（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥cbf3等位基因atcrap2的克隆及抗寒功能研究.pdf

首都帅范人学顾l 论文 拟南芥c b f 3 等位基因a t c r a p 2 的克隆及抗寒功能研究 摘要 低温是影响农作物产量的主要限制因子之一。本实验室以拟南芥3 2 个核心生态型 为试材，在研究拟南芥岱基因的单核苷酸多态性( s n p ) 过程中，发现抗寒生态型 2 0 3 a v 的c b p 3 t , 等位基因的单倍性( h a p l o t y p e ) 与拟南芥的抗寒性密切相关。本试验就 以拟南芥2 0 3 a v 生态型为材料，克隆了c b p 3 等位基因，对其进行了结构分析，并进一 步进行了功能研究。主要结果如下： i 、克隆了基因a t c r a p 2 ( i ) 4 1 5 9 2 3 ) ，由1 0 9 4 对碱基组成，推测编码了含有1 5 0 个 氨基酸残基的多肽。a t c r a p 2 - 与c o l u m b i a 生态型1 8 6 a v 的c b f 3 基因相比，其一碱基发生 突变，导致终止密码子提前1 9 8 b p ，从而使这基因翻译的蛋白少了6 6 个氨基酸，致使 这个基因的转录调控区域缺失一部分。 2 、以c b f 3 为对照，利用表达载体p g r e e n 0 0 2 9 和组成性启动子c a m v 3 5 s 启动子构建 a t c r a p 2 的植物表达载体，经酶切验证正确后，采用农杆菌花粉浸蘸的方法把它们转 化到拟南c o l u m b i a 生态型1 8 6 a v 中。抗生素筛选和p c r 检测证明得到转基因植株。对转 基因植株后代进行卡那霉素抗性筛选等遗传分析，在t 2 代获得单位点插入的转基因纯 系植株，并收获t t 3 代种子。 3 与野生型相比，转a t c r a p 2 基因拟南芥植株表型无明显变化；而转伍弼基因拟 南芥出现明显的表型变化，主要有生长迟滞、鲜重减少、植株矮化等。在直接观察中 发现，4 叶期时转爿f 俐p 瑾因拟南芥植株的根长为3 7 0 c m ，野生型的根长为3 7 5 c m ， 均明显长于转嬲船基因的拟南芥植株的2 7 5 c m ；1 2 叶期，称量转彳f 伽4 p 瑾因拟南芥 植株三棵的总重量为0 2 6 9 ，野生型的为0 2 7 9 ，明显重于转晒彤基因的拟南芥植株的 0 1 3 9 ；转彳嬲e 但馑因拟南芥植株的开花时间与野生型的接近，而转彩巧基因拟商芥 则滞后1 2 天左右。进一步利用微分干涉显微镜观察了转基因植株叶片下表皮细胞的大 小，转a t c r a 只2 基因拟南芥植株叶片的下表皮细胞与野生型叶片的无明显差异；而转 饧冈基因拟南芥植株叶片的下表皮细胞明显小于野生型和转a t c r a 只2 基因拟南芥植株 的下表皮细胞。 4 对转基因拟南芥进行抗冻性检测，无论低温驯化与否，一6 处理4 小时后， 转爿f 俐戌基因植株的相对外渗电导率为4 9 1 4 ，明显低于野生型的6 6 _ + 2 3 。一6 处理6 d , 时后i 转爿f 倒只2 基因植株的成活率为9 4 ，明显高于野生型的1 7 ；而与转c b f 3 基因的拟南芥植株相比，转月t 倒尸2 基因植株的成活率无显著差异。 首都师范大学硕i 论文拟南芥c b f 3 等位堆wa t c r a p 2 的克隆及抗寒功能研究 5 采用r t p c r 方法，检测了对照和转基因拟南芥中曦因在4o c 处理过程中的 表达量变化，随着冷胁迫的时间延长罐因的表达量在不断增加，且c o m a 因在转 彳f 翻臌因的拟南芥中的表达量大于对照，丽与转嬲彤基因植株相比没有明显区别。 关键词：a t c r a p 2 ；转基因；抗寒性；r t p c r 首都师范人学硕士论文拟南芥c b f 3 等位摹圳a t c r a p 2 的克隆及抗寒功能研究 a b s t r a c t l o wt e m p e r a t u r ei so n eo ft h es i g n i f i c a n tl i m i t i n gf a c t o r st h a ta f f e c t c r o p so u t p u t i no u rl a b ，w i t h3 2c o r ea c c e s s i o n so f $ r a b i d o p s i sa s s o c i a t i o n a n a l y s i so f c b f 3s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ( s n p ) s h o w e dt h a tt h e h a p l o t y p eo f2 0 3 a va c c e s s i o n sc b f 3a l l e l ew a sr e l a t e dt oc o l d r e s i s t a n c e i nt h i sp a p e r ，t h e 鳓a l l e l ew a sa m p l i f i e df r o m2 0 3 a va c c e s s i o n ；t h e s t r u c t u r eo ft h ec b