（农业生物环境与能源工程专业论文）复合菌系降解木质纤维素特性及其菌群动态.pdf

研究生学位论文独创声明和使用授权书 i 摘要 化石燃料的储量有限性以及过度利用化石燃料所造成严重的温室效应，迫使人类寻求化 石燃料的替代品。生物质能源由于兼具能源和环境效益受到了高度认可。木质纤维素是生物 质的主要组成成分，同时也是生物质利用的瓶颈。如何高效的实现木质纤维素的水解酸化一 直是困扰生物法利用生物质资源的难题，为了提高木质纤维素的降解效率，不同领域的研究 学者已经做了大量的科研工作，近年来随着环境生物技术的发展，微生物的协同作用逐渐受 到重视，利用复合菌系进行木质纤维素降解成为研究的热点。本论文的主要研究内容和研究 结果如下： 系统地研究了一组木质纤维素降解复合菌系的形态特征、生长特性及生态条件。通过显 微观察发现，复合菌系主要由杆菌组成，普遍周生鞭毛，胞外分泌粘液，表面形貌多样。在 降解过程中复合菌系对氧的需求量较低，反应体系的 do 值的波动范围很小，始终维持在 0.070.25 mg/l范围内。体系的ph值呈现出先降低后上升的趋势，表明复合菌系对发酵产物 的反馈抑制有较强的缓冲能力。 对复合菌系的发酵特性进行了较为详细的探讨，其对木质纤维素的降解表现出较强的能 力，即在 216 h 内稻草降解了 75 %，纤维素降解了 81 %，半纤维素降解了 92 %，木质素降 解了 46 %，并且前 60 h 为高效降解阶段，期间对稻草、纤维素、半纤维素和木质素的降解 量分别占总降解量的 59.0 %、48.5 %、86.8 %、44.0 %。而从复合菌系的发酵类型分析，其 属于典型的乙酸型发酵，90%以上的代谢产物是乙酸，其次是少量的乙醇、丁酸和丙酸。发 酵 108 h 后，乙酸浓度达到最大值 2.58 g/l，此时总挥发酸也达到最大值 2.90 g/l，该发酵类 型为下游两相厌氧消化的产甲烷相的稳定、高效运行提供重要物质基础。发酵体系的 cod 值呈现出先增加后降低的总体趋势，说明了底物由固态的木质纤维素转变为液态的挥发酸， 再转变为气态的 co2和 h2的过程。总凯氏氮和氨态氮的变化趋势表明，复合菌系的活性在 降解后期降低的原因不是氨态氮的累积而是营养的耗尽。 复合菌系的生长规律表明，其整个生长发酵过程划分为三个时期，即 0108 h 的对数生 长期、108144 h 的稳定期、144216 h 的衰亡期。并利用变形梯度凝胶电泳（即 dgge）对 复合菌系的菌群组成及动态进行了探讨， 结果表明， 该复合菌系主要由 14 个微生物种群组成； 随着发酵降解的逐渐进行，复合菌系的菌群出现了一定的波动。dgge指纹图谱的聚类分析 显示， 整个降解过程可以划分为三个阶段： 012 h为降解初期， 24120 h为降解中期， 144216 h 为降解末期，与生长曲线大致吻合。 在降解初期微生物菌群之间竞争激烈，其中，proteolyticum ethanoligenes strain gw、 uncultured acidobacteria bacterium clone rdm3- b02、uncultured bacillus sp. clone 126、 aneurinibacillus danicus gene 等种群数量相对较多， 由于这些好氧菌的生长速率相对较快，引 起反应体系的 do 值和 ph 的迅速下降，从而为复合体系内微好氧菌群的生长发酵提供了适 宜的条件。随着发酵的进行，这些种群的活性逐渐地受到抑制，从而转入休眠状态。 降解中期是稻草水解的主要阶段，数量较多的微生物种群主要有 clostridium sp. pml14、 东北农业大学硕士学位论文 ii clostridium islandicum strain ak1、 brevibacillus borstelensis clone us12、 ureibacillus sp. a3.03、 uncultured bacterium tbr1- 10、bacillus sp. r- 30914、brevibacillus borstelensis strain u404。这 些微生物都属于内生芽孢的革兰氏阳性菌，对温度和 ph 值变化的适应性强，可以产生胞外 水解酶。 其中 uncultured bacterium tbr1- 10、 bacillus sp. r- 30914、 brevibacillus borstelensis strain u404、 clostridium islandicum strain ak1 是功能微生物， 多种微生物的协同作用可以解除木质 素降解过程中产生的有毒物质对降解的抑制，这是复合菌系高效降解木质纤维素的重要原因 之一。 