（光学专业论文）嵌入式胶体金免疫层析试纸定量分析仪的研究.pdf

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学术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并收入相应学位论文 数据哗，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保昏在其他媒体发表论文的权利。 1 r 公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交币i 服务同公开论文。 论义电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 01 , i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是有：南丌人学学列期问剑作完战的作品，j 1 ：已通j , j - 论文答 辩：提交的学位隆文电子版与纸质本论文的内容一致如凶不州造成不良后果| f i 本人自负， 本人同意逆守上述觇定。奉授权书签署式两份，由研究生院和图书馆留存， 作者暨授权人签字：! 龇 2 0 b 年彭月日 南开大学研究生学位论文作者信息 论义题d 嵌入j - 胶体金免疫层析试纸定罐分析仪的研究 姓名。梅剑春学号2 1 2 0 0 7 0 1 0 9 答辩l j 期2 0 1 0 ，乍5 门2 5i j 论文类别博i , r - - 1学历硕l 可硕 专业学位口高校教师口同等学力硕：i ：t _ z i 院系所物理科学学院专业光学 联系i l l 话0 2 2 2 3 4 9 0 9 81e m a i l j i a n c h u n m e i g m a i l c o l n 通信地士【邮编) ：大津i l j 南开区南开人学五教31 5 衙注： 是否批准为非公开论文 荡l 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 年月日 非公开学位论文标注说明 根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 申请密级 口限制( 2 年)口秘密( 1 0 年)口机密( 2 0 年) 保密期限 2 0 年月日至2 0年月日 审批表编号批准日期2 0年月日 限制2 年( 最长2 年，可少于2 年) 秘密- k l o 年( 最长5 年，可少于5 年) 机密 k 2 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) 摘要 摘要 近年来爆发的s a r s 、禽流感、甲型h 1 n 1 等重大传染性疾病给人们生活带 来了极大危害。有效的监控和防范上述类似疾病的侵入，截断病毒和有害细菌 的传播途径，成为检验检疫的重点工作之一。 胶体金免疫层析方法检测病原体的感染情况是一种应用广泛的快速检测方 法，这种方法只需一步加样，2 5 分钟内就能判定结果，和其他技术比较起来， 有简单、高效、携带方便、试剂稳定、假阳性率低等优点，可以有效的解决实 际中面临的困难。胶体金免疫层析方法使用方便，但检测灵敏度不高，极大的 限制了该技术在检验检疫工作中的进一步应用。但是目前胶体金检测方法还主 要通过肉眼对结果进行判读，通过配套仪器提高检测灵敏度，实现半定量检测 的技术应用不广泛。本研究从解决上述实际问题出发，在仔细研究胶体金试纸 定量检测技术的背景和国内外利用这种技术实现的定量分析仪的研发历史及现 状的基础上，提出了一种通过高灵敏度光学检测技术采集试纸条图像信息，并 结合后期图像处理技术实现试剂浓度定量分析的方法。光学检测系统的应用可 提高检测灵敏度，实现对微量、痕量样品的检测。同时该系统还可以改善以往 肉眼进行检测评判的工作，避免由于人为因素主观判断造成的差异，并且降低 工作人员的工作量提高工作效率。 由于嵌入式处理器性能的不断增强，嵌入式系统的处理能力和应用范围越 来越广，由于自身低成本、低功耗和携带方便的特点，已经在很多应用方面取 代了计算机。为了满足各种不同场所检验的需要，摆脱对计算机的依赖，我们 结合快速发展的嵌入式技术，完成了嵌入式定量分析仪的研制，这样还可以省 掉数据传输的时间，加快检测速度。目前已开发出第一代样机，该代定量分析 仪以嵌入式处理器( a r m ，$ 3 c 2 4 4 0 ) 和嵌入式l i n u x 操作系统为控制核心，并 配有打印机、条码扫描仪、i c 卡读写器、触摸屏等多种外设，方便各种场合的 使用。本文将详细介绍它们的硬件结构和软件设计流程。 