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真菌漆酶的制备及其在染料脱色中的应用 摘要 漆酶具有厂“泛的底物特异性，目前在食品、环境、制浆造纸以及 纺织e 1 j 染等诸多领域内具有广阔的潜在应用市场。而这些应用部需要 以人量的漆酶存在为前提，所以筛选出廉价的漆酶高产菌株，并优化 其产酶条件是漆酶得以工业应用需首要解决的课题。 该研究首先对两种漆酶高产真菌彩绒革盖菌和香菇的培养 和j 范酶条件，包括培养状态、培养温度、培养基初始p h 值、金属离 子c u 2 + 和m n 2 的含量、表面活性 | l 酶使崩以及磊导剂的籽；类、添加 量霹l 添加时间等相关冈素进行了优化，并进一步研究了它们的部分酶 学性质。 结果发现彩绒革盖菌p r l 5 7 2 菌株适宜在p h 3 5 p h 5 7 环境下 生长并合成漆酶。添加p h 缓冲液的培养基可以获得更高的酶活， 避 是不龠缓冲液的培养基可扶得较高的酶产率；铜和锰离子的存在厅】以 显著提高漆酶活力，当以0 1m m2 ，5 二甲基苯胺为诱导剂时，培养 基中肖含8 8 0i a mc u 2 + 离子，1 0i u m 左右的m n 2 。离子。在五种常用 漆酶诱导剂巾，2 ，5 二甲基苯胺的效果最佳，且应在菌种进入对数卞 k 驯时加入效果最好，其最适添加浓度为o 。4m m ，此时最适产酶c u 浓度为o 。4m m 。研究疆示漆酶在3 0 和4 0 。c 条件保持6h 后残余 酶活分舅| j 为原酶活的9 5 4 和8 0 1 ：6 0 。c 条件f ，该酶保溢lh 后 的残余活力仅为原酶活的1 3 9 。该漆酶的最适反应温度是6 5 ， 最适反应p h 值为2 。4 3 。 香菇发酵产漆酶条件的优化结果表明，静置培养优于振荡培养： p h i 5 6 时香菇茵体基本无法生长，香菇最适生长及产酶p h 值为3 。5 ； 2 0 低温有利于香菇生长，但最适产酶温度是2 5 。c ；c u 2 。浓度为o 2 1 0m m 时有利于香菇漆酶的合成，其中o 4m m 是香菇产漆酶的最 佳铜离子浓度，肖铜离子终浓度超过5m m 时，严重抑制香蘸菌丝的 生长：除了2 ，5 一二甲基苯胺之外，阿魏酸、愈创木酚、没食子酸、黎 芦醇等诱导剂促进香菇合成漆酶的作用不明显，反而会抑制菌丝生 长；t w e e n 一8 0 的加入不利于漆酶合成。香菇漆酶在6 0 条件下保温 1h 后仍残余了2 的活力；以a b t s 为底物的最佳反应温度是6 5 ， 最适反应p h 值为2 2 ( 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液体系) 。 印染废水是工业用水大户，由于印染工艺中染料不能完全上色纠 织物上，残余的染料成了印染废水主要污染物质之，而这些染料独 特及稳定的化学结构使其很难在传统的有氧条件下被微，1 i 物处理，因 此，以漆酶处理印染废水受到了人f l j t 。泛关注。本文应用彩绒革盖菌 和香菇产生的粗漆酶液对2 0 种常用染料进行催化降解，并针对真菌 漆酶处理染料过程中来自环境p h 值和温度、染料结构和浓度以及漆 酶来源和酶活力等影响因素做了进步研究。结果表 男真菌漆酶可以 赢接降解二十种工业染料中的1 4 种，染料慧否能与漆酶寅接作用， 主要墩决予染拳善的具体结构丽不仪仅是发色基团；染料浓度和酶活力 的增加均会加快染料的降解速率，但对总脱色率的影响不大，过高的 染料浓度易馒最终脱色率略有下降；降解体系温度越高，越有利于加 快降鳃速率，但过高的温度影响到漆酶的稳定性；每种染料脱色最适 p h 不完全一致，大部分染料最适p h 出现在弱酸范围内；由于活性 位点等性质上的差异，使得两种来源的漆酶对染料的脱色效果不尽相 同：以a b t s 等三种染料作为介体对漆酶降解染料起到一定的促进作 用，其中以a b t s 的促进效果最佳。 关键词：彩绒革盖菌；香菇；漆酶；酶性质；染料；脱色 p r o d u c t i o no fl a c c a s e sf r o mw h i t e - r o tf u n g ia n d t h e i r a p p l i c a t i o n si n 粉e e 1 0 1 i z a 垂i o no fd y e s a b s t r a c t l a c c a s e sa r eb l u e l n u l t i e o p p e r c o 藏t a i n i n gp h e n o l o x i d a s e st h a t c a t a l y z et h eo x i d a t i o no fav a r i e t yo fo r g a n i cs u b s t r a t e sc o u p l e dt ot h e r e d u c t i o no fm o l e c u l a ro x y g e nt ow a t e r t h e e n z y m e s a r ew i d e l y d i s t r i b u t e di n h i g h e rp l a n t sa n dm a n yf u n g i 。