（应用化学专业论文）水溶性二茂钛配合物的合成及其与DNA的相互作用.pdf

硕士学位论文 摘要 摘要 以环戊二烯二聚体( d i c y c l o p e n t a d i e n e ，简称d c p d ) 为原料，采用 与水共沸法进料，进行气相裂解得环戊二烯单体( c y c l o p e n t a d i e n e ，简 称c p d ) ，再在二乙胺存在下将其与t i c l 4 反应合成了二氯二茂钛 ( t i t a n o c e n ed i c h l o r i d e ，简称t d c ) 。研究了溶剂的种类、反应物的配 比、二乙胺的用量等对反应的影响。实验结果表明：当二乙胺、t i c l 4 和环戊二烯摩尔比为3 ：1 ：4 ，以1 ，4 二氧六环为溶剂，常压下回流反 应4h 时，t d c 产率可达7 5 4 。并以红外光谱( i r ) 、核磁共振( 1 h n m r ) 和紫外可见吸收光谱( u v - v i s ) 等方法对合成产物进行了表征。 由于二氯二茂钛水溶性差，为改善其亲水性，通过引入含亲水基 团的配体合成了三种配合物：双环戊二烯基水杨酸钛( i v ) ( 配合物1 ， b i s ( c y c l o p e n t a d i e n y l ) s a l i c y l a t ot i t a n i u m ( i v ) ，简称t s c ) 、二氯二茂钛 二甲硫氨酸( 配合物2 ，t i t a n o c e n ed i ( l m e t h i o n i n e ) d i c h l o r i d e ，简称 t m c ) 、二氯二茂钛二苯丙氨酸( 配合物3 ，t i t a n o c e n e d i ( l - p h e n y l a l a n i n e ) d i c h l o r i d e ，简称t p c ) 。经元素分析、红外光谱( i r ) 、 核磁共振( 1 h - n m r ) 和紫外可见吸收光谱( u v - v i s ) 等方法表征了其 结构。结果表明：t s c 为单分子双齿配位的二茂钛配合物，而t m c 和t p c 为双分子单齿配位的二茂钛配合物，且t m c 和t p c 具有很 好的水溶性。同时，经电化学测试，t m c 和t p c 具有良好的电化学 活性，在实验电位范围内能发生准可逆的电化学氧化还原反应。 二氯二茂钛二甲硫氨酸( t m c ) 是一种新型的具有抗肿瘤活性的 金属有机化合物。在本论文中，选择脱氧核糖核苷酸( d n a ) 为研究对 象，采用电化学法、紫外可见吸收光谱法和粘度法研究了t m c 与 d n a 之间的相互作用。电化学实验结果表明：在p h3 0 的k c l 水溶液 中，t m c 与d n a 之间通过静电作用，形成了一种具有电活性的复合 物，且t m c 与d n a z 间的结合位点数为4 。2 6 ，结合常数为2 7 4 x 1 0 1 6 。 同时，紫外可见光谱法和粘度法结果也都表明t m c 与d n a 之间的作 用方式为静电作用。 关键词二氯二茂钛，二氨基酸二茂钛o v ) 爵d 合物，合成，d n a ， 相互作用 硕士学位论文 a b s t r a c t a bs t r a c t d i c y c l o p e n t a d i e n ew a sd e c o m p o s e di n t om o n o m e r ( c y c l o p e n t a d i e n e ) b yt h em e t h o do fv a p o r - p h a s et h e r m a ld e c o m p o s i t i o n t h e nt i t a n o c e n e d i c h l o r i d ew a ss y n t h e s i z e dv i at h er e a c t i o no fc y c l o p e n t a d i e n ea n dt i c h u n d e rt h ee x i s t e n c eo fd i e t h y l a m i n e t h ei n f l u e n c eo ft h er e a c t i o n ，s u c h a st h e s o l v e n t s ，t h em i x t u r er a t i o s o fr e a c t a n t s ，t h ea m o u n t so f d i e t h y l a m i n e ，w e r es t u d i e d t h ey i e l do ft i t a n o c e n ed i c h l o r i d er e a c h e s 7 5 4 w h e nt h em o l a rr a t i oo fd i e t h y l a m i n e ：t i c l 4 ：c y c l o p e n t a d i e n e w a s3 ：1 ：4 ，t