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臭氧法降解制备低分子量壳聚糖及其应用研究 摘要 本文主要研究了臭氧氧化法与膜分离结合，制备低分子量壳聚糖；对 降解产物结构进行表征；所得产物进行植物病原菌抗菌活性的研究。结果 表明： 以8 5 脱乙酰度、分子量为2 5 x1 0 4 的壳聚糖为原料，考察了氧气流量、 反应体系溶剂、p h 、温度、反应时间等单因素对降解反应的影响。结果表 明，以醋酸为反应溶剂，在2 0 。c 、p h3 、氧气流量0 2m 3 h ( 每升反应液) 条件下降解6h 为较理想的反应条件。 降解液用盐酸调至p h2 左右，抽滤收集清液，分别用截留分子量为2 k 、 3 k 、5 k 、1 0 k 、3 0 k 的中空纤维膜超滤，浓缩、醇沉，沉淀用9 5 以上乙醇反 复洗涤至中性，干燥，获得所需聚合度的壳低聚糖。 降解产物的结构用傅立叶红外光谱、核磁共振碳谱表征，脱乙酰度用 双突跃电位滴定法测定，结果表明降解产物的结构单元没有变化；降解产 物的聚合度和分子量用飞行时间质谱和乙酰丙酮法测定，结果表明所得到 产物的主要分子量范围是6 6 2 - 5 4 9 2 ，主要聚合度为4 - 1 9 。 探索降解产物对植物病原菌的抑制作用与其分子量关系。通过测定最 小抑制浓度和抑制圈，研究了不同分子量的可溶性壳聚糖对稻胡麻叶斑病 等1 3 个植物病原菌的抑制作用。结果表明，对多数植物病原菌来说，可溶 性的低分子量壳聚糖分子量在6 6 2 - 5 4 9 2 范围内，随分子量的增加，其抑菌 能力增强，抑菌效果更明显，最小杀菌浓度减小，杀菌能力增强，其中以 聚合度在1 0 - - 3 4 ，即分子量m n = 4 1 0 1 壳聚糖的抑菌效果最好，对野油菜黄 单孢8 0 0 4 菌、青枯雷尔氏菌g m l l 0 0 0 菌和辣椒斑点病菌的抑菌效果都很好。 该研究为植物病原菌抑制剂的开发提供了依据。 关键词：壳聚糖臭氧降解低分子量壳聚糖植物病原菌抑制圈 i i p r e p a r a t i o no fl o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n d e g r a d e db yo z o n ea n di t su s i n gs t u d i e d a bs t r a c t i nt h i sp a p e r ，o z o n eo x i d a t i o nc o m b i n ew i t hm e m b r a n es e p a r a t i o nw a s s t u d i e do np r e p a r a t i o no fd i f f e r e n t so fl o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n t h e s t r u c t u r eo ft h ep r o d u c th a dh e e nc h a r a c t e r i z a t e d ，a n dt h ep r o d u c t sw e r er e s e a r c h o np l a n tp a t h o g e n si n h i b i t t h er e s u l t ss h o wt h a t ： t h ec h i t o s a n ( a ：8 5 5 ；m w ：2 5 10 4 ) d i s s o l v e di na c i ds o l v e n tw a s t r e a t e dw i t ho z o n e t h ee f f e c to ft h eo x y g e nf l o wr a t e 、s o l v e n tr e a c t i o ns y s t e m 、 p h 、t e m p e r a t u r ea n dr e a c t i o nt i m eh a db e e nr e s e a r c h e d t h er e s u l ts h o wt h a t g e n e r a t ef r o mo x y g e nw i t ha p p l i c a t i o nf l o wr a t eo f0 2m 3 h ( f o r1lr e a c t i o n s o l u t i o n ) b yao z o n eg e n e r a t o ra t2 0 0 cf o r6h o u r s ，p h = 3a n ds o l v e n ti sa c e t i c a c i d a f t e rt h er e a c t i o n ，t h ed e g r a d e dc h i t o s a ns o l u t i o nw a sa d j u s tt op h2 a p p r o x i m a t e l yb ya d d i n gh y d r o