l a c c a s e sc a nb e u s e di n m a n yf i e l d s ，s u c h a s d e l i g n i f i c a t i o n ，b i o b l e a c h i n g ，d e t o x i f i c a t i o n ，a n d w a s t e w a t e rt r e a t m e n t a llt h e s ea p p li c a t i o n s r e q u i r el a r g eq u a n t i t i e so f e n z y m e ，w h i c hm a k e st h es c r e e n i n go fm i c r o o r g a n i s m sa n do p t i m i z a t i o n o fc u l t u r ec o n d i t i o n sf o rh i g hl a c c a s ep r o d u c t i o nv e r yi m p o r t a n t t h i sp a p e ri n v e s t i g a t e do p t i m i z a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o n sf o rl a c c a s e p r o d u c t i o nb y t r a m e t e sv e r s i c o l o ra n dl e n t i n u l ae d o d e s ，i n c l u d i n g c u l t i v a t i o nm e t h o d ，t e m p e r a t u r e ，i n i t i a lm e d i u mp hv a l u e ，c o n c e n t r a t i o n o fm e t a li o n s ( c u 2 + a n dm n 2 十) ，t y p e so fi n d u c e r s ，i n d u c e rd o s a g e ，a n d a d d i n g t i m eo fi n d u c e r sw e r es t u d i e da n d o p t i m i z e d 。p a r t s o f c h a r a c t e r i s t i c so ft h ec r u d el a c c a s e sw e r es t u d i e da sw e l l 。 t h er e s ul ts h o w e dt h a trv e r s i c o l o rs u i t e dt og r o wa n dp r o d u c e l a c c a s e sa tp h 3 5 5 。7 u n b u f f e r e dm e d i aw e r ea b l et og e tg o o dl a c c a s e p r o d u c t i v i t yw h i l eb u f f e r e dm e d i ac o u l dg e th i g h e rl a c c a s ea c t i v i t y m e t a l l v i o n sc u 2 a n dm n 2 + i nt h ec u l t u r ec o u l dr e m a r k a b l yi n c r e a s et h ea c t i v i t y o ft a c c a s e s t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fc o p p e r ( i i ) w a s8 8 0t a m ，a n d t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fm a n g a n e s e ( i i ) w a sa b o u t10g m ，w h e nt h e c u l t u r ec o n t a i n e d0 。1m m2 , 5 一d i m e t h o x y a n i l i n e 。a m o n gf i v eu s u a l r e v u l s a n t s ，2 , 5 一d i m e t h o x y a n i l i n e w a st h eb e s to n e i t s o p t i m a l c o n c e n t r a t i o nw a s0 4m ma n di ts h o u l db ea d d e dd u r i n gt h el o g a r i t h m i c g r o w t hp h a s e u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h es u i t a b l ec u 2 + c o n c e n t r a t i o nw a s 0 4m i e n z y m a t i cc h a r a c t e r i z a t i o ni n d i c a t e dt h a tr e s i d u a la c t i v i t yw a s - 9 5 4 a n d8 0 1 o fo r i g i na f t e r6 hm a i n t e n a n c ea t3 0 a n d4 0 。