（应用化学专业论文）若丹宁光散射法对药物和生物大分子的分析及其作用机理的研究.pdf

济南人学硕上学位论文 摘要 本文利用尚未见报道的3 对甲基苯基5 ( 2 磺酸基苯基偶氮) 若丹宁和3 对甲 基苯基一5 一( 4 一甲基2 一磺酸基苯基偶氮) 若丹宁试剂，建立了共振瑞利散射和二级散射 技术测定脱氧核糖核酸、牛血清白蛋白、硫酸新霉素以及金属铝离子的高灵敏度新方 法。通过紫外、荧光、共振瑞利散射和二级散射等手段初步研究了若丹宁类试剂与生 物大分子和药物分子间的相互作用机理。 ：本文的研究内容主要分为以下几个方面： j 1 首次将若丹宁类试剂作为生物大分子脱氧核糖核酸和牛血清白蛋白的光谱 探针，系统研究了在十二烷基磺酸钠微乳液环境中，探针与生物大分子相互作用的 共振瑞利散射和二级散射光谱特征及其反应条件，建立了共振瑞利散射和二级散射 法测定痕量核酸和蛋白质的新方法。通过研究磺酸基偶氮若丹宁探针与生物大分子 的相互作用，发现探针主要以较弱的疏水作用力、氢键和范德华力与生物大分子结 合。当加入十二烷基磺酸钠时，作用力类型发生转变，探针通过十二烷基磺酸钠的 桥键作用以静电引力与生物大分子结合为三元离子缔合体系，引起体系光谱性质的 显著改变。 2 首次将若丹宁类试剂应用于药物的共振瑞利散射和二级散射法中，系统研究 了两种方法测定氨基糖苷类抗生素的实验条件，建立了具有较高灵敏度和较好选择性 测定新霉素的新方法。 利用量子化学的r h f 3 2 1 g * 解析梯度方法，采用g a u s s i a n 9 8 程序对若丹宁、新 霉素和十二烷基磺酸钠的基态电荷、偶极距和轨道占据能进行计算，对各物质问可能 的作用情况进行了预测，并通过紫外光谱和离子强度实验证实了量子化学的预测结果 各物质之间主要以静电引力发生相互作用。 3 以二级散射为手段研究了3 对甲基苯基5 ( 4 甲基2 磺酸基苯基偶氮) 若丹宁 与金属铝离子的相互作用，在十六烷基三甲基溴化铵微乳液环境中，牛血清白蛋白的 加入能够促使体系形成四元离子缔合体系，导致体系二级散射强度急剧增强，基于此 建立了二级散射法测定金属铝离子的新方法。方法具有很高的灵敏度，检测限达5 5 1 n g m l 1 。并应用于实际样品的测定，取得了满意效果。 4 对共振瑞利散射和二级散射法测定脱氧核糖核酸、牛血清白蛋白、硫酸新霉 若丹宁光敏射法对药物和生物人分了的分析足其作用机理的研究 素的测定体系进行比较总结，初步探讨了共振瑞利散射和二级散射光谱之间的关系， 提出了偶氮若丹宁类试剂与被测物质的可能作用机理，并探讨了体系光散射强度增强 的原因，为若丹宁类衍生物的应用及生物大分子和药物的检测提供理论基础。 关键词：共振瑞利散射；二级散射；若丹宁衍生物；生物大分子；新霉素；铝 i i a b s t r a c t ：n e 1 1 e 、vd e 锄协撕o nm e t h o d so f t r a c en u c l e i ca c i 趣b o v i n e s e r u ma l b u m i i l n e o m y c i n 掣等t e a n da l u m i m u m 沁na r ee s t a b l i s h e d 州t 1 1 3 一( 4 - m e t h y l p h e n y l ) 5 ( 2 ，- s u l f o p h e n y ：a z 0 ) 二h o d a n i n ：a n d3 - ( 4 m e m y l p h e n y l ) - 5 - 4 - m e t h y l 2 s u l f 0 - p h e n y l a z 0 ) r h 。d a n i n e w l l i c h 。 ? 代n 0 岫蜘r e p o 删b y r e s o n 觚c er a y l e i g ys c a 蜥n g 觚d 蜘n d 。r d e r s c a n e 啦t h e ：羔篓1 v ，e m e c h a n i s m0 f b i 0 1 0 9 i c a lm a c r o m 。l e c u l e s 锄d 岫、) l ，i t l lr h o d 她e r e a g e 。n t si s s t u 三1 e ? e l e m e n t a l l y b yu l n a v i o l e ts p e c t n 啪，n u 。