f 3a l l e l ew a sa n a l y z e d a n di t sf u n c t i o n sw e r ea l s os t u d i e d o u re x p e r i m e n t a lr e s u l t sw e r es h o w na sf o l l o w i n g ： 1 彳北凇( d q 4 1 5 9 2 3 ) w a sa m p l i f i e dw h i c hh a s1 0 9 4 b pa n de n c o d e1 5 0a m i n oa c i d s t h e r ei so n es i t em u t a t i o ne x i s t i n gi na t c r a p 2 , w h i c hc a u s e st e r m i n a lc o d e a h c a do f1 9 8 b pc o m p a r e dw i t hc b f 3 斌1 8 6 a va c c e s s i o n c o m p a r e dw i t hc b f 3 e n c o d i n gp r o t e i n a t c 融p 2e n c o d i n gp r o t e i nl a c k sc - t e r m i n a l6 6a m i n oa c i d s 2 t w ov e c t o r sh a r b o r i n ga t c r a p 2a n dc b f 3g e n er e s p e c t i v e l yd r i v e nb yc a m v ( c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s ) 3 5 sp r o m o t e r t h et w oc o n s t r u c t sw e r et r a n s f o r m e d i n t oa r a b i d o p s i sc l o m b i aa c c e s s i o n1 8 6 a v t r a n s g e n i cp l a n t sw e r eo b t a i n e d b yp c ra n a l y s i sa n dk a n a m y c i ns c r e e n i n g ，t 3s e e d so ft h r e eh o m o z y g o u sl i n e s f o re a c h k i n do ft r a n s g e n i cp l a n t sw e r eu s e di nt h i ss t u d y 3 t h e r ew a sn op h e n o t y p ed i f f e r e n c eb e t w e e na t c r a p 2t r a n s g e n i cp l a n t sa n d w i l d t y p ea r a b i d o p s i s h o w e v e r 。c b f 3 - o v e r e x p r e s s i o np l a n t sd i s p l a y e d s t r o n g l yp h e n o t y p i ca l t e r a t i o n s ，i n c l u d i n gs t u n t e dp l a n t s ，r e d u c e dw e i g h t a n dg r o w t hr e t a r d a t i o n w h e np l a n t sh a df o u rl e a v e s ，t h ea v e r a g er o o tl e n g t h o f 月比咒 咨t r a n s g e n i cp l a n t sw a s3 7 0 c m a n dt h a to fw il d t y p ep l a n t sw a s 3 7 5 c m ，w h il et h a to f 册o v e r e x p r e s s i o np l a n t sw a so n l y2 7 5 c m ，w h i c hw a s m u c hs h o r t e rt h a nt h ef o r e n a m e do n e s c o m p a r i n gp l a n tf r e s hw e i g h tb e t w e e n t h ew i l d - t y p ep l a n t sa n dt r a n s g e n i ca r a b i d o p s i sa t1 2 一l e a fs t a g e ，t h ef r e s h w e i g h to fc b f 3 - o v e r e x p r e s s i o np l a n t s ( 0 1 3 9 ) w a sa b o u t5 0 o ft h a to f 彳f 口m 刀 t r a n s g e n i cp l a n t s ( 0 2 6 9 ) o rw i l dt y p