（应用化学专业论文）手性农药对映体的高效液相色谱拆分及其热力学研究.pdf

手性农药对映体的高效液相色谱拆分 及其热力学研究 摘要 由于手性农药对映体空间结构的差异，导致许多手性农药进入生态环 境后其各对映体在环境生物体内的活性、代谢和毒性存在着差异性，在环 境中的持久性和对环境的生化过程影响通常也存在着差异，因此，手性农药 对映体的分离分析具有非常重要的意义。在过去二十多年里，利用高效液 相色谱手性固定相法进行对映体拆分取得了巨大的进展，成为获得光学纯 化合物及其分析的确实可行的方法。但是高效液相色谱手性固定相法的拆 分机理仍然不是很清楚，特别是国内在这方面的研究尚未成熟。本文以高 效液相色谱手性固定相法利用直链淀粉三一( 3 ，5 2 甲基苯基氨基甲酸酯) ( a d r h 柱) 和纤维素三一( 3 ，5 - - 2 甲基苯基氨基甲酸酯) ( o d 。r h 柱) 作 - 为固定相，考察并讨论了流动相组成、流速和柱温对喹禾灵、敌草胺、禾 草灵、异丙甲草胺和甲霜灵手性农药对映体拆分的影响，并对其热力学拆 分机理进行了研究。 实验结果显示，手性农药喹禾灵在手性a d r h 柱上取得了良好的对映 体拆分，而在o d r h 上无法实现分离；禾草灵在a d r h 上无法实现对映 体分离，而在o d r h 上取得了较好的拆分；敌草胺、异丙甲草胺和甲霜灵 在a d r h 和o d r h 上都能较好地实现对映体拆分。上述能实现分离的手 性农药的分离度( 黜) 一般都能达到1 5 左右。 本文还对喹禾灵在a i d r h 上，敌草胺和甲霜灵在a d r h 柱和o d r h 上的色谱拆分热力学机理进行了研究，通过对其热力学函数的分析和计算， 解释了色谱拆分机理，并分析比较了上述手性农药在a i d r h 柱和o d r h 柱上的热力学拆分结果，为评价手性柱( 特别是a d r h 和o d r h 柱) 的 拆分性能及其热力学拆分机理研究提供了一定依据。 关键词手性拆分，对映体，热力学，手性固定相，手性农药， 高效液相色谱 i i s t u d yo nt h ee n a n t i o m e r s e p a r a t i o nb yh p l c a n dt h e r m o d y n a m i c sm e c h a n i s mo f c h i r a lp e s t i c i d e t h e r ea r eb i gd i f f e r e n c e so fa c t i v i t i e s ，m e t a b o l i z a t i o na n dt o x i c i t yf o rt h e e n a n t i o m e r so fac h i r a lp e s t i c i d ei nt h ee n v i r o n m e n tb e c a u s eo ft h ed i f f e r e n t s t e r e o c h e m i s t r i e s a l s ot h e i re n d u r a n c e sa n de f f e c t so fb i o c h e m i c a lp r o c e s si n t h ee n v i r o n m e n ta r ed i f f e r e n t t h e r e f o r e ，r a p i da n ds e n s i t i v em e t h o d sf o rt h e r e s o l u t i o na n dq u a n t i f i c a t i o no ft h ei n d i v i d u a lo p t i c a l l yp u r ee n a n t i o m e r sa r eo f g r e a ti m p o r t a n c e c h r o m a t o g r a p h i cm e t h o d sh a v eb e c o m eo fc o n s i d e r a b l e i n t e r e s ti nr e c e n ty e a r s ，e s p e c i a l l yi nt h ep a s t2 0y e a r s b u tm a n yc h i r a l r e c o g n i t i o nm e c h a n i s m sf o re n a n t i o m e r sa r en o tc l e a ra n di no u rc o u n t r yt h e r e l a t i v er e s e a r c hi su n d e r w a y i nt h i sp a p e r , s o m ep e s t i c i d ee n a n t i o m e r sw e r e s e p a r a t e d ， s u c ha s q u i z a l o f o p - e t h y l ， n a p r o p a m i d e ，d i c h l o f o p 。