（应用化学专业论文）高效液相色谱手性固定相法拆分药物对映体研究.pdf

y6 5 4 2 5 7 高效液相色谱手性固定相法拆分药物对映体研究 应用化学专业 研究生唐琴指导教师宋航教授 本论文以萘普生及其四种衍生物、四种胺醇类选择性0 ：受体兴奋药物 以及另外八科一在临床应用较为广泛的手性药物为主要研究对象，在不同的条 件下，用w h e l k 0 1 、d n b p g 、d n b l e u c ir l e 和s h l 等四种手性固定相对其 进行了对映体拆分实验。考察了不同因素对对映体选择性分离的影响，并结 合相应的色谱分离热力学函数，对对映体拆分机理进行了深入地探讨。 实验研究发现，萘普生及其衍生物在w h e l k 一0 l 手性固定相上的对映体 拆分表现出不同于常规的特殊现象，其手性分离因子q 值随流动相极性的增 强呈非线性变化，在很高极性( 2 0 5 0 v 。，) 范围出现分离因子极大值， 而通常此值在较低极性的流动相条件下出现。这说明此时流动相中的极性组 分以较为特殊的方式影响着对映体的手性识别过程。 同时对四种选择性b 。受体兴奋药物在w h e l k 0 1 等四种手性固定相上 的拆分实验表明，流动相极性对分离因子的影响基本成线性。但对相关热力 学函数进行分析发现，在5 v 。流动相条件下，a ( ah ) 及( s ) 出现最大 值，这应是不同的吸附机理所致。说明流动相中的极性组分异丙醇在不同极 性范围的流动相条件下，以完全不同的作用方式参与色谱分离过程。 通过对萘普生和克伦特罗两药物在w h e l k - 0 1 手性固定相上的对映体分 离热力学函数比较研究，给出了两药物对映体分子与该手性固定相分子的手 性识别模型。 另外，本文首次在w h e l k 0 1 手性固定相上实现了对药物硝酸益康唑的 专篙螽蒜囊娃 对映体h p l c 直接拆分。正相色谱条件下，扁桃酸对映体在d n b p c , 固定相上 亦有一定程度的分离。 关键词：手性药物，高效液相色谱，手性固定相，对映体拆分，手性识别 i i e n a n t i o m e r i c s e p a r a t i o n o fs e l e c t e dp h a r m a c e u t i c a l s o nc h i r a l s t a t i o n a r yp h a s e sb y h p l c m a j o r ：a p p l i e dc h e m i s t r y p o s t g r a d u a t e ：t a n gq i n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r s o n g h a n g n a p r o x e na n di t sd e r i v a t i v e s ，f o u rb 2 - a c c e p t o ra n a l e p t i c s ，a n dd g h to t h e r p h a r m a c e u t i c a l sb e i n gw i d e l yu s e di nc l i n i c h a v eb e e ns e l e c t e da n dt e s t e do n f o u re h i r a l s t a t i o n a r yp h a s e s ( c s p s ) i n c l u d i n g w h e l k - 0 1 ，d n b - p g ， d n b l e u c i n ea n ds h 1 b yh p l cu n d e rd i 饿r e n tc o n d i t i o n s t h e e f f e c t so f m o b i l ep h a s ec o m p o s i t i o na n dt e m p e r a t u r eo ne n a n t i o s e l e c t i v i t yh a v eb e e n i n v e s t i g a t e d ，a n dt h ec h i r a lr e c o g n i t i o nm e c h a n i s m sh a v ea l s ob e e nd i s c u s s e d f u r t h e r a c c o r d i n g t 0t h er e l a t i v et h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s i tw a ss h o w nt h a tt h er e s o l u t i o no f n a p r o x e na n d i t sd e r i v a t i v e so nw l a e l k - o l c s pw a sv e r y s p e c i a l w i t h t h ev a r i a t i o no fm o b i l e p h a s e m o d i f i e r s c o