（应用化学专业论文）单光子和双光子激发的均二苯乙烯型金属离子荧光探针.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 最近双光子显微镜成为生物活体样品成像的重要工具，为了充分利用双光子显微 镜，关键是设计合成具有双光子吸收的荧光探针。均二苯乙烯型荧光团由于具有较大的 双光子吸收截面积，被广泛应用于双光子激发荧光探针的合成中。 本文合成了受体4 “- 二( 乙酰氧乙基) 氨基苯甲醛( r e c e p t o r - 1 ) ，受体4 - 二 ( 乙氧羰甲基) 氨基苯甲醛( r e c e p t o r - 2 ) 、3 一乙氧羰甲氧基4 - n , - 二( 乙氧羰甲基) 氨基苯甲醛( r e c e p t o r - 3 ) ，通过v i l s m e i e r 反应和w i t t i g h o m e r 反应合成了四个d 7 1 ；a 型二苯乙烯探针n s b 、c s b ，四个d - 7 c a - 兀- d 对称型均二苯乙烯荧光探针d s b l d s b 4 和一个d 毋a 丹d 不对称型均二苯乙烯荧光探针d s b 5 。 比较d 7 c a 型二苯乙烯探针n s b 、c s b 的光谱性质，测试了其对金属离子的选择 性，p h 滴定发现n s b 型探针表现出不同的耐酸性：n s b i 对酸敏感，n s b 2 具有很强 的耐酸性，通过比较n s b l 与n s b 2 的核磁数据验证这种差距与羰基的位置有关。 为了研究探针分子对金属离子选择性，分别合成了d s b l 、d s b 2 、d s b 4 三个探针 分子，测试了其对金属离子的选择性，由受体r e c e p t o r - 2 合成了d s b 3 荧光探针，并测 试了其对金属离子的响应，比较了受体r e c e p t o r - 1 与r c e p t o r - 2 选择性的差异，这种差 异和羰基的位置有关；由于以均二苯乙烯为母体的荧光探针具有较大的共轭体系，存在 分子内电荷转移，对溶剂极性比较敏感即溶剂化作用，随溶剂极性的增大会出现发射波 长红移的现象；d s b 2 分子的设计是为了增加均二苯乙烯型分子的醇溶性，并测试了其 对p h 的响应情况。d s b 型探针分子在不同溶剂中的荧光量子效率相差较大，在强极性 溶剂中荧光较弱。当采用8 0 0a m 激发时，发射光谱与单光子激发相似，强度要弱于单 光子激发强度。总结上述实验，合成了d 7 c a 兀d 不对称型荧光探针d s b 5 ，并测试了 其对金属离子的选择性、溶剂效应以及双光子激发光谱，发现当加入a r 或h 9 2 + 后荧光 增强。 综上所述，通过合成四个d 一兀_ a 型二苯乙烯探针n s b 、c s b ，四个d 兀a 7 c d 对称 型均二苯乙烯荧光探针d s b l d s b 4 和一个d 7 c a 7 c d 不对称型均二苯乙烯荧光探针 d s b 5 ，探讨了二苯乙烯、均二苯乙烯型分子与金属离子的作用机理，为进一步设计合 成高选择性的探针分子提供帮助。 关键词：二苯乙烯；均二苯乙烯；荧光探针；双光子 单光子和双光子激发的均二苯乙烯型金属离子荧光探针 d i s t y r y l b e n z e n e b a s e df l u o r e s c e n ts e n s o r sf o rm e t a li o n se x c i t e db y o n e - - p h o t o na n dt w o - p h o t o n a b s t r a c t r e c e n t l y ，t w o p h o t o nm i c r o s c o p y ( t p m ) h a sb e c o m e av i t a lt o o lf o rl i v e t i s s u ei m a g i n g f o rm a x i m u mu t i l i z a t i o no ft p m i ti sc r u c i a lt od e v e l o pe f f i c i e n tt w o p h o t o np r o b e sf o r s p e c i f i ca p p l i c a t i o n s t h ef l u o r o p h o r e o fd i s t y r y l b e n z e n e a p p l i e di nt h es y n t h e s i so f t w o p h o t o np r o b e sh a sal a r g et w o - p h o t o nc r o s s - s e c t i o n t h e r e c e p t o r s o f 4 - n , n - b i s ( a c e t y l o x y e t h y l ) a m i n o b e n z a l d e h y d e ( r e c e p t o r - 1 ) ， 4 7 ：n - b i s ( e t h y l o x y