a k i n gd i o x a n ea st h es o l v e n t ，a t m o s p h e r i cr e f l u x i n g4 h t h e i rs p e c t r u m ，u v - v i ss p e c t r u ma n d 1h - n m r w e r et a k e nt oc h a r a c t e r i z e t h ec o m p o u n d d u et ot h ep o o rs o l u b l i t yo ft i t a n o c e n ed i c h l o r i d ei nw a t e r , s o m e h y d r o p h i l i u cg r o u p sa r ec o l v a l e t e dt ot i t a n o c e n em o l e c u l e i nt h i ss t u d y , t h r e ec o m p o u n d s ，n a m e l yb i s ( c y c l o p e n t a d i e n y l ) s a l i c y l a t ot i t a n i u m ( i v ) ( t s c ) ，t i t a n o c e n ed i ( l - m e t h i o n i n e ) d i c h l o r i d e ( t m c ) a n dt i t a n o c e n e d i ( l p h e n y l a l a n i n e ) d i c h l o r i d e ( t p c ) ，w h i c h c o n t a i n e dh y d r o p h i l i c g r o u p sw e r es y n t h e s i z e d t h e s ec o m p o u n d sw e r e c h a r a c t e r i z e db y e l e m e n t a la n a l y s i s ，i rs p e c t r u m ，1 h - n m ra n du v - v i ss p e c t r u m t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt s cw a sa nu n i m o l e c u l a rb i d e n t a t e t i t a n o c e n ec o m p o u n d ，t m ca n dt p cw e r eb i m o l e c u l a ru n i d e n t a t e t i t a n o c e n ec o m p o u n da n dp o s s e s s e dg o o dw a t e rs o l u b l ep r o p e r t i e s a t t h es a m et i m e ，a f t e re l e c t r o c h e m i s t r yt e s t ，t m ca n dt p ca r eo fg o o d e l e c t r o c h e m i s t r ya c t i v i t ya n db e h a v eq u a s i r e v e r s i b l e e l e c t r o d er e d o x r e a c t i o ni nt h ee x p e r i m e n t a lp o t e n t i a ls c o p e t i t a n o c e n ed i ( l - m e t h i o n i n e ) d i c h l o r i d e ( t m c ) i san e wk i n do f a n t i t u m o rm e t a l l o r g a n i c c o m p o u n d c h o o s i n gd e o x y r i b o n u c l e i c a c i d ( d n a ) a st h er e s e a r c ht a r g e t t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt m ca n dd n a w a si n v e s t i g a t e dt h r o u g ht h em e t h o d so fe l e c t r o c h e m i s t r y , u v - v i s i b l e a b s o r p t i o ns p e c t r u ma n dv i s c o m e t r y t h ec vr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e e l e c t r o a c t i v ec o m p