m e t h y l ， m e t o l a c h l o ra n dm e t a l a x y lb ya d r ha n do d r hc h i r a l c o l u m n s t h e e n a n t i o m s e p a r a t i o na n dt h e r m o d y n a m i c sm e c h a n i s mo ft h ec h i r a lp e s t i c i d e s w e r es t u d i e d t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e s o l u t i o no fq u i z a l o f o p e t h y lw a s g o o dw h i l eu s i n ga d r hc o l u m n ，b u ti tc a n tb es e p a r a t e do no d - r h c o l u m n d i c h l o r o p m e t h y lc a n n o tb es e p a r a t e db ya d - r hc o l u m n ，b u tt h e r ew a sg o o d r e s o l u t i o nw i t ho d r hc o l u m n n a p r o p a m i d e ，m e t o l a c h l o ra n dm e t a l a x y lc a l l b es e p a r a t e dw e l lb yb o t ha d r hc o l u m na n do d r hc o l u m n g e n e r a l l y i l l s p e a k i n g ，t h er e s o l u t i o n so ft h ea b o v ec h i r a lp e s t i c i d ew e r em o r et h a n1 5 i nt h i sp a p e r , t h es e p a r a t i o nm e c h a n i s mo fq u i z a l o f o p e t h y lo na d r h c o l u m n ，n a p r o p a m i d ea n dm e t a l a x y lo na d - r hc o l u m na n do d r i dc o l u m n w e r er e s e a r c h e dw i t ht h e r m o d y n a m i c s f o rc o m p a r i n gt h ed i f f e r e n c eo f s e p a r a t i o nc h i r a lp e s t i c i d e so na d - r hc o l u m na n do d r hc o l u m nc s p st h e t h e r m o d y n a m i c sm e a n sw e r eu s e d ，w h i c hw i l lb eu s e f u lt ov a l u ec h i r a lc o l u m n a n dt or e s e a r c ht h e r m o d y n a m i c sm e c h a n i s m k e yw o r d sc h i r a ls e p a r a t i o n ，e n a n t i o m e r , t h e r m o d y n a m i c s ，c s p , c h i r a lp e s t i c i d e ，h p l c i v 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江 工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的 法律责任。 作者签名：多侠世潍 日期：沙年4 月届日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密画，在加pg 年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作：阀彤 导师签名： 日期：五尹6 年犀月6 日 日期：年月日 浙江工业大学学位论文 第一章文献综述 1 1 手性分离的意义 对映体( e n a n t i o m e r s ) 3 l 称为手性异构体或旋光异构体。对映体中所有原子的连接顺 序相同，而原子在空间的排列方式不同，它们之间互为实物和镜像关系【1 1 对映体分为 二类：1 含有手性中心的化合物( 如图1 - 1 含有手性中心的对映体的镜像) ；2 含有手 性轴和手性面，但没有手性中心的化合物【2 j 如图1 - 2 无手性中心的对映体的镜面) 。 