n c e n t r a t i o n ，n o n 1 i n e a rc h a n g eo f e n a n t i o m e r i cs e p a r a t i o nf a c t o r a n dm a x i m a l v a l u eo fac o r r e s p o n d i n gt oav e r yh i g hm o b i l ep h a s ep o l a r i t y ( 2 0 - 5 0 v w a ) w e r ef o u n d t h i sr e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ep o l a rc o m p o n e n to fm o b i l ep h a s e e f f e c t e dt h ec h i r a lr e c o g n i t i o np r o c e s sb yap a r t i c u l a rw a y a tt h es a m et i m e ，t h el i n e a rp l o t so f s e p a r a t i o nf a c t o rt om o b i l ep h a s ep o l a r i t y o fc l e n b u t e r o la n d p r o c a t e r o l e n a n t i o m e r sw e r ef o u n d t oo b t a i nm o r e i n f o r m a t i o na b o u tt h ed i s c r i m i n a t i o np r o c e s s ，t h eg i b b s - h e l m h o l zp a r a m e t e r s ( 、a ha n da a s ) w e r e e x a m i n e d i tw a sf o u a dt h a tt h e r ew e r em a x i m a la a ha a d a a sw h e nt h em o b i l ep h a s eo f5 v t p ab e i n gu s e d o b v i o u s l y , t h ea d s o r p t i o n m e c h a n i s m si nd i f f e r e n tc o n d i t i o n sw e r ed i f f e r e n t t b e c h i r a l r e c o g n i t i o n m o d e l so fr t a p r o x e na n dc l e n b u t e t o le n a n t i o m e r s0 1 1w h e l k - o lc s pw e i e p r e d i c t e db y t h ec o m p a r i s o nr e s e a r c ho f 删9 - s e 妒b 哆。霸卿嗍瞬嗡毋嘛d a t a i n i na d d i t i o n ，e c a n a z o le n a n f i o m e r sh a v eb e e nd i r e c t l ys e p a r a t e db yh p l c o r i g i n a l l yi nt h i ss t u d y k e y w o r d ：c h i r a ld r u g s ，h p l c ，c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ，e n a n t i o s e p a r a t i o n ， c h i r a lr e c o g n i t i o nm e c h a n i s m 四川大学硕士学位论文 第一章前言 科学技术的发展使得“手性”( c h i r a l i t y ) 一词己广泛被大家所熟悉， 尤其是在和我们的日常生活密切相关的制药行业。随着生活水平的日益提 高，人们对医疗保健的要求也越来越高。单一对映体手性药物以其没有或很 低的毒副作用被称为“绿色药品”，因此也愈来愈受到人们的青睐，手性技 术也随着市场的需要迅速发展起来。当前，单一对映体手性药物的研发已成 为国际新药研究的重要方向之一，而2 1 世纪无疑将是手性药物和手性技术飞 速发展的良好时期。 1 手性药物分离的意义 1 1 手性是自然界的本质属性 手性，是用来表达化合物分子结构不对称性的术语。手性是自然界的本 质属性之一，是三维物体的基本属性。人的手是不对称的，左手和右手不能 互相叠合，彼此是实物和镜像的关系。这种关系在化学中称为“对映关系”， 具有对映关系的两个物体互为“对映体”( e n a n t i o m e r s ) 。 化合物的手性与其空间结构有关，因为化合物分子中原子的排列是三维 的。有时候，写在纸面上看起来相同的分子，结构上并不相同，分子中所有 原子的连接顺序相同，而所有原子在空间的排列方式不同。