r e s c e n c es p e c t r l l i i l ，r e s 。i 姗c e r a y l e i 曲 s 唧e n n gs p e c t r u ma n ds e c o n do r d e r s c a t t e r i n gs p e c t n l l l l t h ep a p e rc o n s i s t so f t h ef o l l o w i n g p a r t s ： l jn e 跚删c h 锄c t e 枷c s 觚dr e a c t i o nc o n d i t i o n s b e t w e e np r o b e sa n d b i o l o g i c 以 ：r 0 唑c u l e s 骶咖d i e d s y s t 锄a t i c a l l ya tt l l ep r e s e n c e 。fm i c r 0 蜘u l s j o ns 。三u n l ：叫y ：跚1 舭戚n g 斯龇f i r s t t i m er h o d a n i n er e a g e n t s 嬲耻c 舵lp m b e s b a s e do n 二：1 0 s e ? e n e w m e m o d sf o rd e t 涮n a t i o n o f 慨n u c l e i c a c i da n dp r o t 血a r ee 鼬l i s h e d ：、? ? u r l d m e s u l f o p h e n y l a z or h 。d a u l i i l e sc 锄c o m b i n ew i t l lb i 。l 。g i c a j m a c r o m 。l e c u l e s ，h y d r o p h o b i cf o r c e ，h y d r o g e nb o n d 觚dv 觚d e rw 列sf o r c e u g l ls t u d y h l gt 1 1 e ? t e r a c n o n b e 帆e e np m b e sa i l db i 0 1 。g i c a lm a c r o m 。l e c u l e s b u t a tt h ep r e s e n c e 。fs 。二i 啪 d o d e c y ls u l f o n a t e , a c t i v ef o r c et y p ei sc 。n v e r t e da n d p r o b e sc a l lc 。m b i l l ew i t hb i 。1 。g i c 甜 ：a ? 冀0 1 e c u l e s a n df o m t e m a r yi o n 。a s s o c i a t i 。nc 。m p l e x e sb y e l e c t r o s 诅t i c 南r c et u 曲 警嘶吨e m n da c 石o n0 f s 0 d i 啪d o d e c y ls u l f o n a t e ，w 1 1 i c hr e s u l t si nt 1 1 e0 b v i 。u sc h a l l 二s o is p e c t r a lc h a r a c t e r i s t i c s 厶k n o d 锄n er e a g e n t sa l eu s e df o rt h ef i r s t t i m ei nt h ed e t e r m i n a t i o no f d m g s 州t l l r e s o ：? c e r a y l e i g ) ，s c a n 嘶n ga n ds e c 。n do r d e r s c a t t e r i n gm e t h o d s ，t h e e x p e r i m e n t c 锄d l n 。瑚o f 恤d e t e r m i n a t i 。no fa m i n o g l y c 。s i d ea n t i b i 。t i cn e o m y c i ns u l f a t e a r es t u d i e d s y s t ：m a 舡c a j l y a n d 铆on e wm e t h 。