进入降解末期后，随着底物营养的逐渐耗尽，内源性呼吸作用加强，从而导致部分功能 菌群数量减少，如 clostridium islandicum strain ak1、brevibacillus borstelensis clone us12、 ureibacillus sp. a3.03、uncultured bacterium tbr1- 10、bacillus sp. r- 30914；部分菌群数量出现 了相反的趋势，即在降解后期数量表现明显增加的迹象，逐渐成为优势菌，如：bacillales bacterium 01qdx、uncultured bacilli bacterium clone shbz1189和 aneurinibacillus danicus； 而一些菌群在整个发酵过程中始终保持相对较高的数量，如：clostridium sp. pml14、 brevibacillus borstelensis strain u404。 关键词：木质纤维素 复合菌系 降解特性 菌群动态 abstract iii characteristics and flora development of a microbial community for degradation of lignocellulose abstract as reserves of fossil fuels are limited and greenhouse effect caused by excessive use of fossil fuels is getting serious, the human are forced to seek alternatives to fossil fuels. biomass energy is highly recognized as a result of both energy and environmental benefits. lignocellulose is the main component of biomass and also the bottleneck for the usage of biomass. thus, how to achieve efficient hydrolysis and acidification of lignocellulose has been a difficult problem for the usage of biomass resources. with the development of environmental biotechnology, microbial synergy gradually is taken seriously, and the application of microbial community in lignocellulose degradation has become a hot research. the main contributions to the current understanding of this topic are described below: growth characteristics, morphological characteristics and ecological conditions of the microbial community were studied respectively. microscopic observation reveals that the microbial community is mainly composed of rod- shape bacteria. those bacteria are mostly peritrichous flagellation with extracellular mucus layer, and their surface morphologies are diverse. the microbial community demands low oxygen, and do was kept in 0.070.25 mg/l during degradation. the ph shows a trend of increase after initial decrease, which demonstrates the strong buffer capacity of the microbial community for the feedback inhibition of fermentation product. fermentation characteristics of microbial community were explored in detail and showed stronger capacity of lignocellulose degradation. the degradation rate of rice straw, cellulose, hemi cellulose and lignin may reach 75 %, 81 %, 92 %, and 46 % respectively when the fermentation terminated. the initial 60 h play an important role in degradating process, in which the degradation