k h 一 寤 静凇饼；嬲 图1 1 含有手性中心的对映体的镜像 f i g 1 1m i r r o ri m a g eo fe n a n f i o m e r sw i t hc h i r a lc e n t e r 图1 - 2 无手性中心的对映体的镜面 f i g 1 - zm i r r o ri m a g eo fe n a n t i o m e r sw i t h o u tc h i r a lc e n t e r 对映体化合物由于分子中存在不对称因素，不能互相重合，就象人的左手和右手 关系，因此这类不能重合的分子又叫做手性分子。 手性分子具有一种特殊的物理性质旋光性。但其它物理性质( 如熔点、沸点、 折射率) 和红外等( 由对称的物理能产生) 的吸收光谱则完全相同。 虽然对对映体的结构和物理性质是如此的相似，但是对映体的药效和活性却截 然不同。许多研究表明，含有手性中心的药物，其药效与分子的立体构型有密切关系。 往往一种立体异构体有药效，而它的镜像分子则药效很小，甚至完全没有药效或具有 相反的药效( 3 1 。早在1 9 9 2 年，美国f d a 就规定：对于含有手性因素的药物倾向于发展 单一对映体产品。后来又表示鼓励把已在销售的外消旋药物转化为手性药物；对于申 请新的外消旋药物，则要求对两个对映体都必须提供详细的生理活性和毒理数据，而 不得作为相同物质对待。据美国c & e n 刊物报道，全球单一对映体药物的生产与销售 持续增长。1 9 9 9 年销售额为9 6 4 亿美元。2 0 0 0 年销售额突破1 0 0 0 亿美元，达1 2 3 0 亿 美元。到2 0 0 1 年，手性药物销售额已达1 4 7 2 亿美元。按1 9 9 8 年的统计，全球最畅销 浙江工业大学学位论文 的5 0 0 种药中，以单一异构体销售的手性药物占1 2 以上，占其总销售额的5 2 。 随着生命科学和有机立体化学的发展，提供疗效高、毒副作用小的光学纯药物已 成为现代药物研究的重要内容。生物体内的手性环境，如酶、受体、抗体等与药物对 映体的生物活性密切相关，药物对映体和它们的代谢物常常表现出不同的药理和药代 特性，使用外消旋体药物可能导致错误的药代行为和作用模式。对映体污染造成的最 可怕后果是上世纪6 0 年代外消旋体药物反应停的使用，虽然r 型反应停具有镇静 作用，但s 型却可导致畸胎【4 j 】。然而这一危险对许多外消旋体药物来说是潜在的，如 乙胺丁醇和青霉胺，实验己经证明，用于治疗结核病的乙胺丁醇，其r 型可以致盲， 而用于治疗风湿病的青霉胺，其r 型可引起中毒【6 】。另外，有些药物对映体在生物体内 可发生特异转化，如生理、药理活性较低的r ( 一) 型布洛芬和r ( ) 型非诺洛芬在人体 内转化为s ( + ) 型布洛芬和s ( + ) 型非诺洛芬， 对于杀虫剂、杀菌剂、昆虫性信息素、 而s ( + ) 型具有较高的生理和药理活性。 植物生长调节荆、食品添加剂、香料等精 细化学品，其分子的光学异构体也表现出不同的生理活性。如( + ) 一2 一芳氧基苯酯 类农药对紫苜蓿有良好的除草活性，而( 一) 一2 一芳氧基苯酯类农药的对映体却无此 活性f 丌。有机磷农药氧代苯硫磷中低杀虫活性的( s ) 异构体却有高的神经延迟作用， 而高杀虫活性的( r ) 异构体则无此作用【8 ，川；( r ) d i n i c o n a z o l e 比( s ) d i n i c o n a z o l e 有 高的杀菌活性，而( s ) 异构体比( r ) 异构体有较强的植物生长调节功能；保幼激素 类农药都是天然构型最有效，如：天然激素( i o r ，1 1 s ) 。j h i 的活性比e n t j i l l 大约高 1 2 0 0 0 倍f 1 0 1 ；对于昆虫信息素类则立体构型与生物活性之间的关系更为复杂【1 1 】 在材料科学中，近十几年来新诞生的旋光分子材料显示出了这类材料的性能与其 立体构型的密切关系。由旋光性单体聚合而成的旋光高聚物与相应的外消旋单体的聚 合物相比，具有许多特殊令人赶兴趣的性质。例如，a 取代或o 取代的旋光性丙内酯聚 合物熔点总是比相应外消旋聚合物高得多。1 0 0 光活性的p 一三氯甲基一p 一丙内酯聚 合物熔点高达2 7 5 ，而相应的外消旋体在相同条件下得到的聚合物接近2 0 0 便分解 了【1 2 】。l 乳酸单体中混有8 d - - 孚l 酸时，相应的聚合物熔点降到1 2 4 c 1 3 】。 无论从药物单一对映体的销售额逐渐提高和显示出不同药效、农药等精细化学品 单一对映体的不同活性，还是材料科学中旋光材料的兴起。都显示了拆分外消旋体的 重要性。 目前拆分方法主要有直接结晶法、化学法、色谱法和生物法，其中发展撮快、应 2 浙江工业大学学位论文 用最广的是高效液相色谱( h p l c ) 法，它是药物质量控制、立体选择性的药理学和毒理 学研究的重要手段。从上世纪7 0 年代开始，特别是近些年来，h p l c 在手性研究中取 得了令人瞩目的进展。 