c a r b o n y l m e t h y l ) a m i n o b a n z a l d e h y d e ( r e c e p t o r - 2 ) a n d3 - e t h y l o x y c a r b o n y l m e t h y l o x y l 4 - n , n - b i s ( e t h y l o x y c a r b o n y l m e t h y l ) a m i n o b e n z a l d e h y d e ( r e c e p t o r - 3 ) w e r e s y n t h e s i z e di nt h i sp a p e r t h r o u g hv i l s m e i e rr e a c t i o na n dw i t t i g h o m e rr e a c t i o n ，f o u rd 一7 1 ：一a s e n s o r sb a s e do ns t i l b e n z e n e ( n s b ，c s b ) ，f o u rd 一7 c a 一7 1 ；- ds y m m e t r i cs e n s o r s ( d s b1 d s b 4 ) a n do n ed 冗a 7 c d u n s y m m e t r i cs e n s o r ( d s b 5 ) b a s e do nd i s t y r y l b e n z e n ew e r eo b t a i n e d n l es p e c t r ao fn s ba n dc s b ，t h es e l e c t i v i t yt om e t a li o n sa n dt h et i t r a t i o no fp hw e r e i n v e s t e d t h er e s u l t sw e r et h a tn s b 1w a sm o r es e n s i t i v et ot h ep r o t o nt h a nn s b 2 t h a tw a s d u et ot h ep o s i t i o no ft h ec a r b o n y lg r o u p ，w h i c hw a sp r o v e db yt h e 1h - n m r d e f e r e n c e s b e t w e e nn s b la n dn s b 2 d s b l 一d s b 4w e r es y n t h e s i z e dt or e s e a r c ht h er e s p o n s et om e t a l i o n s t h es e n s o rd s b 3 w a sd i f f e r e n tf r o mt h eo t h e r s ，w h i c hm a yb ed u et ot h es t r u c t u r eo fr e c e p t o r s t h ep o s i t i o no f t h ec a r b o n y lg r o u pi sc r u c i a lf o rt h ed i s t y r y l b e n z e n eb a s e df l u o r o p h o r e i nm o s tc a s e s ，t h e d i p o l em o m e n to fa na r o m a t i cm o l e c u l ei nt h ee x c i t e ds t a t e d i f f e r sf r o mt h a ti nt h eg r o u n d s t a t e t h o s ep r o b e su n d e r g o i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e ru p o ne x c i t a t i o n t h eh i g h e rt h e p o l a r i t yo ft h es o l v e n ti s ，t h el o w e rt h ee n e r g yo ft h er e l a x e ds t a t e i sa n dt h el a r g e rt h e r e d s h i f to ft h ee m i s s i o ns p e c t r u mi s t h ef l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d sw e r ed i f f e r e n ti n v i r o u ss o l v e n t t h et w o p h o t o ne m i s s i o ns p e c t r u mw a se x c i t e db y8 0 0i n t l d 一冗a7 1 ：d u n s y m m