ep l a n t s ( 0 2 7 9 ) m o r e o v e r ，t h ef l o r e - s c e n c eo f 爿t 倒f 訾t r a n s g e n i cp l a n t ss i m i l a rt ow i l d t y p ep l a n t sw a s1 2d a y s 首都师范大学硕i 论文 拟南芥c b f 3 等位肇冈a t c r a p 2 的克隆及抗寒功能研究 e a r l i e rt h a n t h a to fc b f 3 - o v e r e x p r e s s i o np l a n t s u s i n gd i f f e r e n t i a l i n t e r f e r e n c ec o n t r a s tm i c r o s c o p ea s s a y ，i tw a sf o u n dt h a tt h e r ew a so n d i f f e r e n c ef o rt h ev o l u m eo ft h ee p i d e r m a lc e l lb e t w e e na t c r a p 2t r a n s g e n i c p l a n t sa n dw i i d t y p ep l a n t s ：b u tt h ee p i d e r m a lc e l lo fc b f 3 - o v e r e x p r e s s i o n p l a n t sw a sm u c hs m a l l e tt h a nt h a to fa t c r a p 2t r a n s g e n i cp l a n t so rw i l d t y p e p l a n t s 4 u s i n gt h ee l e c t r o l y t el e a k a g ea n a l y s i s ，f r e e z i n gt o l e r a n c ew a sm e a s u r e d w i t ht r a n s g e n i ca n dt h ew il d - t y p ea r a b i d o p s i s i tw a sf o u n dt h a tt r e a t e d f o r4h o u r sa t 一6 t h ep e r c e n t a g eo fe l e c t r o l y t el e a k a g eo ft h ew i l d t y p e w a s6 6 _ 2 3 ，a n dt h a to fa t c r a p 2 t r a n s g e n i cp l a n t sw a s4 9 - - + 1 4 a f t e rt r e a t e d f o r6h o u r sa t 6 c ，t h es u r v i v i n gp e r c e n t a g eo fa t c r a p 2t r a n s g e n i cp l a n t s w a s9 4 b u tt h a to fw i l d t y p ep l a n t sw a so n l y1 7 i n t e r e s t i n g l y ，t h e s u r v i v i n gp e r c e n t a g eo fc b f 3 - o v e r e x p r e s s i o np l a n t sw a ss i m i l a rt ot h a to f t h ea t c r a p 2t r a n s g e n i cp l a n t s 5 d u r i n g4 t r e a t m e n t ，t h et r a n s c r i p t l e v e l so fc o rg e n e si na t c r a p 2 t r a n s g e n i c p l a n t sw e r eh i g h e rt h a n t h o s eo fw i l d t y p ep l a n t sw i t h s e m i q u a n t i t yr t p c ra n a l y s i s h o w e v e r ，t h et r a n s c r i p tl e v e l so fc o rg e n e s i na t c r a p 2t r a n s g e n i cp l a n t sw e r es i m i l a rt ot h a to fc b f 3 - o v e r e x p r e s s i o n p l a n t s t h e s er e s u l t s f u r t h e rs u g g e s tt h a ta t c r a p 2 9 e n em a yb eu s e f u lf o rc o l d t o l e r a n t t r a n s g e n i ce n g i n e e r i n g k e yw o r d s ： a t c p l ，4 p 2 ：t r a n s g e n i cp l a n t ；f r e e z i n gt o l e r a n c e ：r t p c r 首都师范大学硕上论文拟南芥c b f 3 等位基因a t c i 叫p 2 的克隆及抗寒功能研究 缩略词 英文缩写英文名称 a b a a b s c i s i ca c i d a b a a b a 司e r i c i e n t a b ia b a i n s e n s i t i v e a b fa b r e - b i n d i n df a c t o r a b r e a b a - r e s p o n s i v ee l e m e n t a p 2a p e i a ia 2 b p b a s ep a i r b z l p b a s i c - r e g i o nl e u c i n e z i p p e r c a m v c a u l i 丑o w e rm o s a i cv i r u s c b f c - r e p a a t - b i n d i n gf a e t o r c o r c o l d - r e s p o n s i v e c m h e x a d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i n mb r o m i d e c r t c - r e p e a t d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d r e d e h y d r a t i o n r e s p o n s i v ee l e m e n t d r e b d r e - b i n d i n gp r o t e i n e be t h 甜i n mb r o m i d e e d l a e t h y l e n ed i a m i n et c t r a a c e t i ca c i d e r e e a r l yr e s p o n s i v ee l e m e n t e r f e t h y l e n et e s p o n me l e m e n tb i n d i n gf a c t o r e r e b p e t h y l e n er e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n k a n k a n a m y c i ns u f f a t e l bl u r i a - b e r t a n im e d i a l r r e l o w - t e m p a m t u r e r e s p o n s i v ee l e m e n t m s m u r a s h i g e s a l tm i x t u r e o d o p t i c a ld e n s i t y p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r d r e s p o n s i v et od e h y d r a t i o n r n a r i b o n u c l e i ca c i d r p m r o u d e r sp e rm i n u t e s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e s 仃 s e n s i t i v i t yt of r e e z i n g s n p s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m 首都师范大学硕上论文拟南芥c b f 3 等位摹因a t c r a p 2 的克降及抗寒功能研究 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以 明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：剐、仲 日期珈阼6 月fl = t 首都师范大学位论文授权使用声明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位 论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用 于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容 编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文 在解密后适用本规定。 学位论文作者签名：暑4 僻7 日期2 ，叫军6 月f 日 首都师范大学硕l j 论文拟南芥c b f 3 等位基闪a t c r a p 2 的克降发抗寒功能研究 第一章文献综述 1 1 植物在低温胁迫下的伤害机制 1 1 1 低温驯化 低温是一个重要的环境因子，它在很大程度上影响了植物的生长、发展、生存及分布。 