（应用化学专业论文）褐藻多酚化合物提取、纯化及生物活性研究.pdf

中文摘要 摘要 鼠尾藻和海黍子是青岛沿海常见的两种马尾藻属褐藻，其生物量大，易 于采集，并含有丰富的生物活性成分，开发潜力巨大。 本文采用鼠尾藻和海黍子作为研究对象，主要研究了两种海藻中褐藻多 酚的提取、分离及生物活性，得到了如下的实验结果： 1 从鼠尾藻和海黍子中提取褐藻多酚的优化条件是：以新鲜海藻海黍子 和鼠尾藻为原料，加液氮研磨，用组织捣碎机破碎后以9 0 的乙醇为提取溶 媒，温度为3 0 c ，提取时间为1 2 小时。然后用布氏漏斗迅速过滤，滤液减 压蒸馏除去乙醇，即得到两种海藻的褐藻多酚粗提物，置于4 冰箱避光保 存。对鼠尾藻和海黍子中提取的褐藻多酚粗提物的物理化学及光谱特征的研 究表明：褐藻多酚具有多酚类物质的共性。实验表明，乙酸酐一吡啶法可以 使褐藻多酚基本完全乙酰化。 2 褐藻多酚粗提物的生物活性研究结果表明：( 1 ) 海黍子和鼠尾藻的 酚类提取物有着很强的清除自由基的能力。同时，作为海洋天然产物，其与 合成抗氧化剂相比有着明显的优势，因此是很有开发潜力的抗氧化物质。 ( 2 ) 海黍子和鼠尾藻的褐藻多酚提取物对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都具 有一定的抑菌作用，尤其对两种海洋菌的抑菌效果十分明显。( 3 ) 海黍子、 鼠尾藻提取液均具有明显的抗凝血和抗血栓作用。体外可显著延长血浆的复 钙时间、凝血时间和凝血酶元时间；灌胃给药可改变剪尾出血时间、剪尾出 血量、毛细管法小鼠凝血时间、优球蛋白溶解时间、血栓长度、血小板数、 血小板粘附率和血小板聚集率。 3 褐藻多酚的纯化分级实验结果表明：经过初步纯化、二次纯化及活性 筛选以后，我们可以将褐藻多酚中有生物活性的部分分级为1 1 个组分。 4 褐藻多酚纯化分级产物的生物活性研究表明：各分级产物都具有一 定的生物活性，但是在同等浓度下，它们的清除自由基的能力和抑菌能力有 较大差别，而且分子量越大，生物活性越高。 关键词：鼠尾藻海黍子分离纯化生物活性 a b s t r a c t s a r g a s s u mk j e l l a m a n i a n u my e n d oa n ds a r g a s s u mt h u n b e e r g i ik u n t z ea r e t w oc o m m o nk i n d so fb r o w na l g a ea l o n gq i n g d a oc o a s t t h e ya r ea b u n d a n ti n b i o a c t i v ec o n s t i t u e n t s ，w h i c hm a k et h e mp o t e n t i a lr e s o u r c e sf o ra d v a n c e d p h a r m a c e u t i c a lu t i l i z a t i o n t h ep r e s e n tt h e s i si sf o c u s e do l lt h es t u d i e so ft h ee x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n a n db i o a c t i v i t i e so ft h ep h l o r o t a n n i n si nt h et w ob r o w na l g a e t h er e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ec o n d i t i o n sw ec h o o s ef o r t h ee x t r a c t i o no ft h ep h l o r o t a n n i n s ： s o l v e n ti s9 0 a l c o h o l ；t e m p e r a t u r ei s3 0 ：t h ed u r a t i o ni s1 2 ha n dt h e l i q u i dn i t r o g e ni su s e db e f o r eg r o u n d e d 2 t h eb i o a c t i v i t i e so ft h ec r u d ee x t r a c to fb r o w na l g a ep h l o r o t a n n i n s i n c l u d ea n t i o x i d a t i o n ，a n t i b i o s i s ，a n t i c o a g u l a t i o n ，a n ds oo n ( 1 ) t h ec r u d e e x t r a c th a ss t r o n ga c t i v i t yo fs c a v e n g i n gf r e er a d i c a l s a sm a r i n en a t u r a l p r o d u c t s ，t h e