e t r i c a ls e n s o r ( d s b 5 ) w a ss y n t h e s i z e da c c o r d i n gt ot h es i m i l a r m e t h o d s t h e i n t e n s i t yi n c r e a s e du p o na d d i t i o no fa g + o rh g 肘 g e n e r a l l y ，f o u rs t i l b e n z e n eb a s e da n df i v ed i s 毋r y l b e n z e n eb a s e d s e n s o r sw e r e s y n t h e s i z e d t h eb i n d i n gm o d e l sb e t w e e ns e n s o ra n dm e t a l i o n sw e r ep r o p o s e d ，w h i c hm a y b eu s e f u lf o rt h ed e s i g no fh i g hs e l e c t i v es e n s o r s k e y w o r d s ：s t i l b e n z e n e ；d i s t y r y l b e n z e n e ；f l u o r e s c e n tp r o b e s ；t w o 。p h o t o n 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：惫2 鱼f 壑日期：丛1 2 ( ：垒 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位 论文版权使用规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送 交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理 工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也 可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 名：j ! 麴 翩躲盔幽 通年j 月上日 大连理工大学硕士学位论文 引言 荧光分析法作为一种分析方法，出现于十九世纪六十年代。它具有较高的灵敏度， 又有多种测定参数( 如激发波长、发射波长、荧光寿命、荧光量子效率等) ，以及多种 检测技术和方法( 如同步荧光、导数荧光、荧光偏振、荧光动力学分析法、三维荧光光 谱法及相分辨、时间分辨荧光分析法等) ，可以依据实际测定条件的不同加以选择，因 而具有实用性强、选择性好、线形范围较宽的特点，目前已经发展成一种简便实用的分 析技术。荧光探针正是这一分析方法在环境、生物化学领域的应用。 目前，对多数荧光探针来说，采用单光子激发时，最大激发波长小于5 0 0n m ，并且 多处于4 0 0n m 以下，对生物样品而言，其样品基体和一些杂质在此区域也会有吸收、荧 光，再加上光散射的影响往往会产生较为严重的背景干扰，短波激发对生物样品的损伤 较大，因此较短的激发波长限制了荧光探针的应用；针对上述情况，近几年出现了一系 列关于双光子荧光探针的报道。所谓双光子荧光探针是指探针分子能同时吸收两个光子 到达激发态，发射与单光子激发相同的荧光，这类荧光团通常具有较大双光子吸收截面 积。 近年来人们将双光子材料应用于荧光探针的设计合成领域，表现出了独特的优越 性，首先双光子激发过程使用的波长在7 0 0 9 0 0n m 的范围内，避开了生命体系所不能 承受的紫外光的损伤；其次由于生物组织对这一光波段的线性吸收与r a y l e i g h 散射均比 较小，背景光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光致毒都较小。双光子的一个 重要特征是双光子诱导的电子跃迁几率与入射光强度的平方成正比，这与线性光学现象 不同，是非线性的过程。双光子激发具有高度的空间选择性，并能深层成像。材料科学 中，双光子技术发展迅速，出现了双光子荧光显微镜、双光子三维存储、双光子动力学 疗法等技术，然而在双光子荧光探针方面却落后于这些技术，较好的并能应用于生物体 内的双光子荧光探针很少。 将双光子吸收材料应用于双光子荧光探针的合成，成为目前合成双光子荧光探针的 通用方法。目前具有双光子吸收的荧光母体主要有均二苯乙烯类、荧光素类、香豆素类。 均二苯乙烯具有相对较大的双光子吸收截面积，是一类研究较多的双光子吸收材料，是 合成双光子荧光探针的首选。通过对均二苯乙烯两端进行化学修饰，合成出对不同金属 离子有选择性的双光子激发荧光探针成为目前的研究热点。 单光子和双光子激发的均二苯乙烯型金属离子荧光探针 1文献综述 1 1绪论 伴随着学科之间的交叉出现了许多新兴学科，1 9 8 7 年，诺贝尔化学奖得主j e a nm a r i e l e h n 首次明确提出超分子化学的概念，超分子化学正是在生物学与化学相互交叉的背 景下产生的。