1 2 手性拆分方法 迄今在实验室或工业领域中使用的手性拆分技术主要分为6 类【“，1 s 】：直接结晶拆分 法、化学拆分法、动力学拆分法、色谱拆分法、手性膜拆分法和萃取拆分法。现简介 如下。 1 2 1 直接结晶拆分法 1 4 】 此法包括：1 ) 晶体机械分离拆分法：两种对映体分别析出的宏观晶体足够大，可 以借助工具人工分离。2 ) 手性溶剂结晶法：利用外消旋体的两个对映体与手性溶剂的 溶剂化作用力的差异。3 ) 接种晶体析解法【1 5 1 6 】；在一个外消旋混合物的热饱和溶液中 加入纯对映体之一的晶种，然后冷却，则同种对映体将附在晶体上析出，滤去晶体后， 母液重新加热，并补加外消旋混合物使之饱和，然后加入另一种对映体的晶种，冷却 使另一种对映体析出。 1 2 2 化学拆分法【1 7 1 8 】 包括：1 ) 经典成盐拆分法：通过化学反应的方法，用手性试剂将外消旋体中的两 种对映体转化为非对映异构体，然后利用非对映体之间物理性质和化学性质的不同将 两者分开。拆分成功的关键是选择合适的拆分剂( 如图1 3 外消旋体经典成盐拆分法步 骤) 【1 9 1 。2 ) 包结拆分：主要利用主一客体分子之间存在很强的分子识别作用，而使得 手性化合物通过氢键及分子间次级键作用选择性地与菜一个对映异构体形成稳定的包 结络合物而析出，从而实现对映体的分离。由于主一客体分子之间不发生任何化学反 应，因而很容易通过溶剂交换过程以及逐级蒸馏等手段实现主体与客体的分离，使得 溶剂可以重复使用。但其方法存在一些严重缺陷 2 0 l ( 例如难以得到纯的手性衍生化试 剂，且价格昂贵) 。 3 浙江工业大学学位论文 赴澄旋底毖 i 碰签塾主塞翅：遮翘建垒塑 l 厂 硷瘟塑；堑边遮麴 图1 - 3 外消旋体经典成盐拆分法步骤 f ig 1 - 3t h et y p i c a lp r o c e s so fr a c e m is mc h i r a ls e p a r a ti o nw i t hs a lt 1 2 3 动力学拆分【2 1 勿 经典动力学拆分是基于两个对映异构体对于某一反应的动力学差异。根据所使用 的手性试剂或催化剂的不同，可将反应分为酶法和化学法。1 ) 酶法【2 3 1 ：由于酶本身就 是一个手性催化剂，能选择性地作用于对映异构体中的某一异构体而对另一异构体则 不起作用，从而起到拆分作用。另外酶催化的副反应很少、产率高、反应的条件也较 为温和，而且酶无毒、易降解、不会造成环境污染，这些都使得用酶拆分外消旋体成 为理想的选择。2 ) 化学法1 2 4 】( 区别于前面的化学拆分法，这里更强调的是在化学反应过 4 浙江工业大学学位论文 程中生成对映体的速度有差别，而前面指的是只生成其中的种对映体) ：当外消旋体 与某一手性试剂反应或在手性助剂存在下反应时，由于反应中生成的过渡态( 非对映 体) 不同而导致对映异构体反应速度的不同，因此通过选择手性试剂和控制反应进程 可以使其中的一个对映体转化成产物，而另一对对映异构体则不发生反应，从而达到 分离的目的。化学动力学拆分方法可采用等当量的手性助剂加反应试剂的方法，也可 直接使用手性催化剂。 1 2 4 色谱拆分法 1 4 , 2 5 , 2 6 1 色谱拆分法原理为：待分离的对映体与色谱中的手性选择器可逆地形成短寿命非 对映异构络合物，由于它们之间稳定性不同引起保留时间差异，从而达到分离目1 2 7 1 ( 区 别于动力学拆分的化学法，因为色谱拆分法是在色谱条件下进行的) 。其应用分为两类： 分析级水平和制备级水平。用于分析领域的色谱拆分法包括毛细管气相色谱、高效液 相色谱、超临界流体色谱、毛细管电泳以及胶带电动色谱等【1 7 】。在制备领域中，高效 液相色谱( h p l c ) 的应用较为广泛，已成为对映体拆分的重要手段之一1 2 5 1 。另外，手 性色谱技术在工业化生产中也正得到广泛的应用，其中最有希望的是模拟移动床 ( s i m u l a t e dm o v i n gb e d ，s m b ) t 。 1 ) 高效液相色谱：高效液相色谱在拆分对映体时通常有3 种方法：a ) 利用手性试 剂与被拆分物进行衍生化反应生成非对映异构体，从而可被传统的非手性h p l c 所拆 分；b ) 在流动相中加入手性添加剂，利用非手性固定相h p l c 进行拆分；c ) 利用手性 固定相( c s p s ) 的h p l c 进行拆分。其中最有效的方法是手性固定相法。c s p s h p l c 法之所以能拆分对映体，是因为在手性固定相与外消旋体相互作用时，其中一个对映 体与固定相生成不稳定的短暂的对映体复合物，造成在柱淋洗时保留时间不同，从而 达到拆分的目的。 2 ) 模拟移动床色谱：为了克服通常液相制备色谱不能连续操作以及大量溶剂浪费 等弱点，b r o u g h t o n 2 8 2 9 】于2 0 世纪6 0 年代提出了模拟移动床色谱技术( s m b ) 。所谓模拟 移动床色谱就是在色谱分离中模拟出固定相和流动相相对于进样口的循环流动。这样， 两种具有不同保留值的组分就会被固定相和流动相分别带向进样口两边，从而得到分 离。