y h a v e s i g n i f i c a n ta d v a n t a g ec o m p a r e dw i t hs y n t h e s t i c a n t i o x i d a n t ( 2 ) t h ec r u d ee x t r a c th a sa n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so nb o t hp o s i t i v e a n dn e g a t i v eb a c t e r i a ，e s p e c i a l l yo nt w ok i n d so fm a r i n eb a c t e r i a ( 3 ) t h ec r u d e e x t r a c th a se v i d e n ta n t i c o a g u l a t i o na c t i v i t i e s i nv i t r o ，t h e yc a ns h a r p l ye x t e n d p l a s m ac a l c i u mr e s t o r a t i o na n dc o a g u l a t i o nt i m e i nv i v o ，t h e yc a nc h a n g et h e t i m ea n dt h eq u a n t i t i e so fb l e e d i n g ，t h el e n g t ho ft h r o m b i ，t h eq u a n t i t i e sa n d a g g r e g a t i o nr a t eo fb l o o dp l a t e s ，a n ds oo n 3 t h ep u r i f i c a t i o no ft h ee x t r a c tc r u d ec a nb ed i v i d e di n t o1 1b i o a c t i v e f r a c t i o n s t h em e t h o d su s e di nt h i s p r o c e s s i n c l u d e t l c ，c o l u m n c h r o m a o g r a p h yo ns i l i c a ，s e p h a d e xga n ds e p h a d e xl h 一2 0 ，s u p e r f i l t r a t i o n 4 t h eb i o a c t i v i t i e so ft h e1 1f r a c t i o n sa r es t u d i e d ，a n dr e l a t e dt ot h e i r m o l e c u l a rw e i g h t sa c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s t h eb i g g e rt h e m o l e c u l ew e i g h t ，t h es t r o n g e rt h eb i o a c t i v i t i e s 2 k e y w o r d s ：s a r g a s s u mk j e l l a m a n i a n u m y e n d o s a r g a s s u mt h u n b e e r g i i k u n t ze x t r a c t i o n p u r i f i c a t i o nb i o a c t i v i t y 3 第一章文献综述 第一章文献综述 海洋除蕴含着丰富的矿产资源和能源外，尚蕴藏着地球8 0 以上的生物资 源，是我们人类的巨大宝库。可是迄今为止被开发利用的大部分资源都来自陆 地。二十世纪八十年代以来，人类对海洋开发的关注逐年增长，特别是一些海洋 国家，例如日本，由于陆上资源有限，特别重视对海洋的开发l lj 。海洋生物的 种类远比陆上丰富，据称达5 0 万种以上。海洋生物长期处于海洋这样一个特异 的闭锁环境，其特点是：( 1 ) 没有急剧的温度变化； ( 2 ) 高浓度的盐和高的水 压；( 3 ) 生物体用整个机体来吸收稀薄的营养； ( 4 ) 容易受到病原微生物的侵 袭。因此，海洋生物在其进化过程中产生了与陆上生物不同的代谢系统和机体防 御系统，其形态、生态、性状和陆上生物不同，可以期望从海洋生物及其代谢产 物中开发出不同于陆上生物来源的，具有特异、新颖、多种多样化学结构的新物 质。目前在国外已报道的仅有的不足3 0 0 0 中海洋生物化合物中，就发现近5 0 是陆地生物所未见的或差异很大的天然产物。在“向海洋要药物”的过程中，海 藻作为在海洋生物中占据重要地位的一大类物质，尤其引起了人们的极大兴趣。 对此，本文将从以下几个方面对海藻及褐藻多酚的文献调研情况进行论述： 第一节海藻生物活性物质的研究 海藻在海洋生物资源中占有相当大的比重，文献上已经报道的种属超过 1 5 ，0 0 0 种。