由于分子中存在 不对称因素，它们之间的关系如同人的左右手样，不能互相重合，互为对 映体。在不存在外界影响时，对映体具有完全相同的物理和化学性质，但能 够使偏振光向相反的方向旋转；但在手性环境里，如生物体内，由于分子问 利用空间构型相互识别与作用，不同的对映体可能表现出不同的性质“3 。 12 手性药物分离的意义 手性化合物在有机化学、生物化学、药物化学、高分子材料等领域的应 用非常普遍，尤其是在药物化学中占有重要地位。手性药物是指含有手性因 素的化学药物的立体异构体( 包括对映体和非对映体异构体) 。当一个手性 凹川大学硕士学位论文 药物进入生命体时，由于生物体是手性环境，药物对映体与它的受体部位以 手性方式相互作用，常常表现出不同的药理和药代特性，使用外消旋体药物 ( 对映体等量存在的混合物) 可能导致错误的药代行为和作用模式”1 。随着 人们对手性药物对映异构体的深入研究，发现存在以下几种情况：( 1 ) 手性 药物分子两种对映体的药理作用相同，但药效差别很大，如s 萘普诺尔比r 萘普诺尔的活性高约9 8 倍：( 2 ) 两种异构体生理活性完全不同，例如沙利多 胺( t h a l i d o m i d e ) ，其r ( + ) 玮q 型的对映体具有镇静作用，而s ( ) _ 构型的对 映体却能引起胎儿畸形；( 3 ) 一种对映体有生理活性，而另一种则可能无效， 如氯霉素是一种广普性抗生药，d ( 一) 一异构体具有杀菌作用，l ( + ) - 异构体则 完全没有药效0 1 。因此，手性药物的不同异构体本质上应视为不同的化合物， 手性药物的研究对于科学发展以及人类健康有着重要而深远的意义“1 。 据统计“1 ，天然或半合成的药物几乎都具有手性，全合成的药物有4 0 为含有手性因素的药物，而且目前临床常用的7 0 0 多种药物中约有一半至少 含有一个手性中心，其中9 0 以外消旋体的形式作为药物使用，而大部分药 物对映体的疗效及药代动力学的差别远未被认识和深入研究。1 9 9 2 年美国 f d a 发布了手性药物指导原则，新规定要求：所有在美国上市的消旋体类新 药，生产者均需提供报告，说明药物中所含的对映体各自的药理作用、毒性 和临床效果“1 。这意味着申请消旋药物时至少得做3 组( 如果是一个手性中心) 药理、临床数据，这无疑加大研究费用和工作量。如果开发光学纯药物，只 需做一组试验即可，所以选择光学纯药物开发似乎更经济、合算。近年来， 我国食品药品监督管理局( s f d a ) 也对手性药物的研究与开发做出了相应 的规定。 另据报道”1 ，f d a 已经决定给对映体一种新的名分，即规定已批准的消 旋体药物的单一异构体为新化学实体( n c e ) 。因此，一些大的制药公司纷纷 加大其在手性药物开发上的投入，他们将手性作为一种工具，通过外消旋转 化延长其“重磅炸弹”药品的专利保护期，从而控制一个产品的生命周期。 一个突出的例子是a s t r a z e n e e a 公司对其抗溃疡药物奥美拉唑( o m e p r a z o l e ) 的二次开发，它申请了该药物的s 异构体的专利，并已于2 0 0 0 年在欧洲和美 困上市。 市场需求和新规则的制定给手性药物开发带来了前所未有的发展机遇。 p q 川大学碗j j 学位论文 特别是近一二十年来，世界上对手性药物的研究发展很快，世界上手性药物 的销售以及占据药物总数的比例也呈逐年上升趋势。据统计”1 ：从1 9 9 0 1 9 9 3 年共批准了3 6 个单一异构体药物( n c e ) ，1 9 9 01 9 9 3 年分别为7 ，9 ，13 ， 7 个，似乎增长尚不明显，但从1 9 9 4 年起，批准单一对映体药物占世界批准 药物总数的一半以上。据预测，至1 j 2 0 0 5 年世界的上市化学合成新药中约有 6 0 为单一异构体药物。同时，自1 9 9 2 年来，手性药物市场一直保持快速增 长的态势，i 9 9 5 年其销售额为5 5 7 亿美元，占世界药物市场总额的2 2 ，1 9 9 9 年则达到了1 1 5 0 亿美元，手性药物市场首次超过千亿美元( 表1 1 ) 预计 今后几年仍将以年8 的速度增长”，。 表i 1 世界手性药物市场 t a b l e ) 】c h i r a ld r u g sm a r k e to nt h ew o r l d 2 开发手性药物的途径 2 1 从天然产物中获取手性药物 很多天然产物的立体控制的全合成，往往选择个手性物为起始原料。 目前常用的手性起始物有萜类、氨基酸类、糖类、生物碱等，这些化合物通 常统称为“手性池”( c m r a p 0 0 1 ) 1 。直接从天然来源获取手性药物， 价廉易得，生产过程简单，所得产品旋光度高( 个别例外) ，许多大宗产品 都是用此法生产的，但是受到原料来源限制，难以广泛实施。 2 2 手性不对称合成 通过不对称反应立体定向合成单一对映体是获得手性药物最直接的方 法，主要有手性源合成法和不对称合成法“”。手性源合成以价廉易得的天然 手性物为原料，经构型保留、构型转4 t 或- y - 性转换等反应，可以方便的合成 新的手性物。同时，有机合成的发展也为手性合成提供了，醇、黢、环氧化物 p u 川l 大学硕j ：学位论文 等非天然手性源。