为达到这一目的，模拟移动床色谱由许多较短的色谱柱首尾相连而成。 5 浙江工业大学学位论文 1 2 5 手性膜拆分法 膜分离由于具有低能耗、稳定性强、易于连续操作等优点【3 们是大规模进行手性拆 分中比较有潜力的方法之一。手性拆分的膜系统可以分为3 类：第一类为用于专性 底物催化的膜系统；另外两类膜系统是以非专一性反应为基础的，一类为支撑液膜， 另一类为致密固膜。1 ) 支撑液膜：在支撑液膜中，具有手性选择能力的载体溶解子一 定的液体溶剂之中，通过与某个对映异构体特异性的结合，将其从上相运输到下相， 从而实现手性分离。在支撑液膜中，环糊精、酒石酸的衍生物、冠醚等都是常用的特 异载体。但支撑液膜的稳定性较差，其工业应用一直受到很大限制。s l m 的不稳定性 主要表现在两个方面，其一是流量下降，这主要是因为载体的流失；其二是膜两侧的 上下两相可以通过支撑膜较大的孔道接触。为了提高支撑液膜的稳定性，应尽量采用 不溶于水的溶剂与载体，支撑膜的孔径和溶剂的流量都尽可能的小，从而有效防止载 体的冲失。2 ) 致密固膜：为了克服液膜的不稳定性，致密固膜得到了很大的发展。在 固膜中，不同的异构体是通过选择性的吸附或扩散过程来完成穿膜过程的。因此，可 以将用于手性拆分的固膜分为：扩散性选择固膜及吸附性选择固膜j 。 扩散性选择固膜的形式一般有：( 1 ) 由带选择性并能自身支撑的高聚物组成，包 括带有大型手性侧链基团的聚合物( 聚甲硅烷丙炔、聚降冰片二烯 等) 以及具有手 性主链的聚合物( 手性多聚氨基酸、手性多聚苯基乙炔等) ；( 2 ) 由不能自身支撑但 具有选择性的高聚物涂抹在非选择性的支持层表面组成扩散选择性固膜一般都不带有 特殊的手性选择剂。扩散性选择形成的原因是一种对映体比另一种对映体在固膜中更 容易扩散。 吸附性选择固膜主要是利用嵌在聚合物母体中的手性选择剂来进行手性拆分的。 其手性拆分是基于待分离物与手性选择剂之间特殊的分子间作用。通常一种异构体被 较多地选择性吸附在手性选择剂上，而另一种异构体则较多地游离在聚合物母体之中。 吸附性选择固膜的制备方法大致分为两类，一种采用了分析分离中常用的手性选择剂， 包括环糊精、冠醚等。另一种则利用了新兴发展起来的分子印记技术。由于选择性与 透过通量之间的反相关系，扩散性选择固膜的应用受到了限制，只有通过扩大膜面积 或者增加平衡级数来弥补，但这在实际的应用中是很不经济的。而吸附性选择固膜比 6 浙江工业大学学位论文 扩散性选择固膜具有更大的工业应用前景，可以在选择性和透过通量两方面同时提高， 将使得吸附性选择固膜在手性拆分工业中的大规模应用成为可能。 1 2 6 萃取拆分法 萃取拆分法是将传统的溶剂萃取技术应用于外消旋体的拆分，与传统的的溶剂萃取 技术相比，除待拆分的外消旋体外，两互相接触的液相至少有一相要有旋光性【3 2 1 。 根据拆分体系的不同，可以分为1 3 3 】：1 ) 亲和萃取拆分方法：在亲和萃取拆分体系 中，外消旋体和拆分剂之间至少分别有两个作用点，这样一对外消旋体由于构型上的 差异，与拆分剂间形成的非对映体配合物稳定性便不同，其物理性质也就有差异；对 映体与拆分剂间的作用点越多，这种差异就越大，从而使对映体得以萃取拆分。2 ) 配 位萃取拆分法：该法使以手性试剂为配体与中心离子( 多数为过渡元素的离子) 形成 的配合物作萃取拆分剂，与对映体形成螯合物。由于对映体构型上的差异，所形成的 螯合物的稳定性不同，其物理性质表现出极大的差异，在两相间的分配行为表现不同， 从而实现对映体的拆分。3 ) 形成非对映异构体的萃取拆分法：分子手性相互作用会引 起非对映分子物化性质差异，其强度与溶剂有关。这这样利用手性试剂使对映体转化 成非对映体，依据非对映体物化性质的差异就可实现对映体拆分。 各种萃取方法各有利弊，但综合相比，萃取拆分技术和手性膜拆分具有低能耗、 高效率、连续化生产的优点，是今后发展的方向【3 3 】。 1 3 高效液相色谱手性固定相法 手性固定相法是利用待分离的对映体与色谱中的手性选择器可逆地形成短寿命非 对映异构络合物，由于它们之间稳定性不同引起保留时间差异，从而达到分离目的c s p s 法始于上世纪七十年代后期，自从w i l l i a m 和p i r k l e 在1 9 8 1 年【3 4 】成功应用手性固定相法 拆分t ( r ) - n ( 3 ，5 二硝基苯甲酰基) 苯甘氨酸以后手性固定相作为商品出售【3 引因为色 谱技术c s p 合成方法和拆分过程手性识别机理等方面的研究取得了巨大进展，手性固定 相法在最近几年得到了迅猛发展，并越来越成为解决立体化学问题的重要和有效手段。 7 浙江工业大学学位论文 手性固定相 k s ) 。色谱 过程的自由能变化可以表示成n 3 ： ， a g = 一r t l n k = 一r t l n ( k 审) 因此，不难导出： i n k = ( 一h r ) i t + s r 浙江工业大学学位论文 一r s g o = r tl n a = 一a r s ho + t a r sa s o 1 n 伐= ( - a r s h o r ) i t + a 。