c h l o r i ca c i d ，l e a c h i n ga n dc o l l e c t i n gt h ec l e a r l i q u i d t h ed e g r a d e ds o l u t i o nw e r es e p a r a t e du s i n gu l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n e w i t hc u t o f fm o l e c u l a rw e i g h to f2 ，3 ，5 ，10a n d3 0 k d a ，r e s p e c t i v e l y c o n c e n t r a t e ，a l c o h o lp r e c i p i t a t i o n ，w a s ht h ep r e c i p i t a t er e p e a t e d l yt on e u t r a la n d d r yt h ep r e c i p i t a t e t h en e c e s s a r yd e g r e eo fp o l y m e r i z a t i o no ft h el o w m o l e c u l a r i i i w e i g h tc h i t s a nw a so b t a i n i na d d i t i o n ，t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo ft h e d e g r a d e d c h i t o s a nw e r e c h a r a c t e r i z e db yf t - i r ，1 3 c - n m rs p e c t r u m d e g r e eo fd e a c e t y l a t i o nw a s d e t e c t e db yt w oa b r u p tc h a n g ec o n d u c t o m e t r i ct i t r a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t et h a t t h e r ea r en om o d i f i c a t i o no ft h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo ft h ed e g r a d e dc h i t o s a n c o m p a r ew i t ht h ei n i t i a lc h i t o s a n t h ed e g r e eo fp o l y m e r i z a t i o na n dm o l e c u l a r w e i g h to fd e g r a d e dc h i t o s a nw a sd e t e c t e db ym a l d i t o fm a s ss p e c t r u ma n d a c e t y l a c e t o n em e t h o d t h er e s u l ts h o wt h a tt h em a i nd e g r e eo fp o l y m e r i z a t i o n o fl o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t s a na r e4 19 ，a n dt h em o l e c u l a rw e i g h tr a n g ea r e 6 6 2 5 4 9 2 t os t u d yt h ed e g r a d a t i o np r o d u c t sa p p l i c a t i o n t h ea i mw a st oe x p l o r et h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ei n h i b i te f f e c to fc h i t o s a n so np l a n tp a t h o g e n i cb a c t e r i a a n di t sm o l e c u l a rw e i g h t t h ei n h i b i te f f e c to fl o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n s ( l m w c ) w i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h to n13p l a n tp a t h o g e n i cb a c t e r i as u c h a sh e l m i n t h o s p o r i u mo r y z a