d sa r ee s t a b l i s h e d w h i c hh a v el l i 曲e rs e n s i t i v i 砂a 1 1 d g o o as e l e c t i v i t y in eg r 0 岫ds 龇c h a r g e s ，d i p o l e m o m e n t sa n dt o o l e c u l a ro r b i t a le n e r g i e so fr h o d 枷n e r e a g e n t n e o m y c 洫s u l a i l d s o d i u md o d e c y ls u l f o n a t ea r ec 甜c u l a t e db y 觚a l y t i c g r a d s m e t h o d ( r h f 3 - 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。导师签名： 日期：垄型：垦 济南大学硕i ：学位论文 1 i 核酸测定研究进展 第一章前言 核酸是存在于一切生物体中的一类最重要的生物大分子之一，是生命体的最基本 物质，携带生物体的所有遗传信息，具有指导蛋白质的合成并控制有机体细胞的功能， 与生物体的生命活动和各种代谢有密切关系。核酸是许多核苷酸单元按一定顺序连接 所组成的多核苷酸。根据其核苷酸单元中的糖组分不同，核酸可分为脱氧核糖核酸 ( d n a ) 和核糖核酸( i 矾a ) 两大类。这两类核酸在细胞中的主要功能是不同的， d n a 是遗传信息的主要载体，是主要的遗传物质，任何一个生物体细胞都具有发育 完整的全套遗传信息，基因就是d n a 分子的一个片段，一个细胞的所有基因组合在 一起称为基因组； r n a 在蛋白质生物合成中起着重要的作用。现代分子生物学的发 展已经证明：人类大部分疾病( 如癌症) 的发生与核酸的变化有着密切的关系。因此， 核酸的分析研究已经成为现代生物学、生命科学和医学等学科中研究最为活跃的领域 之一。研究小分子物质与核酸的作用机理，建立核酸快速简便的分析方法，对阐明生 命的奥秘、新型药物的开发、在基因水平上实现对疾病的治疗以及促进信息科学的发 展都有重要的意义。 1 1 1 核酸测定方法 目前，核酸常用的测定方法主要有分光光度法和荧光光度法。其中分光光度法是 测定核酸的经典方法，主要包括定糖法、定磷法和紫外光度法。荧光光度法主要基于 荧光试剂和核酸之间的相互作用导致体系荧光强度的增强或猝灭来测定核酸。 1 1 1 1 分光光度法 ( 1 ) 定糖法 该方法主要原理是在酸性条件下核酸的嘌呤核苷键水解生成去嘌呤酸，去嘌呤酸 能够进一步转化为糖醛衍生物，该衍生物能够与二苯胺【1 2 1 、二氨基苯甲酸3 1 、硫代 巴比士酸【4 】等显色剂发生显色反应，据此实现对核酸的定量测定。该方法的显著优点 是能够鉴别d n a 与r n a ，但是准确性和灵敏度较差，选择性不高。 ( 2 ) 定磷法 该方法的主要依据是核酸中磷的含量与核酸含量成正比。因此通过测定样品中磷 l 羞丝室光散盟洼基笾物砸坌塑厶坌王分析殷其作用机理的研充 的含量可以计算核酸的含量【5 1 。该方法准确性好，灵敏度较高，但样品中无机磷杂质 的存在常常影响核酸结果的测定。 ( 3 ) 紫外分光光度法 紫外分光光度法【6 t 刀利用核酸在2 6 0n l l l 的紫外吸收进行定量测定。该方法操作 简单，快速，灵敏度较高，目前仍被广泛使用。但是核酸和蛋白质( 2 m = = 2 8 0n m ) 的吸收峰接近，如果同时存在，则相互干扰，造成相当大的误差，使其在应用上受到 了很多限制。 ( 4 ) 染料结合法 该方法是基于多核苷酸中两个单核苷酸残基之间的电离具有较低的p k 值 ( p k = 1 5 ) 。当溶液中的p h 值大于4 时，核酸会全部离解呈多阴离子状态引，能够 与一些阳离子染料1 9 1 0 1 发生结合，利用分光光度法进行测定。该方法测定核酸简便、 快速、准确性好，但是蛋白质的存在对测定干扰严重。 1 1 1 2 荧光光度法 荧光光度法测定核酸较分光光度法灵敏度高、选择性好，是目前测定核酸的另一 种常用方法。荧光法常用的荧光试剂有金属离子【m 12 1 、金属配合物【1 3 - 1 4 】以及有机荧 光试剂【1 5 1 6 1 。