但是，由于手性源种类有限和在合成过程中会有外消旋的 倾向存在，所以该法在除抗生素合成外的其他类型药物合成中的应用很少。 不对称合成法是在催化剂或酶的作用下合成得到单一对映体化合物的方法， 是化学合成科学的前沿。不对称合成技术开发的热点是手性配体、手性催化 剂、手性合成子或手性砌块、手性助促进剂等“。近2 0 年来，该技术取得了 长足的进步，并且已开始进入工业化生产。目前这个领域的研究工作最吸引 人，最激励人心，也将是今后主流研究方向。2 0 0 1 年诺贝尔化学奖授予了美 国科学家诺尔斯等三位不对称合成的开创者就是最好的说明。然而，化学不 对称合成需要手性源，而且使用的手性催化剂大多数含有重金属，而寻找合 适的催化剂是一个十分漫长的过程。因此，化学不对称合成在制药工业的应 用受到了一定的限制。生物不对称合成作为一种“绿色合成技术”而倍受人 们青睐，它不需要手性源，并且具有很高的对映体选择性，反应介质通常为 稀缓冲水溶液，反应条件温和，但对底物的要求高，同时生物催化底物特异 性很强，因而其在手性药物制备领域的应用也受到了一定的限制。 2 3 手性拆分 外消旋体的拆分是通过物理、化学或生物学方法把外消旋化合物的对映 异构体分开，这是当前手性药物研究中的活跃领域。这也是获得单手性对 映体药物最便利的方法，所需的周期短，是目前手性药物工业化生产的主要 方法。据统计，大约有6 5 的非天然手性药物是由外消旋体或中间产物的拆 分得到的。手性拆分主要的方法有：结晶法、化学拆分法、酶反应拆分法和 色谱拆分法”。 2 3 1 结晶法( 物理法) 利用两种药物对映体的结晶速度和结晶形态的不同，进行对映体的分 离，但生产效率低，只适用于个别产品，目前基本已很少采用a 如苦杏仁酸 ( 羟基苯乙酸) 可以用这种方法得到单一对映体1 。 2 3 2 化学法拆分 用手性试剂与外消旋药物形成非对映体盐或共价衍生物然后利用非对 4 一一 些型查兰堡土堂些堡兰 映体的物化性质差异将两种对映体分开，再将衍生物还原为纯对映体药物。 由于这种方法拆分过程费时、成本高、产率低，环境污染严重，因而一定程 度上限制了其在制药工业的应用。如果通过选用廉价手性试剂、优化工艺条 件等手段来降低成本，提高产品纯度和产率，化学法拆分必将焕发新的生机 和活力，这也正是我们课题组其他成员已经或正在进行的工作“。 2 3 3 酶或微生物法 酶的活性中心是一个不对称环境，有利于识别外消旋体。酶催化反应速 率高，对底物和产物的专性强，反应产品分离提纯简单，而且酶催化反应 都发生在相对温和的条件下，没有设备腐蚀问题，生产安全性高。因此，用 催化效率高、专一性强的酶拆分消旋体是获取光学纯化合物的一条重要途 径。例如s 一布洛芬等许多药物都可以用酶法从其对应的消旋体获得“”。但用 此法获取光学纯化合物的生产周期长，选择有效的酶也十分困难。此外，许 多酶的价格也十分昂贵。目前酶法拆分仍主要用于氨基酸的大规模生产。 2 3 4 手性色谱分离 手性色谱法拆分药物需要使用手性色谱分离柱，或使用一般色谱分离 柱，采用手性流动相进行对映体分离。其分离对映体快速、简便，产品纯度 高。同时，可方便、准确、迅速地测定样品的光学纯度和绝对构型。手性色 谱分离通常可以分为气相色谱( g c ) 、高效液相色谱( h p l c ) 、毛细管电泳( c e ) 及超临界流体色谱( s f c ) 等四种方法。其中发展最快、应用最广的是高效液 相色谱，它是药物质量控制、药理学和毒理学研究的重要手段”3 。从7 0 年代 开始，特别是近些年来，手性高效液相色谱在手性药物研究中取得了令人瞩 目的进展。 高效液相色谱手性分离可以分为间接分离和直接分离两种方法。间接法 又称为手性衍生化试剂法( c d r ) ，即对映异构体先与一种光学纯的试剂反 应生成非对映异构体，然后在非手性环境下分离，例如以r 一氯化酸薄荷醇 酯作为手性衍生化试剂，将r 一麻黄碱与s 麻黄碱衍生化后生成一对非对映 异构体，可用c 1 8 固定相，在反相流动相条件下实现分离；直接法是通过待 分离的对映体与色谱中的手性选择器可逆地形成暂时的非对映异构复合物， 四川大学钡1 ：学位论文 利用它们之间稳定性不同引起保留时间的差异，从而达到分离的目的。间接 法涉及样品的转化、分离等预处理过程，容易造成组分的外消旋化和损失， 而直接法简便、快捷，可以避免不必要的实验误差，因而直接法在应用中更 受欢迎。 高效液相色谱法直接分离手性药物系统中的手性选择器可以是手性固 定相( c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ，简称c s p ) ，又可以是手性流动相添加剂 ( c h i r a lm o b il ep h a s ea g e n t ，简称c m p a ) 。手性流动相添加剂法常应用于 常规非手性液相色谱柱，例如用且一环糊精作手性流动相添加剂可拆分杂环 上有一个手性碳原子的化合物，b 一环糊精衍生物作手性流动相添加剂可分 离侧链上有一个手性碳原子的化合物“。然而由于存在一些诸如手性添加剂 价格过高、难以去除以及检测方式对手性添加剂选择范围的限制等缺陷，使 得这种分离方法的应用一定程度上受到了局限。