ew e r es t u d yb yd e t e c tt h em i n i m u ni n h i b i t o r yc o n c n a n di n h i b i t o r yc i r c l e t om o s tp l a n tp a t h o g e n i cb a c t e r i a ，t h ea n t i b a c t e r i a la b i l i t y o ft h es o l u b l el m w ca r es t r e n g t h e n ，t h ei n h i b i te f f e c ta r em o r eo b v i o u s ，t h e m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c na r ed e c r e a s ea n dt h es t e r i l i z a t i o na b i l i t ya r e s t r e n g t h e nw i t ht h ei n c r e a m e n to ft h em o l e c u l a rw e i g h tw h e nt h em o l e c u l a r w e i g h to fl m w c a r ei nt h er a n g eo f6 6 2 - - - ，5 4 9 2 a m o n gt h e m ，t h ei n h i b i te f f e c t o fl m w cw i t ht h ep o l y m e r i z a t i o nd e g r e eo f10 3 4a n dm o l e c u l a rw e i g h to f m n = 4101i sb e s t ，w h i c hh a db e r e ri n h i b i te f f e c to nx a n t h o m o n a s i v c a m p e s t r i s 一8 0 0 4 ， r a l s t o n i as o l a n a c e a r u mg m i10 0 0a n d s t e m p h y l i u m l y c o p e r s i c i t h er e s e a r c hp r o v i d et h eb a s i sf o rt h ed e v e l o p m e n tf o rp l a n t p a t h o g e n i cb a c t e r i a si n h i b i t o r k e y w o r d s ：c h i t o s a n ；o z o n e ；d e g r a d e d ；l o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n ；p l a n t p a t h o g e n i cb a c t e r i a ；i n h i b i t o r yc i r c l e ； 、】 符号 a 5 2 5 o p a 坛 p d 符号说明 5 2 5 n m 吸光度值 聚合度 脱乙酰度 数均分子量 分散度 意义 i x 单位或量纲 无 无 无 无 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：名目 学位论文使用授权说明 年多月2 日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 曰即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) q 噱新签名幽嵫堋年侈胁日 广西大掌硕- a r a # l 立论文臭窜b 各降解制备低分子量亮聚糖及其应用研究 1 1 引言 第一章绪论 随着科学的发展和人们对生命现象认识的不断深入，糖生物学的研究成了生命科学 研究领域的新前沿，几丁质、壳聚糖及其衍生物的研究是该研究领域中最为活跃的分支 之一。作为自然晃唯一大量存在的碱性多糖【l 】- - 壳聚糖及其衍生物具有不同于其他多糖 的独特作用，相关的应用研究已渗入到化学、生物学、功能材料等各个分支，并显示出 独到的应用价值。几丁寡糖和壳寡糖是天然的低分子量多糖，生物相溶性好，无毒副作 用，与壳聚糖相比，易溶于水，具有更强的生理活性。所以选择适当的条件和方法，将 资源丰富的壳聚糖降解为具有多种生理功能的壳寡糖是目前研究的热点之一。 1 2 壳聚糖的资源研究概况 甲壳素最早由法国学者b r a c o n n o t ( 布拉克诺) 于1 8 1 1 年从蘑菇中首先发现，直到 1 8 2 3 年，由法国科学家o d i e r ( 欧吉尔) 从甲壳类昆虫翅鞘中分离出并命名。甲壳素 ( c h i t i n ) 又名几丁质、甲壳质、聚乙酰氨基葡萄糖等，化学名为1 ，4 2 乙酰氨基2 脱 氧1 3 d 葡聚糖，是n 乙酰基d 葡萄糖胺( g l c n a c ) 以b 1 ，4 糖甘键结合而成的直链 高聚物( c 1 6 h 2 6 0 l o n 2 ) n 。