海藻生长在海水这一特殊的环境中：海水含有约3 的盐分，还有 大量可溶性和混悬的有机物质及毒素、维生素、激素、氨基酸、类固醇和酶等。 此外，海水中有几种能够抑制细菌生长的因素，还含有其他的因素可降低病毒的 感染力，其杀菌及抗病毒活性是由于非生命的生化抗菌物质所致。因此，海藻与 陆地植物相比，它们具有许多特殊的成分。可以说，海藻是海洋生物活性物质的 新来源【“。研究表明，海藻的主要成分【3 】【4 】包括：酸、生物碱、胺、纤维素、 酶、红藻淀粉、葡萄糖、无机的物质、脂类、甾醇、甾类化合物、脂防酸、酚的 化合物( 鞣酸物质，即海藻单宁) 、植物激素、色素、蛋白质、氨基酸、糖酒 精、维生素和易挥发的成分及有毒的物质，此外还有一些抗细菌、抗真菌的以及 抗病毒的物质。近年来，大量生源学和生态学研究结果表明，海洋生物活性物质 的初始来源，大部分甚至可能全部是来自于低级海洋生物如藻类及其共生菌类。 因此，运用现代生物技术筛选、提取并应用藻类活性物质正成为这一领域的主 流。海藻生物活性物质大致可以分为两类：一类是难以被消化吸收的细胞间的粘 第一章文献综述 性多塘，主要包括褐藻中藻酸、褐藻糖胶，红藻中琼胶、卡拉胶等；另一类是分子 量较小，吸收后能直接或间接影响体内代谢物质，主要包括卤族化合物，萜类化 合物，溴酚类化合物，对苯二酚，海藻单宁，昆布氢酸等。 述。 1 ，1 抗肿瘤的生物活性物质 肿瘤是危害人类生存的顽疾，从海藻中获得抗癌物质是藻类学家的愿望，并 已经做了大量的工作。现在科学研究表明。具有抗肿瘤活性的海藻种类不下四五 十种，其中活性较大的海藻有：鼠尾藻、海黍子、铜藻、半时马尾藻、裂叶马尾 藻、叉开纲地藻、波状网翼藻、角叉菜、海萝、扁平海萝、钝形凹项藻、拳状松 藻和刺松藻等。 1 2 抗微生物作用的海藻的生物活性物质 p e s a n d 5 】报道了东南地中海沿岸的某些海藻的抗细菌及抗真菌活性的筛选结 果：在观察的3 1 种海藻中，1 1 种具有抗菌活性，它们是钩沙菜、钝形凹顼藻、 海门冬、囊链藻、网地藻、线状网地藻等，其活性物质可能是萜类化合物。 m ，a u b e r t 6 t 等指出在海藻的三大类群：红藻、褐藻和绿藻中的1 0 0 种海藻，有许 多具有抗细菌和抗真菌活性物质。 1 ，3 影响心血管机能的生物活性物质 在各种海藻的提取物中都能发现能影响心脏收缩强度的频率、心肌生化指标 能抑制血液凝固的物质磺胺多聚糖，广泛存在于各种具有生物活性的海藻代 谢物中，主要分布在卡拉胶、琼胶和昆布糖等多种海藻多糖中。木村润1 8 】用7 9 中海藻做实验，证明其中的2 1 种海藻具有很强的抗凝作用。e l s m e r r 9j 从红叶藻 种分离出的多糖复合物具有明显的抗凝活性。红藻在体内和体外培养都有很强的 抗凝活性，而且没有毒性有希望作为一种廉价的抗凝血剂。海带属、角叉菜 属、石花菜属等海藻均具有较强的抗凝活性。 1 5 具有抗血脂和降低血清胆固醇的生物活性物质 1 9 5 7 年j a c k s o n 1 1o l 用海藻提取物中的卡拉胶对兔子进行实验，结果表明卡 拉胶能对动脉硬化挤兑总脂质、血清胆固醇的上升有抑制作用。龟田次郎i n 】 等，通过用海带喂饲家兔，证明它们对高血脂疰、高血压和动脉硬化有抑制作 用。g u v e n ”j 从囊链藻属、马尾藻属及多管藻属的一些海藻种分离出抗血脂活性 第一章文献综述 的物质。r e i n e r ”1通过从墨角藻属和马尾藻属海藻分离出甾醇喂雏鸡，结果： 岩藻甾醇、马尾藻甾醇对降低胆固醇有奇效。此外，从海藻中提取的多糖复合物 海带多糖、海萝聚糖、褐藻酸钠等均具有抗血脂及抑制胆固醇上升的活性。以下 的海藻所具有的生物活性很高：海带属、角叉菜属、马尾藻属、墨角藻属、鹿角 藻属、紫菜属、海萝属、石莼属、浒苔属及礁膜属。 1 6 具有降血压物质的生物活性 t a k e m o t o i “l 报道在狭叶海带、树枝软骨藻及异软骨藻等的提取物含有能降 血压和其他药理作用的成分，其活性成分是昆布氨酸及类似的物质。具有降压活 性的海藻还有：海带属的各种海藻，昆布属、裙带菜属及k j e l l m a n i e l l a 、 c o s t a r i a 、a r t h r o t h a m u u s 等属海藻。 1 7 具有杀死肠道寄生蠕虫作用的生物活性物质 自古以来，海人草一直被利用为肠道寄生蠕虫的药剂。现已发现4 0 余种褐 藻具有杀死肠道寄生蠕虫作用的生物活性物质。b e n i g n i ”】指出干燥的海人草治 疗蛔虫很有效，珊瑚藻的提取物对治疗蛔虫有效。石花菜属、蜈蚣藻属和墨角藻 属等海藻的提取物均有驱虫活性。软骨藻属海藻的提取物对蛔虫和蛲虫有效。小 林节子 1 6 1 的调查结果表明：如以海人草的驱虫效率为1 0 0 ，则刺松藻为3 0 0 ，珊 瑚藻属为1 5 0 ，石花菜属是1 0 0 ，鼠尾藻是8 0 ，凝菜属是3 8 。它们的有效成分是 海人草酸。 1 8 具有药理作用的其他类型的海藻的生物活性物质 ”】【”】 1 9 】 海藻除了具有以上所述的生物活性物质以外，它们在生命活动过程中的各种 产物还有一些具有药理效应的化合物，如神经兴奋、催吐、轻泻、止血作用，还 有提高动脉血压和血糖含量、抑制和加强排尿，加强肌肉组织收缩活动等作用。 