关键词：免疫层析嵌入式处理器嵌入式l i n u x 操作系统 h a sl o w e rf a l s ep o s i t i v er a t ea n ds oo n n o wi th a sb e e nv e r yw i d e l ya p p l i e di nv a r i o u sf i e l d so fi n f e c t i o u s d i s e a s e s t e s t i n g ，a n d c a l le f f e c t i v e l ys o l v em a n yp r a c t i c a l d i f f i c u l t i e s b u tt h ef u r t h e r a p p l i c a t i o ni sl a r g e l yl i m i t e db yt h ef a c t t h a t t h ed e t e c t i o np r e c i s i o ni sn o th i g h e n o u g h t h em a i ni n t e r p r e t a t i o no f t h ec o l l o i d a lg o l dt e s t i n gr e s u l t si sa c h i e v e db yt h e n a k e de y en o w a d a y s t h et e c h n o l o g yo fu s i n gt h es u p p o r t i n ge q u i p m e n tt ol m p r o v e d e t e c t i o ns e n s i t i v i t ya n dt oa c h i e v es e m i q u a n t i t a t i v ed e t e c t i o ni sn o tw i d e s p r e a d t o s o l v et h ep r a c t i c a lp r o b l e m s ，w ec a r e f u l l yi n v e s t i g a t e dt h et e c h n o l o g yb a c k g r o u n do f c 0 1 1 0 i d a lg o l dt e s ts t r i pq u a n t i t a t i v e ，r e s e a r c h e dt h eh i s t o r ya n dc u r r e n td e v e l o p m e n t s i t i l a t i o no ft h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i si n s t r u m e n tw i t ht h et e c h n o l o g y b a s e do nt h e s t u d yr e s u l t w ec a r r i e do u tan e wa p p r o a c h c o l l e c tt h ei m a g eo f t h es t r i pw i t hh i g h s e n s i t i v i t yo p t i c a ld e t e c t i o nt e c h n o l o g ya tf i r s t ，a n dt h e nu s et h et m a g ep r o c e s s i n g t e c h n o l o g yt o c a l c u l a t e t h er e a g e n tc o n c e n t r a t i o n o p t i c a li n s p e c t i o ns y s t e mc a l l i m p r o v et h es e n s i t i v i t y ；c a l lb eu s e dt od e t e c tt h em i c r ot r a c es a m p l e s a tt h es a m e t i m et h a tt h es y s t e mc a na l s oi m p r o v et h eo l dj u d g r n e n tm e t h o dw i t ht h en a k e de y e ， a v o i ds u b j e c t i v ej u d g m e n t si n a c c u r a c ya sr e s u l to fh u m a nd i f f e r e n c e s ，a n dr e d u c et h e w o r k l o a dt oi m