因此，当用高效液相色谱对 手性药物进行分离时，人们常常青睐于采用手性固定相法。这也使得近2 0 年来t f p l c 手性固定相法在手性药物研发领域得以蓬勃发展“。 目前，高效液相色谱手性固定相法已成为药物手性分离最为重要也是最 有效的方法。手性固定相是整个h p l c 系统的关键部件，它直接决定了拆分的 效果。因此，具有良好手性识别能力的c s p 的研制，是手性色谱发展的前沿 领域，也是手性色谱发展的关键和核心“。一个有效的c s p ，应能快速、准 确测定对映体纯度；尽可能适应多种结构类型对映体分离；对一系列结构类 似的手性化合物，其d 、l 或r 、s 对映体洗脱顺序基本不变，可提供绝对构型 信息；应有较高对映体分离选择性( n 1 2 ) 和柱容量，具有制备分离能力 “。因而普适高效手性固定相的研制，成为当今手性色谱分离领域的难点 和热点。 以前在药物领域，手性h p l c 多是被人们作为种手段来进行手性药物的 分离、分析和纯度测定以及小规模的制备拆分。近年来。随着越来越多高性 能手性固定相的合成和各项新型色谱技术的应用，手性h p l c $ 1 备拆分手性药 物研究获得了长足的发展“。例如以w h e l k 一0 1 为固定相，可以快速地进行 2 0 0 m g ( 4 - ) 一华法林样品地拆分”1 。而模拟流动床色谱( s m b ) 是近年迅速 发展起来的可用于大规模制备手性药物的一个强有力的工具，其拆分能力可 以达到成吨级的水平”。”1 。 6 四川1 人学硕【学位论义 第二章 高效液相色谱手性固定相拆分药物对映体 为了深入探讨手性药物对映异构体各自的生理和药理作用以及临床应 用，对映异构体的拆分和测定研究已经越来越受到人们的密切关注，而且已 迅速发展成为当前药物研究领域的热点问题。现代分离分析技术在此方面显 示出了巨大的优越性。其中高效液相色谱法特别是高效液相色谱手性固定 相法以其高效、简便、快捷等优点，获得了较广泛的重视。同时，随着越来 越多的新的技术工艺的出现，高效液相色谱手性固定相法在手性药物研究领 域的应用，已逐渐由传统的单纯的分离分析向制备分离转变，成为制备单一 对映体手性药物的首选方法。 1 高效液相色谱手性固定相 目前世界上已经合成了几百种用于手性分离的不同类型c s p 。但是，显 然这些手性固定相仍然不能满足手性分离的需要，新的手性固定相还在不断 的合成。以固定化的手性选择器的结构特征和手性分离的机制这两项特征为 依据，可将它们分为以下几类“：生物大分子类固定相、手性聚合物固定相、 含有手性空腔的固定相、分子印迹手性固定相、大环抗生素手性固定相和给 体一受体手性固定相等。 1 1 生物大分子手性固定相 生物体内是个大的手性环境，能识别手性分子，因此，利用某些生物大 分子作为固定相，能达到拆分手性分子的目的。蛋白质是常见的能充当手性 固定相的生物大分子。 蛋白质是由手性单元l 一氨基酸组成的手性大分子化合物，具有独特的一 缴、二级及三级结构特征，是对映异构体的天然识别体。手性识别过程中， 三级结构的疏水性口袋、沟槽或通道以及极性基团间的相互作用，使手性化 合物形成了类非对映异构体从而实现拆分。目前，用于h p l c 手性拆分的蛋白 质c s p 主要有：人a 一酸性糖蛋白( n a g p ) ，它是碱性药物的主要血浆结 合蛋白，分子量为4 0 0 0 0 左右；卵黏蛋白( o v g ) ，应用范围与a c , p 类似，但 四川大学硕士学位论文 有更好的稳定性，分子量为2 7 0 0 左右；人血清白蛋白( h s a ) 和牛血清白蛋 白( b s a ) ，这种蛋白与a g p 和卵黏蛋白不同，它不含糖基，分子构像对环境 变化十分敏感，适用于酸性、中性和内源性药物，分子量超过6 0 0 0 0 。 蛋白质型c s p 均在反相条件下工作，适用于生物医学分析，对对映体选 择性较强，对p h 值、有机调节剂的含量变化十分敏感。在所有的手性固定相 中，蛋白质手性固定相适用范围最广，但拆分效能大都不高，柱容量也很低， 进样量大于l “g 就可观察到过载现象，很少用于拆分制备”。 12 手性聚合物固定相 此类手性固定相包括两类来源不同的聚合物。一类是天然的多糖衍生 物，包括纤维素和直链淀粉，另一类是合成的高分子化合物。 纤维素和直链淀粉是自然界最丰富的有机聚合物，可直接或经衍生后用 作h p l c 的手性固定相。它们是直链d 葡萄糖单元通过b l ，4 一糖苷键或a 一 1 ，4 糖苷键链接而形成的线形聚合物。由于葡萄糖单元的手性，每个聚合物 链均具有沿着纤维素主链存在的一个螺旋形的沟槽。对映体进入沟中，主要 通过吸引和包合作用实现对映异构体的拆分。对一个给定的溶质来说，决定 分离能力的是其分子的大小和形状，而不是官能团。此类固定相在手性药物 拆分领域的应用也较广泛。其中3 ，5 一二甲苯基氨甲酸酯( t d m p c ) 衍生物 制作的纤维素c s p ，可拆分多类手性药物，尤其对0 阻滞剂类药物有着十分 良好的拆分效果，已经投入工业生产”“1 。合成的手性聚合物也可以用作手 性h p l c 的固定相，它们的手性来源于聚合物的螺旋型结构，主要有聚酰胺类、 聚氨酯类及聚甲基丙烯酸酯类等”。 