在长期的自然进化过程中植物创造出了一系列抵御逆境的方法，温带植物在秋末冬初感受 逐渐下降的外界温度，体内发生一系列生理生化变化，产生适应性反应，提高对冬季低温 的抵抗能力，这个过程被称作低温驯化( c o l da c c l i m a t i o n ) ( l e v i t te ta 1 ，1 9 8 0 ) 。对 于植物的这种冷驯化机制，科学家们作了很多研究，上世纪8 0 年代就已产生了许多关于冷 驯化的观点。包括：耐寒性提高是由多基因控制；植物细胞及组织的冷损伤是由于冰的形 成而使细胞脱水造成；细胞膜系统是冰冻损伤的主要位点等( t h o m a s h o we ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 目前在低温驯化研究领域中的关键问题是要搞清楚究竟是什么基因在植物低温驯化 过程中起到了关键的作用? 这些基因如何起作用? 植物是如何感受到温度的变化并进一 步激活了低温驯化的反应? 日益增加的证据表明，植物抗寒的生理生化变化是通过改变基 因表达而引发的，而且己经克隆了许多相关的基因( h u g h e se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。通过转基因 方法验证其中一部分基因确实可以改变植物体内生理生化反应，提高植物的抗寒能力。 1 1 2 低温引起的细胞伤害 1 1 2 1 膜伤害 植物遭受低温伤害时，生物膜首先发生膜脂的物相变化，从柔曲的层状液晶态变为坚 硬的凝胶相，膜脂上的脂肪酸链从无序排列变为有序排列，膜上产生龟裂而使膜的通透性 增大以及膜结合酶结构改变，导致植物细胞生理代谢变化和功能的紊乱。 自由基积累与膜伤害有密切关系，过剩的自由基引发或加剧膜脂的过氧化作用，膜脂 过氧化的中伺产物自由基和最终产物丙二醛都会严重损伤生物膜，这种损伤主要是由膜中 蛋白质的聚合和交联以及膜中类脂的变化。另外，丙二醛与蛋白质结合会引起膜蛋白的变r 性。因此，膜脂过氧化也是导致膜脂流动性降低和脂膜通透性增大的重要原因。 1 1 2 2 酶系统破坏 1 首都师范人学硕士论文 拟南芥c b f 3 等位肇周a t c r a p 2 的克隆硬抗寒功能研究 在细胞中都存在着冷敏感酶，它们在引起冷害的临界温度下往往会发生结构、功能或 数量的变化。其中一种变化是如酶复合体解聚，植物光合过程中的关键酶丙酮酸磷酸双激 酶在低温条件下由四聚体变为二聚体；另一种变化是酶构象的变化，如核酮糖1 ，5 二磷酸 羧化酶，在低温条件下发生构象改变，使其内疏水基团外露，导致酶功能丧失。引起上述 两种变化的根本原因是由于低温使维系酶分子三维结构的疏水键束缚力减弱，从而破坏酶 蛋白的三维结构。 1 1 2 3 细胞骨架破坏 细胞骨架是真核细胞中普遍存在的蛋白纤维网架体系，植物中主要是指微管和微丝。 大量研究表明，细胞骨架不仅在维持细胞形态，保持细胞内部结构的有序性中起重要作用， 而且与细胞运动、能量转换、信息传递、细胞分裂、基因表达及细胞分化等生命活动都密 切相关。现代研究表明，低温直接毁坏了细胞骨架，使细胞质基质结构紊乱，进而破坏细 胞的代谢系统及其中物质的运输。 1 2 植物对低温胁迫的反应 植物细胞膜在感受外界低温信号时，细胞膜的流动性发生改变，同时伴随着细胞骨架 的重排。它们通过流向胞质的钙流将体外的低温物理信号转化为体内的生化信号。大量的 研究已证明将c a “流与下游信号分子偶联起来的物质是钙调蛋白( c a m ) 和激酶 如钙依赖性 蛋白激酶( c d p k ) 。促分裂原活化蛋白激酶( m a p k ) 级联路径中三个关键激酶 ，它们可能通过 将蛋白质磷酸化和去磷酸化的方式传递信号，但其具体机制现在还不是很清楚。最初一直 认为植物在低温条件下许多基因的诱导表达只与a b a ( 脱落酸) 活性有关。但是在a b a 基因缺 失突变体( a b a - d i f i c i e n t ，a b a ) 或a 队敏感型突变体( a b h - r e s p o n s i v e ，a b i ) 中，许多 基因在干旱或低温条件下还是被诱导( t h o m a s h o we ta 1 ，1 9 9 9 ) ，这表明除了依赖于a b a 的信号途径外，还存在不依赖于a b a 信号的转导途径。 1 2 1 c a 细胞内转导低温信号的第二信使 己有许多证据说明，植物在低温驯化时，c a 2 + 是低温信号传递过程中重要的第二信使 ( k n i g h te ta 1 ，1 9 9 6 ；m o n r o ye ta 1 ，1 9 9 3 ) 。细胞内游离c a ”离子浓度的增加是c a 2 + 充 当第二信使的内在基础。当植物受到低温刺激时，细胞内的c a 2 + 水平出现短暂迅速的提高 ( k n i g h te ta 1 ，1 9 9 1 ：b u s he ta 1 ，1 9 9 5 ) 。目前发现，低温引起细胞内c a ”离子浓度 2 首鄙帅范人学顾i j 论文拟南芥c b f 3 等位堆阏a t c p 叫p 2 的克降发抗寒功能研究 短暂增加是诱发抗寒性植物拟南芥和冬小麦冷适应基因表达和抗冻性提高所必需的 ( k u r k e l aa n db o r g f r a n c ke ta 1 ，1 9 9 2 ) 。但低温是如何激活c a 2 + 通道引起胞质中c a 2 + 浓 度上升的，这一直是冷信号转导研究的关键问题之一。