p r o v ee f f i c i e n c y w i t ht h eg r o w i n gp e r f o r m a n c eo fe m b e d d e dp r o c e s s o r t h ep r o c e s s i n gp o w e r a n dr a i l g eo fa p p l i c a t i o no fe m b e d d e ds y s t e mh a sb e e nw i d e l ye x t e n d e d d u et oi t s i i k e yw o r d s ：i m m u n o c h r o m a t o g r a p h y e m b e d d e ds y s t e m e m b e d d e dl i n u x o p e r a t i n gs y s t e m i i i 摘要i a b s t r a c t i i 目录i v 第一章引言1 第一节研究目的1 第二节研究意义1 第三节选题背景2 第四节胶体金试纸定量分析仪的研究现状4 第五节嵌入式系统设计6 第六节论文结构安排7 第二章金标免疫层析定量分析系统设计方案9 第一节金标免疫层析试纸结构9 第二节系统设计方案1 2 第三节照明光源1 3 第四节图像采集器件选择1 5 第五节图像分析处理1 6 2 5 1 开窗1 6 2 5 2 预处理1 7 2 5 3 特征提取1 9 第三章系统硬件结构2 2 第一节嵌入式微处理器的选择2 2 i v 2 3 2 5 2 6 2 7 2 7 2 8 3 2 第一节交叉编译环境3 2 第二节b o o t l o a d e r 3 3 第三节l i n u x 内核移植3 4 第四节文件系统移植3 4 4 4 1 图形传感器驱动程序3 5 4 4 2 嵌入式l i n u x 下的u s bd e v i c e 驱动3 7 4 4 3 嵌入式l i n u x 下液晶显示模块驱动设计4 0 第五节图形化应用程序设计4 l 4 5 1 嵌入式g u i 系统的选择4 2 4 5 2q t e m b e d d e d 介绍4 3 4 5 3 程序设计4 5 第五章实验结果分析4 7 第六章总结和展望5 1 第一节工作总结5 1 第二节将来工作的展望5 1 参考文献5 3 致谢5 5 个人简历5 6 v 第一章引言 第一节研究目的 随着社会经济的不断发展，人的活动对自然生态环境的影响逐渐加深。各 种新现和再现的传染性疾病不断发生。而且由于各种现代化交通工具的极大普 及，地区与地区之间，国与国之间在文化、商务、旅游等方面的联系日渐紧密， 人员的流动性越来越强。在局部发生的上述疾病，往往会迅速爆发为全球的较 大规模流行。近年来爆发的s a r s 、禽流感、甲型h 1 n 1 等传染性疾病为人民敲 响了警钟。有效的监控和防范上述类似疾病的侵入，截断病毒的传播途径，已 成为出入境检验检疫的重点工作之一。 检验检疫工作依赖于检测技术手段的进步，而实际工作中的具体问题，往 往制约着检测技术手段的应用。例如，2 0 0 9 年甲型流感大规模爆发期间，由于 技术手段的不足，导致只能对体温不正常的入境人员简单的实行隔离措施，造 成了社会资源的浪费。而且出于技术手段的制约和国际影响的考虑，也难以对 所有的检测对象进行创伤性血清学的检测。 从解决上述实际问题出发，拟根据重要发热传染病抗体在机体内的分布特 性，基于免疫胶体金技术和高灵敏度光学检测技术，通过对口腔组织渗出液等 体液代替血液作为检测目标进行免疫学检验，实现对发热病人的非创伤性现场 快速检测，提高口岸检疫的效率，降低受检者的痛苦，从根本上克服在检验检 疫工作中遇到的具体困难。 第二节研究意义 首先，本课题的研究成果可以填补目前出入境检验检疫方法上的空白，为 提高检验检疫工作水平提供技术上的支持，具有一定的学术价值。目前，虽然 多种先进快速的检测方法被应用于检验检疫的实际工作中，但是在非创伤性现 场快速检测方法中依然是较少，本研究提出的采集口腔组织渗出液等体液代替 血液作为检测目标进行免疫学检验方法和标准仍然是空白，本研究的成果可以 的支持。 便携性高 的特点，开发出小型的检测设备，可以免除检测场所的限制，缩短现场检测时 间，提升口岸检疫应对突发疫情的反应能力，为国家安全和人民身体健康提供 有力的保障，具有重要的社会意义。 本研究可以提高疫情防控工作的效率，提高检测目标的针对性，加大对突 发疫情防控措施的力度，从根本上提高检测水平和相关疾病的防控能力，防止 外来疫情疫病的输入和国内疫病的输出。 最后，本研究成果在检验检疫领域的应用可以带来显著的经济效益，具有 重要的经济价值。 本研究的成果可以降低检验检疫工作人员的劳动强度，减少受检者的痛苦， 避免交叉感染的风险，在实际工作中得到较好的推广。