l e xw a sf o r m e dv i ae l e c t r o s t a t i ce f f e c t sa tp h3 0 i i 硕士学位论文 a b s t r a c t m o r e o v e r , t h en u m b e ro fb i n d i n gr a t i on = 4 2 6a n da na f f i n i t yc o n s t a n t o fk a = 2 7 4x10 w e r eo b t a i n e d a tt h es a m et i m e ，t h er e s u l t so b t a i n e db y u v - v i ss p e c t r o s c o p i ca n dv i s c o m e t r ya l s oi n d i c a t e dt h a tt h ei n t e r a c t o n w a y b e t w e e nt m ca n dd n aw a se l e c t r o s t a t i ce f f e c t s k e yw o r d st i t a n o c e n ed i c h l o r i d e ，d i c y c l o p e n t a d i e n y lt i t a n i u m ( i v ) a m i n oa c i dc o m p l e x e s ，s y n t h e s i s ，d n a ，i n t e r a c t i o n i i i 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。 作者签名：垫多纠! 日期：4 年三月生日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：查玺望童!导师签名日期：年上月旦日 硕士学位论文第一章文献综述 1 1 引言 第一章文献综述 核酸是生命过程中的重要化学物质，它介入了生物的生长、发育和繁殖等正 常生命活动，并与致癌等生命的异常情况密切相关，而且它将参与这些信息在细 胞内的表达，从而促成代谢过程并控制这一过程。而人们要想了解生物体内的生 命过程，就必须从物理和化学的角度出发，在原子、分子及其电子结构等微观水 平上认识这些反应过程的微观机制。因此，借助金属配合物与d n a 的相互作用， 研究d n a 的结构与功能的关系，将有助于人们从分子水平了解生命现象的本质。 同时，也有助于人们从基因的水平上理解某些疾病的发病机理，并通过分子设计 来寻找有效的治疗药物。 癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一，为攻克这一难题，寻找药效高、 抗癌谱广、毒性低的抗癌剂一直是药物学家、化学家共同关心的课题。上个世纪 6 0 年代末，r o s e n b e r g 发现了顺式二氯二氨合铂( 简称顺铂) 有抗癌活性【l j ，开辟 了金属配合物抗癌作用研究的新领域。由于顺铂具有广谱、高效的特点，很快进 入临床实验。但顺铂具有较大的肾毒性、骨髓毒性及致呕吐等毒副作用。随后的 研究发现f e 、c o 、n i 、r h 、r u 、p d 、m o 、w 、v 、n b 、t i 、c u 、a g 、a u 、s n 、 g e 等金属的配合物也具有不同程度的抗癌活性。其中，最引人注目的是某些金 属茂类配合物。 1 2 茂金属配合物 茂金属配合物( m e t a l l o c e n e ) ，即两个环戊二烯基( c p - ) 或其衍生物以平面共轭 兀键的形式与金属的卤化物成键所形成的金属有机配合物【2 j 。 1 9 5 1 年，k e a l y 和p a u s o n 【3 j 意外地合成了二茂铁( f e r r o c e n e ) ，次年，w i l k i n s o n 和w o o d w a r d l 4 1 确认它是一个具有芳香性和夹心结构( s a n d 、v i c hs t r u c t u r e ) 的金属 配合物。二茂铁的发现使金属有机化学的发展出现了一个飞跃，也开辟了茂金属 化学的先河。由于它们独特的分子结构及其突出的芳香特性，二茂铁及其衍生物 具有许多特殊性能，对于它们的应用研究己经涉足于不对称有机合成催化剂f 5 j 、 燃烧控制剂或调节剂、光敏剂、稳定剂【6 】、改良剂、电极的修饰【7 】以及生化与医 药【8 - 1 0 1 等领域。 1 9 5 4 年，另一种茂金属配合物二氯二茂钛【l u ( t i t a n o c e n ed i c h l o r i d e ， c p 2 w i t h ) 问世，从此，各种取代的、桥联的、混合配位的茂钛化合物被合成出来。 硕士学位论文 第一章文献综述 茂钛类化合物也因其在催化烯烃聚合【1 2 - 15 1 、不饱和烃加氢还原、有机合成【1 6 加】 以及生物活性1 8 - 2 1 1 等方面的重要作用而被广泛研究。