of rice straw, cellulose, hemi cellulose and lignin reached 59.0 %, 48.5 %, 86.8 % and 44.0 % of total degradation amount respectively. the fermentation is typically acetic acid type owing to 90% metabolite is acetic acid, and there are also a little ethanol, butyric acid and propionic acid in fermentative products. at 108 h, acetic acid and total volatile acids concentration reached maximum, they were 2.58 g/l and 2.90 g/l, respectively. the cod value of reactive system shows a trend that it increased at initial stage and decreased graduately. this demonstrates changes of 东北农业大学硕士学位论文 iv substrate from solide lignocellulose to liquid volitail fatty acid, then to gaseous co2 and h2. furthermore, the change of total kjeltic nitrogen (tkn) and ammonia nitrogen show that degradation capacity of microbial community declined owing to mainly depletion of the substrates, but not ammonia accumulation in 144- 216 h. growth curve of the microbial community includes typical three periods, they are logarithmic phase (0108 h), stationary phase (108144 h) and decline phase (144216 h) respectively. community composition and development were investigated by the means of dgge, and results showed that microbial community was constituted of 14 kinds of bacteria and presented fluctuation in some degree with fermention. furthmore, result of c luster analysis of dgge profile was accordant with growth curve, and the degradation process was divided into three stages: initial stage (012 h), intermediate stage (24144 h) and end stage (144216 h). in initial stage, bateria competed fiercely, some bateria amount were dominant, such as proteolyticum ethanoligenes strain gw，uncultured acidobacteria bacterium clone rdm3- b02， uncultured bacillus sp. clone 126 and aneurinibacillus danicus, do and ph of reactive system decreased rapidly owing to these aerobic bacteria s relative faster grow rate, this will provide fitting conditions for grow and fermentation of facultative bacteria. in intermediate stage, these species were gradually being inhibited and transferred to a dormant state. straw degradation occurred mainly in intermediate stage. in this stage clostridium sp. pml14，clostridium