目前，国内尚无该类产 品，国际市场上一次检测成本较高，每种传染病检测大约需要2 0 0 元左右，通 过产品的开发，可以极大的降低检测成本，节约检验检疫经费的投入，同时带 来可观的经济效益。 第三节选题背景 免疫胶体金标记技术( i m m u n o g o l dl a b e l i n gt e c h n i q u e ，i l t ) 是1 9 世纪8 0 年代初期继酶免疫标记、荧光免疫标记、放射性同位素免疫标记三大标记技术 之后，发展起来的新型固相标记免疫测定技术。l l j 上个世纪八十年代，法拉第在利用还原法制作胶体金的过程中，发现在氯 金酸溶液中掺入少部分电解质以后，胶体金的颜色会发生变化。首先由红色转 变为蓝色，并最终变成无色。但是如果加入明胶，这个变色过程就会被阻断。 这个重大发现为胶体金标记技术的发明奠定了科学基础。 2 1 免疫胶体金标记技术 以胶体金( c o l l o i d a lg o l d ) 作为示踪标志物，以抗原抗体反应作为主要工作方式。 其原理是胶体金在还原剂如白磷、抗坏血酸、鞣酸、柠檬酸钠等的作用下，通 过聚合作用，形成特定大小( 3 4 0 n m ) 的颗粒，并且在静电作用下形成一种稳 定的胶体状态，故被称为胶体金。胶体金标记的实质就是蛋白等高分子被吸附 到胶体金颗粒表面的包被过程，其吸附机理可能是利用它在碱性条件下带负电 荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团，靠静电吸引而牢固结合，因而金标一 2 第一章引言 抗或二抗具有较好的稳定性。【3 】由于粒子的尺度在纳米量级，胶体金颗粒具有纳 米材料所特有的三大效应：表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应，具有 很大的表面积，独特的光学、导电、导热等物理特性以及良好的生物相容性， 可以与蛋白质、核酸等非共价结合。【4 j 胶体金的溶液一般呈橘红色到紫红色。1 9 7 1 年f a u l k 和t a y l o r 在研究沙 门氏菌壁细胞抗原成分时，将胶体金引入免疫化学中，开始作为一种免疫标记 技术使用，胶体金在免疫化学中的这种应用，又被称为免疫金。近年来胶体金 标记已经发展为一项重要的免疫标记技术。并越来越受到相关研究领域的重视。 和其他标记技术相比，胶体金的主要技术优势是，简便、迅速、准确、特异性 强、敏度高、无污染、假阳性率低等。且检测不依赖昂贵的激光检测仪器，只 需普通光学仪器，甚至肉眼即可辨别。【l j 使用免疫胶体金作为标记的快速诊断技术现在主要有两种：斑点金免疫渗 滤法( d o t i m m u n og o l df i l t r a t i o na s s a y ，d i g f a ) 和胶体金免疫层析法( c o l l o i d a l g o l di m m t m o c h r o m a t o g r a p h y a s s a y ，g i c a ) 。其中免疫层析方法免疫层析是在免 疫渗透技术的基础上发展起来，是一种方便快捷的医学检测技术，首次出现于 十九世纪八十年代。这种方法多以条状纤维层材料为固相，通过毛细作用使样 品溶液在层析条上移动，同时使样品中待测物与层析材料上针对待测物的受体 ( 如抗原或抗体) 发生高特异性、高亲合性的免疫反应。在层析过程中免疫复 合物被富集或截留在层析材料的一定区域( 检测带) ，通过酶反应或目标测定 带而得到直观的试验现象【5 1 ，而游离的标记物则越过检测带，达到与结合标记物 自动分离的目的。检测过程更加简便，结果也更加稳定，是一种普遍采用的检 验检疫方法。 该方法只需加样一次，2 - 5 m i n u t e s 以内就能够得到结果，所以比其他技术更 加有简单、高效、快速。从在实际应用中的效果来看，胶体金免疫层析方法还 有以下优点：操作人员上手速度快，不需要长时间培训；方便携带，占用体积 小；试剂稳定，可长时间存放：假阳性率低。 目前的主要应用范围是在医学临床诊断领域，包括：1 传染病病原、2 激 素、3 细菌、4 性病、5 肿瘤标记物、6 寄生虫、7 毒品等。特别适合于广大 出入境检验检疫机构、医院、检疫局等需要快速大规模检测和大范围普查等。 现状 胶体金免疫层析技术主要应用在需要定性检测的场合。当待检溶液中样本 的浓度超过一定的范围时，会出现比较明显的颜色变化，反之则没有。该技术 特别适用在疾病定性监测当中，分析血清、尿液中有没有异常升高的物质，例 如怀孕时尿液中h c g 的含量等。 这种方法简单以是否超过正常参考值上限为阳性界限，检测结果为是或者 不是这种二值关系。 定性检测在临床应用中往往不能满足需求，人们需要一种更为精确的定量 检测方法。