超分子化学是研究分子组装和分子间键的化学【l 翻，是超出个分子范围 并且分子间特定作用力聚集在一起的多分子化学，它是具有超分子结构性质的科学；超 分子结构是由两个或两个以上分子经由分子间作用力所构成的实体，超分子化学改变了 化学家的两个传统观念【3 】：( 1 ) 弱的非共价键相互作用在一定条件下通过加合与协同可 以转化为强的结合力分子，( 2 ) 组装赋予超分子体系新的特性，分子不再是保持物性的 最小单位，超分子体系内各单元间通过弱的非共价键相互作用，实现分子的定向排列和 有序组装，从而构筑具有能量传递、物质输运和化学转换等功能的超分子组装体。在超 分子这一概念提出以前，人们的认识过程经历了由宏观到微观，再由微观到宏观的认识 过程，无论是物理学家还是化学家都将主要精力集中在微观或宏观这一单一领域，超分 子概念的提出使人们意识到原来在宏观与微观之间还存在着一个独特的领域，继而化学 家们不再孤立的看待分子，而是倾向于关注分子间的相互作用，因为分子和社会中的人 一样也表现有一定的“社会行为”即分子只有与它周围的分子发生作用才能展现它的性 质，这种性质通常与分子自身的性质不同。 分子识别是生命活动中一个重要的现象，是超分子化学研究的基础。分子识别是分 子之间的一种特殊的、专一性的相互作用，是主体对受体( 客体对底物) 选择性结合并产 生某种特定功能的过程f 4 1 。例如抗体对抗原的结合作用，酶对底物的专一作用。人们设 计、合成了大量能够将分子识别事件通过分子的荧光信号来有效表达的复杂荧光分子， 这些分子也就是所谓的荧光分子探针。 荧光是一种电磁辐射，是激发态分子的一种能量衰减方式。当用特定波长的光照射 荧光团( 通常是具有大的共轭平面的分子) 时，其最高能量占有轨道( h o m o ) 上的电子将 跃迁到最低空轨道( l u m o ) 上产生激发态。激发态将通过各种能量衰减途径回落到基 态，激发态荧光团的各种衰减途径包括：辐射跃迁如荧光、磷光和非辐射跃迁如电子转 移、质子转移、双键翻转等。通过改变荧光团的结构来实现荧光发射的可控性成为荧光 分子探针的设计思想。利用荧光探针分子与客体之间的超分子作用实现了类似于生物体 系中对不同底物的识别，现在荧光分子探针不但能够识别n a + 、1 0 等常见的金属离子还 能识别一些阴离子【5 - 7 】、有机极性小分子【8 】、生物小分子【9 1 。荧光分子探针也因此被广泛 大连理工大学硕士学位论文 应用于临床医学，分析化学，生物化学分析，医学和环境学等领域。目前，大多数荧光 分子探针所用的激发波长还处于3 0 0 5 0 0n l t l 的短波长区，这一类的荧光探针多数属于 单光子荧光探针，较短的激发波长是这类荧光分子探针的显著特点，这一特点也成为制 约其应用的重要缺陷。由于荧光分子探针多应用于环境相对比较复杂的领域如医学、生 化和环境学，复杂的背景也成为影响荧光分子探针灵敏度的重要因素。双光子荧光探针 就是在这样的背景下产生的。 双光子荧光探针是从具有双光子吸收的非线性光学材料发展而来的，双光子吸收是 指化合物吸收两个光子，使电子由基态激发跃迁到激发态，并以荧光发射的方式回到基 态的过程【1 0 ! z n 图1 1 。 、 t r “7 ； 图1 1 单光子( 左) 与双光子( 右) 的吸收过程 f i g1 1 t h ep r o c e s so fo n ep h o t o na n dt w op h o t o na b s o r p t i o n 双光子材料应用于生命科学等领域具有独特的优越性，首先双光子激发过程使用的 波长在生物光学窗口( 6 0 0 - 9 0 0r u n ) 的范围内，避开了生命体系所不能承受的紫外- 可 见光损伤；其次由于生物组织对这一光波段的线性吸收与r a y l e i g h 散射均比较小，背景 光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。双光子诱导的电子跃迁几 率与入射光强度的平方成正比，使得发色团的激发具有高度的空间选择性。由此可见将 具有双光子吸收的材料应用于探针的设计、合成中具有重大的现实意义。 1 2 荧光探针的识别原理 荧光探针的原理主要有光诱导电子转移p e t ( p h o t o n i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ) 、分 子内电荷转移i c t ( i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 、扭曲分子内电荷转移机理t i c t ( t w i s t e di m r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 、激基缔合物( e x c i m e r ) 、荧光共振能量转移 单光子和双光子激发的均二苯乙烯型金属离子荧光探针 f r e t ( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ) ，到目前为止，大部分双光子荧光探针 的设计还是根据单光子荧光探针的原理来设计，下面简要介绍一下这五种机理。 