a s o r 式( 1 ) 、( 2 ) 表明i n k - - - 1 t 、i n a - - 一i t 呈线性关系，如图卜6 n 啪1 所示： ( 2 ) 图i - 6 温度对形成非对映异构分子络合物的热力学平衡常数和对映异构体选择性的影响 f i g 1 6t h ee f f c e t so ft e m p e r a t u r eo ne q i l i b r i u mc o n s t a n ta n dr e c o g n i s t i o no fd i e n a n t i o m e r s 在倒转温度t i 脚时，非对映异构分子络合物的热力学平衡常数k r = k s ，对映异构 体同时流出，在该温度时无对映异构体选择性， r , s = l ，理论上是由于： 1 n o t = ( 一r t s h r ) i t 十a r 。s a s r = 0 目n ( 一xr 。h r ) 1 t n w ：。s s r 1 - 、p ： 一r s a h = t i 。，a r s s 在该点的两边，温度对对映异构体选择性系数的影响刚好相反，而且溶质对映体 流出顺序相反。该点的右边，即：t t n v ，色谱手性识别过程为熵变占优势，随着温 度的升高，仅增大。在手性识别研究中，对映异构体流出顺序在不同温度下倒转的现象 迄今只有少量的报道。由于高效液相色谱的温度变化范围较窄，大多数情况下，t i 删不 在该温度范围内，并且t t i n v ，色谱手性识别过程焓变占优势，值随着温度的升高而降 低【1 恻。 2 4 浙江工业大学学位论文 手性色谱的对映体分离是一个复杂的色谱过程，p i r k l e t l 4 0 1 曾报道了l n k - - 一l f r 非线 性的实验结果。因此，在不同温度下得到不同的对映体流出顺序也可能是手性色谱保 留和拆分机理的改变造成的。 q o h r n h ，e 。0 ( c h 小一翰辆端 、一、 一h 、c h 3 c 黯 h 、，c h 剐( c h 3 ) 2 、一 。剁) 2 c 刳p 阡l k c o n h 搴：h 2 ) 5 1 i 3 图1 - 7n 一( 3 ，5 - - 硝基苯甲酰基) 一亮氨酸正己酰胺及所用手性固定相的结构 t a b l e 1 - 7t h es t r u c t u r eo fn 一( 3 , 5 一d i n i t r o b e n z o y l p h e n y l g l y c i n e ) a n dt h ec s p p i r k l e 5 8 1 和d a v a n k o v 等曾分别研究了手性色谱分离对映异构体选择性0 和非对映 异构体络合物自由能之差( a a g ) 之间的关系：a r = ，考虑到实际的色谱分, s a g r t l n a 离过程，非常小的热力学选择性a a g ，如果g = 0 0 2 4k j t o o l ，就可以得到一定的拆 分，o 【= 1 0 1 。随着a a g 的增加，对映体选择性将表现为相应的指数级增长。p i r k l e 等 用实验印证了这种关系【8 1 ，在图1 7 所示的c s p 上，用3 0 异丙醇正己烷为流动相， n ( 3 ，5 二硝基苯甲酰基) 亮氨酸正己酰胺的对趺异构体选择性测定值0 【= 1 0 5 ，其中( s ) 一 对映体保留较长，相互作用能之差g = 5 9 3k j m o l 。 h 。，c h 2 c h ( c h 3 ) 2 c h 3 ) 2 c h c h 2 ，h ，r ，v ，、 ( 0 2 n ) 2 c s h a c o n h 一c o n 一( c h 2 ) 5 一( c h 2 ) 5 嗍0 c n h c o c 一3 ( n 0 2 ) 2 图1 - 8 ( s s ) 。( r r ) 对映体化合物的结构 f i g 1 8t h es t r u c t u r eo f ( s s ) a n d ( r r ) e n a n t i o m e r 同样，对具有两个手性中心如图1 8 所示化合物的( s s ) ，( 黜u 对映体，可以预料： 由于手性中心相隔较远，与c s p 作用的自由能之差为2 a ag m ，实验所得的手性选择 2 5 浙江工业大学学位论文 性a 为1 2 1 ，大致为前者的平方值o c 2 。后来，p i r k l e 等再次通过设计出相应的实验提出了 这样的论断【1 4 1 】：具有两个溶质c s p 相互作用部位产生的对映异构体选择性大致为只有 一个作用部位所取得的对映异构体选择性值的平方。b o e h m 等n 删用统计热力学理论研 究了化学键合手性固定相上溶质对映异构体( a r 、a s ) 的保留行为和分离模式： k = e x p ( 一p a ) 其中p = 1 ( k t ) ，p a 为溶质由流动相到固定相传质过程的h e l m h o l t z 自由能，因此： 仪= 。e x p ( 一p e ；n ) ej e x p ( 一p e j s ) 其中e ；。和e ，。