由于g i c a 阳性显色的深浅与标本中待检物的浓度有一定的关系，可 以根据颜色的测定来进行定量测量。 但是使用这种方法进行定量测量在实际操作中较为困难，因为加入进去的 标本会和金标结合物混合在起沿着n c 膜向前推进，检测线上反映出来的颜色 在这个过程中逐步加深。但是由于原材料和生产工艺水平的显示，很难保证各 份试剂的性质一致，而且液体流动速度和周围环境等因素也会对反映过程有影 响，所以会出现同一浓度的样品在多份试纸条中显示的颜色深浅差距较大的情 况，很难保证结果的可重现性，为定量测量提出了挑战。但是几家著名的滤膜 生产厂家最近已生产出高质量的n c 膜等材料，而且也有很多专业的厂商( 如 k i n m a - t i ea u t o m a t i o n 公司等) 提供精密的加液、切割和组装器材，而且还提供 自动化全套的生产流水线，因此在执行严格质量控制的条件下已能生产出性质 基本一致的免疫胶体金金渗滤试剂盒和胶体金免疫层析测试条，这就为试纸条 的定量分析创造了必要条件。【6 j 现在实际中用到的胶体金定量分析方法主要有以下三种方法：肉眼识别、 简单设备检测和使用定量分析仪分析。 直接用肉眼识别，根据和对照线( 卡) 颜色的色差来确定待测物的浓度，还 有的有的是通过多条平行检测带最后出现的条数来确定其含量。肉眼识别的优 势在于不需要其他辅助设备，简单方便。可以随身携带多套标记试纸进行病理 检测，检测结果直接有效。但是缺点也很明显，检测速度慢，自动化程度低。 而且检测人员容易疲劳，无法进行大批量测量。人的主观性大，无法保证检测 结果一直安全有效，误差率大。 有种测量方法是使用反射光密度计测定光密度强度，根据得出的数字结果 4 法。 为满足临床应用的需要，各种胶体金试纸定量分析仪相继被人们研制了出 来。市场上定量分析仪的设计均采用光学方式，实现的测量方案主要集中在下 面几个之中：光敏电阻测量方案、反射光纤传感器测量反射光强方案、图像传 感器采集图像方案。 光学检测系统的应用可提高检测灵敏度，实现对微量、痕量物质的检测。1 7 1 同时该系统还可以改善以往肉眼进行检测评判的工作，避免由于人为因素主观 判断造成的差异，并且降低工作人员的工作量，提高工作效率。但是不同类型 的光学检测系统各有自己独特的使用优点和局限性。 光敏电阻是利用半导体的光电效应制成的一种光学元器件，其电阻会根据 入射光强的增大而增大。而且由于电阻值的测量相当方便，所以可以很方便通 过测量光敏电阻的阻值，得出从试纸上反射的光的光强。而且光敏电阻具有很 宽的响应范围和很高的测量灵敏度。利用此种原理设计的定量分析仪测量精度 高，设计结构简单，成本低廉。但是，绝大部分的光敏电阻会受到前历现象的 影响，即在前十几秒钟，在同一稳定光强的照射下，阻值会发生变化，所以要 得到稳定的结果，必须要有很长的启动时间。所以这种方法的测量速度太慢， 无法满足检验检疫中快速大批量测试的需要。 s l 反射型光纤传感器由入射光纤和接收光纤组成的一种测量装置。光源发出 的光经由入射光纤射向被测体的表面，接收光纤收集并传送到光探测器转换成 电信号输出。f 9 j 然后可以根据电信号的大小得出光强的大小，进而得到样品的浓 度【1 0 1 。由于光纤传感器感受的光的面积非常小，所以需要连接步进电机扫描装 置，通过带动光纤移动来实现光从背景到测试线的扫描。这就需要引入额外的 驱动电路和后期信号处理电路，增加了系统的集成度和功耗，同时由于步进电 机的震动会引入大量噪声，会影响图像信号，严重地会导致失真。而且也会由 于扫描速度无法提升而减慢采样速度，无法达到快速检测的要求。 利用图像传感器采集图像信号进行分析处理，是免疫层析检测设备中近年 来非常流行的方法。c c d 和c m o s 是现在普遍采用的两种半导体图像传感器， 它们具有很快速的响应时间，很高的采样精度，而且采样时受到的干扰较小， 和面阵两种，而c m o s 只有面阵一种形式。线阵c c d 传感器的成本很低，但是由于采样范围为一条直 线，为了采集图像信息，同样需要引入步迸电机驱动电路，所以也存在噪声干 扰的影响。面阵的c c d 和c m o s 图像传感器可以很方便的快速采集试纸图像， 利用图像处理技术可以除掉生物试纸图像中的毛刺和瑕疵，提高分析系统的稳 定性。【1 2 】但是图像处理操作运算量大，对处理器的要求很高。普通的单片机无 法完成，如果将图像传输到计算机上，利用计算机强大的处理能力来解决，就 会使设备的便携性、易用性受到很大影响，不利于生物试纸定量测量方法的推 广和使用。在便携式定量分析仪中，需要采用主频高，实时性强、运算能力高 的处理器，采用嵌入式系统的设计方案能有效的解决系统需求，设计出稳定快 捷的胶体金试纸定量分析仪。 