特别是1 9 7 9 年，k o e p f 等 首次发现了二氯二茂钛( c p 2 t i c l 2 ，t d c ) 的抗肿瘤活性【2 2 】，由于钛类的毒性远比 铂类低，很快就受到人们的重视，开创了金属茂类抗癌剂研究的新领域。 1 2 1 茂钛类配合物的合成方法 ( 1 ) 无水条件下的合成 二茂钛配合物的传统合成方法是通过无水无氧的操作来完成，这也是最有效 的方法，但缺点也不言自明：条件苛刻，处理困难。 以各种金属盐为前体，合成二茂钛配合物。通常的方法是首先合成环戊二烯 或衍生物的锂、钠或钾盐，再和四氯化钛或三氯单茂钛反应，得到二茂钛配合物。 中国科学院化学研究所的冯茹等【2 3 】就用该法合成得到了硅氧硅桥链的双核茂钛 催化剂，并应用到乙烯的聚合研究( 图1 1 ) 。 吲韧一譬簪 图1 - 1 硅氧硅桥链的双核茂钛的合成 f i g 1 1s y n t h e s i so fc p c l 2 t i ( q 5 - c 5 h 4 ) - s i ( c h 3 ) 2 o - ( c h 3 ) 2 s i - ( t 1 5 - c 5 h 4 ) t i c p c l 2 以有机碱为催化剂，合成二茂钛配合物。二甲基环戊二烯基二氯化钛 2 4 1 就 是采用二乙胺为氯化氢的吸收剂，由四氯化钛和甲基环戊二烯反应来合成的( 图 1 - 2 ) 。 6 景c k 图1 2 二甲基环戊二烯基二氯化钛的合成 f i g 1 2s y n t h e s i so f ( c h 3 c p h t i c l 2 2 硕士学位论文第一章文献综述 ( 2 ) 单纯水相中的合成 与无机物反应：t h e w a l t 等【2 5 1 由c p 2 t i c l 2 和硫酸钠在水相中反应得到了硫酸 根桥联的双核二茂钛( i i i ) 配合物c p 2 t i ( 1 1 2 - p 1 s 0 4 ) t i ( h 2 0 ) c p 2 ( 图1 3 ) 。 2 c p 州s 0 4 旦兰醐 图l - 3 硫酸根桥联的双核二茂钛( ) 配合物的合成 f i g 1 - 3s y n t h e s i so f c p 2 t i ( t t 2 “l s 0 4 ) t i ( h 2 0 ) c p 2 与有机配体反应：k a u s h i k 小组【2 6 之8 1 报道了在水相中合成了离子型二茂钛化 合物 c p 2 t i l + x - ，h l 是8 羟基喹啉( h o x i n e ) 、乙酰丙酮( h a c a c ) 、水杨醛( h s a l ) 、 苯甲酰丙酮( h b z a o 等，x - 为r o c s 2 、r r n c s 2 等负离子。 c p 2 m c l 2+ h 2 0 _ c p 2 m o h + + c l - + h c i c p 2 m o h + + c l - + h l 2 【c p 2 m e + c l 。+ h 2 0 m l 】+ c i - + x 一旦生 c m m l + x 。+ c i 。 m - t i ，z r ；h l 2 h o x i n e ，h a c ，i - i b z a c ，h s a l ，d h p ，a h p ；x - = r o c s 2 。，r r n c s 2 。 o p 、o 矿 硕士学位论文第一章文献综述 ( 3 ) 两相法合成 高子伟【3 0 】采用两相法由c p 2 t i c l 2 和水杨酸反应合成了一种单核环状的二茂 钛水杨酸配合物( 图1 5 ) 。 h 0 2 c 泠 c p 2 t i c l 2 + 0i h 影 c h c l 3 h 2 0 o i i c 计o o - - 人c 价 图1 5 单核环状的二茂钛水杨酸配合物的合成 f i g 1 - 5s y n t h e s i so fm o n o n u c l e a rc y c l i cs a l i c y l a t ot i t a n o c e n ec o m p l e x 1 9 9 4 年，t o m i e p o r t h o e t t i n g 等p 1 1 在含微量水的体系中合成了离子型二茂钛 氨基酸配合物( 图1 - 6o c p 2 t i c l 2 + 2a a m e o h ，r o o mt e m p 【c p 2 t i ( a a + ) 2 】 c 1 。】2 l - 3 a a = g l y c i n e ，l - a l a n i n e ，2 - m e t h y l a l a n i n e 图l _ 6 离子型二茂钛氨基酸配合物的合成 f i g 1 - 6s y n t h e s i so f i o n i ct i t a n o c e n ea m i n oa c i dc o m p l e x e s 高玲香等p 2 彤】在水相和两相体系( c h c l 3 h 2 0 ) 中合成出了双分子取代的二 茂钛氨基酸配合物( 图1 - 7 ) 。 