c ， r e s p e c t i v e l y a f t e r1 hm a i n t e n a n c ea t6 0 。c t h ea c t i v i t yw a sl e f t13 9 t h eo p t i m a lr e a c t i o nt e m p e r a t u r eo fl a c c a s ew a s6 5 。ca n dt h eo p t i m a l r e a c t i o np hw a s2 4 3 。 f o re d i b l em u s h r o o ml 。e d o d e s ，s t a t i cc u l t i v a t i o nw a sb e t t e rt h a n s h a k i n go n ef o rp r e p a r a t i o no fl a c c a s e w h e nc u l t u r ep hw a s 5 。6 。l + e d o d e sw a sb a s i c a l l yu n a b l et og r o w t h eb e s ta c t i v i t yo fl a c c a s ew a s f o u n dw h e n p hw a sa r o u n d3 5a n dc u l t u r et e m p e r a t u r ew a s25 。c ，t h o u g h 2 0 。cb e n e f i t e dt h eg r o w t ho ft h em u s h r o o m t h ec o n c e n t r a t i o no fc u 2 + f r o m0 2t o1 0m mi m p r o v e dl a c c a s e p r o d u c t i o nb yl e d o d e si n e v i d e n c e ，w h i l et h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fc u 2 + w a s0 4m m t t o w e v e r w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fc u 2 + e x c e e d e d5m m ，t h eg r o w t ho fl e d o d e s w a si n h i b i t e d 。e x c e p t2 , 5 - d i m e t h o x y a n i l i n e ，o t h e rf o u ri n d u c e r s ，f e r u l i c a c i d ，2 - m e t h o x y p h e n o l ，g a l l i ca c i d ( 3 ，4 ，5 一t r i h y d r o x y b e n z o i ca c i d ) a n d v v e r a t r y la l c o h o l ( 3 , 4 一d i m e t h o x y b e n z y l a l k o h 0 1 ) d i dn o ti n c r e a s el a c c a s e a c t i v i t yv e r y m u c hb u ti n h i b i t e dt h em u s h r o o m s g r o w t h i n s t e a d 。 t w e e n 一8 0a f f e c t e dt h ey i e l do fl a c c a s en e g a t i v e l y 。t h er e s u l ta l s os h o w e d 2 o ft h ea c t i v i t yo fl 。e d o d e sl a c c a s er e m a i n e da f t e r1hi n c u b a t i o na t 6 0 。