第五节嵌入式系统设计 i e e e ( 国际电机工程师协会) 对于嵌入式系统的定义是“控制、监视或者 辅助装置、机器和设备运行的装置 ( 原文是d e v i c e su s e dt oc o n t r o l ，m o n i t o r ，o r a s s i s tt h eo p e r a t i o no f e q u i p m e n t m a c h i n e r yo rp l a n t s ) 。这主要是在应用方面加以 定义的，从中可以看出嵌入式系统同时包含软件和硬件方面的内容，还可以同 时包括机械等从属器件。 不过i e e e 的定义不能全面反映出嵌入式系统的内涵，目前一个被业界普遍 认可的规定是：以应用为中心、以计算机技术为基础、软件硬件可裁剪、适应 应用系统对功能、可靠性、成本、体积、功耗严格要求的专用计算机系统。【l 列 相比于p c 系统，嵌入式系统功耗低，体积小，专用性强。其c p u 大多工 作在为特定用户群设计的系统中，能够把p c 中许多由板卡完成的任务即成在芯 片内部，从而有利于嵌入式系统设计趋于小型化。此外，嵌入式系统的硬件和 软件必须高效率地设计，系统要精简，以满足特定的需求，这样，嵌入式系统 的实时性得到了很大提高。1 1 4 j 通过对以上设计方案的对比和分析，本项目决定采用面阵c m o s 作为图像 传感器，来采集试纸图像信息，后期的图像分析处理在嵌入式处理器上完成， 实现嵌入式胶体金试纸定量分析仪的设计。充分利用嵌入式系统功耗低、体积 小、运算能力强的特点，开发出方便快捷的检测系统。 6 的比较，决定采用a r m 9 内核的$ 3 c 2 4 4 0 实时处理器。由于c m o s 图像传感器需要多路驱动脉冲控制， 对驱动时序要求较严格。同时c m o s 输出信号数据量大、输出数率快，采样电 路必须达到相当的采样率，采样时刻的选取也很重要。为了快速正确的采集图 像数据，同时避免占用太多c p u 的运算资源，使处理器更有效的完成图像处理、 控制分析功能。我们引入了c p l d 芯片来辅助完成c m o s 的驱动时序。最终形 成了c m o s + 删+ c p l d 的嵌入式系统设计方案。在以后的章节中我们将就这 种设计方案进行详细解读。 第六节论文结构安排 本文根据国内外出入境工作中面临的快速大规模检验检疫工作的实际需 要，提出了基于免疫胶体金技术和高灵敏度光学检测技术，通过对口腔组织渗 出液等体液代替血液作为检测目标进行免疫学检验，实现对发热病人的非创伤 性现场快速检测的设计思路，并设计了一种嵌入式胶体金层析定量分析仪。 首先对胶体金试纸定量检测技术进行了详细介绍，并研究了国内外利用这 种技术实现的定量分析仪的研发历史和现状。提出了利用图像传感器采集图像， 进行后期图像处理来实现定量分析的方法。结合当前正在快速发展的嵌入式技 术，提出了用嵌入式系统来设计实现定量分析系统的方案。 对嵌入式系统的原理和开发方法作了认真研究，分析了嵌入式系统的体系 架构、开发流程和开发方法。就如何使用嵌入式系统来实现c m o s 成像系统的 问题，提出了a r m + c p l d 的解决方案，后期的图像分析处理主要在a r m 处理 器上完成。独立完成了电路设计、系统移植、时序逻辑实现、驱动程序和应用 程序的编写，并开发出了胶体金层析试纸定量分析仪的样机，成功的应用到了 实际检验工作当中。 本文的内容主要分为六章： 第一章为绪论，介绍胶体金试纸定量检测技术的背景和国内外利用这种技 术实现的定量分析仪的研发历史和现状。提出了利用图像传感器采集图像，进 行后期图像处理来实现定量分析的方法。结合当前正在快速发展的嵌入式技术， 提出了用嵌入式系统来设计实现定量分析系统的方案，采用a r m + c p l d 的设计 思路。 7 的设计部分，包括试纸条、 光学检测系统，c m o s 图像传感器，图像处理算法等，分别进行了详细介绍。 第三章介绍嵌入式系统硬件开发环境建立，主要是硬件部分的体系结构， 并详细介绍了所采用嵌入式处理器$ 3 c 2 4 4 0 ，所采用的c p l d 芯片e p m 2 4 0 ，图 像采集时序、d m a 数据传输时序以及包括触摸屏、显示屏、u s b 、i c 读卡器、 条码扫描仪、打印机在内的各种外设。 第四章介绍了嵌入式系统软件开发环境的建立，包括b o o t l o a d e r 移植、嵌入 式l i n u x 操作系统移植、驱动程序编写以及图形化应用程序q t e m b e d d e d 的设计 方法。并仔细介绍了主要模块驱动程序的设计思路。 第五章介绍开发出来的定量分析仪，并就实验结果进行了分析，验证了设 计的可行性。 第六章总结了自己所做的工作，并就将来需要进行的工作进行了详细介绍。 