但该方法常受限于荧光体系，且荧光试剂一般比较昂贵，部分带有一 定的毒性，限制了荧光光度法的进一步应用。 1 1 2 核酸与小分子的作用机理 核酸与小分子的作用主要包括共价作用和非共价作用。共价作用主要指小分子与 核酸分子中各种碱基的反应。亲核反应、亲电取代反应、加成反应都属于共价作用， 该种作用类型的特点是非可逆性。 非共价作用主要包括插入作用、沟槽作用、静电作用与远程组装与外围结合。这 种作用类型的特点是具有可逆性，当介质的酸度、离子强度、小分子与核酸的摩尔比 发生改变时，小分子与核酸的作用形式可能发生改变。 1 1 2 1 插入作用 插入作用主要指小分子与核酸双螺旋结构中的碱基发生作用，这种作用主要表现 为核酸熔点的提耐1 7 1 8 1 和粘度的改变【1 9 】。 1 1 2 2 沟槽作用 沟槽作用主要指小分子与核酸分子双螺旋结构中的大沟区和小沟区作用。其中大 2 济南大学硕士学位论文 沟区和小沟区在氢键特征、电场、空间作用以及水化作用等方面存在显著差异。小分 子主要与核酸的小沟区发生作用【2 0 】。 1 1 2 3 静电作用 静电作用主要指带正电荷的小分子与核酸分子中带负电荷的磷酸根骨架通过静 电吸引发生相互作用。这种作用没有选择性，可以通过离子强度实验对测定体系的影 响进行判断【2 1 1 。 1 1 2 4 远程组装与外围结合 远程组装与外围结合是指小分子以双螺旋结构的d n a 分子为模板，在其表面进 行排列或堆积，形成远程组装堆积结构，结果导致体系共振光散射增裂2 2 1 。 研究小分子与核酸的结合作用尤其是非共价结合作用是目前的热点领域。采用的 研究方法有光谱、法【2 3 - 2 6 、电色谱法【2 7 】、电化学法【2 引、线性二色谱法 2 9 1 、质谱法1 3 0 l 、 粘度法【3 1 1 和熔点法【1 8 1 等。其中应用最广泛的方法为光谱法，主要包括紫外一可见光 谱法、共振光散射光谱法、荧光光谱法、c d 光谱法等。小分子与核酸的结合类型可 以根据以下依据判断：紫外一可见光谱法中，如果核酸加入后，小分子最大吸收峰发 生吸收强度的减小并伴随最大吸收峰位置的红移，表明小分子与d n a 之间存在插入 作用【3 2 】；共振光散射光谱中，如果核酸加入后能够引起体系共振光散射强度增强，表 明小分子与d n a 之间存在远程组装与外围结合；荧光光谱中主要借助e b 探针和 s c a t c h a r d 图判断小分子与d n a 的结合类型。s c a t c h a r d 图由s c a t c h a r d 方程r c = k ( 疗r ) 以r c 对尺作图得到，其中j i c 表示d n a 分子中平均每个核苷酸结合的e b 分子数， c 表示e b 的游离浓度，玎表示每个核苷酸上的成键位点数，k 表示每一位点的结合 常数。根据小分子存在下的s c a t c h a r d 图判断小分子与d n a 的作用方式，其判断依 据是s c a t c h a r d 图中r 不变而k 变化时，小分子与d n a 发生插入结合作用；k 不 变而n 变化时，小分子与d n a 是非插入结合；当”与k 均发生变化时，小分子与 d n a 存在多种结合方式。 另外，根据小分子与d n a 作用前后熔点或粘度的变化情况以及小分子与变性前 后d n a 的作用情况均能判断小分子与d n a 之间是否存在插入键合作用。其判断依据 分别是：如果小分子的加入引起d n a 熔点的升高【1 7 - 1 8 域粘度增大【3 1 1 ，表n d , 分子与 d n a 之间存在插入作用；如果小分子与变性前后d n a 作用存在较大的差别，亦表 明d n a 与小分子之间存在插入键合作用【3 3 】。 3 1 2 蛋白质测定研究进展 蛋白质是生物体的结构和功能物质，是生物最重要的基本组成成分之一，生命的 起源和生物的进化都与蛋白质的发展密不可分。蛋白质与生物体的营养、免疫、新陈 代谢、生命的起源和进化等都息息相关。由于蛋白质在体液中的含量可作为人体营养 健康、疾病诊断的重要指标，因此蛋白质的定量测定在生命科学、临床医学和化学研 究中占有十分重要的地位。近年来兴起的蛋白质组学揭示蛋白质的结构和功能，这对 阐明生命在不同状态下的活动规律及发展变化机制，为重大疾病的预防提供了依据。 