c矿t+hooch2cnh电丽1chc而13h20c ri i p h ；p - c l ；m - c i ；p - o c h 3 ；m - c h 3 时黑 r 图1 7 非离子型二茂钛氨基酸配合物的合成 f i g 1 - 7s y n t h e s i so fn o n i o n i ct i t a n o c e n ea m i n oa c i dc o m p l e x e s 4 硕士学位论文第一章文献综述 ( 4 ) 过渡配体存在下合成 高子伟小组【湘6 】利用多种可与c p 2 t i c l 2 形成离子型配合物的配体8 羟基喹 啉( h o x i n e ) 、乙酰丙酮( h a c a c ) 、苯甲酰丙酮( h b z a c ) 或5 一磺基水杨酸( h e s s a l ) ( 均被 称为过渡配体) 存在下，由c p 2 t i c l 2 和硫代水杨酸反应合成了一系列二茂钛配合 物。并且利用紫外可见吸收光谱法对其反应机理进行了深入的研究，提出了过 渡配体存在下二茂钛配合物的反应模型( 图1 8 ) 。 c p 2 t i y ( n - l 2 )21 【 + - 二_ ( n - l ，2 ) h l ：过渡性配体hm y ：配体 图1 8 过渡配体存在下二茂钛配合物的反应模型 f i g 1 - 8 r e a c t i o nm o d e lo f t i t a n o c e n ec o m p l e x e si nt h ep r e s e n c eo f t r a n s i t i o nl i g a n d 1 2 2 抗癌的金属茂类化合物 ( 1 ) 抗癌的金属茂类化合物的结构类型 二茂金属二酸根配合物，通式为【c e 2 m x 2 】。例如：二氯二茂钛类化合物 ( c e 2 t i c l 2 ，t d c ) 、离子性的茂钛化合物 c p 2 t i c i ( n c h 3 ) + f e c e s 。但二氯二茂 钛水溶性、水稳定性差，而离子性的茂钛化合物由于其离子性使其具有较好的水 溶性而倍受青睐。 金属箱离子盐，通式为【c p 2 f e 】+ x 。如：二茂铁( ) 鲦三氯乙酸盐 【c p 2 f e + c c l 3 c o o 。，由于其具有更低的毒性及高的水溶性和水稳定性，使它们 具有更高的临床应用价值【3 7 1 。 主族金属茂化合物， ( c d t s ) s c s 2 g e ，【( c 6 h s ) s c s 2 s n 也有较好的抗癌活性。 ( 2 ) 抗癌的金属茂类化合物的抗癌谱 大量实验表明：金属茂类化合物有广泛的抗癌谱，动物实验以二氯二茂钛效 果最好，其对多种实验瘤株有1 0 0 的治愈率。二氯二茂钛对艾氏腹水癌( e a t ) 、 肉瘤s 1 8 0 、b 1 6 黑色素瘤、结肠癌3 8 、l e w i s 肺癌等均具有明显疗效【3 8 。9 1 。二茂 铁锚离子盐类的抗癌谱和二氯二茂钛类似。 ( 3 ) 抗癌的金属茂类化合物的作用机理 关于化学物质抗癌理论有多种，但对于金属抗癌理论影响最大的就是：抗 5 硕士学位论文第一章文献综述 癌双配位键合理论1 4 0 】和“两极互补”理论【4 。其中“两极互补”理论由我国的科研工 作者杨频教授创立，此理论包括三个层次的互补：分子结构的两极互补；受体一 底物作用方程式的两极互补；受体、底物在对称性上的两极互补。 二氯二茂钛类化合物作为一种具有很好的抗癌活性金属茂类化合物，已进入 二期临床研究。杨频研究组t 4 2 - 4 5 】对其作用机理进行了研究，开展了以下工作：( 1 ) 应用电子光谱、园二色谱、荧光谱、透析检测法等，研究了二氯二茂钛( t d c ) 作 用于d n a 的机制，发现t d c 可与d n a 发生不可逆共价结合，在低的t d c d n a 浓度比时，t d c 与d n a 磷酸基团结合而导致d n a 收缩；在高的t d c d n a 浓 度比时，t d c 与d n a 碱基作用而导致d n a 二级结构改变，双螺旋解开甚至变 性；( 2 ) 利用n m r ( 直接) 方法，研究了二氯二茂钛与5 - a m p 、5 - c m p 、5 - t m p 、 5 - g m p 的成键特征。研究结果表明，除5 - t m p 只有磷酸根参与成键外，5 - c m p 、 5 - a m p 、5 - g m p 均既有磷酸根参与成键，又有碱基上的n 原子参与成键。当以 二氯二茂钛与等当量的5 - a m p 及5 - t m p 的混合物作用时，发现参与形成氢键 的5 - a m p 上的n ( 6 ) h 质子峰消失，从而首次发现二氯二茂钛对碱基对之间的氢 键有破坏作用。这与以前报道的二氯二茂钼、二氯二茂钒对碱基对之间的氢键无 损伤是不同的。也表明二氯二茂钛有着完全不同的抗肿瘤机理；( 3 ) 根据文献合 成了苷氨酸和丙氨酸的两种二氯二茂钛氨基酸衍生物，进行体外活性试验时，首 次发现二茂钛苷氨酸衍生物及丙氨酸衍生物具有很高的抗肿瘤活性。