手性聚合物类c s p 的缺点是耐压性较差，不能用于较大的流速，稳定性 较差，对流动相的要求较高，柱予容易损坏，即使使用标准的正己烷一异丙 醇流动相，固定物也有轻微的洗脱现象。 1 3 含有手性空腔的手性固定相 常见的含有手性空腔的固定相有环糊精和冠醚手性固定相。这类分子的 三维结构都有个空腔靠着空腔边和空腔内基团识别不同的空间构型的分 删川大学硕士学位论文 子，从而分离手性对映体。 环糊精( c y c l o d e x t r i n ，c d ) 是复曲面环状寡糖，最常见的是由6 n 8 个d 一毗喃葡萄糖组成，分别称为n 一，b 一，y 一环糊精。环糊精分子空腔内 具有疏水性，而腔外具有亲水性。分离过程中，手性化合物分子进入环糊精 分子疏水性的空腔内，对映体分子的疏水性部分被c d 的疏水空腔紧密包容， 分子中的极性基团则可以与c d 分子空腔边缘的仲醇羟基之间发生氢键等极 性相互作用，从而出现保留和对映体选择性，实现手性分离。因此，环糊精 手性固定相的选择性与对映异构体分子的大小密切相关，对较小或较大的对 映体分子都不能有效的识别。针对环糊精c s p 已经开展了许多工作，保留和 手型识别机理研究得也较清楚。此类c s p 已经得到了较广泛的应用，非甾体 类药物、1 3 一阻滞剂类药物等多类药物都可用此类c s p 拆分。“2 “，并能承受生 物样品直接进样。但这类手性固定相的表面环糊精覆盖率不高，柱容量有限， 并且动态包合过程相对较慢，致使拆分峰形较差，所以不太适用于手性制备 拆分。 冠醚类手性固定相主要用于一些含有能够质子化的伯胺宫能团的手性 化合物分离，尤其是氨基酸及其衍生物对映体的拆分。利用冠醚类手性固定 相进行拆分时，一般都使用酸性流动相”。 1 4 分子印迹类手性固定相 分子印迹( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ) 技术“”源于免疫学的发展，与常规和 传统的分离或分析介质相比，基于分子识别的分子印迹聚合物的突出特点是 对分离物或分析物具有高度的选择性。一个手性模板分子通过一个可断裂的 键，链接在交联的聚合物内，经水解反应，样板手性分子离开聚合物，这样 聚合物内就留下了与此分子相匹配的手性印迹空腔。如果构建合适，分子印 迹空腔就像锁一样对该钥匙具有选择性，能有效识别与手性样板分子具有相 同或相近结构的外消旋化合物。在分子识别过程中，通常是由很多的非共价 键偶合和很多个作用点的协同作用。现在，已经采用分子印迹手性固定相技 术成功分离了萘普生、氨基酸衍生物等手性分子。但是，作为一种刚兴起 的技术，由于其色谱效率低下，很大程度上限制了该类手性固定相的应用。 凹j i i 大学硕士学位论文 1 5 大环抗生素手性固定相 a r m s t r o n g ”“等于1 9 9 4 年提出了一类新的手性固定相用于毛细管电泳、 液相色谱和薄层色谱，这类固定相就是大环抗生素手性固定相。大环抗生素 手性固定相被人们看作是一类有着良好前景的固定相。它具有一些独特的优 点，例如大环抗生素分子可以和被分离物形成多种功能团相互作用，具有多 个手性选择中心，因而有着好的广泛的手性识别能力。此外，在大环抗生素 分子上有亲水性基团和离子基团，因而有很好的水溶性，便于其在流动相中 使用。糖肽是目前这些大环抗生素中使用较为广泛的手性固定相”“。 1 6 给体一受体手性固定相 固定相与溶质分子之间，通过非离子型基团相互吸引作用形成手性识别 的手性固定相称为给体一受体手性固定相( d o n o r a c c e p t o rc s p s ) 。这类 手性固定相是通过一定的间隔臂，连接一个单分子层的手性有机分子到硅胶 载体上而制得，因而又被称之为“刷型”或“束型”手性固定相( b r u s h l y p ec s p s ) 。本论文中所涉及到的手性固定相为给体一受体手性固定相。 给体一受体手性固定相与溶质问的作用是氢键作用，n n 作用，偶极 堆积作用以及立体作用的总和。给体一受体手性固定相有着非常确切的化学 结构，通常在手性中心至少含有下列一种官能团：( 1 ) n 一吸电子或一 给电子的芳香基团( 在手性识别过程中发生一电荷相互作用) ： ( 2 ) 能形成氢键的原子或基团；( 3 ) 能发生偶极偶极相互作用的极性键或基 团；( 4 ) 能提供立体排斥、范德华相互作用和构型控制的较大的非极性基 团。同样，待分离溶质也需要有相似的互补基团爿能达到理想的分离效果， 虽然这种固定相结构简单，然而大量的化合物可在此类手性固定相上分离 “。3 “1 ，而且可以得到其它类手性固定相无与伦比的手性分离系数，这正是 我们制备拆分手性药物所希望的。 尽管世界上众多的科研小组致力于给体一受体手性固定相的研究，但就 其贡献来讲应首推p i r k l e d 、组，因此这类固定相也被命名为p i r k l e 型手性固 定相。p i r k l e 等人在上世纪7 0 年代研究9 一葸基一三氟甲基甲醇作为n m r 手性溶 剂时发现，对于某些手性化合物，9 一蒽基一三氟甲基甲醇能与对映体之一形 1 0 咖川大学颅卜学位论文 成络合物，根据这一现象，将9 蒽基一三氟甲基甲醇固定到载体上，制成c s p ， 成功拆分了大量的含有3 ，5 一二硝基苯( d n b ) 的一酸取代的胺、氨基酸 和亚砜类手性物质。