蛋白质的定量测定是研究蛋白质的基础，因此寻找高灵敏度、高选择性、操作简便的 蛋白质测定方法具有十分重要的意义。 以下总结了目前蛋白质常用的测定方法。 1 2 1 凯氏定氮法 目前测定蛋白质的方法很多，但是世界各国还是把1 9 世纪丹麦化学家凯道尔发 明的凯氏定氮法作为标准检测方法。该方法具有较高的准确度、精密度和灵敏度，应 用范围广范，可用于动植物和食品中等蛋白质的测定1 3 4 1 。但也有其缺陷，如操作过程 繁琐、定氮的结果只能是粗蛋白的含量，对于含有大量碱性氨基酸的蛋白质测定常常 存在一定的误差，结果偏高。 1 2 2 紫外吸收法 蛋白质中含有的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，具有特征苯环等芳香族共轭双键结 构、能够使吸收峰波长向长波方向移动的助色团和能够使化合物最大吸收峰向紫外区 移动的生色团结构，它们在紫外光区域有光吸收，因此借助这些氨基酸的紫外吸收光 谱可以定量测定蛋白质含量【3 5 - 3 6 1 。利用紫外吸收光谱测定蛋白质方法简便、快速， 应用广泛，但是样品中含有易吸收紫外光的物质，如嘧啶、嘌呤等常引起较大的偏差。 1 2 3 双缩脲法 蛋白质含有肽键，肽键在碱性溶液中可与铜离子形成紫红色化合物，此化合物在 5 4 0n m 处有吸收峰，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸 组成无关。该方法的优点是对白、红蛋白产生颜色反应相近，干扰物质少，不受温度 影响。但是灵敏度低，且操作复杂，难于实现自动化仪器分析【3 7 1 。 4 济南大学硕十学位论文 1 2 4 考马斯亮蓝( c b b ) 法 c b b 法是目前最广泛的用于测定微量蛋白质的方法。其原理是根据c b b 与蛋白 质形成特异的吸收峰，并在一定的蛋白浓度范围内，吸收峰值的大小与蛋白含量成正 比来测定溶液中的蛋白质3 8 3 9 1 。该方法灵敏度高，分析快速。但是c b b 与蛋白结合 形成的蓝色复合物，随反应时间延长，易发生沉淀反应【4 0 1 。 1 2 5l o w r y 法 l o w r y 法亦称改良福林酚试剂法，于1 9 5 1 年由l o w r y 等将福林法与双缩脲法结 合进行改良而成。通过芳香族氨基酸残基 r y r 和t r y 的迅速反应与肽链、极性侧链或 两者的铜络合物较慢的反应而把磷钼酸发色集团还原成暗蓝色，在7 5 0m 波长处出 现最大吸收h 。此方法的灵敏度较高，比吸光光度法( 2 = 2 8 0n m ) 、双缩脲法分别提 高1 0 - 2 0 、1 0 0 倍。但是由于该方法中酸试剂与蛋白质的非特效反应，抗干扰能力差。 1 2 6 毛细管电泳法 毛细管电泳分析( c e ) 技术是最近十几年来发展最为迅速的现代分析技术。它具有 高灵敏度，紫外检测器的检测限可达1 0 - 1 3 1 0 1 5m o l ，而激光诱导荧光检测器可达 1 0 1 9 - 1 0 2 1t o o l ；速度快，一般分析不会超过3 0m i n ，有的甚至几分钟；样品少，只需 h e ( 1 0 。9 l 1 级的进样量；成本低，只需少量流动相和价格低廉的毛细管；模式多等优点 【4 2 】。该方法能够使疏水相近的蛋白质可以很好的分离，并能够对蛋白质进行定量检测 4 3 - 4 5 】。毛细管电泳法以其在测定生物大分子方面的独特优点，使其在分析蛋白质方面 占据重要地位。 1 2 7 高效液相色谱法 用高效液相色谱法( h p l c ) 来分析蛋白质是一种近年来发展较快的新型分析方法 4 6 1 。h p l c 以其高效的分离效果、快的分析速度、样品回收简单、机动灵活等特点， 已经成为分离和检测蛋白质的重要工具。h p l c 可将不同蛋白分离并测定，且有很高 的灵敏度，对医药、临床病理、预防学等的深入研究是强有力的手段，唯仪器投资相 对较高，普遍应用尚有困难【4 7 1 。 1 3 氨基糖苷类抗生素测定研究进展 氨基糖苷类抗生素由氨基环醇与氨基糖缩合而成，具有共同的化学性质和抗菌特 5 菪丹宁光散射法对药物和生物人分子1 1 勺分析硬其作用机理的研究 性，自问世以来以杀菌完全、性质稳定、用药方便和价格便宜【4 8 j 等优点成为临床上重 要的抗感染药物。目前，用于临床上的氨基糖苷类抗生素主要有新霉素、卡那霉素、 庆大霉素、妥布霉素、链霉素以及其衍生物的硫酸盐。