8 案 胶体金免疫标记技术( g o l di m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ca s s a y ，g i c a ) 是以胶 体金作为示踪标志物应用于抗原抗体反应的一种新型的免疫标记技术，是相继 酶免疫标记、荧光免疫标记、同位素免疫标记三大标记技术之后，迅速发展起 来的新型免疫技术。 其原理是胶体金在还原剂如白磷、抗坏血酸、柠檬酸钠和鞣酸等的作用下， 聚合成特定大小( 3 - 一4 0 n m ) 的金颗粒，并由于静电作用而成为一种稳定的胶体 状态，故称为胶体金。胶体金标记实质上是蛋白等高分子被吸附到胶体金颗粒 表面的包被过程，其吸附机理可能是利用它在碱性条件下带负电荷的性质，与 蛋白质分子的正电荷基团，靠静电吸引而牢固结合，因而金标一抗或二抗具有 较好的稳定性。 胶体金，也被称为胶体纳米金。由于胶体金的粒子尺度在纳米量级，所以 胶体金颗粒具有纳米材料所特有的三大效应：表面效应、小尺寸效应和宏观量 子隧道效应，具有很大的比表面积，独特的光学、导电、导热等物理特性以及 良好的生物相容性。可以与蛋白质、核酸等非共价结合，其标记技术具有简单、 快速、准确和无污染等优点，且检测不依赖昂贵的激光检测仪器，只需普通光 学仪器，甚至肉眼即可辨别。 第一节金标免疫层析试纸结构 胶体金层析检测方法的的主要检测流程如下图所示，主要分为三个步骤， 首先使用检测板采样，然后浸入缓冲液发生抗体抗原反应，然后将采样板放入 定量分析仪中读取结果，所以了解检测板即试纸的结构，对设计定量分析仪非 常重要。 图2 1 样品检测流程 9 方案 金标免疫层析检测技术的基本原理，是借助毛细管虹吸作用，使样品与喷 在玻璃纤维上的胶体金标记物混合在一起在硝酸纤维膜上移动，若样品中含有 抗原( 或抗体) ，与胶体金标记的抗体( 或抗原) 结合，扩散至膜上检测区再 与未标记的抗体( 或抗原) 结合，形成金标抗原抗体复合物，滞留在检测线上 并显色，可得到直观的检测结果。 一个完整的试纸条包括：底板、样品垫、金标结合垫、分析膜、吸收垫五 个部分。其中底板具有承载样品垫，金标结合垫，分析膜和吸收垫的作用，构 成条状的检测外形，易于检测操作的进行。 样品垫置于试纸条的前端，用于进样，控制测试液待测的溶液，可能是全 血，血清，血浆，尿液或唾液的流速，以保证测试液以一个均匀的速度流入金 标结合垫。如果在样品垫中加入一些试剂，即样品垫经过一定处理液处理后， 可以更好地使结合垫上的显色标记物标记过的待测物的受体如抗体或抗原与测 试液中的待测物特异性地结合。 结合垫是胶体金标记过的待测物的受体下文简称胶体金结合物或胶体金标 记物的承载体，测试液经样品垫流经金标结合垫时，胶体金结合物从金标结合 垫上释放下来并与测试液中的待测物特异性结合形成免疫复合物，然后随测试 液一起流向分析膜。 分析膜整个金标免疫层析试纸条中最重要的一部分，因为它是最终结果的 显示区域。膜上一般有两条线，检测线( 简称t 线) 和对照线( 简称c 线) 。t 线上一般包被的是待测物的另一特异性抗体，而c 线上般包被的是金标结合 垫上胶体金标记过的受体的抗体。对照线用于检测此次测试是否有效，如果线 上未观察到颜色即胶体金的颇色红色或紫色，则表示此次测试无效，线上的结 果不可取，无意义如果线上观察到颜色，则根据观察线上的颜色来判定结果。 这种方法称为双抗体夹心法，用于确保检测安全，有效。【1 7 】下图是双抗体夹 心法的工作示意图。 l o 吸收垫一般置于试纸条的末端，用于控制测试液的吸收量，增大流入试纸 条的测试液的量，以冲洗掉膜上游离的胶体金结合物，从而减小背景干扰以提 图2 3 金标免疫层析试纸结构图 个位于 样品垫的加样孔和用于观察测试结果的检测线和对照线。使用的方法如下图所 示 图2 4 实际试纸使用方法示意图 第二节系统设计方案 利用胶体金易于检测的特点，我们开发了基于嵌入式系统的胶体金免疫层 析试纸定量分析仪。主要设计原理是用恒定亮度，指定波长的光源，照射到检 测试纸上，然后利用图像采集设备采集从试纸上反射出来的光。利用图像处理 技术，进行滤波和噪声处理，然后分析数据，得出判读结果。然后通过各种触 摸屏、显示屏、打印机等各种外设显示数据，与外界用户进行交互。 系统主要设计方案如下图所示： 1 2 图2 5 系统设计方案 第三节照明光源 光学检测系统主要包括照明光源、光学镜头和图像采集芯片三个部分。由 于金标试纸定量检测就是让待测样品与是试纸上制定的抗体发生反应，然后通 过图像传感器判读条文颜色的灰度信息来得出溶液浓度的判读结果。当试纸条 上的抗体与样品完全匹配时，反应的试纸条纹颜色比较淡；而抗体与样品不完 全匹配时，反应的试纸条纹颜色比较深。所以试纸上t 线( 检测线) 的灰度值 是检测系统的判别指标。它的提取准确与否直接影响这个定量分析仪设计的可 靠性高下。