1 2 1 光诱导电子转移p e t ( p h o t o n i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ) u蝴。r u 盼一。丰 卜 l 眭鞋q h a 皤b 卜嗍o d c e i 谴厶f稳嚣exclrd b o u 1 i l d 1 9 , g o f i o ：p h o r er e g e p r o r # n 鳓勇o 哪6 隧r e c e p t o r 图1 2p e t 探针识别金属离子的原理示意图f 1 1 】 f i g 1 2p r i n c i p l eo fc a t i o nr e c o g n i t i o no f f l u o r e s c e n tp e ts e n s o r 荧光分子探针的组成是由其作用机理决定的，不同作用机理的荧光探针，其自身的 结构也不相同。在荧光分子探针的设计中，光诱导电子转移p e t 机理应用的最多。这类 探针分子的结构组成包括荧光团( f l u o r o p h o r e ) 、受体( r e c e p t o r ) 和连接桥( s p a c e r ) 。 根据氧化还原电位的大小，选择合适的受体和荧光团，使得富电子受体的一个电子可以 转移到缺电子的荧光团上。在这种情况下，荧光团受激发而跃迁到激发态的电子不能回 到基态而使荧光团荧光淬灭，荧光变弱。当受体与金属离子作用后，其h o m o 轨道能 量降低，荧光团受激发而跃迁到激发态的电子则能够回到基态，荧光团荧光恢复，发生 了抑制p e t 的作用。这是一种底物诱导的荧光增强现象。荧光增强c = l ( o n o f f ) 值为2 时，就有应用价值，而达到1 0 ，在暗场中就有明显的视觉效果。p e t 探针通常只有荧光 强度的变化，不会出现荧光波长的移动。 r 0 1 n o oo l o p e t 一1 p e t 2 大连理工大学硕士学位论文 p e t - 1 是最早也是结构最简单的p e t 荧光探针。加入k + ，荧光量子产率从0 0 0 3 增加到0 1 4 。而p e t 一2 【l2 j 中的受体部分是一个含硫的杂冠醚，对铜离子具有很强的络 合。但是，p e t 过程是从荧光团到金属离子，存在一个c u 2 + c u 十的还原过程，导致荧光 淬灭。当然并不是所有的荧光团都能发生p e t ，p e t 探针的设计不但要满足受体 ( r e c e p t o r ) 与荧光团( f l u o r o p h o r e ) 的氧化还原电位要相互匹配，同时连接桥( s p a c e r ) 也起着至关重要的作用，通常连接桥为一个或两个亚甲基。 1 2 2 分子内电荷转移i c t ( i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 加舳c f d n 叫晰伪e d d n o ，卵u p m 姆删o n 州狮帕a c 唧鼢岔r o u p 赋琵豳蛔 图1 3 客体对不同结构i c t 探针前线轨道的影响【1 3 】 f i g 1 3 f r o n t i e ro r b i tc h a n g eo fd i f f e r e n ti c tp r o b ew i t ht h ei n t e r a c t i o no fa n a l y t e 黔鼎 这一原理也被称作光诱导电荷转移p c t ( p h o t o n i n d u c e dc h a r g et r a n s f e r ) 。具有分子内 电荷转移( i c t ) 机理的探针分子，其结构组成上的一个不同于p e t 机理的重要特征是 荧光团( f l u o r o p h o r e ) 与受体( r e c e p t o r ) 是直接相连，没有连接桥( s p a c e r ) 部分。通 常受体与荧光团之间存在一定的共轭作用，而整个分子则为大的7 1 ；体系，受体可以是供 电子基团，也可以是吸电子基团。当金属离子与探针分子作用后，吸收光谱表现出相应 的蓝移和红移。如探针分子i c t 1 、i c t 一2 几 od o ) oq j n oo o h i c i 一1i c 。i 一2 i c t 1 1 1 4 j 为典型的i c t 荧光探针，氮杂冠醚既是受体，同时也是推拉电子体系的电 子供给体，冠醚受体部分与荧光母体萘酰亚胺形成推电子能力当金属离子进入冠醚空穴 中后，会改变体系由推电子变为拉电子，i c t 一1 与碱土金属离子如c a 2 十络合时，由于金 属离子的拉电子效应，降低了冠醚氮原子的供电子能力，因此发生荧光蓝移，并使荧光 一望堂兰塑翌堂量塑垄塑塑三茎圣堕型全星塞三茎娄堡笪 增强。i c t 一2 【1 5 】中金属离子与香豆素羰基和羧基作用而增强了原来的推拉电子体系，吸 收光谱红移，荧光峰的位置通常也要发生改变。i c t 机理的荧光探针的个显著应用在 于其可作为比例探针，金属离子与受体作用之后会使荧光团吸收出现蓝移或红移的现 象，荧光除了强度的变化之外还有波长的变化，这是i c t 机理荧光探针的重要特点。