后来，p i r k t e 提出了在以后的给体一受体手性固定 相分子设计中有重要指导意义的原则：“互为相反作用原则”( t h e p r i n c i p l eo fr e c i p r o c i t y ) ，即如果能实现一个固定的化合物a 的对映体之 一对另个化合物b 的对映体手性拆分，那么反之办然”。”州。根据这种推理， p i r k l e 又研制成了多种手性固定相，如将3 ，5 - 二硝基苯甲酰氯的氨基酸衍 生物链接到3 一丙胺基硅胶上制成的第二代给体一受体固定相，以及将乙内 酰脲链接到硅胶上制成的第三代固定相，都取得了很大的成功。此外，根据 从试验中总结出来的手性识别规律，又针对特定的待拆分物的分子结构而设 计了一些固定相，都取得了不错的效果“。 给体一受体手性固定相，是所有的手性固定相中拆分机理研究得最透彻 的一类。大多数给体一受体手性固定相识别手性对映体需要芳香基团问的n n 作用，因为大多数药物都含有芳香基团，所以此类固定相在药物拆分领 域有广泛的应用“”3 。此外也有许多不需要n n 作用的给体一受体固定相 相继被设计合成。 2 高效液相色谱手性识别机理 手性拆分的过程实际上就是手性固定相分子与手性对映体分子之间识 别的过程。1 9 5 2 年，d a l g l i e s h 采用纸层析研究氨基酸对映体的分离时提出 了色谱直接拆分的“三点相互作用”手性识别模式“1 。“三点作用原理” 是对不对称识别条件的原始阐述。后来，l o c h m u l e r 和d o b a s h i 提出“两点作 用模型；l o c h m u l e r 和w a i n e r 提出“单点作用”机理。l o c h m u l e r 进一步提 出某些系统存在“环境手性”而没有专一的作用点，此时对映体的拆分过程 可以是熵控制的，手性识别源于形状选择性的识别模型( 图2 1 ) 。也就是说， 在没有结合点( 如氢键、色散力、偶极作用、n n 相互作用等) 的手性环境 罩，熵控制下，对映体在色谱过程中是可以被拆分的。事实上，由于熵变化 值较小，从而导致分离因子a 值不够显著，因此，能够通过增加作用点来提 高手性选择性值，识别模型如图2 2 所示，此时对映体的拆分源于分子形状 和相互作用力的共同贡献。 u q 川大学硕士学位论文 图2 - 1 形状选择性的识别模型 f i g 2 1r e c o g n i t i o nm o d e l o f c o n f o r m a t i o n s e l e c t i v i t y 单作用点或作用点 图2 2 分子形状和相互作用力共同参与 f i g 2 2r e c o g n i t i o nm o d e lo f m o l e c u l a r c o n f c i r m a t i o na n di n t e r a c t i o n 近年来，p i r k l e “”等发展了d a l g l i e s h 观点，再一次阐述了“三点作用” 理论：手性识别要求手性固定相和对映异构体( 至少一个对映体) 之间至少 有三个同时存在的作用力，并且这些作用力中至少有一个是与立体化学相关 的。也就是说，用其中的另一个对映异构体来替代后，至少有一个作用力不 复存在或明显改变其性质。用如图2 3 所示的手性识别模型表达：在手性固 定相上有三个作用点a 、b 、c ，与之作用的对跌异构体也同样有三个作用点 a t 、b 、c 。对映体i 与c s p 形成a a 1 、b b 1 、c c 三个作用力，对映体i i 贝, l j 不 存在c c 1 作用力。如果c 。c 作用是吸引作用力，使形成的非对映分子络合物 稳定化，则在色谱分离系统中对映体i l l ：l l 保留时间长，后洗脱；反之，对映 体i 由于c c 的排斥作用则先流出色谱柱。如果c c 作用力很小，则对映体i 、 i l 与手性固定相之间的相互作用不存在明显差异，从而不能被色谱拆分。 - c + b l 0 。d - i a d ： c s p 8 、jc a ，j 图2 - 3 手性识别的“三点作用”模型 f i g 2 3 “t h r e ep o i n ti n t e r a c t i o n m o d e lf o r 图2 4 相似的相互作用力( a a ，b b ) 导致 色谱手性识别能力的降低或消失 f i g ，2 4d e c r e a s i n go f c h i r a lr e c o g n i t i o n a b i l i t yb e c a u s eo f t h es i m i l a ri n t e r a c t i o n s 四川人学硕上学位论文 1 9 9 2 年，t a y l o r 4 7 | 等对“三点作用原理”进行了较为详尽的解释：对映 体分子与手性固定相分子的三个作用力中，至少有一个作用力具有立体选择 性，即依赖于对映异构体和固定相的立体化学，而另外两个作用力必须是两 种不同类型的作用力，如氢键作用、偶极堆叠作用、n n 电子相互作用等， 否则如果存在两个相同的作用力，可能产生不利于对映体手性拆分的作用， 使得手性固定相对该物质对映体的手性识别能力降低或消失，例如当a a 和b b 作用力相同时，就可能使手性固定相失去手性分离能力( 图2 4 ) 。