分别为r 一体( a 8 ) 和s 一体( a 8 ) 在c s p 上第i 种和第j 种作用能。并认为 c s p 与a 的4 种一点作用、3 6 种两点作用、1 2 种三点和四点作用中，只有三点和四点 作用存在手性识别能力。如果只有一种优势识别模型，则l n a 与1 t 呈线性关系。 b e r t h o d 等“们1 用热力学方法研究手性识别中手性碳原子所连四个基团各自对手性 识别的贡献，分析了1 2 6 个化合物中8 1 种与手性碳相连的基团，并设氢取代时a g = 0 ， 化合物上各基团独立与c s p 作用，在e = i 仅。一曲。i 最小化条件下解如下方程： a ( a g ) = ( a c 。- a g 。) + ( g 2 。- a g 2 2 ) + ( a g 3 , - a g 3 2 ) 十( a g 4 , - a g 4 2 ) 定量给出了各个基团对手性识别的贡献( c s p 为s - n e c - c d 和r - n e c c d ) ，并发现s p 2 杂化的碳与手性中心相连比s p 3 杂化的碳手性识别能力强。该方法只能预示对映体能否 被拆分，而不能预示流出顺序。 单作用点双辨糟瘴 图，9 形状选择性的识别模型 图1 1 ：篇毳鬈莓翟要嚣同参 飚小9 倒础l em o d e lo f f i g u r ef i t t i 唱 f 昏1 - 1 。譬篡= ：竺裂黜山砌 2 6 浙江工业大学学位论文 1 - 4 2 手性识别模型 目前，关于手性识别的一般机理众说纷纭。在手性色谱学这一领域，早在1 9 5 2 年，d a l g l i e s h n “3 采用纸层析研究氨基酸对映体的分离时就提出了色谱直接拆分“三点 作用”分离理论。后来，l o c h m u l e r 和d o b a s h i 提出“两点作用模型；l o c h m u l e r 和 w a i n e r 提出“单点作用 机理，l o c h m u l e r 进一步提出某些系统存在“环境手性而 没有专一的作用点。对映体的拆分过程可以是熵控制的，手性识别源于形状选择性的 识别模型( 图卜9 ) 。也就是说，在没有结合点( 如氢键、色散力、偶极作用、7 r 一兀相互作 用等) 的手性环境里，熵控制下，对映体在色谱过程中是可以被拆分的。事实上，由于 熵变化值较小，从而导致a 值不够显著，因此，能够通过增加作用点来提高手性选择性 值，识别模型如图i - 1 0 所示，对映体的拆分源于分子形状和相互作用力的共同贡献。 近些年来，p i r k l e 等旧3 在深入研究手性固定相以及手性色谱立体识别机理的过程 中，发展了d a l g l i e s h 观点，再一次阐述了“三点作用”分离理论：手性识别要求手 性固定相和对映异构体之间至少有三个同时存在的作用力，这些作用力中至少有一个 依赖于立体化学。也就是说，用其中的另一对映异构体( 不作任何构象改变) 来替代后， 至少有一个作用力不复存在或明显改变其性质。用如图1 1 0 所示的手性识别模型表达： 在手性固定相上有三个作用点a 、b 、c ，与之作用的对映异构体也同样有三个作用点 a 、b 、c 。对映体i 与c s p 形成a - a 、b - b 、c - c 三个作用力，对映体i i 则不存在 c - c 作用力。如果c - c 作用力使形成的非对映分子络合物稳定化，那么，色谱分离过 程中对映体i 比工工滞后；反之，对映体i 由于c - c 的排斥作用先流出色谱柱。如果 c - c 作用力很小，则对映体i 、i i 不能被色谱拆分。 c 二 、 慧三一 d ： 麓多弋c c h i r a ls 0 1 t o t a n a l y t ee n a n t i 口r n c 穗 ia n d i i 图i - il 色谱手性识别的“三点作用”模型 f i g 1 11 “t h r e ea c t i o n ”m o d e lo f r e c o g n i t i o n c s p 曩 图1 1 2 相似的相互作用力( a a ，b - b ) 导致色谱手性识别能力的降低或消失 f i g 1 - 1 2s c m b l a b l ea c t “a a ，b b i n d u c e r e c o g n i t i o nr e d u c e i n go rd i s a p p e a r 2 7 浙江工业大学学位论文 1 9 9 2 年，t a y l o r 等 1 4 5 1 对“三点作用”原理评述认为：对映体与c s p 的三个作用力中， 至少有一个力具有立体选择性即依赖于对映异构体和c s p 的立体化学，而另外两个作 用力必须是两种不同类型的作用力，如氢键、偶极作用、伽冗作用等，否则如果存在两 个相同的作用力，则可能产生不利的作用，使得c s p 的手性识别能力降低或消失，例 如当a a 和b b 作用力相同时，就可能使c s p 失去手性分离能力( 图1 1 2 ) 。 