i c t 机理的荧光探针也存在缺陷：当金属离子与供电子的受体作用时，受光激发会发生光致 金属离子解离。 1 2 3 扭曲分子内电荷转移t i c t ( t w i s t e di n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 扭曲分子内电荷转移( t i c t ) 是分子内电荷转移的- - 干0 0 ，之所以将其单独说明是因 为近年来在利用t i c t 机理设计分子荧光探针方面出现了崭新的局面，如t i c t 一1 荧光探 针分子【1 6 , 1 7 】， r n h r=h c n t i c t 1 蕊 + o 厣8 0 篙协司+ o i j _ 7 j 、o = m e t a i ml l 哆j 。矿毋弋、兰一n 一口，( 长”；兰一。n 曙 探针分子t i c t 1 在与金属离子作用之前，二苯乙烯平面与冠醚平面由于经n 原子 的连接而非共平面处于扭曲t i c ts t a t e ，当金属离子与冠醚作用后，由于金属离子诱导 的c - n 键的旋转，使得当分子处于激发态时，共平面性变好为p i c ts t a t e 。这一实验现 象表明当金属离子与探针作用后，使分子由7 i i c ts t a t e 变为p i c ts t a t e ，共平面性变好 有利于增强探针与金属离子的结合，而不至于发生光致金属离子解离。 1 2 4 激基缔合物( e x c i m e r ) 激基复合是指当两个分子相互靠近时，由于分子间作用力使的两分子相互作用，分 子间的电荷会发生转移。如果原来的分子有荧光，经分子间电荷转移后会造成整个复合 物荧光淬灭，当分子间的距离超过一定值时，化合物分子又会重新发射荧光。分子间的 这种能量转移包括近程能量转移和远程能量转移。激基复合物应用于分子荧光探针设计 中的荧光团主要有萘、葸、芘等，由于形成这种激基缔合物需要激发态分子与基态分子 大连理工大学硕士学位论文 达到碰撞距离约3 5a ，所以荧光团之间的距离是形成激基缔合物的关键。葸、萘等荧光 团由于具有较长的激发单线态寿命，易形成激基缔合物，常常被用于此类探针设计中【1 引。 化合物e x c i m e r 1 【1 9 j 具有双芘荧光发色团，氮杂冠醚络合k + 或b a 2 + 后，抑制了从氮原 子到芘的光诱导电子转移，使荧光发射增强，同时单体与激基缔合物的荧光强度比发生 变化。化合物e x c i m e r 2 t 2 0 】是两个萘荧光团通过聚醚链连接的荧光化合物，碱土金属离 子c a 2 + ，b a 2 + 可以与乙氧链上的多个氧原子以及酯键上的氧原子络合，造成链的收缩， 使两个蔡环得以靠近，促进激基缔合物的形成，使萘单体发射荧光强度减弱。 o 常 e x c i m e r 1e x c i m e r - 2 1 2 5 荧光共振能量转移f r e t ( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ) 荧光共振能量转移f r e t 机理在生物标记领域应用较多，尤其是在分子灯标的设计 中尤为普遍，当能量给体荧光团d 与能量受体荧光团a 相隔的距离远大于d a 的碰撞 直径时，只要d 与a 的基态和第一激发态两者的能级间能量差相当，或者说d 的发射 光谱与a 的吸收光谱能有效重叠，就可能发生从d 到a 的非辐射能量转移，又称为长 距离能量转移( 甚至相距远达7 0 1 0 0a ) 弘。 o n n l l 。 n n 峨 f r e t 1 t 2 2 】荧光素母体作为荧光团d ，偶氮化合物作为缺电子的给体a ，当体系中 存在活性基团时，荧光素中的酰胺键断开，使得处于激发态荧光素的电子不会跃迁到d 部分基团上，从而使荧光素恢复强荧光发射。 单光子和双光子激发的均二苯乙烯型金属离子荧光探针 舶。一。呛。一 i f r e t 1 2 3 】中，香豆素分子d 与三氟甲基取代的香豆素a 通过醚链连接，香豆素基 团间距离较远，能量共振转移效率低，当用短波激发时，只能观测到d 香豆素荧光，加 入p b 2 + 时，p b 2 + 与开链聚醚形成络合物，拉近d a 距离，f r e t 效率得以提高，激发d 时，得到较强的a 的荧光发射。 1 3 有机双光子材料 1 3 1 双光子吸收过程 双光子吸收是一种非线性光学现象，在强光激发下，介质通过一个虚拟中间态同时 吸收两个光子，从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程【2 4 】。这种双光子吸收过程的 强弱，取决于原子或分子体系相应的跃迁几率或截面、光场与体系跃迁的共振或非共振 特性以及光场的强度。 s 1 一腑删鳓 rl 1 。b ( ) 1 - 6 03 - j i v i r t u es t a t e 6 0 2 ji ( ) ( | ) l i s i n g l e p h o t o nt w o p h o t o n g r o u ds t a t e 图1 4 单、双光子吸收和发射机理示意图 f i g 1 4 s c h e m a t i co fo n ea n dt w o - p h o t o ne x c i t a t i o np r o c e s s 双光子吸收截面是表示双光子吸收强弱的物理量，其单位为：c m s p h o t o n 一。