广泛存在于甲壳纲动物虾、蟹的甲壳，昆虫的甲壳，真菌( 酵母， 霉菌) 、藻类及植物的细胞壁中【l 。自然界年生物合成的甲壳素量估计有近1 0 0 亿吨之 多，仅次于纤维素。同时甲壳素也是自然界中含氮量位据第二大的天然有机化合物p j ， 仅次于蛋白质，据此可以说明甲壳素的重要地位。 壳聚糖( c h i t o s a n ) 贝t j 是甲壳素脱去n 乙酰基的产物，化学名为聚( 1 ，4 ) 2 氨基2 一脱氧 1 3 d 葡萄糖。壳聚糖是具有珍珠光泽的、半透明状的高分子聚合物，其色泽一般为 白色或浅黄色，其分子量因不同的来源和制备方法而存在较大差异，一般在2 0 1 0 0 万 之间，其分子结构如图1 1 所示。 号h 3 c - - - o o o o h 图1 - 1 壳聚糖的结构图 f i g 1 - 1t h es t r u c t u r a lf o r m u l ao f c h i t o s a n 壳聚糖的概念不是很严密，甲壳素脱乙酰基在5 0 - - 1 0 0 的都叫壳聚糖，一般壳聚 糖工业品的脱乙酰度为6 5 0 0 - - 9 0 ，其中以7 0 0 0 - - 8 0 最常见。由此可见，甲壳素与壳聚糖 广西大掌硕士掌位论文 妻氧法降解制备低分寺- 叫壳聚糖及其应用研究 的差别就在于两者的n 脱乙酰度不同。壳聚糖含有游离氨基，能结合酸分子，是自然界 中唯一的碱性多糖，也是少数具有正电荷的天然产物之一。因壳聚糖及其衍生物具有独 特的理化性能，使其在化工、医药、食品、纺织、印染、造纸、环保等行业有着广阔的 应用前景1 4 1 。 1 3 低分子量壳聚糖的制备及研究现状 低分子量壳聚糖也叫低聚糖或寡糖，过去把2 1 0 个环的糖单元叫寡糖，现在一般 把这个范围扩大n 2 0 个环。对于壳聚糖来说，相对分子质量低于1 0 0 0 0 的壳聚糖具有许 多优于高分子量壳聚糖的功能，并且都是人们感兴趣的，尤其是具有生物活性的5 - - 9 糖， 特别是6 , - 一8 糖在抑制肿瘤方面令人鼓舞，是当今国内外研究、开发的重点领域。现在问 题在于如何有效、快速、低成本、规模地生产出低聚糖。如今国内外研究生产低聚糖的 方法大体有以下几种，分别介绍如下t 1 3 1 化学降解法 化学法降解壳聚糖包括酸解法、过氧化氢及过硼酸钠氧化降解法等。 1 3 1 1 酸水解法 壳聚糖在酸性溶液中不稳定，会发生长连的部分水解，即糖苷键的断裂，形成许多 分子量大小不等的片段，严重水解则大部分水解成单糖。因此，酸水解法是制备单糖和 一系列相应寡糖的主要途径之一。但是酸水解法制得的是单糖、其次是二糖，比较难得 到具有生物活性的寡糖。所以各国的学者目前也都有在研究控制酸水解的关键技术。 壳聚糖的酸水解法制备低聚糖有：盐酸法【5 】，上世纪5 0 - - 6 0 年代就有人研究过盐 酸水解壳聚糖，最近有y o s h i n o r i 等【6 l 研究了壳聚糖在室温、7 5 当量和在4 0 。c ，3 3 当量盐 酸水解糖苷键，h c l 降解法也是目前工业化生产方法。乙酸法【7 1 ，磷酸法【舯，氢氟 酸法【9 1 等。 酸水解法在制备壳低聚糖的过程中由于大量使用酸、碱等化学试剂，容易造成设备 腐蚀及严重的环境污染【l o l ，且常涉及到高压、高温，水解程度也不易控制，降解得到的 产物的分子量分布较宽，产物分离纯化困难，产量偏低，故不够理想。 1 3 1 2 氧化降解法 氧化降解法是近年来国内外研究壳聚糖降解方法的热点。特别是氧化降解法，该方 法具有反应速度快、产率高、对环境友好等优点，是一种比较理想的化学降解方法。我 国学者1 1 1 3 】研究了h 2 0 2 法氧化降解壳聚糖的反应，结果发现，采用过氧化氢法降解，在 不同反应条件下，得到的产品大部分为水溶性低聚糖，这说明该法制备壳低聚糖有望进 行工业化生产。其他的氧化降解方法还包括h 2 0 2 n a c l 0 法【1 4 1 、n a b 0 3 法【1 5 】、过醋酸法 等方法。 2 臭每b 去降解制鲁低分日叫壳聚糖及其应用研究 1 3 2 酶降解法 最近1 0 多来，酶法降解壳聚糖在国内外研究工作十分活跃。已经发现有4 0 多种专一 性或非专一性酶可用于壳聚糖和甲壳素的降解反应。与其它化学、物理等降解方法相比， 酶降解法具有反应条件温和，反应条件易控制，降解产物相对分子量分布窄，制备的低 聚壳聚糖生物活性高，且对环境友好等优势，是一种理想的降解方法【1 6 1 。酶法降解壳聚 糖分专一性酶和非专一性酶。 1 3 2 1 专一性酶 ( 1 ) 壳聚糖酶降解：壳聚糖酶降解壳聚糖的机制是：以内切的方式将大分子壳聚 糖( 分子量几十到上百万) 分解为d p 缸3 0 2 0 51 o1 52 o2 53 03 54 04 5 r e a c t i o nt i m e h 图2 - 3氧气流量对降解反应的影响 f i g 2 - 3e f f e c to fo x y g e nf l o wr a t eo nt h ed e g r a d er e a c t i o n 2 3 2p h 值对降解反应的影响 图2 4 说明，随反应液p h 增加，降解程度减小。