但是任何一种氨基糖苷类抗生 素都有轻重不等的耳毒性和肾毒性，其中最令人关注的是它的耳毒性问题。据中国残 疾人联合会统计，我国有听力语言障碍者高达1 7 7 0 万人，其中聋哑儿约1 0 0 万人。 因此对该类抗生素进行分析检测具有重要的意义。 目前用于氨基糖苷类抗生素的测定方法主要有： 1 3 1 微生物法 中华人民共和国药典 4 9 1 和中国药物大全【5 0 1 对氨基糖苷类抗生素含量的 测定方法均采用微生物法。该法能反映生物效价，设备简单，适于大批样品的检测。 但操作费时、繁琐，灵敏度低，并且影响因素较多，条件不易控制。 1 3 2 唧l c 法 h p l c 法能够对多组分混合物进行分离测定，逐渐成为药物分析检测中的一种重 要方法。在该类抗生素的测定中，h p l c 可以利用柱前衍生和柱后衍生化等手段，实 现多种氨基糖苷类抗生素【5 1 5 5 1 的分离测定，并与微生物法比较，结果准确可靠。但该 方法仪器投资相对较高，样品预处理复杂，普遍应用尚有困难【4 7 1 。 1 3 3 免疫法 免疫分析法【5 6 】是近年来快速发展的一种方法，根据对抗原标记方法不同，免疫分 析法可分为放射免疫分析阿5 钔，酶免疫分析盼6 0 1 ，化学发光免疫分析【6 1 1 等方法。该 法具有灵敏度高、特异性强、适用范围广、操作简便、快捷、成本低廉及现场适应能 力强等优点，已开始用于生物样本中微量抗生素的快速鉴别，但该方法也存在其自身 的缺陷。如放射免疫分析法具有放射性污染，且后处理困难、费用高，目前已较少应 用；酶免疫法则重复性与精确性较差，交叉反应率高。 1 3 4 分光光度法 分光光度法以方法简单、仪器低廉、分析精度高、重现性好、线性范围宽等优点 广泛应用于氨基糖苷类抗生素的分析检测。该方法常用的显色剂有金属离子及其配合 物6 2 拼1 和有机试剂6 5 石刀等。但是该方法检测限低，灵敏度和选择性不高，不能满足更 低检测范围内药物的控制与分析测定。 6 济雨大学坝：t 学位论文 1 3 5 气相色谱法( g c ) g c 是目前众多色谱法中分辨率最高、分离最迅速、检测最灵敏、流动相价格最 便宜、最不污染环境的高效色谱法。问题是只有当样品能挥发并且具有热稳定性时才 能直接进行测定。氨基糖苷类抗生素为非挥发性化合物，且在紫外可见光区无吸收， 须先进行衍生化处理【6 8 1 使其适于分析。 1 3 6 化学发光法 化学发光分析法【6 9 ，7 0 l 使用仪器设备简单，可测线性范围宽，用于氨基糖苷类抗 生素类药物的测定具有灵敏度高，分析速度快，易实现自动化等优点，优于紫外可 见分光光度法等一般的分析测定技术。但是化学发光分析法往往选择性较差，大多数 的氨基糖苷类抗生素纯度又不是高，需分离后才能进行更好的测定，这限制了该方法 的广泛应用。将该方法与高效液相色谱结合，充分发挥各自的优势，是药物分析领域 的一种发展趋势。 1 3 7 电化学法 电化学法【7 1 】用于抗生素的测定操作简单、仪器廉价，具有较好的选择性和较高 的分析精度，而且还能够研究与药物相关的动力学和热力学参数。但该方法主要使用 光分析技术进行检测，测定的灵敏度受到一定的限制。 1 4 共振瑞利散射法研究进展 1 4 1 共振瑞利散射技术 当入射光通过某种介质时，在入射光以外的各个方向上都能观察到光辐射，这一 现象称为光散射。当散射光波长和入射光波长相等并且散射粒子又远小于入射光波长 时的弹性散射称为瑞利散射。其散射强度与散射粒子的大小、溶液浓度、溶液折射率 的波动值以及入射光波长有关【7 2 1 。当瑞利散射的波长位于和接近于分子的吸收带时， 其散射强度不再遵守瑞利定律并且某些波长的散射强度急剧升高，可以提高几个数量 级，这种现象称为共振瑞利散射( r e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g ，r r s ) 7 3 】。在一定 条件下，当被测定的物质浓度在一定范围之内时，其共振瑞利散射强度与浓度呈现一 定的线性关系，这是共振瑞利散射测定的理论基础。以下是共振瑞利散射法测定物质 浓度的定量基础： 7 若丹宁光散射注对药物和生物人分子的分析及其作矸】机理的研究 k 鲁 妻j c o 娑a o - a + 掣卜。c2 矿1 i 上百+ 百f 则w 虬 i l u t s ：光散射强度，玎：溶液的折光系数，娴：波长a 处的摩尔吸光系数，知： 真空中入射光和散射光波长，c ：溶液的物质的量浓度，a ：整个分子吸收带中的 任意波长，s ( 如) ：波长如处的摩尔吸光系数。 