islandicum strain ak1，brevibacillus borstelensis clone us12，ureibacillus sp. a3.03，uncultured bacterium tbr1- 10，bacillus sp. r- 30914，brevibacillus borstelensis strain u404 existed in a large amount. these microorganisms are gram- positive bacteria with endogenous spore, which can adapt to changes in temperature and ph value and produce extracellular hydrolase. uncultured bacterium tbr1- 10、bacillus sp. r- 30914、brevibacillus borstelensis strain u 404、 clostridium islandicum strain ak1 performed as functional species group. synergy of microbial community can also lift inhibition produced by toxic substances of the lignin degradation. this is one of the important reasons for the effective degradation of lignocellulose. after entering end stage, with gradual depletion of the nutrients in substrate, part of functional species group declined as a result of endogenous respiration, such as clostridium islandicum strain ak1、brevibacillus borstelensis clone us12、ureibacillus sp. a3.03、uncultured bacterium tbr1- 10、bacillus sp. r- 30914；part of species shows the contary trend,and gradually develop into dominant species group, such as bacillales bacterium 01qdx、uncultured bacilli bacterium clone shbz1189 and aneurinibacillus danicus；while some species have always been to maintain a relatively high number, such as clostridium sp. pml14 and brevibacillus borstelensis strain u404。 keywords: lignocellulose; microbial communiry; characteristics of degradation; flora development candidate: liu shuang speciality: agricultural biological environmental and energy engineering supervisor: prof. li wenzhe 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独 创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名： 日期： 年 月 日 引 言 1 1 引言 进入到 21 世纪， 地球环境问题， 特别是二氧化碳排放所造成的全球化温室效应愈发严重， 只要人们继续消费化石燃料，大气中的二氧化碳气体的积累就得不到缓解。同时，化石燃料 的储量有限也是不争的事实。虽然通过勘探和发现新油田以及依靠科学技术的进步使得石油 采收率提高，可以延缓石油枯竭的速度，但是现在确实已经到了开始摆脱依赖于化石燃料的 时代了，抑制二氧化碳排放的一项有力的对策是使用可再生能源来替代化石燃料，利用生物 质资源生产燃料和化学产品的生物转化技术正被人们普遍接受和高度认可（日本能源协会， 2007） 。 能源短缺问题已经成为全世界各国普遍关注的问题。 美国于 2002 年提出了生物质技术路 线图，计划到 2010 年生物质产品由目前占产品总量的 5 %增加到 12 %，燃料酒精由占运输 燃料总量的 0.5 %提高到 4 %；欧盟委员会提出到2020 年运输燃料的 20 %将用生物柴油和燃 料乙醇等生物燃料替代；日本制订了“阳光计划” ；印度制订了“绿色能源工程计划” （石元 春，2005） 。