文献【8 5 1 报道在酸性条件下，臭氧与 特定基团之间进行有选择性的直接氧化反应。随着p h 增加，臭氧在水中溶解度减少，并 且随p h 增大，产物颜色变褐程度也加大，于是选择反应的p h = 3 左右比较适合。 o 3 2 0 3 0 鼍0 2 8 o e o0 2 6 do 2 4 曼0 2 2 2o 2 0 0 18 1 o 1 5 2 0 2 53 03 5 4 0 r e a c t i o nt i m e h 图2 - 4p h 值对降解反应的影响 f i g 2 - 4e f f e c to fp ho nt h ed e g r a d er e a c t i o n 2 3 3 溶剂对降解反应的影响 图2 5 说明，用醋酸作为反应的溶剂，粘均分子量降低更为显著，原因是：壳聚糖 分子中的n h 2 与溶剂中的旷质子化成n h 3 + ，它与带负电荷的酸根离子形成盐键，盐键 可能具有阻碍糖苷键断裂的作用。相同条件下，盐酸对壳聚糖质子化程度较强，使壳聚 糖高分子连结合成在一起的程度也增大，不利于高分子链的打开，使臭氧进攻受阻。醋 1 3 广西大国明页士学位论文 臭章b 去降解制薯r 低分子量亮聚糖及其应用习f 究 酸和盐酸都能很好地溶解壳聚糖，另外，由于醋酸对臭氧的溶解性较好【刚。所以对于降 解来说，选择醋酸作为溶剂为宜。 但是低分子量壳聚糖在稀醋酸溶液中不稳定，易变褐色。低分子量壳聚糖在稀盐酸 溶液中比较稳定，不易变褐色，能够保持无色透明状态。 为了解决褐变问题，在醋酸溶液中降解一定时间后，在降解产物的溶液没有发生褐 变时，及时向反应后体系中加入盐酸，调节p h 值为2 0 左右。低分子量壳聚糖溶液经过 盐酸酸化后，颜色不再变黄或变褐。因此，以醋酸为溶剂用臭氧降解壳聚糖之后再用盐 酸酸化，不但能够快速降解壳聚糖，而且能够保持降解产物的稳定性，不会导致降解产 物变褐色，不会导致降解产物的化学结构发生明显改变。 0 7 o 6 o 5 o 4 o 3 0 2 0 51 01 52 o2 5 3 03 54 04 5 r e a c t i o nt i m e | h 图2 - 5 溶剂对降解反应的影响 f i g 2 - 5e f f e c to fr e a t i o ns o l v e mo nt h ed e m er e a c t i o n 2 3 4 温度对降解反应的影响 图2 6 说明，随反应温度的增加，降解速度加快后又减缓，这是因为温度升高使溶 液粘度降低，分子运动加快，促进降解反应进行。但温度太高，臭氧的溶解度会急剧下 降【8 7 】，不利于降解反应，因此降解速度减小。对比这两个因素，臭氧的溶解度占主导作 用。而且反应温度增加，降解产物的褐变增强。综合考虑，选择反应温度在2 0 左右为 宜。 1 4 占一们oo一o一爵一oi 广西大掌硕士掌位论文臭氧法降解制低分子量壳聚糖及其应用研究 o 3 4 o 3 2 、0 3 0 d 昌0 2 8 c ) 鎏0 2 6 q 名0 2 4 c 口 歪o 2 2 o 2 0 0 1 8 1 o1 52 o2 53 03 54 0 r e a c t i o nt i m e | h 图2 - 6 温度对降解反应的影响 f i g 2 - 6e f f e c to ft e m p e r a t u r eo n t h ed e g r a d er e a c t i o n 2 3 5 时间对降解反应的影响 图2 7 说明，随反应时间延长，降解程度加大，在2 h 前，降解速度最大，至t j 6 h 后， 降解的速度变缓，原因可能是壳聚糖在降解过程中，开始时由于壳聚糖分子链较长，总 分子数较少，在较短时间内降解壳聚糖分子数占总分子数的比例较大，使降解初期壳聚 糖的平均分子量变化较明显。而随着时间延长，壳聚糖分子变小，壳聚糖总的分子数要 远大于起始时壳聚糖总分子数，断裂相同数量糖苷键形成新的小分子对溶液平均分子量 的影响变小。因此，一定时间以后，分子量虽也继续降低，但降低的速度变缓。于是选择 反应在6 h 左右为宜。 1 0 o 2 o2 4681 0 r e a c t i o nt i m e h 图2 7 时间对降解反应的影响 f i g 2 - 7e f f e c to ft i m e o nt h ed e g r a d er e a c t i o n 1 5 占_们odhq人i葛_12 广西大掌硕士掌位论文臭氧法降解制名r 低分子量壳聚稠| 及其应用研究 2 3 6 讨论 现有制备壳低聚糖的降解方法大致分为酸降解法、酶降解法和氧化降解法三种。其 中酸降解法工艺操作虽然简单，但降解产品中的单糖和双糖含量偏高，三糖以上的活性 壳寡糖含量偏低，还存在降解条件较难控制，后处理繁琐等缺点。酶降解法条件温和， 降解过程及聚合度容易控制，但酶成本高，而且多数单一水解酶对壳聚糖降解程度有限， 水解时间过长，生产周期太长。