o p t i m a lr e a c t i o nt e m p e r a t u r eo ft h el a c c a s ew a s6 5 a n d o p t i m u mp h w a s2 2 ，u s i n ga b t sa ss u b s t r a t e p r e s e n t l y , am u l t i t u d eo fs y n t h e t i cd y e sa r eu s e di nt h ep r i n t i n ga n d d y e i n gi n d u s t r i e s b e c a u s eo f t h e i ru n i q u ea n ds t a b l ec h e m i c a ls t r u c t u r e s ， c o m m e r c i a ld y e sa r en o tu n i f o r m l ys u s c e p t i b l et om i c r o b i a la t t a c ki n c o n v e n t i o n a la e r o b i ct r e a t m e n t s r e c e n t l y , t h e r eh a sb e e ng r e a ti n t e r e s ti n t h ed e c o l o r i z a t i o no ft e x t i l ed y e su s i n gl a c c a s eb e c a u s et h ee n z y m eh a sa w i d er a n g eo fs u b s t r a t e sa n dc a nd e g r a d ed y e se f f i c i e n t l y t h i sp a p e ru s e d t h ec r u d el a c c a s ef r o mzv e r s i c o l o ra n dl 。e d o d e st or e m o v et h ec o l o ro f t w e n t yi n d u s t r i a ld y e si nc o m m o n u s ea n df o u r t e e na m o n gt h e mc o u l db e d e c o l o r i z e db yt h ee n z y m e 。b e s i d e st h i s ，t h ef a c t o r si n f l u e n c i n gt h e d e c o l o r i z a t i o no fd y e sb yt h el a c c a s e s ，s u c ha sc o n c e n t r a t i o no fl a c c a s e s a n dd y e s ，s o u r c e so fl a c c a s e s ，c l a s s i f i c a t i o no fd y e s ，p ha n dt e m p e r a t u r e e t c ，w e r es t u d i e d w h e t h e ro n ek i n do fd y ew a sd e c o l o r i z e db yl a c c a s e d i r e c t l y , i nf a c t ，i td e p e n d s o ns t r u c t u r eo fd y eb e s i d e si t sc o l o r c h r o m o p h o r e i n c r e a s i n ge n z y m ea c t i v i t yc o u l de h a n c et h ev e l o c i t yo f d e c o l o r i z a t i o nr e a c t i o n ，b u td i dn o ta f f e c tt h et o t a ld e c o l o r i z a t i o nv e r y m u c h t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nr e a c t i o nv e l o c i t ya n dc o n c e n t r a t i o no f d y e sf o l l o w e d am i c h a e l i s m e n t e n l i k es a t u r a t i o nk i n e t i c s t h et o t a l d e c o l o r i z a t i o no fd y e sw o u l db ed e d u c e dw i t hi n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no f d y e s w i t ha l o n gt h et e m p e r a t u r ei n c r e a s i n g ，t h er e a c t i o na c t i v i t yo f l a c c a s ew a se n h a n c e d ，b u ti t st h e r m a ls t a b ili t yw o u l db er e d u c e d t h e o p t im a lp ho fe a c hd y ew a sd