在很 多情况下，三个作用力中，不一定都是吸引力，也可以是排斥力。手性识别 可以靠空间位阻的排斥力和两个吸引力来实现( 图2 5 ) 。在这种识别模式中， 对映体i i 由于其大基团的空问位阻，使得其另外的氢键和n n 作用等吸引 力明显减弱，两对映体分子在色谱柱上的保留时问产生明显的差别，从而达 到手性识别的目的。这种作用模式已被n m r 分子i 司的核极化效应和分子机 理计算所证实。 图2 - 5 来源于一种排斥力和二种吸引力 的“三点作用”手性识别模型 f i g 2 5c h i r a lr e c o g n i t i o nm o d e l f o ro n e a n t i - a c t i o na n dt w oa t t r a c t i o n d ( r ) d ( ) 图2 - 6c s p 手性中心附近基团柔韧性过 强导致色谱手性识别能力丧失 f i g 2 6d e c r e a s i n go f c h i r a lr e c o g n i t i o n a b i l i t yb e c a u s eo f t h e t o os t r o n gf l e x i l i t y 另一方面，“三点作用”原理要求c s p 分子和待分离对映异构体的手性 中心附近都要有一定的刚性，柔韧性过强将会使手性识别能力丧失，如图2 6 所示。 手性色谱分离过程中，所有分子之间的相互作用力类型都可以成为手性 识别的有效贡献因素，分子间作用力可以分为单点性和多点性的。对此， i3 州川大学硕学位论文 p i r k l e “”等给出了较为明晰的描述：两个凸圆面相互接触时，接触处形成一 个理想的点，于是将凸圆形电子轨道的相互作用描述成单点性的，如氢键、 尾一尾偶极相互作用是单点性质作用力：通过线或面的基团的相互作用，如 偶极堆积，n n 作用则为多点性质的。因此，在分离过程中并不强调手性 识别仅仅源于两个手性四面体角顶点的相互作用。也可以是沿着a b 和a 。b 的偶极基团，通过多点性质的偶极堆积作用达到两个点作用的效果，芳环间 的一n 作用亦是如此，手性识别模型如图2 - 7 所示。 c s p 图2 7 通过偶极堆积相互作用形成色谱手性识别 f i g 2 7c h i r a lr e c o g n i t i o nm o d e lf o rd i p o l e - d i p o l es t a c k i n g 总之，经典“三点作用原理”理论认为，在手性固定相与对映体的识别 过程中，至少需要两个不同的力，使两对映体按照同一空间取向吸附在固定 相上，因为两对映体空间构型的不同，使得第三个力( 吸引力或排斥力) 作 用不同，由于吸附能大小的差异导致两暂时非对映异构络合物稳定性的不 同，从而得到不同的保留值而分开。和酶识别底物模型相比较，两个不同的 力是识别的前提，这两个力也可以被一系列的弱力所代替，只要满足图2 所 示，使两对映体分子按照同一方式吸附上去，如果参与吸附的弱力多，那么 识别的专业性就越强，就像钥匙上的密码齿一样。第三个力对不同的对映体 作用的差异是拆分的关键。因为第三个作用力的不同，导致了吸附能的不同。 因此，在丌发新的固定相时，为了使拆分的专业性强，可以考虑根据拆分物 的结构，使识别的力群的特异性增加，为了分离因子的提高，可以使第三个 力对不同对映体的强度差异增加。 然而，待分离药物对映体与手性固定相间的手性识别是纷繁复杂的，源 四川i 大学硕士学位论文 于分子形状和分子间相互作用的共同贡献，是所有作用综合影响的结果，某 些作用因素些许的变化就能导致手性识别方式的明显改变。有时手性识别是 几个不同的识别机理相互竞争的过程，而有些时候是不能完全用经典的“三 点作用原理”来解释的。我们通过研究发现，在有些分离体系中，即使流动 相组成的轻微改变也可能导致前后手性识别过程的迥然不同。因此，简单的 手性识别模型不可能解释所有的实验现象，对映体拆分的手性识别机理还有 待于更深入的研究。 3 高效液相色谱手性固定相拆分药物对映体的热力学 高效液相色谱手性拆分药物对映体热力学的本质就是研究色谱操作参 数影响保留值的规律性。通过对拆分热力学的研究，弄清手性拆分过程与宏 观热力学量之间的依赖关系，这对于间接推测和研究手性识别的微观机制具 有重要意义。 高效液相色谱手性固定相法直接拆分药物对映体，在色谱柱内存在着下 述平衡： c s p + a 3 _ c s p a r c s p + + a 5 c s p a o 在经典热力学中，体系自由能变化( g o ) 与焓变( h o ) 、熵变( a s o ) 之间 的关系遵从6 i b b s 方程： a 6 0 = a h o t a s o 在液相色谱中，溶质色谱保留参数即容量因子k 与溶质对映体在流动相、 固定相问可逆吸附的热力学平衡常数k 的关系为：k = d p k ( m 是色谱柱相比) 。 对映异构体选择性以a = k 。k 。( k ： k 。) 来表征。色谱过程的自由能变化 可