事实上，手性色谱分离中有的对映体确实是靠氢键这一种类型的力在c s p 上识别 的【1 4 5 , 1 4 6 ，这种手性识别可以认为是对映异构体和手性固定相形成非对映异构络合物的 分子构象不同，使得其平衡常数k 1 、k 2 不同。另一方面，“三点作用”原理要求c s p 分 子和待分离对映异构体的手性中心附近都要有一定的刚性，柔韧性过强将会使手性识 别能力丧失，如图1 1 3 所示。 “三点作用，原理与o g s t o n 1 4 7 】为解释酶催化反应的立体专一性而提出的“三点键 合”原理不同，二者的区别在于：“三点作用”原理没有要求三点都是吸引力。在许多情 况下，手性识别可以靠空间位阻的排斥力和两个吸引力来实现( 图1 1 3 ) ，对映体i i 由于 其大基团的空间位阻，使得其另外的氢键和孔弘作用明显减弱。这种作用已被n m r 分 子间的核极化效应【1 4 8 1 和分子机理计算 1 3 6 , 1 4 9 1 所证实。表现在色谱过程中，对映体i i 的 保留时间会低于对映体i 。 分子间作用力的单点性和多点性的特征由p i r k l e 等给出了明晰的描述【5 8 】：两个凸 圆面相互接触时，接触处形成一个理想的点，于是将凸圆形电子轨道的相互作用描述 成单点性的，如氢键、尾尾偶极相互作用是单点性质作用力。 图卜1 3c s p 手性中心附近基团柔韧性过 强导致色谱手性识别能力丧失 f i g 1 - 1 3t h er e c o g n i z a t i o nd i s a p p e a rd u ot o t e n a c i t yi n 翱m u m g eg r o u po f c s p 2 8 图卜1 4 来源于一种排斥力和二种吸引力的 “三点作用”手性识别模型 f i g 卜1 4 t h r e ea c t i o n m o d e lo f o n er e p u l s i o na n dt w o a m a e t a b i l i t y 浙江工业大学学位论文 通过线或面的基团的相互作用，如偶极堆积，7 t - 7 1 ；作用则为多点性质的。基于这些 思想，可以将“三点作用”原理扩展：并不强调手性识别仅仅源于两个手性四面体的角顶 点的相互作用，也可以沿着a b 和a b 的偶极基团，通过多点性质的偶极堆积作用同样 达到两个点作用的效果；芳环间的弘7 c 作用亦是如此，手性识别模型如图1 1 5 所示。 c s p 图1 - 1 5 通过偶极堆积相互作用形成色谱手性识别 f i g 1 1 5r e c o g n i z a b l em o d e lt h r o u g ha c c u m u l a t ed i p o l e 色谱手性识别是个复杂的过程，模型的提出是将复杂过程简单明晰化。p i r k l e 在运 用和发展“三点作用”原理时，强调形成非对映异构分子络合物的c s p 和对映体二者分 子构象不发生改变，在模式上易于理解，但事实上并不完全如同所描述的那样。色谱 过程是时间的函数，分子不同的排列取向、不同的构象体、以及不同的相互作用( 包括 手性作用和非手性作用) 都将影响到手性识别过程，大多数情况下考虑的是低能量的优 势构象的贡献；再者手性识别也可能是多种机理的竞争。 在手性h p l c 中，根据手性固定相或手性选择剂的不同，在对映体选择吸附过程 中主要存在下列几种键合类型：( 1 ) 过渡金属离子的手性配体相互作用； ( 2 ) 兀一兀 电荷转移相互作用；( 3 ) 包结络合作用；( 4 ) 氢键相互作用；( 5 ) 立体锲合作用； ( 6 ) 偶极一偶极相互作用。 现阶段，只有“刷型”手性固定相的立体选择机理是比较成熟的一种模型。典型的 一种独立型c s p ，其立体识别也是基于三点作用原理。但它的发展主要应归功于i l l i n o i s 大学的p i r k l e 研究小组，因此又命名为p i r k l e 型或多种作用( m u l t i p l e i n t e r a c t i o n ) 手性固 2 9 浙江工业大学学位论文 定相1 4 5 ，1 5 2 1 在手性液相色谱领域，p i r k l e 型c s p 是当前使用量最大、适用面最广的c s p 。 他们具有确定的化学结构，其共同特征是在手性中心附近至少含有下列基团之 一： ( 1 ) 兖一酸或7 c 一碱芳基，具有给体一受体相互作用能力( 电子转移络合) ；( 2 ) 极 性氢键给体受体；( 3 ) 形成偶极相互作用的极性基团； ( 4 ) 大体积非极性基团，提 供立体位阻、范德华作用或构型控制作用【1 4 5 1 5 3 】，图1 1 6 描述t p i r k l e 型手性固定相立 体选择性作用点。 d i p o l e - d i p o l ei n t e a e t i o n s t e r i ch i n d r a n c e l s i 图1 1 6p i r k l e 型c s p 上立体选择相互作用点 f i g 1 。16a c t i o nd o to fr e c o g n i z a t i o ni l lp i r k e lc s p p i r