共振瑞利散射分析技术具有以下特点： 1 ) 操作简便，易于实现。 2 ) 灵敏度和选择性高【7 4 】。相比单纯的散射强度能够提高几个数量级，可以用于 更稀的溶液研究。r r s 光谱特征直接受到吸收光谱的影响，具有不同吸收光谱的分 子会出现彼此不同的r r s 光谱特征和相应的r r s 峰，因此具有更好的选择性。 3 ) 应用广范。广泛用于测定蛋白质【7 5 7 6 1 、核酸【7 7 t7 8 1 、药物、金属离子等。 4 ) 可为研究分子结构和反应特征提供更为丰富的信息【7 4 1 。r r s 光谱兼具散射 和电子吸收光谱的双重特性，但又与两者不同，形成了一种新的光谱特征，因而它 能够对研究分子结构、大小和形状( 如球形、链形、无规则线团等) 、电荷( 特别是 兀电荷) 分布，键合性质等提供新的、更丰富的信息。尤其对大分子的非键作用， 如缔合、聚集、长距离组装更为敏锐，因此对生物大分子的测定、表征及反应历程 的研究极为有利。 1 4 2 共振瑞利散射法测定蛋白质研究进展 近年来随着共振瑞利散射法在测定生物大分子方面的广泛应用，这种技术已成为 测定蛋白质的一种有力方法，操作简便，选择性好，检测限低，可以达到纳克级。 张爱榭7 9 1 等研究了吖啶红s l s 体系r r s 法测定蛋白质，对牛血清白蛋白( b s a ) 、 t 球蛋白的检出限达到了6 4n g m l 一、1 0 8n g m l ，并成功地用于人血清、牛奶、豆 浆、尿液中总蛋白质的测定。李永新8 0 1 等研究了在p h 3 6 的c l a r k l u b s 缓冲溶液中， 各种蛋白质与四磺基锰酞菁( m n t s p c ) 结合的r r s 光谱，测定了b s a 、人血清白蛋白 ( h s a ) 、p 球蛋白( v - l g o ) 及卵蛋白( o v b ) ，线性范围为0 1 - - - 3 0 、0 0 1 6 、0 0 5 2 0 及 0 0 。1 0m g l ，检测限为5 7 、8 3 、1 3 和1 3n g m l 。刘绍璞【3 l 】等发现钙黄绿素与蛋 白质在p h 3 4 的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液中反应能够使r r s 显著增强，实现了 h s a 、b s a 、q 糜蛋白( q c h y ) 、卵白蛋白( o v a ) 、溶菌酶( l y s ) 等水溶性蛋白质的测定， 线性范围为o 2 8 、0 2 2 、0 2 8 、o 4 8 、0 0 5 6p g m l ，检测限为9 8 、2 0 4 、1 8 5 、 8 济南大学硕十学位论文 4 0 0 、4 0n g m l l ，并从分子角度解释了r r s 增强的原因。杨睿【8 2 】等研究发现乙酸 乙酸钠介质中铝( i i i ) 与铬天青s 形成金属螯合物进一步与蛋白质反应形成新的化合 物后其r r s 强度明显增强，对b s a 、0 【糜蛋白酶和溶蛋白的检测限为0 0 1 3 5 、0 0 2 0 7 、 0 2 1 8l a g m l 。有些探针需要借助表面活性剂与蛋白质形成三元体系从而实现对蛋白 质的测定。李玲【8 3 】利用溴代十六烷基吡啶对f e ( p h e n ) ( b p y ) s 0 4 - 蛋白质体系的增敏作用 测定了b s a ，线性范围为4 0 8 1 0 2m g l 一，检测限为0 0 2m g l 。冯素玲【踟等研究 了t r i t o n x 1 0 0 对达旦黄蛋白质体系共振光谱的增强作用，并在p h l 2 4 的w a l p o l e 缓冲溶液中对b s a 、h a s 、a l b 、l y s 、t r y 的线性范围为0 0 3 , - 0 9 、o 0 3 1 0 、o o 仙8 、 0 0 4 1 0 、0 8 2 0l a g m l ，检测限为0 0 1 7 7 、0 0 1 7 6 、0 0 2 5 4 、0 0 2 2 0 、0 4 7 5l a g m l 一。 近些年利用r r s 法测定蛋白质得到了很大的发展。表1 1 分别从测定的蛋白质 种类、所用探针、缓冲介质、线性范围、检测限等方面将该方法测定蛋白质的相关报 道做一总结。 