第二节褐藻多酚的研究进展 海藻中褐藻门是藻类中比较高级的一大类群，是含有褐色色素的丝状的或丝 原植体的藻类，共有2 4 0 属，1 5 0 0 种，具有个体大、产量高、分布广等特点，是 海藻中非常引人注目的一类。在我国沿海品种纷繁的经济资源中，褐藻类占据显 著地位，成为我国三大经济海藻之一。现在已被人们开发利用的褐藻门的主要产 物是褐藻酸和褐藻酸盐。褐藻酸( a l g i n i c ) 和褐藻酸盐( a l i g i n a t e s ) 主要分布 在海带属( 占干重的1 5 4 0 ) 、巨藻属( 占干重的1 4 2 1 ) 、马尾藻属( 占干 重的2 0 2 5 ) 及翅藻、昆布、喇叭藻及铁钉菜等属的褐藻中，它们具有抗微生 物及抗凝血活性，对血液中的胆固醇有某种程度的降低作用。褐藻酸钾有明显的 止血作用，褐藻酸钠在免疫过程中可作为两种病毒的载体。褐藻酸还有治疗糖尿 病和降低血脂的作用【2 m 。褐藻中除含有大量的褐藻胶、甘露醇、碘和无机盐等成 第一章文献综述 分以外，还含有一类结构特殊、具有生物活性和医药价值的褐藻多酚化合物。褐 藻多酚的研究工作在国内尚未深入展开，对其生物活性的研究和应用具有重要的 意义。 我国对褐藻多酚的进一步研究最初源于对褐藻胶的质量进行改进的探索。我 国马尾藻的资源非常丰富，沿海自然生长着大量马尾藻。仅在辽东半岛和山东半 岛，每年干品产量就在1 0 0 0 吨以上，南方产量更大。而且，马尾藻胶m g 比较 小，能形成相当强度的凝胶，潜在的应用价值很高。那么，是什么原因影响马尾 藻胶成色较深，粘度不稳定呢? 研究发现是褐藻多酚造成的。到目前为止，这类 化合物被认为仅存在于褐藻类植物中，是类独特的天然产物。这类物质的研究 工作很少，虽然对它的研究历史已有百余年，但终因其结构复杂、不易纯化、容 易氧化等棘手的问题导致了认识状况的停滞不前。通过文献调研，可将褐蘧垒娶 鬯巫壅型盆垫三全历建监殷己筮= 险墼墨塑熙竺畛退：圭茎墨塞堕亟叁观察窭墅 而上学的思考。c r a t o ，e 和k y l i n ，h ( 均是德国藻类学家) 等初步得出褐藻细胞内 某种特定的细胞器( 藻泡，p h y s o d e ) 中富含间苯三酚类物质，具有单宁性。第 二险垦是撞物化堂班塞睑昼，主要是高等植物单宁研究和海藻化工的推动及细胞 学电子显微镜观测的引入，h a u g a ，m u n d a 【( 均是挪威藻类学家) 等广泛地研究了 褐藻多酚的含量及作用，但对结构尚不明确。第三阶段是天然产物结构研究及相 关的生理生态研究，主要是结构解析工作。k w g l o m b i t z a ( 德国) 和m a r a g a n ( 加拿大) 等在这一阶段取得了实质性突破，了解到褐藻多酚是一组分子 量分布复杂的一类化合物，其结构单元是问苯三酚。下面，将介绍前人对小分子 量褐藻多酚的结构分类及高分子量褐藻多酚的研究结果l z ：i 11 “j 。 2 1小分子量褐藻多酚的结构研究 据文献的研究结果，小分子量褐藻多酚的结构类型除间苯三酚( 1 ) ( 各结 构式附后) 之外，寡聚物依其聚合方式不同可分为六类。其一，间苯三酚以芳 基、芳基联接，称为f u c o l s ，如d i f u c o l s ( 2 ) ，t r i f u c o l ( 3 ) ，t e t r a f u c o la ( 4 ) ，t e t r a f u c o lb ( 5 ) ；其二，间苯三酚以二芳基醚键联接，称为p h l o r t h o l s ， 如d i p h l o r t h o l ( 6 ) ，t r i p h l o r t h o la ( 7 ) ，t r i p h l o r t h o lb ( 8 ) ，t r i p h l o r t h o lc ( 9 ) ，t e t r a p h l o r t h o la ( 1 0 ) ，t e t r a p h l o r t h o lb ( 1 1 ) ，t e t r a p h l o r t h o lc ( 1 2 ) 以及h y d r o x y t e t r a p h l or t h o l (1 3) ，h y d r o x y p e n t a p h l o r t h o l (1 4 ) ， h y d r o x y h e x a p h l o n h o l ( 1 5 ) 等；其三，间苯三酚寡聚体中同时含有芳基芳基键 和二芳醚键，称为f u c o p h l o r e t h o l s 即f u c o l s 和p h l o r e t h o l 两者的结合，因此这 类化合物的最简单形式含有三个间苯三酚单元。