我国石油资源匮乏，石油安全问题日益突出，必须找出一条保障能源安全的根本 途径和替代方法；同时，大气污染形势严峻，酸雨、温室效应等与使用化石燃料有紧密关联 的环境问题日益突出。我国又是生物质资源的大国和富国，大量的草本植物、淀粉、纤维素、 木质素、农林畜产品废弃物、食品加工废弃物、餐饮废弃物和城市生活垃圾等生物质资源都 可以利用（刘广青，郑万里，乔艳云等，2003） 。发展工业生物技术，并以此取代传统的石化 产业，才是改善环境、源头治理的根本出路。使用可再生的生物质和生物能源已经被我国列 为“十一五”规划的战略目标和重点发展方向。 木质纤维素是生物质的主要成分，也是地球上最丰富的可再生资源，其生成量每年高达 51010 t，且这些生物质能通过光合作用年复一年再生，永不枯竭，且无额外 co2排放，因 此，木质纤维素的转化对解决能源问题、缓解环境污染具有重要的现实意义（陈洪章， 2008） 。 1.1 木质纤维素的组成和结构 木质纤维素由纤维素、半纤维素和木质素的混合物组成，三者通过特定的方式结合在一 起形成稳定的复杂结构（glazer a n，nikaido h，2002） 。 1.1.1 纤维素 纤维素是地球上含量最多的有机化合物，一个纤维素聚合物是由成千上万葡萄糖分子通 过 - 1,4 糖苷键连接而成的直链分子，基本重复单位是纤维二糖。纤维素中相邻葡萄糖绕糖 苷键的中心轴旋转 180，因此，最末端的纤维二糖可以出现两种不同的立体化学形式中的 东北农业大学硕士学位论文 2 任一种，纤维素聚合链通过链内氢键形成扁平、带状的稳定结构，其他氢键位于相邻的链间 使它们在很多具有相同极性的平行链中彼此强烈的相互作用，结果形成很长的巨大结晶状聚 合物称为微纤丝。微纤丝（宽 2500 nm）之间连在一起形成更大的纤丝，这些纤丝在薄层中, 组织在一起并形成植物细胞壁不同层的框架结构。纤维素纤丝具有高度有序区（结晶区）和 少序区。迄今为止人们发现固体纤维素存在 5 中结晶变体，即纤维素 i、纤维素 ii、纤维素 iii、纤维素iv和纤维素 v，其中天然纤维素属于 i 型结晶。在一定条件下，大多数纤维素结 晶变体可以相互转化（高振华，邸明伟，2008） 。纤维素不溶于水，具有很大的张力，并且比 其他葡萄糖聚合物（如淀粉）抗降解。水解纤维素可以生成葡萄糖，进而利用其糖平台进行 一系列生物转化，例如生产燃料乙醇、乳酸和作为生产合成树脂和生物高聚物原料的丁二酸 等，因而受到广泛的关注。 1.1.2 半纤维素 半纤维素是由以木糖为主的五碳糖和少数六碳糖组成的杂多糖，含量仅次于纤维素。纤 维素是线状多聚物，在种属间结构变化很小，半纤维素则高度分枝，且一般是非结晶状杂多 糖。半纤维素中糖的残基包括木糖、己糖和糠醛酸，这些残基呗乙酰化或甲基化修饰，半纤 维素的聚合程度低于纤维素（少于200 个糖基） 。 木糖是自然界中仅次于葡萄糖的糖分具有重 要的利用价值，如使用五碳糖酵母转化生产乙醇，或直接水解生产木糖醇等重要的功能性食 品（du c y，sze k c l，koutinas a，2008） 。 1.1.3 木质素 木质素是地球上数量最多的芳香族聚合物，它是由苯丙烷单位随机构成的共聚物。木质 素的直接前体是来自对羟基苯丙烯酸的三种醇松柏醇、芥子醇及香豆醇。根据这三种结 构单元的相对量，木质素可以分为软木木质素、硬木木质素和草木质素。分解后的木质素单 体及其二聚体可转化为有工业意义的化学品，如被誉为香料之王的香草醛，具有较强的抗氧 化、抗菌活性和一定抗肿瘤作用的香草酸，以及阿魏酸、苯酚类物质等（孙 勇，李佐虎， 陈洪章，2005） 。 1.2 微生物降解木质纤维素的国内外研究现状 木质纤维素是光合作用所转化的能量和生物圈中有机物的主要储藏形式，因此自然环境 中广泛存在着具有分解纤维素、半纤维素及木质素能力的微生物（杨晓宸，卢雪梅，黄峰， 2007） 。 引 言 3 1.2.1 微生物对纤维素的降解 在自然界中分布着上百种能降解纤维素的已知微生物，这些生物包括真菌、细菌、放线 菌，如表 1- 1 所示（贾丙志，范运梁，程文静，2008） 。 表 1- 1 降解纤维素的微生物 tab. 1- 1 microorganisms degrading cellulose 所属类别 微生物种类 真菌 绿色木霉、球毛壳、黄白卧孔菌、变色多孔菌、粗皮侧耳、青霉、曲霉、黑曲 霉、米曲霉、海枣曲霉、棘抱曲霉 细菌 假单胞菌属，杆菌属中的芽孢杆菌、枯草杆菌、地衣球菌。 放线菌 诺卡氏菌属、节杆菌、链霉菌属、高温放线菌属、小单胞菌属。 然而尽管很多微生物能生长在纤维素上，并产生可降解不定形纤维素的酶，但很少有微 生物能产生体外降解结晶状纤维素的胞外纤维酶。研究的最广泛的产生纤维素分解酶的微生 物是真菌中的木霉以及细菌中的纤维单胞菌（cellulomonas, 一种好氧菌）和热纤梭菌 （clostridium thermocellum, 一种厌氧菌） 。 1.2.1.1 真菌对纤维素的降解 里氏木霉的纤维素分解系统是丝状真菌中的典型系统， 里氏木霉产生三种纤维素分解酶， 即内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和 - 葡萄糖苷酶，它们在纤维素分解过程中共同作用，内 切葡聚糖酶是水解纤维素纤丝的无序区域中的内部化学键，这种方式产生的末端再被县委二 糖水解酶作用，释放出纤维二糖。