常 用测试方法包括非线性透过率法，上转换荧光法，瞬态吸收法和四波混频法。采用上转 换荧光法计算双光子吸收截面的公式为跚： 大连理工大学硕士学位论文 由rc rmf s 仃s = 仃7 面乙i f r 公式( 1 ) sc f 胁 “扎7 其中，下标r 代表参比，s 代表样品，n 是折射率，f 是双光子积分强度，是双光 子荧光量子产率，由于双光子量子产率很难测定，通常假定单、双光子荧光量子产率相 同。由于使用普通荧光仪f 6 5 0 0 测试的双光子荧光，尚未计算双光子截面积。 1 3 2 常见有机双光子材料的结构 双光子吸收过程以其特有的三维处理能力和极高的空间分辨本领而在生物、物理、 化学、医学和微电子技术等广泛领域显示出变革性的应用潜力。近几年来高效率的双光 子吸收材料得到很大的发展。由于高效双光子吸收材料在双光予荧光成像和显微技术、 3 d 信息存储、光化学治疗、微加工、上转换材料等方面的应用，引起了科学家们的巨 大兴趣，基于双光子吸收过程的分子设计、组装及性能研究成了光电子领域的热门课题。 目前，双光子材料主要有以下几种类型： ( 1 ) 二苯乙烯类和均二苯乙烯类双光子吸收材料 美国纽约州立大学b u f f u l o 分校的p r a s a d 【2 6 1 教授领导的小组的设计思路是基于双光 子吸收截面和三级非线性极化率的关系上，最初设计了以下两种基本结构的双光子吸收 材料。如图1 1 5 所示： 聊e 。 _ _ ( 二卜弋 电子供体极化电子桥电子供体 电子受体 极化兀电子桥电子受体 伽e _ - ( 二 电子供体极化兀电子桥电子受体 图1 5 两类具有强双光子吸收的分子结构 f i g 1 5 m o l e c u l a r - s t r u c t u r em o t i f sf o rh i g h l ya c t i v et w o p h o t o na b s o r b i n gc h r o m o p h o r e s 这一类共轭分子的双光子吸收截面的大小和分子四极矩的变化有直接的关系，在受 激光激发后，如果四极矩发生较大的变化，则具有相对较大的双光子吸收截面。 单光子和双光子激发的均二苯乙烯型金属离子荧光探针 m a r d e r 等【2 7 】新合成一系列具有d a 7 c a d 、d ada d 和d da d d 结构的化合 物，这类化合物易溶于二氯甲烷等有机溶剂，其中化合物c 的双光子吸收截面最大达到 5 3 0 0g m ，有广泛的应用前景。 广 广_ 一 n l 一、。 a ：r l2 c n ，r 2 = h b ：r 1 - - c n ，r 2 = o c l 2 h 2 5 c ：r l = o c h 3 ，r 2 = c n ( 2 ) 多枝状结构的双光子吸收材料 在具有多枝状结构的分子中，由于支链间电子偶合和电子共振作用，能显著提高双 光子吸收截面【2 8 】。k o r e a 大学c h o 教授研究小组【2 刀合成了一类星状结构的双光子分子， 荧光量子产率达到了o 6 7 ，双光子吸收截面为5 0 3 0g m 。 n 3 ( 3 ) y 型双光子吸收材料 f e n g 等人合成了含有咪唑- 噻唑杂环的y 型分子，由于噻唑环没有任何氢原子与咪 唑环共轭造成扭曲，因而两个杂环保持较好的共平面性，分子表现出很强的双光子吸收， 吸收截面为2 1 0 0g m 。 ( 4 ) 对称八极分子结构的双光子吸收材料 2 0 世纪9 0 年代，z y s s 等 3 0 1 在研究具有d 3 h 分子对称性的平面型三硝基三氨基苯的结 构及其二阶非线性效应的过程中引入了非偶极非中心对称的八极分子( o c m p o l a r ) 的概念， 指出八极分子的晶体中没有偶极- 偶极作用导致的中心对称化趋势，倾向于聚集成非中 心对称的晶体结构，出现宏观二阶非线性效应的几率增大。此后，关于八极分子的双光子 p 。b 大连理工大学硕士学位论文 吸收的研究日益增多。k o r e a 大学的c h o 教授【3 1 】的研究小组合成了具有平面d 3 h 对称性的 六取代六元芳环八极分子，其双光子吸收截面达至u 5 3 9 5g m 。 1 4 具有双光子吸收的荧光母体 目前，尽管双光子荧光探针作为一种优于单光子荧光探针的检测方法，但是其应用 不是特别广泛，主要原因在于双光子探针分子的研发与双光子技术发展的不平衡，能够 满足生物体系应用的双光子荧光探针不是特别多、双光子荧光团较少，并且多数荧光探 针在与金属离子作用后会发生荧光淬灭。现在研究较多的具有双光子吸收的荧光团主要 有三大类：均二苯乙烯类、荧光素类和香豆素类，下面简要介绍一下这几种荧光团： 1 4 1 均二苯乙烯类 均二苯乙烯型荧光团是较早应用于双光子荧光探针设计的荧光团之一，均二苯乙烯 的使用源于其在双光子材料方面的广泛应用。均二苯乙烯荧光母体以其荧光量子效率 高，双光子截面积大的优势使其成为双光子荧光探针合成的首选，早期报道的双光子荧 光探针中其占了大部分。