如f u c o p h l o r e t h o la ( 1 6 ) ，b ( 2 9 ) ，c ( 4 2 ) ，f u c o d i p h l o r e t h 0 1a ( 1 7 ) ，b ( 3 5 ) ，c ( 3 6 ) ，d ( 3 0 ) ，e ( 2 4 ) ，f ( 4 3 ) ，f u c o p h l o r e t b o la ( 1 8 ) ，b ( 3 1 ) ，c ( 3 7 ) ，d ( 2 5 ) ， 7 第一章文献综述 e ( 2 2 ) ，f ( 2 7 ) ，f u c o t e t r a p h l o r e t h o la ( 3 2 ) ，b ( 3 8 ) ，c ( 1 9 ) ，d ( 2 1 ) ，e ( 2 8 ) ，f ( 2 6 ) ，g ( 2 3 ) ，f u c o p e n t a p h l o r e t h o l a ( 3 3 ) ，b ( 2 0 ) ， f u c o h e p t a p h l o r e t h o la( 3 4 )，以及d i f u c o 曲l o r e t h o la( 4 4 )， b i s f u c o p h l o f e t h o l a(3 9) ， b i s f u c o t e t r a p h l o r e t h o l a ( 4 0 ) b i s f u c o p e n t a p h l o r e t h o la ( 4 1 ) 等；其四，间苯三酚以芳基的醚键联 系，但其单体中含有附加羟基形成邻羟基化合物，称为f u h a l o l s ，如b i f u h a l o l (45) ，t r i f u h a l o l a(46) ，b (47) ， t e t r a f u h a l o la ( 4 9 ) ，b ( 4 8 ) ，c ( 5 8 ) ，d ( 5 9 ) ，p e n t a f u h a l o la ( 5 0 ) ，h e x a f u h a l o la ( 5 1 ) ，b ( 6 0 ) ，h e p t a f u h a l o la ( 5 2 ) ，o c t a f u h a l 0 1a ( 5 4 ) 。n o n a f u h a l o la ( 5 5 ) ，u n d e c a f u h a l o l ( 5 6 ) ，t r i d e c a f u h a l o l ( 5 7 ) 以及 d e o x y h e p t a f u h a l o l ( 5 3 ) 等。这一类化合物数目繁多，结构规律性较差，有些化 合物不能完全符合上述规则，如：某些间苯三酚单元无附加的羟基；另外，间苯 三酚醚键有立体结构差异，一般均是对位和邻位，少数采用间位方式，又被称为 异构体i s a f u h a l o l s 。其五，这类化合物称为e c k o l s ，在三个间苯三酚单元的脱水 寡聚物中，其中两个间苯三酚单元进一步环化形成而二苯杂二氧 ( d i b e n 1 ，4 d i o x i n ) ( 6 1 ) ，它还能进一步形成第二个二苯杂二氧系统即 d i o x i n o d e h y d r o e c k o l ( 6 2 ) ，进一步羟基化即h y d r o x y e c k o l ( 6 3 ) ，或以第四个间 苯三酚单元酚氧化即3 - p h l o r o e c k o l ( 6 4 ) 或芳基化联接后脱水形成二苯呋喃型化 合物即f u c o f u r o e c k o la ( 6 5 ) ，b ( 6 6 ) ，c ( 6 7 ) ，然后还可以通过醚键连上第五 个间苯三酚单元即p h l o r o f u c o f u r o e c k o l ( 6 8 ) 。此外，e c k o l s 还能进一步聚合， 形成d i e c k o l ( 8 ，4 醚键) ，或b i e c k o l ( 7 ，7 芳键；7 ，9 芳键：9 ，9 芳键等) ：其六，卤 代、硫酸酯化、烷基化多酚，这类化合物不太常见，缺乏典型性，故不作赘述 ( g l o m b i t z ag r o u p1 9 7 4 1 9 9 1 ) 。 2 2 高分子量褐藻多酚的研究 一般认为寡聚的间苯三酚可以进一步聚合形成更高分子量的单宁质，但其生 物合成途径尚未清楚。由于褐藻多酚分子量大，结构复杂，容易氧化，不易纯 化。红外、紫外及核磁共振等结构解析手段均未获得十分明确的结构信息，因 此，仅就核磁共振和降解研究作一阐述一刮_ 【“1 ( r a g a ng r o u p1 9 7 6 1 9 8 5 ) 。 早期的降解手段有酸水解，氧化还原降解，乙酸水解，臭氧裂解以及氢解， 但未得到可被辨认的碎片；若作剧烈的碱水解则释放间苯三酚，若以碱性高锰酸 钾氧化，则得到间苯三酚的二聚或三聚体。但若在碱性条件下加热，对降解产物 乙酰化则可得到二苯呋哺化合物，w o l w e r r i e c k ( 1 9 8 4 ) 详细地研究了这一反应机 理：即二芳基醚键断裂的过程和条件。二苯呋喃不是通过醌中间体加成或氧化偶 联生成的，而是碱催化缩合成阴碳离子，再由其进攻二苯醚键邻位之亲电性碳原 8 第一章文献综述 子，脱水生成二苯呋喃。另外对甲基化之褐藻多酚以液氨钠或锂或钙降解，使芳 基芳基醚键断裂。