if f e r e n t ，h o w e v e r , a l lo f t h e ma p p e a r e di n t h ep hr a n g2 - 6s i n c et h ea c t i v i t yo fl a c c a s ei sh i g hu n d e rw e a ka c i d i c c o n d i t i o n t h ed e c o l o r i z a t i o no fd y e sb yzv e r s i c o l o rl a c c a s ea n dl e d o d e so n ew a sn o tc o n s i s t e n tc o m p l e t e l yb e c a u s et h ea c t i v es i t e so ft h e l a c c a s e sw e r ed i f f e r e n t a d d i t i o no fa b t sa n do t h e rt w od y e sa s m e d i a t o r sc o u l dp r o m o t ed e g r a d a t i o no fs e v e r a ld y e sb yl a c c a s e a m o n g t h em e d i a t o r sa b t sw a st h eb e s to n e y uz h a n g ( a p p l i e dc h e m is t r y ) s u p e r v i s e db yd r f e n gh o n g k e yw o r d s ：t r a m e t e sv e r s i c o l o r ，l e n t i n u l ae d o d e s ，l a c c a s e ，e n z y m e c h a r a c t e r i z a t i o n ，d y e ，d e c o l o r i z a t i o n v l l 附件一： 东华大学学位论文原创性声明 本人郯- 曩声明：找恪守学术道德，崇尚严i 荸。! 风。所，1 交的。学付论丈是本人n ：导师的 指导l 、，独：进州丌究l ：作所取得的成果。除文中已明确沣明和引州的内窬外，本论文彳i 包 含任何其他个人或集体l 经发表或撰弓过的作 及成果的内弈。论丈为本人亲自撰弓，找对 所下j 的内容负责，井完全意识剑本声明的法律结果山本人承担。 学何论文作者签名： h 期：歹衫年 附件二： 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解校有关保留、使川位论文的规定，同意学校保留了f 向国家 仃犬部i j 或机构送交论文的复印仆和电r 版，允许沦文被a 阅或借阅。本人授权尔# 入学叫。 以将本学侮论文的拿部戏部分1 人j 窬编入有笑数据痒进行检索，可以采川影印、缩印戏扫描等 复制手段保存和7 【! 编本7 化论文。 保密叼，住 1 年解密后适川本版权 5 。 本。学位论文属1 i 小保密口。 学位论史作者签名： 旋乏 h ! 【j j ：夕彳年，月多日 指导教师签名： 体极 日期：泐多年月乡日 露季天学硕t 论文真凶漆酶黼j 备及鲫：辫m m 计j 足6 顺 第一章前言 1 1漆酶概况 漆酶是目自玎研究较为热门的一种酶，多被用于木质素降解和纸浆乍物漂广1 。近年水， 由于其具有较广泛的底物范围，漆酶在处理废水，尤其是印染废水的研究- 1 t 获得j 较高 的脱色率，并大大降低了其它方法处理印染废水时对环境产生的污染。 1 1 1 漆酶的历史与来源 漆酶【1 】是一种含铜的蓝色多酚氧化酶( l a c c a s e ，p d i p h e n o lo x i d a s e ，e c l 1 0 3 2 ) 。该 酶最早是在1 8 8 3 年由同本人y o s h i d a 在漆树( r h u sv e r n i c i f e ，口) 的汁液中发现，1 8 8 4 年 b e r t r a n d 将其命名为漆酶，1 8 9 6 年l a b o r d e 发现真菌中也存在漆酶，岳宋发现能分泌 漆酶的真菌种类非常多( 特别是白腐菌中分布更广泛) ，近几卜年来的研究结粜表l 刿禽 有漆酶的真葡约七十余种。在这些真菌中以担子菌、亚门层菌纲命l 莉f - l 的彩绒麓。彳：简 ( t r a m e t e sv e r s i c o l o r ，p o l y p o r u sv e r s i c o l o r ，c o r i o l u sv e r s i c o l o r ) 产漆嗍毓较多，研一积j 也较为透彻。 1 1 2 漆酶性质及应用 漆酶按来源可分为：漆树漆酶和真菌漆酶两大类【引。不f 叫束源漆酶f 内乡占构和。p t 顷也 不完全相同，漆树漆酶和真菌漆酶在分子量、等电点、氧化还原电辨等方向都仃n ：眷异， 真菌漆酶的分子量在5 9 k d a 8 0 k d a 之间，多为分泌型糖蛋白，含糖曼3 5 小等， 大多为蕾体酶，等电点p i 在3 6 【3 1 。