h 2 0 2 氧化降解法的速度相对较快，但其反应条件较难控 制，有人发现h 2 0 2 氧化法会引起氨基含量的下降和羧基( - - c o o h ) 的出现【9 羽，说明聚 合物单元结构发生改变，而且降解过程的后期常常伴有褐变反应。 臭氧降解法与其它降解法比较，具有如下优点： 1 本方法工艺简单，降解速度比酶法快，与h 2 0 2 同一级别，但与h 2 0 2 和酸降解法不 同的是反应条件容易控制，反应周期短，使生产成本降低。 2 臭氧既能降解壳聚糖又能直接脱色，降解完成后加入盐酸可使壳低聚糖产品不会 褐变。 3 臭氧与壳聚糖作用后，唯一副产品是氧气，可以导入臭氧发生器中重复使用，因 此本发明技术是一种绿色化工生产技术。 4 臭氧发生器产生的臭氧源源不断，臭氧降解和膜分离的连续操作，易于实现产业 化，而且未降解的壳聚糖循环使用，可以充分利用原料资源。 2 4 小结 用臭氧法降解制备壳低聚糖，通过单因素实验得到降解的优化条件为( 在l l 的反应 液) ：氧气流量o 2m 3 i l ，以醋酸为溶剂，在p h = 3 、2 0 下反应6 h 。降解完成后，加入 盐酸调节p h 值为2 o 左右，能够保持降解产物的稳定性，不会导致褐变。与其它的壳低 聚糖制备方法对比，本方法是一种能够快速降解、反应条件容易控制、降解过程不会产 生褐变的制备方法，具有工艺简单，生产周期短，生产成本低，适于工业化规模生产等 特点。 1 6 广西大掌硕士学位论文臭每b 基降解制鲁低分子量壳聚糖及其应用研究 第三章降解产物壳低聚糖的分析 3 1 实验材料及仪器设备 3 1 1 实验材料和试剂 浓盐酸( 分析纯) 无水乙醇( 分析纯) 氢氧化钠( 分析纯) 邻苯二甲酸氢钾( 优级纯) 酚酞( 优级纯) 对二甲氨基苯甲醛( 分析纯) 无水碳酸钠( 分析纯) 乙酰丙酮( 分析纯) 3 1 2 实验仪器 广西师范学院化学试剂厂 广东光华化学厂有限公司 重庆川江市集有限公司 天津市光复精细化工研究所 上海三爱思试剂有限公司 天津市大茂化学试剂厂 北京化工厂 汕头西龙化工有限公司 电子精密分析天平( s m o f i ub s2 1 0 s ) 德国s a n o f i u s 公司 u v - 1 7 0 0 紫外分光光度计贝曼克公司 p h s 3 c 酸度计上海精密仪器有限公司 贝克曼高速冷冻离心机美国b a c k m 距公司 周转式振荡器上海环球物化仪器厂 傅立叶红外光谱仪( n i c o l e t5 d x bu p g r a t et om o m n i c ) 美国n i c o l e t 公司 循环水式多用真空泵( s h b h i a ) ，郑州长城科工贸有限公司 真空干燥机上海跃进仪器厂 a v a n c ea v - 5 0 0 核磁共振仪，瑞士b r u k e rb i o s p i n 觚u p 公司。 b i f l e xi i i 型基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，瑞士b r u k e rd a l t o m c s 公 司。 恒温水浴锅 深圳市沙头角国华仪器厂 m g a k ud m a ) 【2 5 0 0 vx 射线衍射仪 日本理学公司 3 2 实验方法 1 7 广西大掌硕士学位论文- i 窜b 表降解制j r 低分子量壳聚糟及其应用研究 3 2 1 壳低聚糖水溶性的测定 精密称取由2 2 1 制备的壳低聚糖g l 、g 2 、g 3 、g 4 、g 5 ，各1 0 0 m g ，三个平行，放入 预先6 5 烘箱干燥至恒重的e p 管，室温下加入l m l 蒸馏水，周转式振荡器振荡3 m i n 混匀， 观察溶解情况，3 0 m i n 后1 2 0 0 0r m i n 离, t 二, 1 0 m i n ，弃上清液，沉淀置6 5 烘箱干燥后称重， 计算沉淀物占投入重量的百分比【跚。 3 2 2 脱乙酰度的测定 分别称取原料壳聚糖 脱乙酰度8 5 、反应2 h 、反应6 h 的壳低聚糖准确至0 1 9 ，溶 解于水中，用2m o l l 的盐酸溶液的调节p h2 - - 3 ，配置成质量分数为1 的溶液。h c l 与 壳聚糖中的n h 2 等摩尔反应后，溶液中含有过量的h c i 。用标准n a o h 溶液滴定时， n a o h 溶液首先中和过量的h c i ，p h 值出现急剧上升，即第一突变。然后n a o h 标准溶 液再中和与壳聚糖n h 2 结合的h c i ，达到滴定等当点时，p h 出现第二个突变，两个突 变间消耗的n a o h 摩尔数相当于样品中的n h 2 摩尔数【8 9 1 。壳聚糖脱乙酰基程度0 【可按下 式计算： 口：a v c n a o h x 1 0 - 3 x1 6 ( 3 1 ) m 0 0 9 9 4 、。 式中： a v 二个突变点之间的消耗的n a o h 体积之差( m l ) c s a o n - n a o h 的浓度m o l l 一 m 样品质量g r 脱乙酰基程度 1 6 一氨基的相对分子质量 0 0 9 9 卜理论氨基含量 3 2 3 分子量的测定 3 2 3 1 乙酰丙酮法测定壳低聚糖的分子量 氨基葡萄糖盐酸盐( g l u e o s a m i n e h c l ) 在碱性条件下与乙酰丙酮缩合生成生色 原2 甲基3 二乙酰吡咯衍生物。