着类生物或匍匐性生物。在这种情况 下，絮凝体的尺寸多为5 0 0 1 0 0 0 m 左右。 性能不好时出现的原生动物主要有波豆形属、弹跳虫属、屋滴虫属、豆形属及草履 虫属等快速游泳的种属。当这些生物出现时，絮凝体一般很小，在1 0 0 哪左右。一般 来说，当活性污泥状态不好时，只有波豆虫属和屋滴虫属出现，而活性污泥极端恶化时， 原生动物和后生动物也随之消失【l 引。 因此，通过观察活性污泥中的生物相，也可以反映活性污泥的性能，特别是原生动 物及微小后生动物比较容易鉴别和计数。因而在活性污水处理的运行管理中应将其作为 重要的判断项目来进行观察1 1 4 】。 一些研究表明城市的污水排放系统与活性污泥法的污水处理设施对n p n e o 具有一 定的降解能力。j y h u 等人在某城市污水处理厂进水中检出的n p n e o 的总浓度为 1 7 4 眦o l l ，其中n p 2 e o 、n p l e o 、n p 的总浓度为1 4 4 o n m o 儿，说明大部分的n p n e o 在排水管网中已经被降解成n p 2 e o 、n p l e o 、n p 。而在对该污水处理厂处理水的检测 中发现n p 2 e o 、n p l e o 、n p 的总浓度为4 3 9 m n o 。，n p 2 e o 、n p l e o 、n p 的总降解 率为7 1 【9 】o 这一结果提示，城市排水系统的缺氧环境具有将n p l l e o 从高聚合物降解 为低聚合物n p 2 e o 、n p l e o 、n p 的功效，而城市污水处理厂的好氧环境发挥了进一步 降解n p 2 e o 、n p l e o 、n p 的作用。 5 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 另一方面，k k o m o r i 等人在研究活性污泥对n p i l e o 的降解时发现，在缺氧条件下 n p 2 e o 和n p l e o 有较高的n p 转化率，而在好氧条件下，部分n p 2 e 0 、n p l e o 、n p 被 进一步降解了，且n p 的分解速度( o 0 8 9 o 1 7 g v s s d ) 大于n p 2 e o 的分解速度 ( 0 0 1 9 o 0 3 8 9 g v ss d ) 【l o 】。特别地，在缺氧、好氧两种工艺反复操作条件下，n p l e o 和n p 2 e o 有可能完全转变成n p 。 1 3 分子生物学技术在环境微生物群落结构分析中的应用 传统的微生物分析测定技术，如显微镜观察、选择性培养基计数、纯种分离等技术， 由于方法本身的局限性，很难真实准确地反映出环境微生物中细菌的种类和数量。同时， 对于环境样品的培养分离，周期较长、工作量大，且培养基的选择性对微生物原有种群 结构会有影响和破坏。分子生物学方法与传统的分离培养方法相比，在研究微生物群落 结构组成时，有很大的优越性。分子生物学技术是以微生物的核酸( 基因组d n a 或i 矾a ) 序列为依据，通过分析环境样品中核酸分子的种类和数量来反映其微生物群落结构中各 种群的种类和数量。由于每种微生物细胞都具有独特的核酸分子，其序列组成也有各自 独特的特征，因此，通过直接从环境样品中提取所有微生物的核酸( 基因组总d n a 或 r n a ) ，依据核酸序列的不同，分析这些d n a 或i a 的种类和相对数量，就可以反映 出微生物的种类组成以及种群数量的比例情况，从而对微生物的群落结构得到一个比较 全面、客观的认识。近年来，分子生物学技术在微生物群落结构分析中的应用主要包括： ( 1 ) 克隆文库分析 在分析环境样品中核酸分子的种类和数量时，由于直接提取的核酸分子的量很少， 不能用于直接分析，一般是通过p c r 扩增和构建克隆文库的方法。即先从环境样品中 提取出微生物基因组总d n a ，然后用携带了物种进化信息的标记基因( 常用的是核糖 体r n a 基因) 的通用引物或种属特异性引物对微生物基因组总d n a 进行p c r 扩增。 p c r 扩增产物与载体连接后，转化至大肠杆菌，得到大量的转化子。这些转化子就组成 了一个克隆文库，每个转化子都含有一个标记基因的序列。通过对文库各转化子序列的 测定，就可以知道该环境样品中这些基因的种类和相对数量，从而获得群落组成的信息。 ( 2 ) 探针杂交技术 每一种微生物都具有与其他微生物不同的、独特的核酸片段，通过分离和鉴定这些 片段就可制备出核酸探针。