由于试纸的条纹在不同光源的照射下颜色深浅不一致，所以在检测 系统中光源的选取尤为重要。本系统中光源的选取，要求照明均匀，而且要有 很高的稳定性。可供选择的常见光源主要有热辐射光源、气体放电光源、激光 器、发光二极管等。 发光二极管( 1 i g h te m i t t i n gd i o d e ，l e d ) 是由半导体材料所制成的发光组件， 主要是由p 型及1 1 型半导结合而成，对p n 节加上正向电压，通入极小的电流， 经由电子空穴之结合可将剩余能量以光的形式激发释出，也被称为注入型电致 发光器件。发光二极管发出的荧光属于自发辐射，为非相干光。特别是采用氮 榴石荧光粉 组合在一起，开发出了高亮度的白光二极管。图像测量系统中采用发光二极管 做光源有许多优点： ( 1 ) 工作电压低，耗电少，使用方便：冷阴极荧光灯光源可能需要高达2 0 伏的电源或负电源。便携式设备的电池不易提供此类电压，而需要使用高压或 负压变压器。白色二极管需4 1 伏的2 0 毫安电源，与冷阴极荧光灯相比，此 类电源更易于获取且效率更高。 ( 2 ) 使用寿命长、成本低：采用热辐射发光的光源，有灯丝发光易烧、热 沉积、光衰减等缺点。而采用l e d 光源体积小、重量轻，环氧树脂封装，可承 受高强度机械冲击和震动，不易破碎，平均寿命达1 0 万小时。 ( 3 ) 光源稳定：多个二极管光源组成面光源或线光源，通过工作电流的调 节可使光源保持很高的稳定性。而且长时间使用温度不会升高，免除了热量对 系统参数的影响。 由于以上原因，本系统采用发光二极管作为照明光源。由于光源发光的各 项异性，为了使照射在样品上的光强的空间分布均匀，本系统将多个发光二极 管串连，摆成环形。整个照明系统的结构如下图所示： 图2 6 照明系统结构图 光学镜头的作用是将反射回来的光汇聚的焦点设在图像采集设备上，从而 形成清晰的图像。 1 4 计方案 择 图像采集器件是光电成像系统的核心，成像质量的高低对后期数据分析处 理是否成功影响很大。现在可以选用的图像采集设备种类很多，每一种都有自 己独特的优势和适用范围。所以选择一款合适的设备非常关键，下面结合试纸 图像的特点，分析一下设备选择的关键因素： 1 ) 由于需要用软件的图像处理去分析处理数据，所以需要图像有很大的分 辨率。这样才能有足够多的数据点进行处理，便于去除试纸的不均匀性、 噪声、背景等影响，提高算法准确性。 2 ) 由于是从图像得出样品数据信息，所以对图像准确性要求很高。要求图 像采集器件要有很高的采样精度，而且受噪声干扰小。 3 ) 为了快速得出判读结果，对采样时间提出了很高要求。要求采样时间短， 数据传输速度快。 4 ) 为了使定量分析仪外形设计考虑，要求图像采集设备具有体积小，功耗 低的特点。 从光电管、光电倍增管，到以半导体为材料的固态摄像器件，光电成像系 统的类型经历了一系列的变化和发展。早期的光电管分为真空光电管和充气光 电管两种，真空光电管( 又称电子光电管) 由封装于真空管内的光电阴极和阳 极构成。当入射光线穿过光窗照到光阴极上时，由于外光电效应，光电子就从 极层内发射至真空。在电场的作用下，光电子在极间作加速运动，最后被高电 位的阳极接收，在阳极电路内就可测出光电流。充气光电管( 又称离子光电管) 由封装于充气管内的光阴极和阳极构成。它不同于真空光电管的是，光电子在 电场作用下向阳极运动时与管中气体原子碰撞而发生电离现象。由电离产生的 电子和光电子一起都被阳极接收，正离子却反向运动被阴极接收。因此在阳极 电路内形成数倍于真空光电管的光电流。但是，光电管灵敏度低、体积大、易 破损，已逐渐被固体光电器件所代替。 固态光电器件的功能是把光学图像转换为电信号，即把入射到传感器光敏 面上按时间分布的光强信息，转换为按时序串行输出的电信号一视频信号，而 视频信号能再现入射的光辐射图像。主要包括c c d 和c m o s 两种。 c c d ( 电荷耦合器件) 的工作原理是基于内光电效应在光敏面阵上产生信 号电荷包，通过时序控制电极电位形成势阱变化完成电荷包转移，由此自扫描 第二章金标免疫层析定量分析系统设计方案 过程在输出端获得视频电信号，一般都是模拟信号，需要经过后期放大、去噪 和模数转换等，转换为稳定的数字信号。 c m o s ( c o m p l e m e n t a r ym e t a lo x i d es e m i c o n d u c t o r , 互补金属氧化物半导 体) 图像传感器是在c c d 基础上发展而来，工作原理和c c d 类似，都是利用 光电二极管产生电信号，主要的差异体现在数据传输方式上。在c m o s 传感器 中，由每个像素都会邻接一个放大器和a d 转换电路，用类似内存电路的方法 将数据输出。而造成这种差异的原因在于：c c d 的特殊工艺可以保证数据在传 送不失真