生色原与对二甲氨基苯甲醛( d m a b a ) 在酸性条件下呈 红色，可进行定量分析。由于乙酰丙酮试剂与甲壳胺寡糖反应产生生色原时，涉及糖单 位还原端基的开环反应，理论上寡糖与乙酰丙酮反应时仅与末端的糖单位参与反应，其 余的糖单位不能开环，故不能与乙酰丙酮反应。因此，测得的分光光度值与甲壳胺寡糖 的摩尔浓度应具有线性关系 9 0 l 。 ( 1 ) 溶液的配制。 乙酰丙酮溶液：取乙酰丙酮3 5l i l l ，溶于1m o f l 碳酸钠溶液中定容至5 0m l ，混匀( 临 用前配制) ；d m a b a ( 对2 - - 甲氨基苯甲醛) 溶液：称取对一二甲氨基苯甲醛0 8g 溶于1 5 l i l l 无水乙醇及1 5 “浓盐酸的混合液中，摇匀保存于棕色瓶中，现用现配【9 1 1 。 1 8 广西大学硕士掌位论j r 臭每法降解制鲁低分日叫壳聚糖及其应用研究 ( 2 ) 标准曲线的绘制 准确称取1 0 5 c 烘至恒重的分析纯氨基葡萄糖盐酸盐3 2 3 4m g ，置于小烧杯中，加少 量蒸馏水溶解后，转移到1 0 0 0m l 容量瓶中，用蒸馏水定容至1 0 0 0m l 混匀。 精密量取溶液o ，1 0 ，2 o ，3 o ，4 0 和5 0m l ，分别置于1 0 “容量瓶中，各加水5 o ，4 0 ，3 0 ，2 0 ，1 0 ，0m l ，再分别加乙酰丙酮溶液l m l ，摇匀，置1 0 0 。c 水浴中加热2 5 m i n ， 取出，置冷水中冷却至室温下。各j j i i d m a b a 溶液l m l ，用无水乙醇定容至l o m l ，摇匀， 6 0 * ( 2 水浴中保温1 h ，放冷，以o 管为空白，在5 2 5h i l l 波长处测定吸光度值( a ) ，以d - 氨基葡萄糖盐酸盐溶液浓度( ue d m l ) 为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线【9 l 】。 ( 3 ) 样品分子量的测定 精确称取1 0 5 干燥至恒重的由2 2 1 制备的壳低聚糖g l 、g 2 、g 3 、g 4 、g 5mg ，每 个样两个平行，置于2 5 0 m l 量瓶中，加水至刻度，摇匀，调p h 至7 。吸取3m l 溶液置试管 中，每个样两个平行，以下实验步骤同“标准曲线的绘制”，测出a 值，通过标准曲线 来确定壳寡糖的浓度c ( ug m 1 ) 。 壳寡糖均数分子量的计算洲： m 一一n ：竺磐生 ( 3 32 一) = _ 一 l ) x 1 0 - o 2 5 0 式中：x 一样品中的壳寡糖浓度( u m 1 ) ；2 5 卜稀释倍数；m 一样品重量( g ) ； 2 15 6 _ 氨基葡萄糖盐酸盐分子量。 3 2 3 2 基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定分子量 质谱所用仪器为b r u k e rd a l t o n i c s 公司b i f l e xh i 型m a l d i t o f 质谱仪，氮激光 器，激光波长3 3 7 n m ，采用延时引出( d e l a y e de x t r a c t i o n ) 和反射( r e f l e c t i o n ) 的工作 方式，加速电压1 9 5k v ，反射电压2 0k v ，延时引出电压1 4 5 1 6 5k v ，延时时间为5 0 - 2 0 0n s ，正离子检测。 按( 乙腈) ：v ( 超纯水) ：( 三氟乙酸) = 2 0 0 ：1 0 0 ：3 配制成乙腈酸性溶剂备用。基质 溶解于此溶剂中配制成1 0 0g l 的储备液，壳聚糖样品也溶于此溶剂中配制成5 0 l 的储 备液，用时稀释至所需浓度。吸取l l x l 的基质溶液和l l x l 的样品溶液，充分混匀，吸取 0 5 1 x l 的混合液滴于干净的不锈钢样品靶上，待溶剂自然挥发样品结晶后，再滴加0 5 1 x l 的乙醇，使样品与基质形成的混晶二次结晶，乙醇挥发后即制得待测分析样品，送入质 谱仪，进行质谱分析，累加1 0 - - 5 0 次单次扫描信号得到质谱图眦j 。 3 2 4 壳聚糖及其降解产物的红外光谱 取一定量干燥的壳聚糖及其降解产物，与溴化钾约1 ：1 5 0 混匀。放入玛瑙研钵，经 研磨成一定细度( 2 0 0 目左右) 后，放入压片机，1 2k p a 维持1 0 m i n 取出，红外光谱仪进 行扫描分析。 1 9 广西大学司e 士掌位论文 臭氧法降解制畚低分日叫壳聚糖及其应用研究 3 2 5 壳聚糖及其降解产物的核磁共振1 3 c - n m r 谱 将壳聚糖及其降解产物溶解于d 2 0 中，用超导核磁共振仪测定其核磁共振谱图。 3 2 6 壳聚糖及其降解产物的x 衍射图 利用x 射线衍射仪对壳聚糖原料及降解后产物进行x 衍射实验，观察壳聚糖在降解 过程中，其降解程度与结晶性能的变化。 