以光谱法研 究它们与d n a 的作用时，发现它们与d n a 均有很强的成键作用；( 4 ) 应用电子 光谱、园二色谱、荧光探针技术、酶切及电泳手段，对二茂铁锚离子三氯乙酸盐 f r e t ) 与d n a 作用机制进行了研究，结果表明，f c t 首先作用于d n a 磷酸基团， 使d n a 收缩，进一步导致d n a 结构破坏，单键断裂，形成37 羟基缺刻，其作 用程度明显依赖于f c t 与核苷酸的摩尔比。f c t 与d n a 的作用不存在插入方式。 首次提出了f c t 的可能的分子作用机制模型。 1 3d n a 的组成和结构特性 1 3 1d n a 的组成 d n a 的主要结构单元为脱氧核糖核苷酸。脱氧核糖核苷酸由脱氧核糖、磷 酸根基和碱基三种成分组成。脱氧核糖是在2 位没有羟基的五碳糖，碱基有胞 嘧啶( c ) 、胸腺嘧啶( d 、鸟嘌呤( g ) 和腺嘌呤( a ) 四种( 图1 - 9 ) 。 6 硕士学位论文 第一章文献综述 脱氧核糖 i h 平n 图1 - 9 脱氧核糖、嘧啶和嘌呤结构 f i g 1 9 s t r u c t u r eo f d e o x y r i b o s e 、p y r i d i n ea n dp u r i n e 1 3 2d n a 的结构特性 d n a 是一种柔性生物大分子，其结构可分为一级、二级和三级结构。一级 结构是指d n a 碱基连接于脱氧核糖的1 位，磷酸基团连接于脱氧核糖的3 位羟 基或5 位羟基。构成d n a 分子的基本单元的脱氧核苷酸通过3 。5 磷酸二酯键 相连形成的直线型分子( 图1 1 0 ) 。d n a 的二级结构就是它的双螺旋结构( 图 l 一1 1 ) ，由两条平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成的，其分子中的脱氧核糖和磷酸 交替连结，排列在外侧，碱基排列在内侧，两条链上的碱基通过氢键连结起来， 形成碱基对。这种结构的稳定性主要来源与以下三种力：一是互补碱基对之间的 氢键；二是碱基堆积力，由芳香碱基上的兀电子之间的相互作用产生，是比较主 要的力；第三种力来自磷酸残基上的负电荷与介质中的阳离子之间的静电作用 力。d n a 的三级结构是指除了双螺旋结构以外的非直线型结构。 d n a 双螺旋结构有多种空间构型，如a 、b 、c 、d 、z 等构型。b 型是大 多数天然d n a 的存在形式，其结构特点是两条反向平行的多核苷酸围绕同一螺 旋轴旋转而成右手螺旋，每十个碱基对围绕一圈形成一个螺旋结构，螺距3 4 n m ， 螺距直径2 n m 。在双螺旋表面分别形成深度差不多的大沟和小沟。z d n a 是d n a 几种构象中唯一的左手双螺旋。d n a 不同的构象所具有的特征使得用小分子配 合物来识别d n a 的二级结构成为可能。 7 & 王 洲 胸 硬 j 学位论文第一章文献综述 图1 1 0 核酸的片段结构 f i g1 - i o s t r u c t u r e o f t h e f r a c t i o n o f n u c l e i c a c i d 14 配合物与d n a 作用的基本形式 图1 1 id n a 的双螺旋结构 f i g 1 - 1 1s t r u c t u r eo f d o u b l e - h e l i x d n a 根据目前的研究，过渡金属配合物与d n a 的结合模式归纳起来主要有三种， 即非共价结合、共价结合和剪切作用。共价结合是较强的方式，非共价结合作用 相对较弱，包括插入作用、沟面结合和静电作用等。其中，以非共价结合研究最 为广泛。 14 1 共价结合 软金属离子如p l o d ，p d ( f r ，r u q l ) 和碱基的亲桉性部位之问可产生共价结 合。与非共价结合相比配合物与d n a 共价结合的序列特异性识别能力要强得 多。晶体衍射等方法已证实，顺铂( c i s p l a t i n ) 中的p t 原子能够与d n a 小沟中同一 条链上相邻鸟嘌呤【d ( q ，0 ) 1 的n 7 共价结合形成链内加成物，使d n a 双链解旋 并产生弯曲嘲。 硕士学位论文第一章文献综述 1 4 2 非共价结合 非共价结合包含三种不同的形式，即静电结合、沟面结合和嵌插结合，如图 1 1 2 所示。另外还有氢键、离子键、范德华力和疏水键这些弱的相互作用。小分 子通过沟内或嵌插结合在核酸的螺旋沟或碱基中，加上静电力的作用，常会诱发 许多生物效应，阻碍核酸信息的正常表达，同时这四种力还凭借氢键、范德华力、 疏水作用等使相互作用增强。 ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) 图1 1 2 非共价键合模式 f i g 1 1 2 t h eu n c o v a l e mb i n d i n gm o d e so f d n aa n ds m a l lm o l e c u l e s ( 1 ) e l e c t o r s t a t i cb i n d i n g ( 2 ) g r o o v eb i n d i n g0 ) i n t e r c a l a t i v eb i n d i n g ( 1 ) 静电结合( e l e c t o r s t a t i cb i n d i n g ) ，即小分子通过非特异性的相互作用结合 于带负电荷的d n a 双螺旋外部的磷酸酯骨架。