在水解过程中，纤维二糖水解酶破坏纤维素纤丝中结晶区 域的链与链之间的相互作用，最后，纤维二糖被 - 葡萄糖苷酶水解为葡萄糖（图 1- 1） 。 1.2.1.2 细菌对纤维素的降解 在好氧和厌氧细菌中广泛存在降解结晶纤维素的能力。细菌要么以可溶性胞外酶的形式 分泌纤维素酶，要么将它们组装成一个大复合体，成为纤维素酶体（cellulosome） ，并把它 附着在细菌细胞表面（bayer e a, lamed r, himmel m e, 2007） 。由不同细菌如土壤细菌粪肥 纤维单胞菌（clostridium fimi）产生的胞外内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶与里氏木霉产生的 酶有相同的结构特征。 研究最清楚的纤维素酶体是有嗜热的厌氧菌热纤梭菌（clostridium thermocellum） 产生的，由 418 个多肽组成，分子质量约为 2106 da。这种纤维素酶体包含多个内切葡聚 糖酶、外切葡聚糖酶及木聚糖酶，热纤梭菌的葡聚糖酶缺乏纤维素结合区域。这种纤维素酶 体还包括不具酶活的多肽，此多肽的功能仅在构成纤维素酶体或帮助将酶附着在细胞表面上 及纤维素上，这种功能让细菌在自然界中与其他生物争夺纤维素降解物中的可溶产物时具有 东北农业大学硕士学位论文 4 竞争优势。纤维素酶体是能够降解纤维素的高活性酶系统，它降解结晶纤维的活性比降解无 定形纤维素的更高。在细菌对数生长期，主要发现纤维素酶体附着在细胞表面当细胞进入稳 定期，这种复合物大量被释放到发酵液中去。图 1- 2 描绘了细胞结合纤维素酶体的一种模型。 内切葡聚糖酶（如里氏木霉eg i和eg ii）攻击无定 形区的糖苷键。由于氧化酶作用可能形成纤维素片段 纤维素 在晶体区的非还原端，纤维素二糖还原酶（如 里氏木霉cbh i和cbh ii）对其进行攻击 纤维糊精+纤维二糖 纤维糊精 - 葡糖苷霉 葡萄糖 纤维糊精 内切葡聚糖或纤维二糖水解酶 纤维素 纤维二糖 - 葡糖苷霉 葡萄糖 纤维二糖 纤维二糖氧化酶/脱氢酶 纤维二糖酸内酯 内酯酶 纤维素二糖酸 葡萄糖 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸内酯 内酯酶 葡糖酸 图 1- 1 真菌降解纤维素的一种推测机制 fig. 1- 1 an speculation of mechanism of fungal degradation of cellulose cipa的纤维素结合区 cipa纤维素酶体整合蛋白 纤维素链 催化区 c i p a 的介导受体 s- 层 肽聚糖 细胞膜 图 1- 2 与细胞结合的纤维素酶体结构模型 fig. 1- 2 organization of cellulosome attaching with cell 引 言 5 1.2.2 微生物对半纤维素的降解 对半纤维素降解的研究大部分集中在木聚糖，由于木聚糖在木质纤维素中含量很高，将 这种大分子经济有效地转化为小分子需要切实可行的发酵方法。木聚糖的结构很复杂，其完 全生物降解需要多种酶共同完成，从不同环境中分离的细菌和真菌都含有多种木聚糖酶。表 1- 2 列出了常见的能将木聚糖降解的微生物。 表 1- 2 降解木聚糖的细菌和真菌 tab. 1- 2 bacteria and fungi degrading xylanase 所属类别 微生物种类 产物 细菌 热纤梭菌（clostridium thermocellum） 乙醇，乙酸，乳酸 热硫化氢梭菌（c. thermohydrosulfuricum） 乙醇 热解糖梭菌（c. thermosaccharolyticum） 乙醇 产乙醇热厌氧杆菌（thermoanaerobacter ethanolicus） 乙醇，乙酸，乳酸 布氏热厌氧杆菌（thermoanaerobium brockii） 乙醇，乙酸，乳酸 乙酰乙基热厌氧杆菌（thermobacteroides acetoethylicus） 乙醇，乙酸，乳酸 真菌 粗糙链孢霉（neurospora crassa） 乙醇 具柄毕赤氏酵母（pichia stipitis） 乙醇 1.2.3 微生物对木质素的降解 自然界中木质纤维素降解微生物分布非常广泛，而具有木质素降解能力的主要是真菌、 部分放线菌和细菌，真菌中朽木菌对木质素的降解效果明显，部分放线菌和其他一些细菌也 参与木质素降解过程，可溶解或降解木质素或其相关化合物。降解木质素的微生物如表 1- 3 所示。 朽木菌是自然界中降解木材的主要作用者， 它分泌胞外酶降解木材细胞壁中的多聚成分， 根据形态不同朽木菌可分为白腐菌、褐腐菌和软腐菌。白腐菌因在木材上引起木材的白色腐 朽而得名，可分泌胞外酶，形成自由基攻击木质素结构使其降解，是木腐微生物中降解木质 素最彻底的微生物。褐腐菌也具有一定降解木质素能力。软腐菌由于其只能部分作用于木质 素或修饰木质素结构， 因而不能完全降解木质素。 