测试条件为：采用n i 过滤c 嵌a 射线为入射射线；工作电流一1 0 0 n 认；工作电压一 5 0 k v ；扫描范围一3 - 4 0 0 ；扫描速度o 2 0 m m 。 3 3 实验结果与讨论 3 3 1 壳低聚糖水溶性的测定 表3 1 为壳聚糖臭氧降解产物壳低聚糖g l 、g 2 、g 3 、g 4 、g 5 的水溶性测定结果。 表3 - 1 壳聚糖降解产物水溶性的测定 t a b l e3 - 1r es o l u b i l i t yo f t h ed e g r a d e dc h i t o s a n 从表3 1 看出，壳低聚糖g l g 4 的水溶性均很好，达到9 7 以上，壳低聚糖g 5 的水 溶解性相对差点，但是也达到8 0 左右。同样方法，根据文献跏中报道，聚合度6 8 的 壳低聚糖的水不溶物占投入比的0 1 ，即水溶性达到9 9 9 。可见，用臭氧降解壳聚糖 和膜分离耦合制备壳寡糖，得到样品水溶性好。 3 3 2 脱乙酰度的测定 壳聚糖产品中的胺基含量即脱乙酰度，与壳聚糖的物化性质，如溶解度、富集离子 2 0 广西大鼍明页士学位论文 臭氧法降解制鲁低分子量壳聚糖及其应用研究 的能力、絮凝力和n 选择性酰化能力有关，所以脱乙酰度已成为鉴定壳聚糖产品质量的 一个重要指标睇】。用标准c n a 0 h = 0 1 2m o l l - 1 溶液滴定时，开始p h 变化比较慢，可以放 快滴定速率，每次滴2 m l ，当p h 变化较明显的时候，需要马上放慢滴定的速率，每次 0 2 m l ，直到p h 变化由较慢时，重复前面操作，每一个样平行做三次。 以下图3 1 - - 3 6 为反应过程中壳聚糖及其降解产物的电位滴定曲线和一级微商曲 线。从各图中可见到，对每一个样品，三次实验的重复性好，p h 值滴定曲线中两个明显 的突跃点，用量可从一级微商曲线中得到，结果见表3 - 2 ： 02468 10l2l416l82 0 v n a o h m l 图3 - 1 壳聚糖脱乙酰度的p h 值滴定曲线 f i g 3 - 1p o t e n t i a lt i t r a t i o np hc u r v eo fd e a c e t y l a t i o nd e g r e eo fc h i t o s a n v n a o h m l 图3 2 壳聚糖脱乙酰度的p h 值滴定的一级微商曲线 f i g 3 - 2p o t e n t i a lt i t r a t i o np ho ft h ed e r i v a t i v ec u r v eo fd e a c e t y l a t i o nd e g r e eo fc h i t o s a n 2 1 2 o 8 6 4 2 l i h d 2 o 8 6 4 2 o l l | a q 广西大掌硕士掌位论文臭氧法降解制备低分号叫壳聚糖及其应用研究 1 2 l o 8 暑6 4 2 ，- 。一。 v n a o h m l 图3 3 壳聚糖降解2 h 产物脱乙酰度的p h 值滴定曲线 f i g 3 - 3p o t e n t i a lt i t r a t i o np h c u r v eo fd e a c e t y l a t i o nd e g r e eo fd e g r a d e db yt w oh o u r sc h i t o s a n z 厶 司 1 2 l o 8 02 4681 01 21 41 61 82 0 v n a o h m l 图3 - 4 降解2 h 产物脱乙酰度的p h 值滴定一级微商曲线 f i g 3 - 4p o t e n t i a lt i t r a t i o np ho f t h ed e r i v a t i v ec u r v eo fd e a c e t y l a t i o nd e g r e eo fd e g r a d e db yt w o h o u r s c h i t o s a n 广西大掌硕士掌位论文臭氧法降解制奋低分子量亮聚糖及其应用研究 l2 lo 8 暑6 4 2 ，。 o24681ol2l4l6l82 0 v n a o h m l 图3 - 5 壳聚糖降解6 h 产物脱乙酰度的p h 值滴定曲线 f i g 3 - 5p o t e n t i a lt i t r a t i o np hc u r v eo fd e a c e t y l a t i o nd e g r e eo fd e g r a d e db ys i xh o u r sc h i t o s a n z a q 02468l01 21 41 6l8 ： v n a o h m l 图3 缶降解6h 产物脱乙酰度的p h 值滴定一级微商曲线 f i g 3 - 6p o t e n t i a lt i t r a t i o np ho f t h ed e r i v a t i v ec u r v eo f d e a c e t y l a t i o nd e g r e eo f d e g r a d e db ys i