单链d n a 探针在与其互补的r n a 或d n a 相遇时，两者的 互补片段在一定条件下能退火形成氢键，形成稳定的双链结构，此即为核酸杂交。根据 这个原理，以一条特异标记( 荧光、同位素或d i g 等) 的核酸片段为探针，就可以检测 6 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 出另一条靶核酸序列的存在。该技术在微生物群落结构研究中起了重大作用。如荧光原 位杂交( n u o r e s c e n ti ns i 仉h y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 技术、基因芯片( g e n ec b j p ) 技术等。 ( 3 ) 遗传指纹图谱分析 该方法是将代表微生物群落结构的核酸分子进行各种形式的凝胶电泳，从而将代表 微生物群落中的各种不同种群的核酸分子分开。凝胶电泳中各微生物群落核酸分子的迁 移行为就构成了该群落特异的指纹图谱。该方法的一大优点是可以同时对比大量的微生 物群落样品。如核糖体d n a 扩增片段的限制性内切酶分析( 锄p l i f i e d 曲o s o m a ld n a r e s t r i c t i o na n a l y s i s ，a r d r a ) 、变性温度梯度凝胶电泳分析( d e n a n 鹏献e m p e r a t l 脱g r a d i e n t g e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e t g g e ) 、单链构象多态性分析( s i n g l es t r 锄dc o n f o m a t i o n a l p o l y m o r p h i s m ，s s c p ) 、末端限制性片段长度多态性分析( t e m i n a lr e s t r i c t i o n6 a g m e n t l e n g t hp o l y m o 啦i s m ，t - i 心l p ) 、核糖体基因间隔序列分析( 曲o s o m a li n t e 唱e n i cs p a c e r a i l a l y s i s ，s a ) 、随机扩增多态性d n a 分析( r a l l d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p m cd n a ， r a p d ) 、磷脂脂肪酸图谱分析( p h o s p h o l i p i df a t t ) ，a c i d ，p l f a ) 等技术都被广泛应用于微 生物群落结构的分析。 1 4 选题背景和研究内容 随着社会的发展和人们生活水平的不断提高，人们也更加关注与我们的生活密切相 关的环境污染问题。由于壬基酚聚氧乙烯醚型非离子表面活性剂的广泛应用，大量 n p i l e o 在使用后通过污水处理厂或直接排放到环境中，尤其水体环境中，引起水体的 污染，有关n p i 也o 降解中间体n p 、n p l e o 等具有雌激素效应的报道也比较多。但目 前关于n p n e o 在环境中的生物降解仍存在很多争议，n p i 也o 在环境中生物降解途径还 不明确，目前国内对于利用活性污泥法降解n p n e 0 的能力还没有过多研究，对活性污 泥中降解n p i 正o 的微生物菌群结构的研究也不深入。 本课题在实验室条件下，采用o 工艺活性污泥反应器，进行活性污泥的培养及处 理含n p n e o 污水的模拟试验。在试验过程中监测各项数据：进出水的c o d 值、以及污 泥沉降比s v 3 0 、混合液悬浮固体m l s s 。采用合适的温度、p h 值、d o 、污泥龄和日进 水量等工艺参数，研究o 工艺对n p n e o 的处理效果。利用分子生物学手段分析研究 活性污泥内的微生物菌群结构在处理n p i l e o 前后的变化。实验主要内容有： ( 1 ) 通过控制p h 值、温度、溶解氧等环境条件逐步培养出状态良好的活性污泥。 ( 2 ) 利用o 工艺降解n p l o e o ，检测各种常规水质，分析n p l o e o 对活性污泥状态 和水质的影响。同时检测n p l o e o 浓度的变化趋势，分析n p l o e o 的去除率以及微生物 7 东北大学硕士学位论文第1 章绪论 降解效果。 ( 3 ) 采用p