白腐菌中的黄孢原毛平革菌 （phanerochaete chrysosporium）由于其适应性强，酶系产生稳定，且具有深度脱木质素能力，在有关机制研 究中被广为采用，经过诱变筛分出的过氧化物酶缺陷株，作为模式菌株开展的研究获得了突 破性结果。目前大部分研究者把白腐菌作为一种预处理手段，以降低木质素的含量，使纤维 素暴露出来，为下一步的酶处理或者其他微生物对纤维素的降解创造条件（邓海波，林 鹿， 黄伟韩，2008） 。美国北卡罗来纳州立大学的 shi等人利用黄孢原毛平革菌对棉花秸秆进行了 东北农业大学硕士学位论文 6 固态发酵预处理（shi j, chinn m s, sharma r r, et al, 2008） ，经过 14 天的发酵获得了 27.6 % 的木质素降解率、71.1 %的固体回收率和 41.6 %糖产率。作为原核生物的细菌，其细胞结构 相对简单，细胞尺寸相对较小，可以穿透木质纤维素等不溶底物。菌体与底物之间结合相对 紧密，便于胞外酶对底物的作用。然而，已发现的具有降解木质素能力的细菌仅能够将木质 素降解为低分子量的聚合木质素片断，增强木质素的溶解性。 表 1- 3 降解木质素的微生物 tab. 1- 3 microorganisms degrading lignin 所属类别 微生物种类 白腐菌 黄孢原毛平革菌（phanerochaete chrysosporim） 杂色木云芝（coriolus versicolor） 粪生黑蛋巢菌（cyathus stereoreus） 多年层孔菌（fomes annosus） 木灵芝（ganoderma ostrale） 贝壳状革菌（panus conchatus） 糙皮侧耳菌（pleurotus ostreatus） 射脉齿菌（phlebia radiata） 褐腐菌 拟管革裥菌（lenzites trabea） 细菌 节杆菌（arthrobacter sp.） 小单孢菌（micromonospora sp.） 小双孢菌（microbispora sp.） 诺卡氏菌（nocardia sp.） 红球菌（rhodococcus sp.） 链霉菌（streptomyces sp.） 高温单孢菌（thermomonspora mesophila） 微生物降解木质素的过程是一种非特异的氧化过程， 主要依靠微生物产生的胞外酶进行。 已发现的木质素降解酶主要有木质素过氧化物酶（lip ec1.11.1.7） 、锰过氧化物酶（mnp ec 1.11.1.7）和漆酶（laccase ec 1.10.3.2） 。lip 和 mnp 都是血红素糖蛋白，需要在过氧化氢存 在条件下进行木质素降解。laccase 是含铜酚氧化酶，不需要过氧化氢的存在，而是以分子 氧作为氧化剂，将木质素酚型结构氧化为酚氧游离基。黄孢原毛平革菌降解木质素的过程如 图 1- 3 所示。 越来越多的研究结果证实， 木质素酶类对木质素的降解是与小分子非酶物质协同完成的， kirk 提出了共底物的概念，揭示了木腐微生物在降解木质素过程中需要葡萄糖、纤维素等糖 类与木质素共同作为其生长底物。因此，一些氧化分解糖类的酶，通过催化糖类底物的反应 间接促进木质素的降解。 引 言 7 木质素 木质素过氧化酶和mn2+- 过氧化物酶及这些 酶产生的活性中间体催化降解木质纤维素 单，双和低聚木素 与木质素降解相同机理的进一步降解 c1,c2,c3片段单木质素环裂解产物芳香酸和醛醌 氢醌 被真菌吸收后这些片段经中心代谢途径降解 二氧化碳和水 醌还原酶 图 1- 3 黄孢原毛平革菌降解木质素的主要步骤 fig. 1- 3 major steps of phanerochaete chrysosporium degrading lignin 1.3 混合菌协同降解木质纤维素的国内外研究现状 由于木质纤维素三组分交联在一起，形成了类似于钢筋混凝土的结构及纤维素分子的高 结晶度，使得木质纤维素很难被单一微生物所降解，自然状态下彻底降解木质纤维素要依赖 于纤维素分解菌、半纤维素分解菌及木质素分解菌等多种微生物的共同作用，与单一微生物 相比，混合菌群中微生物间的协同作用关系，使系统产酶具有多样性，而且可较快和较彻底 的解除产物的反馈抑制，调节培养液的 ph，从而可提高木质纤维素的转化率。近藤道雄在微 生物生态学的研究也表明，微生物多样性可以保证微生态系统的稳定性（michio k, 2003 纤 维素应充分注重多种微生物之间的协同效应。 最近，分解木质纤维素混合菌的筛选逐渐成为研究热点。arora 等考察了 7 种真菌单独 或混合降解麦秆中木质素的情况。黄孢原毛平革菌（phanerochaete chrysosporium）单独效果 最好。在不同种类白腐菌的组合中（白腐菌+白腐菌、白腐菌+褐腐菌和白腐菌+软腐菌） ，木 质素的降解得到了一定程度的加强，其中褐腐菌（deadalea flavida）和黄孢原毛平革菌的组 合最佳，可以达到 36.27 %的降解效果（arora d s，1995） 东北农业大学硕士学位论文 8 stepanova 对三株白腐菌（coriolus hirsutus、coriolus zonatus、cerrena maxima）和两株 丝状真菌（mycelia sterilia inbi2- 26、trichoderma reesei 6/16）在以燕麦秸秆为基础的液态和 固态培养基上进行了单独和混合的培养研究。