然后对降解产物作g c e i m s 分析，结果表明：其一，墨角藻 多酚完全由间苯三酚单元通过醚键或碳碳键联接组成：其二，六羟基二苯官能团 主要存在于终端，其余部分则由间位或对位醚键联接：其三，六羟基二苯官能团 化出现在链中，但是比例甚小；其四，无邻三羟基、羧基、烷基、卤代物；其 五，寡聚芳基化合物回收率甚小；其六，间苯三酚单元有支点，为对、邻、问醚 键；其七，终端官能团除六羟基二苯外，尚有间苯三酚单元。但是，由于聚合物 的不同区域抗降解程度不同，因此，它所得到的结构信息不能说明这些结构单位 在原始聚合物中所占的比例。 m c l n n e s t “j 等人对褐藻多酚高聚物作了详细的研究( 见图1 1 ) 。其使用的技 术是e d i t ”c n m r ，这是由一维多脉冲技术所产生的二个次光谱图，一张仅表明 甲基碳或甲川碳，另一张仅表明季碳或亚甲碳，二谱相加则是通常的宽波段，1 h 脱偶”c 谱图。处于高频区( 1 5 1 0 5 1 6 3 5 ) 的信号，相对应于聚合物中原始间苯 三酚的c 1 ，3 ，5 位置氧联碳原子；而位于中频区( 1 2 6 0 1 2 8 5 ) 的信号，则是与 氧醚相联的2 ，4 ，6 碳原子受对位和邻位氧屏蔽；位于低频区( 9 6 5 1 0 5 5 ) 的 信号来自于甲川碳或碳碳键之季碳，前者处于更低的频率。其使用的实验材料有 p i l a y e l l e 和s p o n g o n e m a ，实验发现其响应都位于1 0 1 8 1 0 2 2 p p m 和1 5 8 8 1 6 0 0 p p m ，中频部分明显缺乏，说明它几乎完全由碳碳键联接；对于 d i c t y o s f 口 d n ，c h o r d a r i a 和c y s t o s e i r a 而言，低频的季碳信号无响应，中频的醚 键碳信号有多重分裂，说明它几乎完全由醚键联接，且间苯三酚单元上有多余的 氧取代，其聚合度是高度支化的。对于a l a r i ae s c u l e n t qa g a r u mc r i b o s u m , a s c o p h y l l u mn o d o s u m 以及f u s u sv e s i c u l o s u s 来说，低频季碳和中频醚碳均有存 在，但是醚碳信号单一，说明这类聚合物具有混合结构，全缺少五氧取代或进一 步的羟基化。m c l n n e s 还进一步运用模型化合物研究，还得到了聚合物中终端单 元、支化单元和其它单元的比例是1 ：1 ：2 5 。 2 3 褐藻多酚的生物学研究 m c c u l l y p 刮用光学显微镜、电子显微镜和组织化学方法确定电子致密液泡或 含有多酚物质，或含有褐藻酸。e v a n s 和h o l l i g a n p 叫证实了藻泡的酚类物质，但 是电镜照片模糊。l p e l l i g r i n i ( 1 9 8 0 ) 用光电显微镜比较研究了c y s t o s e i r as t r i c t a s a u v 营养细胞，对藻泡作了准确定位，位于分生组织细胞的外极 p r o m e r i s t e m a t i c 细胞的藻泡呈分散状，其本质是单层膜液泡，液泡内含物是液态 或半液态的。藻泡内含物或被溶酶体酸性磷酸酶裂解，或通过细胞壁排泄。 m a n g e n o t p 刮的观点是：褐藻藻泡等价于高等植物的单宁液泡。根据高等植物液 泡发育的规律，它一般要经历三个阶段。其一，前液泡产生；其二，前液泡融合 9 第一章文献综述 成小液泡；其三，小液泡扩张。藻泡生长也有这些过程t ：o j 。但是，我们对于参 与间苯三酚聚合的多酚氧化酶还一无所知。m n c l a y t o n ( 1 9 8 3 ) 在研究藻泡超微 结构时，改进了固定方法( m u l l e r 等人曾将咖啡因加入戊二醛固定液中稳定酚类 物质，1 9 7 8 ) ，得出结论：1 的咖啡因与3 5 戊二醛混用能得到良好的效果， 并对褐藻细胞超微结构作了整体描述。藻泡的化学特性随着细胞的成熟而改变。 但是有关藻泡的结构、发生、分泌过程仍有争议。 多酚的化学防御性质也得到了研究。s t e i n b e r g p ，j 研究了多种褐藻的多酚含 量及其摄食威慑性。虽然，早在1 8 8 8 年，s t a h l 就提出植物单宁的作用是防止草 食性动物的摄食，但是，只有随着植物单宁化学本质的不断显示，以及 t s w a i n 5 8 】i ”】等不懈地强调植物次生物质的生理功能，才推动了单宁物质的生 物学研究。其它的研究还包括褐藻多酚对重金属离子的络合作用 ( r a g a n ，1 9 7 9 ，1 9 8 0 ) ，杀菌、杀幼虫的性质等( c r a i g i e1 9 6 4 ，s i e b u r t h 1 9 6 5 ，c o n o v e r1 9 6 6 ) 。 中科院海洋所的严小军( 1 9 9 4 ) 是国内较早研究褐藻多酚的学者之一。他详 尽的研究了褐藻多酚的组成结构特征及其与多糖的相互作用，并对褐藻多酚的进 一步研究和利用提出了如下的想法：其一，褐藻多酚具有潜在的生物活性，可研 制开发成食用抗氧化剂；其二，褐藻多酚是天然的生态治理工具，因它可与蛋白 质、生物碱结合。已知的许多海洋生物毒素都是生物碱，如：河纯毒素，石房蛤 毒素等；其三，褐藻多酚与褐藻富集碘、同化碘的功能有关。 