表1 1r r s 测定蛋白质总结 里尘：! ：! 墨旦堡里璺型垫! 垒壁垒堕呈里i 望型i q 里q ! 巳! 旦! 呈i 堕垒y ! 坚墨 b s a 十二烷基硫酸钠【8 5 】c l a r k 1 u b s 缓冲溶液 o l o1 7 达旦判吲p h i 6 的h c ! - k c i 缓冲液 0 0 3 1 01 3 1 同多钼酸【8 7 1 p h i 2 0 0 2 - 54 1 偶氮胭脂红b t m p h 3 2 邻苯二甲酸氢0 , - 1 6 3 8 7 偶氮氯瞵i i i 【跏 钾盐酸缓冲溶液 p h 3 7 柠檬酸o 3 6 1 8 5 钠盐酸缓冲溶液 曲利本蓝【1 p h 2 0h c i n a a e 缓冲溶液 o 56 7 5 考马斯亮蓝刚p h i 6 的h c i k c i 缓冲溶液0 o 枷8 6 3 磷锑钼科9 2 10 1 5 m o l l 。1 h 2 s 0 4 溶液o 6 0 2 1 重铬酸钾【9 3 1p h 3 0 的缓冲溶液 2 肚8 0 7 6 4 十二烷基苯磺酸钠【州p h 2 , 8c l a r k - l u b s 缓冲溶液0 - 8 l7 8 h s a同多钼酸【5 7 1 p hi 2 h c ! c h 3 c o o n a 0 0 2 65 2 偶氮胭脂红b t h ip h 3 2 邻苯二甲酸 o 1 4 3 6 2 偶氮氯膦i i i 【| 9 1 氢钾盐酸缓冲溶液 p h 3 7 柠檬酸钠盐酸 缓冲溶液 7 0 5 曲利本蓝【卿p h 2 ，0h a c - n a a c 缓冲溶液o 也 1 1 6 9 考马斯亮蓝【9 1 1 p h i 6 的h c ! k c i 缓冲溶液0 0 3 , - 0 5 4 7 磷锑钼蓝【蜘0 1 5 m o l l 。1 h 2 s 0 4 溶液0 - 4 0 2 3 重铬酸钾【9 3 1 p h 3 0 的缓冲溶液0 2 5 0 5 4 十二烷基苯磺酸钠【舛1 p h 2 8c l a r k l u b s 缓冲溶液 o 82 0 5 o v a 考马斯亮蓝【9 p h l 6 的h c i k c i 缓冲溶液 0 0 5 1 07 9 重铬酸钾【钟1p h 3 0 的缓冲溶液0 5 础 1 7 0 十二烷基苯磺酸钠【舛1 p h 2 8c l a r k - l u b s 缓冲溶液 卜84 3 3 7 - 1 9 g 十二烷基硫酸钠i 。5 lc l a r k - l u b s 缓冲溶液0 5 4 4 考马斯亮蓝【9 up h i 6 的h c i k c i 缓冲溶液 o o “1 2 9 2 十二烷基苯磺酸钠【州p h 2 8c l a r k - l u b s 缓冲溶液0 5 4 3 9 9 若丹宁光散射法对药物和生物大， 了的分析及其作用机理的研究 1 4 3 共振瑞利散射法测定核酸研究进展 1 4 3 1 有机染料作探针 ( 1 ) 卟啉类试剂 首先用作r r s 技术测定核酸的染料探针是水溶性卟啉试剂t a p p ，由于t a p p 的 质子化使之在核酸表面聚集，从而导致核酸超螺旋结构的形成，r r s 增强【9 5 1 。利用 核酸对t a p p 的r r s 增强可以用于c t d n a 的测定，其显线性范围为( 1 8 - 1 0 8 ) x 1 0 4 t 0 0 1 l ，检测限为4 1 x l o t 0 0 1 l 1 ，与荧光猝灭法相比灵敏度提高了一个数量级【9 6 1 。 黄承志等【9 7 】研究了t a p p 和m e s o 四( 对三甲基吡啶基) 卟啉( t m p y p 4 ) 在不同酸度下 与核酸作用的r r s 光谱，发现核酸能够使t a p p 的共振光散射加强，但对t m p y p 4 的共振光散射信号无影响，并对其原因做了一定的解释，认为共振光散射强度取决于 探针分子本身的散射和分子吸收两个因素。这对以后的分析工作者选择探针测定核酸 提供了一定的理论基础。 ( 2 ) 醌亚胺类染料 醌亚胺类染料种类很多，如藏红t 【9 钔、亚甲蓝【9 9 】、中性红【1 吲、天青b 【1 0 1 l 、亮甲 酚蓝【1 0 2 1 等。醌亚胺类染料测定核酸是利用该类染料能够在核酸分子表面进行长距离 组装并产生特征的增强r r s 光谱。这类探针在核酸分子表面聚集后形成的混合