所有菌株都可以在添加了粉碎后的燕麦秸秆为 碳源的琼脂培养基上良好生长。里氏木霉对所研究的其它担子菌的生长起很强的抑制作用。 从纤维素、半纤维素、木质素的降解可以看出，混合培养有较优的效果（stepanova e v , koroleva o v , vasilehenko l g, et al, 2003） 。 baldrian 等发现混合培养能提高漆酶活性。菌与菌之间的相互作用可以提高酶活。土壤 的浸提液也可以起到相似的作用。在添加了土壤真菌、细菌和酵母后，变色栓菌（trametes versicolor）和平菇（pleurotus ostreatus）的漆酶酶活相比于未添加时有显著提高。哈茨木霉 （trichoderma harzianum）的添加使变色栓菌的产漆酶能力提高了 40 倍。使用经过加热或过 滤除菌的微生物培养物以及土壤或土壤浸提液不能诱导混合培养产漆酶， 添加了哈茨木霉后， 所测试的 24 株白腐菌中有 16 株产生的漆酶得到了提高，而本身不产漆酶或产漆酶能力很低 的白腐菌在添加了哈茨木霉也不能获得漆酶产酶的改善。指出漆酶的增加是混合培养中菌株 相互作用的一个普遍反映（baldrian p, 2004） 。 卢月霞等从森林落叶土、腐烂的秸秆和农家堆肥中筛选出 4 株能较好降解纤维素的菌株, 初步判断为 3 株细菌，1 株放线菌。混合培养表明，在一定程度上提高了纤维素酶活，菌株 组合 d6/d7 的酶活72 h达 67.12 u，相当于其单独培养时的 2 倍（卢月霞，吕志伟，袁红莉 等，2008） 。 宋颖琦等在自然环境和秸秆降解物中筛选出 3 种分解纤维素能力较强的木霉、青霉和曲 霉，将 3 种菌株以不同的组合形式进行产酶特性和对玉米秸秆粉中粗纤维的利用率的研究， 试验结果表明，木霉与青霉的混合培养在纤维素筛选培养基上培养 24，h 后即可生长，在发 酵培养基中培养 72 h后达到产酶高峰，酶活可达 3.116 u，对粗纤维的利用率为 68，%，远 超过青霉和木霉的单独培养（宋颖琦，刘睿倩，杨 谦等，2002） 。 上述方法虽然获得较好的木质纤维素降解效果，但群落往往过于简单，难以维持功能的 稳定性。崔宗均、王伟东等创造性的利用了自然条件下微生物之间的协同关系，通过限制性 培养和微生物间的优化组合获得了稳定高效分解木质纤维素的复合菌系，表现出了强大的纤 维素分解能力（崔宗均，李美丹，朴哲等，2002；王伟东，王小芬，李玉花等，2004；王伟 东，崔宗均，牛俊玲等，2007） 。高效分解木质纤维素复合菌系的成功构建，为加速天然木质 纤维素资源的利用研究开辟了新的道路，也引发了国内筛选木质纤维素复合菌系的热潮。 罗辉等通过自然筛选的方法，获得两组具有高效转化纤维素为甲烷的复合菌系 h- 11 和 cbc，在不经过预处理和灭菌的情况下，都能利用富含纤维素的废弃物。并且将 h- 11 复合菌 系作为沼气发酵的刺激因子，发现在 70 d（平均气温 30 ）的发酵周期内体系产气量提高 了 3.72 %；发酵终止前 50 d（平均气温 20 ）产气量提高了 111.4 %，在保证农村户用沼气 池中一定量原料的情况下， 以复合菌系作为菌剂进行了投池试验， 结果表明低温 （15 - 3 13 ）条件下能明显提高农村户用沼气池的产气量（罗辉，2008） 。 宋亚彬等利用限制性培养技术，从沼液中筛选出 1 组木质纤维素降解复合菌系。采用木 质纤维素失重法，对复合菌系的培养条件进行研究。单因素试验结果表明，稻秆经碱液浸泡 后降解率最高，最佳氮源为“蛋白胨+酵母浸粉+硝酸铵”的复合氮源。采用五因素二次通用 引 言 9 旋转组合设计进行培养条件的优化组合试验及分析，建立了碳源添加量、氮源添加量、ph、 温度、接种量与秸秆降解率间的数学模型，确定在最佳的碳、氮源添加量和培养条件下，稻 秆的降解率可达到 64.98 %（宋亚彬，戚桂娜，邓 伟等，2008） 。 崔诗法等从腐烂的枯枝落叶中分离到一组分解能力较强的纤维素分解复合菌系 st- 13， 该 复合菌系由平板可分离的细菌和难培养细菌组成。 5 d内可使滤纸完全崩溃，液体培养到 14 d 时能够分解玉米秸秆中 85.27 %的纤维素，总失重率为 58.03 %。通过正交优化试验，确定该 复合菌系的产酶最佳条件为：2 %微晶纤维素，1.5 % nano3，初始 ph 为 7.0，温度 32 ； 摇床培养 48 h时其 cmcase为 0.455 iu/ml（崔诗法，廖银章，黎云祥等，2009） 。 1.4 dgge 技术在木质纤维素生物降解研究中的应用 分子生物学技术的发展大大促进了微生态学的研究，导致了微生物分子生态学的产生。 微生物分子生态学方法弥补了传统的微生物生态学方法的不足，使人们可以避开传统的分离 培养过程而直接探讨自然界中微生物的种群结构及其与环境的关系 （张洪勋， 陈 曦， 2007） 。 当前常用的分子生物学方法主要有变形梯度凝胶电泳(dg