真菌漆酶的催化活性高于漆树漆酶，斟而真菌漆 酶比漆树漆酶具有更广泛的应用日，j 景。目的漆树漆酶的应用研究芒嘤集f i ：，| 漆1 1 。燥f 戈 膜、毛发染色、固定化漆酶电极等方面：而真菌漆酶的应j j 研究二 i 要t j i j j ；境、食j “生 物、造纸、纺织印染等诸多现代工业领域f 4 】例如：染料废水的脱色2 j 去毒、一j ：壤的； 化；饮料中酚的脱除、油中除氧；生物传感器的构建、免疫榆测1 5 l ；创伤植物的h 戊f 裂 护；生物制浆及漂白、纸浆脱木质素；织物的漂白、染料的合成| 6 i 等。 1 1 3 漆酶的结构及底物 第1 页 露季天学硕十论文真燃酶肿j 器及其住辩。盖色中的刚，灿顺 漆酶分子中一般含有四个铜原子( 图1 1 ) ，根扼磁学及其光谱学r 扛质的f i hl ，j 将陔 四个铜原子分为三种类型：即i 型c u 2 + ( t y p e ic u ，t ic u ) 和i i 型c u 2 + ( t y p e 2c u ， t 2c u ) 各一个，i j i 型c u 2 + ( c u 2 4 + ，t y p e3c u ，t 3c u ) 两个。其中t 1c u 是单电子受 体，呈蓝色，在6 1 4 n m 处有特征吸收峰，具顺磁性，可以用顺磁共振( e s r ) ，有i 个 配体，是2 个组氨酸( h i s ) 和一个半胱氨酸( c y s ) ；t 2c u 也是币电子受体，具顺磁性，可 用e s r 检测，但无特征吸收峰，它的配体是2 个组氨酸( h i s ) 平n 一个水分予，里t 犁几何 结构；t 3c u 是双电子受体，呈反磁性，紫外光谱在3 3 0 n m 处何宽吸收峰，它的2 个 c u 2 + 通过一个氧桥键连接，另外还有3 个组氨酸配体，形成四方：立体结构。由于真菌漆 酶的含糖量较高，难以获得用于x 射线一衍射分析的币晶，直到1 9 9 8 年d u c r o s j 从 c o r p p r i n u sc i n e r e u s 菌中得以制备，并且成功地分析了它的结构【_ 7 1 ，该x 射线 i j 射艟示 t 2 和t 3 被定位在0 4 n m 的空| 日j 内形成了一个i 核中心结构。 h i s 甲i sh r i m ”- ”e u c y s h o i 。 h h i s 图1 - 1 漆酶中心结构示意图 有关漆酶的催化机理，f a r v e r 等【8 】曾指出t 1 活性位点的铜离子从还原念的底物1 7 支收 电子，再将其传递到三核中t 2 和t 3 型铜离子，分子氧在这罩经超氧化物过渡体进步 被还原成水，底物则被氧化成不稳定的自由基，进而导致各种各样的非酶促次级反应， 如：羟化、歧化、聚合或被漆酶氧化分解为更简单的化合物。漆酶可催化氧化不同类型 -e 的底物已达2 5 0 多个，而且还有增加的趋势，按底物的结构可以归纳划叫：酚类及其衍 生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾体激素和牛物色素、余属仃机化合物和其 它非酚类底物( 如：亚铁氰化钾、抗坏血酸、苯环上连仃羟摹、烷氧纂、氨基的吲哚衍 生物等) 。 1 2印染废水的主要成分及处理方法 1 2 1 印染废水的主要成分 第2 页 碧季天学硕一+ ：论文真燃酶的制备及其住黼愀鲫舻川 i i6 l i 砭 印染废水是指棉、毛等天然纤维或化学纤维纺织品在漂炼、染f q 、印花和移理过水 中所产生的废水。在我固，印染产业是基础产业之一，但印染行业楚1 ：、i p 废水排放大“， 每年约有6 7 亿吨印染废水排入水环境中。印染废水具有水量大、有机污染物含量高、 色度深、碱性大、水质易变化等特点，处理该废水的最大问题足色度和雌降解有机物的 去除。带有色泽的水，排放至天然水源，一般不宜饮用，对环境影响较大，尤其足对r 白净能力较弱的水域。使用常规的物理、化学方法( 如氧化法) 难以有效地消除这类污 染，因此印染废水的处理不仅是当日，j 废水处理的难点，也足闷丽的研究热_ 。抓f 天j 之 献报道，利用生物法脱色和降解去除这类废水中染料等有害物足汀 邪小境的订效方法。 印染废水中的污染物质主要来源于纤维材料、纺织用浆，以及印染加工中的漂煳；、 染色、印花、整理等工序中使用的染料、化学药剂、表面活件剂和抨类枢胖剂。此， 印染废水中大多含有残余染料、染色助剂、酸碱以及一些霞金属等，其中钱余染利及助 剂构成了废水中有机污染物的主要成分，并使废水带有特殊的颜色。再：令f t l ：界范l h 勺， 合成染料广泛用于工业印染过程中，每年要消耗掉超过7 0 0 ，0 0 0 吨约1 0 0 0 0 多种不同的 染料，其中1 0 - - - - 1 5 的染料流失到废水中1 1 0 】。这些污染物色泽深，b o d ( 生化需氧量) 和 c o d ( 化学需氧量) 值很高，但b o d c o d 比值很低，可生化性低，有些还含有各种有毒有。离物 质，对人类健康影响很大，使其难于利用常规废水处理方法有效去除。7 ( ) 年代朱的研究 发现，某些肠道细菌可降解几种偶氮染料。由于微，上物繁殖速率快，适应：强，利用j - j 丑 行废水处理，成本低廉，因此，许多学者致力于分离选育对染料有较高降解活限的菌株。 