例如，2 0 0 4 年，s t e p h a n i ej k p o n d 在j a c s 上发表的文章1 3 2 j 报道了一类具有d 兀a 冗d 结构的均二苯乙烯类双光子荧光探针d i s t y r y l b e n z e n e 1 和 d i s t y r y l b e n z e n e 2 ，分别在均二苯乙烯的一端或两端连有氮杂1 5 冠5 作为络合金属的受 体。加入m 孑+ 后，7 3 0 8 6 0n i 1 范围内分子的双光子吸收截面下降5 0 多倍。其结构如下： n f d i s t y r y l b e n z e n e 一1d i s t y r y l b e n z e n e 一2 单光子和双光子激发的均二苯乙烯型金属离子荧光探针 意大利的c a m i l l af e r r a n t e 等相继报道了两个以1 ，4 ，7 ，12 4 氮杂环十二烷为识别基团 的，均二苯乙烯双光子荧光探针d i s t y r y l b e n z e n e 3 和d i s t y r y l b e n z e n e 4 1 3 3 , 3 4 。d i s t y r y l b e n z e n e 3 在没有金属离子存在时，为推拉电子的d 冗a 兀a 结构j 3 h x z n 2 + 后，受体部 分的供电子能力减弱，变为不对称的a 7 c a 兀一a 结构。 厂n 、 一n n l 、j 一n d i s t y r y l b e n z e n e - 3 d i s t y r y l b e n z e n e 4 韩国大学的c h ob o n gr a e 小组设计合成了一系列的双光子荧光探针，主要是针对 金属离子的识别。在2 0 0 4 到2 0 0 6 年间分别报道了o i s t y r i b e n z e n e 5 【3 5 】，d i s t t 0 4 b e n z e n e 6 t 3 6 1 和d i s t y r y l b e n z e n e 7 三个以均二苯乙烯为荧光团的双光子荧光探针。 d i s t y r y l b e n z e n e 一5 峥j 姻 n o p 湘i r e s c e n c e s t r o n g f l u o r , 群c e n c e d i s t y r y l b e n z e n e 一7 d i s t y r y l b e n z e n e 5 和d i s t y r y l b e n z e n e 一6 在甲苯中的双光子吸收截面都为3 2 0g m ，在 乙腈中要小很多这种溶剂效应的原因目前还不清楚。但是，双光子激发的荧光强度能 、n 厂n l 一 回n 园 q n l n 大连理工大学硕士学位论文 满足测试的需要。c e + 对d i s t y r y l b e n z e n e 一5 的荧光淬灭作用最显著，但是m 9 2 + ，b a 2 + ， n a + 有干扰，加之生物组织中m g 。2 + ，n a + 的含量较大，所以，探针d i s t y r y l b e n z e n e 5 的 选择性与实际应用还有很大距离。d i s t y r y l b e n z e n e 6 在加入z n 2 + 后，荧光淬灭。 与d i s t y r y l b e n z e n e 一5 和d i s t y r y l b e n z e n e 一6 相比，d i s t y r y l b e n z e n e 7 的不同在于k + 和p b 2 + 的加入阻断了两个双光子荧光团之间的荧光共振能量转移，从而荧光大大增强。 这种“关一开 ( o f j f _ _ 0 n ) 类型的探针对于实现对底物的分析更为有效。因为引起荧光 淬灭的因素很多，并且荧光淬灭也不利于在生物体中的成像分析。 d i s t y r y l b e n z e n e 1 d i s t y r y l b e n z e n e - 6 虽然都具有较大的双光子吸收截面，加入某些 金属离子能影响其吸收和荧光，但是它们的缺点也显而易见，对金属离子的选择性不好。 s t e p h a n i ej k p o n d 和b o n gr a ec h o 在其文章中只是介绍了m 孑+ ，c a 2 + ，z n 2 + 等离子对 d i s t y r y l b e n z e n e 的单、双光子激发荧光光谱的影响，给出了设计此类双光子荧光探针的 潜在可行性，选择性要求还不能满足实际应用，另外还有不具备水溶性，加入金属后荧 光淬灭不能用于生物样品成像。 h 3 c 1r = h 2r = f d i s t y r y l b e n z e n e 。8 美国的f a h m ic j 于2 0 0 7 报道了d i s t y r y l b e n z e n e 8 型的探针分子【3 8 】，这一类型的 探针分子与均二苯乙烯不同属于联苯型，但无论是从结构特点还是作用机理来看，其与 均二苯乙烯是极其相似的。d i s t y r y l b e n z e n e 8 分子的电子体系是d 一7 c