静电结合的两种基本作用方式： 收缩型作用，通常指一些无机阳离子烈a + ，k + ，m 9 2 + ) l 与b 型d n a 的相互作 用，这种作用通常使核酸的熔点( ) 升高，但大量的无机阳离子与核酸作用也可 能使核酸的熔点( t ) 降低；非特异性外部堆积，通常指一定烷基胺盐和磷脂类 化合物与核酸的最初作用。杨频等【4 7 】认为核酸分子表面有静电力形成的水化层 中水分子的排列与碱基有关。 ( 2 ) 沟面结合( g r o o v eb i t a d i n 曲，即d n a 靶向分子与d n a 的大沟和小沟的 碱基对边缘直接发生作用，有自堆积结合和无自堆积结合两种。大沟区、小沟区 在电势能、氢键特征、立体效应、水合作用上都有很大的不同。大分子蛋白质与 d n a 在大沟结合，多数小分子则是在小沟区作用。通常非稠合的芳环体系( 如 呋喃、吡咯、苯环等) 能通过一定的旋转后结合在小沟中a t 富集区【4 引。 ( 3 ) 嵌插结合( i n t e r c a l a t i v eb i n d i n g ) ，即在碱基对之间嵌入平面的或几乎平面 的芳香环系，这是芳环的离域兀体系与碱基的冗体系间的兀一兀相互作用、偶极 9 硕士学位论文第一章文献综述 一偶极相互作用及疏水作用的结果，是药物分子与d n a 发生作用的最重要的形 式之一。通常稠环芳香体系都趋向于结合在g c 富集区。当d n a 靶向分子嵌入 d n a 碱基对之间后，有的可以直接抑制d n a 复制与转录的功能；有的则在经过 进一步活化后，使d n a 断裂受损而影响其功能。 1 5 金属配合物与d n a 相互作用的研究方法 金属配合物与d n a 作用的位点( 大沟、小沟) 、作用的形式( 插入、沟结 合、静电作用) 、有无构型选择或碱基序列选择，需要多种方法加以确定。常用 的研究技术有光谱学方法、流体力学方法、电化学方法、n m r 技术，另外还有 热力学方法等。 1 5 1 光谱法 通常配合物与d n a 结合后会导致其配体所处环境发生变化，结合强弱可通 过电子吸收光谱、发射光谱、激发态寿命等一系列变化反映出来。 ( 1 ) 紫外一可见光谱法 由于双螺旋结构的d n a 分子含有芳香碱基和磷酸生色基团，其电子吸收光 谱在2 6 0 n m 左右有一强的吸收峰【4 9 5 0 】，许多d n a 靶向分子或本身具有光学活性， 或与d n a 结合后产生光学活性，因此用光谱方法通过考察d n a 结合其靶向分 子后结构上的变化来研究其结合机理，是非常有效和应用最为广泛的方法，其中 紫外可见吸收光谱法是研究小分子与核酸相互作用的一种最常用、最方便的技 术。某些小分子如金属配合物亦有吸收谱带，可根据其与d n a 相互作用前后 d n a 或其它分子的吸收谱带的变化对二者相互作用模式进行判断。 对于d n a 的吸收光谱来说，如导致分子的轴向变化即其构象变化，则产生 减色效应及红移现象，且光谱变化的大小与其结合力相关联，即作用越强减色效 应越明显；如导致d n a 双螺旋结构的破坏，则产生增色效应【5 。增色效应说明 配合物可能与其腺嘌呤碱基嵌入到d n a 双螺旋碱基对间，引起构成碱基堆积力 的疏水作用力和范得华力的相应改变，影响了d n a 构象与结构的稳定。 对于金属配合物的特征吸收谱带，加入d n a 后，该分子与d n a 发生嵌插 作用，则该分子的电子吸收光谱的吸收峰位置红移，强度减小；因为插入配体与 d n a 碱基对可发生兀电子堆积，作用配体的兀空轨道与碱基的兀电子轨道发生 偶合，使能级下降，从而导致删跃迁能减小，产生红移现象；同时，偶合后 的兀轨道因部分填充电子，使兀_ 7 c 跃迁几率减小，产生减色效应【5 l 】。如该分子 1 0 硕士学位论文第一章文献综述 与d n a 发生静电作用或沟槽作用，则使紫外可见吸收光谱峰将出现较小的红移， 且减色效应不明显【5 l 】。 ( 2 ) 荧光光谱法 荧光光谱法可以作为一种研究具有荧光特性靶向化合物的理想方法，配合 物与d n a 的键合方式也直接影响其稳态荧光光谱，可根据相互作用前后荧光强 度的变化，对二者相互作用的模式进行判断。对于自身荧光较低的某些金属配合 物来说，当与d n a 发生嵌插作用时，常伴随着配合物荧光强度的增强及其荧光 寿命的增加，同时，其受阴离子猝灭剂的影响也较小。对于某些药物分子，可借 助于荧光探针溴化乙锭( e b ) 5 2 - 5 4 l 、亚啶橙、二氨基亚啶等对药物与d n a 的作用 模式进行判断。 ( 3 ) 线二色谱( l d ) 和圆二色谱( c d ) 线二色谱( l d ) 采用与固定光轴方向平行或垂直的平面偏振光，测量结合 d n a 后的配合物对垂直和平行于d n a 的线偏振光的不同吸收( - - 色性) ，计算出 配合物与d n a 的相对取向。通过线二色谱技术和有关计算可以得到配合物与 d n a 相互作用的键合几何学方面的信息【5 5 。5 6 1 。 圆二色谱( c d ) 可以检测物质的旋光性，该法通常与平衡透析实验结合来研究 外消旋配合物与d n a 相互作用的立体选择性。