最初分离得到的菌株大多只能在厌氧条件下不完全降解染料，使其应用范围受到限制。 近年来，发现一些丝状微生物，如白腐菌，可在有氧条件下降解多种类犁的染料。 1 2 2 印染废水的处理方法 目日订，处理印染废水的方法【有很多，大致可分为三大类，即物理法、化学法及：i 二 物处理法。其中，生物处理法由于绿色坏保、运行成本低且可获得比较高的脱色率，冈 此是近期印染废水脱色研究的热点。生物法脱色主要是利用微生物的酶柬氧化或还坞i 染 料分子，破坏不饱和键及发色摹团。脱色微生物对染料具有专惟，其降解j ! 砟分，f 1 个 阶段充成。先是染料分子的吸附和富集，接着是染料分子的降解，通过系训的0 l 化、 还原、水解、化合等生命活动，染料分子最终被降解成简单无机物或转化为务种f 掾物 及原生质。目日订用于生物脱色的菌种主要有丽种：硫酸吉舞还原蔺和f ：j 腐陶，其巾以 ? ；弦毒 菌处理印染废水的研究最为突出。而在白腐菌使染料脱色l 2 】时起 t 要作用的就是：t 人水 第3 页 碧季天学硕1 ：论文真菌漆酶的制备及其住辩f 脱色巾的刚，灿顺 质素降解酶：木质素过氧化物酶( 1 i g n i np e r o x i d a s e ，l i p ) 、锰过氧化物酶( m a n g a n e s e p e r o x i d a s e ，m n p ) 和漆酶( i a c c a s e ，l c c ) 。与l i p 和m n p 相比，漆酶义具有更人的潜 在应用价值。首先，l i p 和m n p 是在既限碳、又限氮条件下产生的1 矿格次级代谢j 、，= 物， 而工业废水中碳、氮源营养物的存在限制了细胞对酶的分泌；另外，【 j 于它们以：降解仃 机污染物时需要大量的h 2 0 2 作为辅助剂，这在现实情况下很难实现。而漆酶可在碳和 或氮存在条件下由菌体分泌，更重要的是漆酶能把分子氧直接还原为水，冈此在没有 h 2 0 2 和其它次级代谢产物存在下，照样可催化氰化有机污染物。 1 3真菌漆酶处理染料的研究现状 漆酶作为一种氧化还原酶，可以通过电子的转移催化氰化多种有机和无机化合物， 氧分子常常作为电子的接受体。漆酶氧化它的底物过程中，来i q i t , - 。陀巾，山的四个c u 离子被还原成c u + ，电子进一步转移将分子氧( o o ) 还原成水( o 厶) 。底物则被氧化 戊 为活泼的阳离子自由基，不稳定的自由基发生水合、歧化、聚合或进一形被漆酶催化瓴 化分解成为简单的化合物【1 3 】。在此过程中，如果自由基的寿命长一些，它就可以从其它 富电子体如合成染料中获得电子而重新恢复其原有结构。币是由于这，电子转移机王哏使 得漆酶能降解很多染料【1 4 】( 见表1 1 ) ，其部分染料结构见附录1 。研究表明蒽醌类、偶 氮类、三芳基甲烷类、靛蓝类和聚合类染料可以直接或| 、日j 接( 介体存在的条件下) 【i , l 漆 酶反应。除了染料外，漆酶还可与染料废水中的其它成分如氯酚类、芳香胺类等反j 、v ， 从而对印染废水进一步脱毒。 目自订利用漆酶脱除染料颜色所采用的方式主要有以下三种： 1 ) 染料的整细胞脱色 利用产漆酶的整细胞进行脱色时，其它的胞内、胞外酶( 如l i p i ”1 6 1 ) 等也能起到 脱色作用，从而使得利用整纽胞脱色染料一般都能获得较高脱色率。p o i n t i n g i l 7 1 ， c h i v u k u l a 1 引、p a s z c z y n s k i l l9 1 、p a s t i g r i g s b y l 2 0 1 、s w a m y l 2 1 1h e i n f l i n 9 1 2 2 1 等就是利用产漆嗨 菌体对一系列偶氮类染料进行了脱色实验并获得了良好的脱色效果。然而这些研究都是 仅限于对模拟印染废水的脱色处理，实际的印染废水中由于成分极其复杂，很l i 能存4 ： 抑制真菌产酶的化合物( 如高盐成分等) ，甚至杀死真菌。 第4 页 碧霉天学硕十论文真凶漆酶的制蠡及其仡黼脱刨训， 表1 1 利用漆酶处理过的染料 2 ) 染料的纯酶脱色f 2 3 2 稍 利用缝酶进行染料脱色的研究，近年柬也逐溉增多起柬。方蕊。该类娥究钌剽j i 染料漆酶脱色机理的探讨；另方面，也能克服整细胞脱色印染废水时的彳i 利疗| f f ： 是，使用纯酶处理废水时需要酶的分离纯化，以殷为了豳收酶惭避 娜i u “! ；之 艺，这就尺欠 第5 页 碧季大学硕十论文真菌漆酶的制备及其在辩愀钟的应刖灿。页 提高了印染废水处理时的成本。 3 ) 染料的料酶脱色 利用半h 酶液脱除染料颜刨2 5 1 能克服整细胞处理印染废水时生长受抑制的缺点，同f t , j 其它胞外酶还可以提供协同脱色作用，但需要考虑粗酶液中的其它胞外酶系的影h 向j 人j 素 ( 如h 2 0 2 浓度对m n p 的影响【2 6 1 ) ，为提高酶液的利用率，也可以将其| 卤：| 定化，成本介 于以一1 - 两种方法之间。 1 4 漆酶及真菌处理印染废水的影响因素 1 4 1 染料化学结构的影响 迄今为止，利用漆酶处理的染料类型有偶氮、葸醌、三芳甲烷、靛类、酞箐类、杂 环和聚合类例染料。