现在，褐藻多酚的潜在的生物活性已得到了一些药理学研究。 d m w h i t a k e r 和g p c a r l s o n ( 1 9 7 3 ) 研究了e i s e n i ab i c y c l i sk j e l l m a n 提取物 的药理作用，提取物的主要成分是多酚聚合物，分子量大约为1 0 ，0 0 0 ，提取溶 剂为水或盐水，测试模型为与间苯三酚对照，研究抗炎及肝微粒体酶活性等指 标，结果表明，以卡拉胶诱发猫爪水肿，用褐藻多酚对其进行消炎处理，有效率 达8 8 ，对于0 1 5 牛血清蛋白缓冲液而言，在7 0 加温时，若加入褐藻多酚 浓度达3 2 0ug m l 时，抑制失活率为9 6 。另外，褐藻多酚能够拮抗箭毒，这可 能与它对生物碱的反应活性有关。g b l u n d e n 等人( 1 9 9 4 ) 对海藻提取物做了广 泛的生物活性测试，包括裂解d n a ，抑制酶活性，凝集人体红细胞。在这些测 试中，几种褐藻包括a s c o p h y l l u mn o d o s u m ，f u c u ss e r r a t u & f v e s i c u l o s u s , h a l i d r y s s i l l i q u o s a 和h i m a n t h a l i ae l o n g a t a 均具有十分显著的活性。通过透析，将提取 物分离成高分子量和小分子量部分，发现上述所有的活性均来自高分子量部分。 运用氢核磁共振光谱检查这些组分表明存在多酚和碳水化合物，用聚乙烯吡咯烷 酮( p v p ) 除去多酚后活性全部消失，说明这些褐藻提取物所具有的活性裂解 d n a ，抑制酶活性以及凝集人血红细胞均归因于提取物中存在的褐藻多酚类化合 第一章文献综述 物。e c k o l s 类化合物是抗血纤维蛋白溶酶原的抑制物，这类物质还具有脱臭作用 ( k i t a n e ta i1 9 9 0 ) 。 2 3 1 褐藻多酚除臭活性的研究进展【6 0 】【6 l 】 褐藻多酚是一类电化学活性物质。多酚的化学结构使其容易氧化成为相应 的醌，而这种具有环状二元酮结构的醌，又能还原成原来的多酚。在碱性介质 中，多酚的吸氧能力最强可以被用来作为氧化过程的良好载氧体。这个性质使 其可用作有实用价值的工业脱硫剂，对无机硫( h 2 s ) 、有机硫( 硫酵) 都很有 效。将多酚制成多酚一金属盐( 特别是f e 3 + ) 络合物，可以有效的吸附硫化氢、 硫醇和氨气，用于除去异味和室内空气的净化。 2 3 1 1 多酚( p p ) 的脱硫机理 硫化氢( h z s ) 是天然气、煤气、水煤气、石油气等多种工业气体中的有害杂 质，也是煤中人们想除去的成分。采用植物多酚脱硫已经用于工业生产，属于湿 法氧化法，具有无毒、高活性、低温度、能耗少等优点。多酚( p p ) 的工作原理 如下： 碱性溶液吸收h 2 s ，生成h s ，使气体脱硫。 n a 2 c 0 3 + h 2 一n a h s + n a h c 0 3 h s 被v 5 + 氧化成硫析出，以回收硫。 n a h s + n a h c 0 3 + 2 n a v 0 3 卜s + n a 2 v 2 0 5 + n a z c 0 3 + h z o 氧化态的多酚( 即醌) 将v “氧化成v “，使偏钒酸钠得以重复循环利用 o h p p ( 氧化态) + n a 2 v 2 0 5- + p p ( 还原态) + 2n a v 0 3 h 2 0 还原态的多酚在喷射器内被空气氧化，再生为氧化态的多酚以便循环利 用： p pf 还原态pp p ( 氧化态) 多酚在脱硫中主要起到催化氧化剂的作用，此过程实质上是一个醌一酚转化的关 系。褐藻多酚及其降解产物均具有相似的催化氧化能力。 2 3 2 2 褐藻多酚去除异味的活性 茶叶碎末可以除去冰箱里的异味，从这一生活常识中可以了解植物多酚对 n h 3 ，h 2 s 和有机硫都有一定的吸附能力。与植物多酚楣类似，褐藻多酚与金属 ( f e ，m n ，c r ，n i ，z n ，a i ，c u ，s n ) 离子或金属氧化物、氢氧化物、硫化物形成的络合 物对这些异昧气体有很强的吸附性。 据n o r i y o s h ik i t a 等人的研究成果，1 ：3 臭最初来自于细菌对食物残渣中的蛋 白质、皮肤残留物及口腔细菌的分解。引起口臭的物质主要是含氮或含硫化合 第一章文献综述 物、短链的脂肪酸、醇类和醛类。由于观察到甲硫醇浓度和口臭可感值之间有线 性关系，可见除去甲硫醇在减少口臭时十分重要。n o r i y o s h ik i t a 等通过对3 3 种 海藻进行筛选，发现三聚体的间苯三酚单宁表现出对甲硫醇有着显著的去臭活 性，而且明显高于常用的叶绿素及时绿素铜钠盐。 总之，目前的褐藻多酚研究是多学科的交叉研究，其研究目的也是多元性 的。褐藻多酚作为种独特的天然产物，其以前的研究内容主要是海藻化学，包 括生物有机化学，如天然产物结构解析，有机合成，定量分析以及药理作用，以 及海洋化学工业如作为鞣质材料、媒染剂等，多酚的提取和综合利用，褐藻胶的 纯化、脱色、保质。