若消旋化的配合物对d n a 透析 达平衡后，出现c d 信号，则证明配合物对d n a 产生了立体选择性结合【5 7 巧引。 1 5 2 流体力学法 在确定小分子化合物与d n a 相互作用模式方面，流体力学法( 如粘度法， 沉降速度及凝胶电泳等) 有其独特的应用【5 9 。6 。该方法常被用来验证小分子化合 物是否以插入方式与d n a 作用。 ( 1 ) 凝胶电泳 电泳是在外电场存在下，利用分子携带不同的净电荷对不同分子量的混合物 进行分离和分析的一种实验技术。序列凝胶电泳及足印迹分析技术是生物学中用 来研究d n a 与其它分子相互作用最基本的两种手段【6 2 1 。凝胶电泳可以考察d n a 剪切或其它分子与d n a 螺旋共价结合留下的永久性“痕迹”，研究其它分子与 d n a 作用的序列特异性问题。 ( 2 ) 粘度法 粘度法在确定小分子与d n a 作用模式方面也有其独特的应用，在缺少晶 硕士学位论文第一章文献综述 体结构资料的情况下，粘度法是检测配合物是否与d n a 以插入方式结合最有效 的方法，其结果比光谱学数据更具有说服力1 6 3 j 。含有平面芳香环系的小分子( 如 e b ) 或金属配合物以经典的插入方式插入到d n a 碱基对时，会导致d n a 双螺 旋长度的增加，从而其溶液的粘度增大；当以部分插入方式进入d n a 碱基对时， 常产生d n a 双螺旋的扭结，导致溶液粘度下降；而当化合物以沟槽结合或静电 方式与d n a 相互作用时，则d n a 溶液粘度变化不明显唧】。据此可判断小分子 与d n a 作用的键合模式。 1 5 3 电化学方法 电化学方法主要是利用电能与化学能之间的相互作用以及转化过程中的有 关规律来获得某些相互作用信息，该方法又叫做电化学分析法或者电分析化学， 它包括电导分析、电位分析、库伦分析、极谱分析和伏安法等。电化学方法作为 研究电子转移方面的有力手段，可以对光谱实验结果进行有效的补充，从而更深 入地了解金属配合物与d n a 相互作用的机n 6 蛐9 j 。这种方法使用最多的为循环 伏安法( c v ) 。有电活性的小分子与d n a 相互作用后，小分子的特征氧化还原电 流会明显变化，峰电位也发生移动。该方法尤其是对于一些主要通过静电结合模 式与d n a 作用的分子，采用表面电化学方法可获得许多其它方法无法得到的信 息。1 9 8 7 年，b a r d a j 小组 7 0 - 7 l 】采用循环伏安法研究了c o ( i i i ) 配合物与d n a 相 互作用的电化学行为，并发展了根据配合物中心离子的峰电流和峰电位计算二者 的表观结合常数和结合位点的方法。b a r daj 小组还提出，当小分子与d n a 相 互作用时，若e o 向正方向偏移，则小分子与d n a 发生嵌插作用；若e 0 向负方 向偏移，则小分子与d n a 发生静电作用r 7 2 】。基于d n a 修饰电极发展起来的表 面电化学方法【7 3 。7 5 1 ，更是具有简便、可靠、d n a 用量少等优点。因此，电化学 方法也是用来研究配合物与d n a 相互作用最广泛而有效的一种方法之一。 1 5 4x 射线衍射技术和n m r 技术 单晶x 射线衍射技术是提供配合物与d n a 作用的结构信息量精确的实验 手段。但前提是要能培养出金属配合物和核酸在结合状态下的合适的单晶。 n m r 谱能够直接提供配合物和d n a 键合的详细信息，用于更深层次上探 钡t j d , 分子化合物与d n a 的键合机理及作用位点( 如d n a 的大沟、小沟、或碱基 位置的特异性结合等) 。尤其是二维n m r 的出现。二维n o e s y 谱可给出配合物 与d n a 作用的具体位点的信息，包括二者作用的位点是在d n a 的大沟还是小 沟以及碱基位置的特异性结合等信息。这一技术所提供的信息是上述光谱法等手 1 2 硕士学位论文第一章文献综述 段所无法获得的，也是近几年来在更深层次上探测小分子化合物与d n a 键合机 理所采用的一种新技术【7 6 】。 此外还有许多其它物理化学方法，如热力学方法【7 7 1 、平衡渗析等也被用于 小分子化合物与d n a 键合机理研究，但不太常用。 1 6 课题的提出及意义 茂钛配合物由于其在加氢催化、有机合成和抗癌等方面的重要作用，而成 为金属有机化学最为活跃的研究对象之一。然而，二氯二茂钛虽是一种最早的、 最基本的茂钛化合物，但由于其传统的合成工艺条件较苛刻，生产成本高【7 8 】。 另外，二氯二茂钛作为抗癌剂，虽具有抗癌谱广、药效高及毒性远低于顺铂等优 点，但其水溶性差、水稳定性差，限制其临床应用；同时也因其在水中溶解度不 大，妨碍了对它与d n a 作用机理的进一步研究，使其抗癌机理不明。鉴于此， 提出本课题并拟进行以下几个方面的工作： ( 1 ) 对现有二氯二茂钛的合成方法进行比较，选择相对较优的合成方法并对 其某些工艺进行改进，优化其合成条件，降低其合成成本。对其产品进行红外、 紫外、核磁等表征。 ( 2 ) 针对二氯二茂钛水溶性差的问题，可用亲水性的基团取代其中的氯以改 善其亲水性。水杨酸不仅