其中日i 【j l j 利，染料在工业中应用十分j 泛，斟丽哑受到研究l - f l 栉的 青睐。对于偶氮类染料脱色机理研究较为透彻，首先，偶氮类染料存漆酶的作用f 舀：嘭 环上失去个电子形成酚氧自由基，继而再失去另一个电子，形成阳离子( 因芳环i ：有 供电子取代基而稳定存在) ( 1 8 】。靛类染料中以靛蓝( c i 还原蓝1 ，v a tb l u e1 ) 研可芒最 多，作为牛仔向上色主要染料，在漆酶催化电子转移作用下，先形成靛细，进i 而脱：碳 酸摹，最终以稳定的氨基苯甲酸氧化产物形式存在1 2 引。 虽然真菌漆酶的具有较高的氧化还原电势( o 7 - 0 8v ) ，但并不是所有工业染料均 能被其降解或彻底脱色。这与染料的结构有着密切的关系，通常，蒽醌类染料是漆酶的 优良底物，大部分偶氮类染料易于脱色【2 3 1 ，而三芳甲烷类染料则难r 脱色f 2 9 1 。荨# 史j ：， 不仅染料的发色暴团影响到真菌漆酶的脱色效果，而且发色基l = j 1 1 棚连的笨环 ：取代壤的 种类和位置、发色基团的数目以及染料的分子量都卣接影响到漆酶处理陔染料的脱以 率。对于小分子偶氮染料2 4 1 ，与偶氮皋团直接相连的芳香环上的取代堆川的电子作j | 慢 于空| 、日j 效应。一般来讹该芳香环上连有供电基团( 羟基、甲氧基和甲基) 的偶氮染料 ： 易于同漆酶发生作用，连有吸电子作用的取代基( 如：氯、氟和石肖堆) 则强烈抑制f 【崭 。 漆酶氧化该偶氮型染料，各取代基对提高染料脱色率顺序为o h o c h 3 一c h 3 c i f n 0 2 。此外，单取代时甲基位于问位比邻位和对位的染料更易_ f 脱色p o 】。三芳 烷类 染料副品红不能直接与漆酶作用，但它的甲基化衍生物结晶紫就易：j 二脱色，这很可能就 是甲基供电性作用所至。 第6 页 碧季天学硕十论文真菌漆酶的制备及其住辩撇色中的应川典6 。页 1 4 2 染料浓度的影响 随着时问的延长，漆酶对不同浓度染料的脱色率都呈上升趋势，f 降解速率不f r 刁， 脱色率也随之出现差异，适当的染料浓度可以缩短染料的反应时i j j ，提离最终的染料总 脱色率。c l a u s 等1 3 l j 的结果显示分别利用三种白腐菌纯漆酶处理多种单色染料时，所作 的染料浓度一脱色率曲线都不一致，但有一个相同的大致趋势，就是随着染料浓度从f 氐 ( 约 2 0 0m g l ) ，大部分染料的漆酶脱色率从低到高返刽最人值婿 又降低，即染料浓度有一最佳值，在2 0m l 附近脱色牢最高。染料浓瞍j 脱任反膨速 率之间呈现两种关系：起初反应速率随着染料浓度的增加迅速增加，当染卡：f 浓度j ：升刘 一定值后，一部分染料反应速率丌始呈现下降趋势，这可能是降解产物对该酶反应产7 卜 了抑制作用；另一部分则继续随着染料浓度的增加而升高，但上升趋势趋于缓慢，自峰 甚至逐渐趋于定值，使得该酶反应完全符合米氏规律3 2 1 。 1 4 3 真菌漆酶来源和酶活力的影响 不同来源的漆酶性质一i z 有很多相近之处，而催化能力却不完全一敛，r o d r i g u c z 等 人f 2 5 1 发现：束源十zh i s p i d a 的漆酶的分子量为6 8k d a ，来源于7 o s l r e ( t l u s 的分，j ，毓为 6 4k d a ，zv e r s i c o l o r 的为6 7k d a ，pe r y n g i i 的为6 1 6 5k d a ：然而th i s p i d a & po l l e ( m u v 的漆酶却表现出不同的底物专一性，zh i , w i d a 粗漆酶能脱除2 3 种染料中的1 1 种，向 po s t r e a t u s 粗漆酶只能氧化其中的5 种。对此实验结果，他们认为，一疗| i i 这种等肄n 可能是由于其它酶系在起作用；另一方面，不同漆酶的催化差异与其不同的氨犟骏r t ：纠j 有关。c l a u s 等【3 l 】发现zv e r s i c o l o r 和户p i n i s i t u s 的漆酶活力明显高于膨t h e r m o p h i l a 漆 酶，他们认为这不是培养条件的影响，而应该是不同的漆酶具有不同的氨蘩睃序列的原 因。因此寻找一种价格低廉又可以对大部分染料起作用的含漆酶菌种县订卜分母嘤的研 究意义。 酶的活力决定了反应的速度，但不能改变染料的最终脱色率。s c h l i e p h a k e i 圳等人健 用户c i n n a b a r i n u s 纯漆酶降解芝加哥天蓝，结果表明最仞的染料吸光艘变化了f t , 1 f u j l 线 性关系，而该直线的斜率取决于漆酶酶活。c l a u s l 3 1 1 发现以1 6n k a t m l 的尸p i n i v l l , i y 漆 酶直接处理酸一陀蓝7 4 使其完伞脱色需要1 6 h ，而如将酶活提高到1 7n k a t m 时仪前砭 4 h 就可以完全脱色。n a g a i 等【3 3 1 也曾指出漆酶脱除四种染料颜色的速度墩决f 漆酶的总 活力，肖漆酶的活力为5u m l 时，9 0 分钟后染料仅剩下最初的1 0 。 第7 页 碧季天学硕十论文真凶漆酶的制备及其住辩m 色中的刚，舢页 1 4 4