其次，褐藻多酚是细胞学和生物化学关注的对象，通过光 学、电子显微镜和细胞染色的方法研究藻泡及各细胞器的超微结构，褐藻多酚的 生物合成，代谢途径和转运过程等。褐藻多酚与环境的相互作用正使褐藻的某些 生理生态过程描述更加专门化，如环境化学中褐藻多酚螫合重金属离子，形成腐 殖酸。毒理学中对真菌、微藻及动物幼体的毒性，植物生理和动物行为等领域也 有此类化合物的报道( e g t a n i g u c h i ，k e ta l ，1 9 9 l ，s u e u r ，s e ta 1 ，1 9 8 2 ) ，见图 1 - 2 。本文对褐藻多酚的研究主要集中在褐藻多酚的提取分离、纯化分级、定量 分析以及生理活性等方面。 ( 藻泡生物合成、发生、转移) 细胞学和生物化学 t 褐藻多酚 上 环境化学等：环境+ 一化学工_ 匕生物有机化学：结构解析等 鞣质材料多酚的提取与综合利用褐藻胶的纯化、脱色、保质 图1 - 2 褐藻多酚的相关研究 第一章文献综述 第三节鼠尾藻和海黍子的研究现状 褐藻门马尾藻属海黍子( s a r g a s s u mt f e l l m a n i a n u my e n d o ) 和鼠尾藻 ( s a r g a s s u mt h u n b e r g i ik u n t z e ) ，因具有软坚散结、利尿消肿、消热化痰之功效， 且生物量大，已被收藏于中国海洋药物辞典，主治淋巴结核、淋病、甲状腺 肿大、心绞痛等症。国内外学者对它们的化学成分的研究已有诸多报道，但多集 中在多搪和挥发性组分上，张尔贤等i o 纠【o j j 的研究表明，鼠尾藻的醇提物具有多 方面的生理活性，不仅对癌细胞的生长有一定的调节作用，而且与机体代谢功能 具有多种协调性，包括控制代谢物质活性、浓度，对免疫结构和功能的影响等。 另外，鼠尾藻多糖对氧自由基有较强的清除活性。于广利，吕志华等i ”j 利用自 由基引发氧化体系对青岛近海的2 4 种海藻的抗氧化性能进行筛选，获得了具有 较强抗氧化活性的藻种一海黍子，并从中分离得到两种混合组分，进一步研究了 它们对鱼油和卵磷脂的抗氧化作用。师然新，徐祖洪p 刘研究了青岛沿海常见的9 种海藻的抗菌能力。结果表明：海黍子和鼠尾藻的提取物对大肠杆菌和枯草杆菌 均有一定的抑制作用。但是在文献调研过程中，我们发现对于海黍子和鼠尾藻所 含的多酚化合物在文献中却鲜有报道。在本实验中，我们将深入的研究鼠尾藻和 海黍子的多酚类物质的提取、分离、及纯化方法，并研究其生物活性，从而为海 洋药物的开发研究提供理论和实验的基础。 第四节海洋药物的新发展 我们知道，海洋药物的基本任务，就是研究有特异活性的海洋天然产物，获 取这类成分为人类提供新药，或利用具有特异活性成分的化学结构作为先导物或 模式，设计合成有特殊疗效的新药 6 6 】。近几年来，海洋药物的研究手段不断提 高，思路愈加开阔，出现了一些新兴的领域。这些新兴的领域可以进一步开拓我 们的研究思路，为海洋天然药物的发展具有重要的借鉴意义。下面将简单介绍一 下其中的两种。 4 1 海洋配位化合物药物( 6 7 j 近年发展的重要研究前沿一一中药配位化学学说为我们提供了解决海洋药物 的基本任务的新思路与新方法。海藻，富集了海水中几十种常量和微量元素，存 在着大量配合物；人们已经从海洋生物中得到金属硫蛋白和多糖金属配合物 生物高分子配合物；海洋生物毒素、生物碱、海洋多烯类化合物、海洋高级脂肪 酸及氨基酸都可以作为配位体来合成配合物药物。 4 2 抗病毒药物导向化合物的研究【6 8 】 6 9 】 抗病毒化学疗法是3 0 年前碘苷成功的治疗单纯疱疹性角膜炎后而得以形成 的。尽管对海洋天然产物的抗病毒活性尚未进行详尽的研究，但从已检索到的文 第一章文献综述 献资料表明，某些水生生物的次级代谢物在体外生物鉴定系统中显示出抗病毒活 性。鉴于以下几个原因，可因认为海洋天然产物是进行抗病毒研究的重要化合 物：多年来从化学和药学角度上探索海洋生物的工作，相对而言是不够的。其 关键是技术问题。近几十年来海洋学已取得了实质性进展，上述问题已部分得以 解决。在海洋生物学家、有机化学家和病毒学家的密切协作下，丰富的海洋动植 物群将成为包括抗病毒药物在内的药物研究的丰富资源；天然产物被认为是酶 抑制剂的丰富来源，其中有许多对特异酶有重要的选择性。因而，有理由认为在 种类繁多的海洋天然产物中存在着病毒编码酶的选择抑制剂，且可能具有抗病毒 剂所需的效力和选择性：发现有效的抗病毒药物的困难性，其部分原因系因病 毒时常突变为抗药株。因此，采用机理不同的药物进行联合治疗是有益的。所 以，寻找抗病毒化合物的一个策略是获取具有不同作用机理和各种化学结构的导 向物。水生生物因其生物习性可以生物合成结构与陆生生物或任何人工合成的化 合物不同的次级代谢产物。这些结构独特的代谢物能以新的方式与生物系统相互 作用，可作为开发新药的模板。 综上所述，由于褐藻中多酚化合物成分复杂，分离纯化难度极大，所以多年 来的研究一直徘徊在简单的粗提物和部分结构简单的成分上。因此，如果我们以 生物活性成分的化学研究为核心，结合中医理论，用现代科技方法对常见海洋药 物进行化学和生物活性的基础研究，搞清其主要化学成分及其作用机理，探索褐 藻多酚化学结构与生物活性的关系，对阐明海洋药物防病机理有重大意义。同时， 以此为基础进行褐藻多酚类生物活