最近发现低温首先使膜的流动性减 弱( o r v a re ta 1 ，2 0 0 0 ) ，这种减弱信息可通过细胞骨架( 如肌动蛋白) 传递给c a 2 + 通道， 刺激质膜上c a “通道打开，使胞# b c a 2 + 进入胞内，引起胞内c a 2 + 上升。但一些植物细胞在低 温下升高的c a 2 + 不是来自于胞外，而是来自于胞内的c a 2 + 贮器，因此，它们在低温下细胞内 c a 2 + 浓度的上升可能与质膜c a 2 + 通道打开的机制有所不同。对此，k r a t s c h 和w i s e 提出了他 们的观点( k r a t s c ha n dw i s ee ta 1 ，2 0 0 0 ) ，认为叶绿体对低温非常敏感，低温能改变 叶绿体内p s l l 的还原状态，使其产生高水平的活性氧( r o s ) ，随后r o s 激活内质网、液泡和 线粒体等c a 2 + 贮器，促进其贮藏的c 矿释放到细胞质中。 1 2 2 冷信号转导中的蛋白质磷酸化和去磷酸化反应 有关c 8 2 + 流如何转导冷信号并诱导冷响应基因表达的研究也取得了一定进展。这很可 能涉及了蛋白质的磷酸化和去磷酸化反应：( 1 ) 用冈田酸( o k a d a i ca c i d ，蛋白磷酸激酶2 a 的阻止剂) 处理可使拟南芥c o r l 5 a 基因在常温下转录量增加，而用星形抱素 ( s t a u o s p o r i n e ，蛋白激酶的阻止荆) 处理，c o r l 5 a 即使在低温下的表达量也低于正常水平 ( m o n r o ye ta 1 ，1 9 9 8 ) ：( 2 ) 蛋白磷酸激酶2 a 在低温下活性的下降依赖于细胞内c a “浓度 的上升，c a “依赖型蛋白激酶在低温下的激活依赖于细胞内c a 2 + 浓度的升高，超表达此酶的 转基因植株，抗冷性增强( m a r t i na n db u s c o n ie ta 1 ，2 0 0 1 ) ：( 3 ) 抑制蛋白磷酸激酶活 性的温度阈值、提高蛋白过磷酸化的温度阐值和诱导细胞c a 2 + 浓度上升的低温阐值相吻 合( m o n r o ye ta 1 ，1 9 9 8 ) 1 2 3 a b a 在低温信号传导中的作用 低温胁迫下，植物内源a b a 含量显著增加。在非驯化条件下，用a b a 处理的植株抗冻性 增加；拟南芥的a b a 合成缺失突变体a b a l 在低温驯化期间会受到伤害，但当加入外源a b a 时， 这种缺陷可以弥补( 吴楚和王政权，2 0 0 0 ) 。低温对质膜的损伤是造成植物冻害的主要机 制，a b a 提高原生质体抗冻力的原因之一是低温条件下原生质膜的稳定性和原生质体活力 有所提高。陈靠山和周燮( 1 9 9 5 ) 的工作表明，a b a 对线粒体膜结合n a + 一k + a t p a s e 活性和 线粒体吸氧速率有明显的促进作用，可降低线粒体的膜相变温度，提高植物在低温胁迫下 膜的稳定性。a r o c a 等( 2 0 0 3 ) 研究a b a 在玉米抗寒性中的作用的结果表明，叶片由于低温 首都师范大学硕士论文 拟南芥c b f 3 等位基斟a t c r a p 2 的克隆发抗寒功能研究 和长时间冷暴露会导致a b a 含量增加，经a b a 处理的植株则能通过降低叶的热传导和增加根 流而预防水分缺失。r y y r i n e n ( 1 9 9 8 ) 研究a b a 对冷害所致的银桦( s i l v e r b i r c h ) 玻璃化 茎尖的恢复生长作用，在培养基中加入4 一l o m o l l - 1 a b a ，玻璃化茎尖的恢复率可超过4 0 。 他们的工作还显示，a b a 可在低温和短日照下起作用，能增强植物的冷驯化作用和促进冷 害所导致的愈伤组织的形成，由于冷驯化和愈伤组织的形成均是植物适应低温胁迫的途 径，因而可以认为a b a 对两者的促进作用可以提高植物抗低温胁迫的能力。 1 3 低温驯化植物的生理生化变化 分布于温带地区的植物，在温暖季节对冰冻的抗性相当弱。但是，随着季节的变化，气 温的逐渐降低，植物对冰冻的抗性也逐渐增强。例如，未经低温驯化的黑麦在一5 下就会被 冻死。而经过一段时间的低温驯化的黑麦则能抵抗一3 0 c 的低温。这就说明在低温驯化期间， 植物采取了一些保护措旌以抵抗冰冻胁迫。大量的研究表明，植物细胞内生物膜系统是冰 冻伤害的初始位置，而植物细胞内膜系统的伤害主要是由严重的冰冻脱水引起的。维持膜 系统的低温稳定性是植物采取的主要防御措施。 1 3 1 基因表达与膜的低温稳定性 在低温驯化期间，除了膜脂组成成分发生许多变化以维持膜的稳定性之外，同时低温 还诱导许多基因的表达而维持膜的稳定性。膜脂组成成分的变化需要许多酶的参与，其中 最重要的是各种去饱和酶。这些去饱和酶的生物合成也是低温诱导相关基因表达的结果， 然后它们把双键引入膜脂的脂肪酰基链中( m u r a t ae ta 1 ，1 9 9 5 ) 。例如，拟南芥菜中的f a d 7 基因编码一种叶绿体。一3 脂肪酸去饱和酶，它在转基因烟草中表达能增加抗寒性( k o d a m a - e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。拟南芥菜的突变体f a d 2 、f a d 5 和f a d 6 因减少了聚不饱和脂肪酸的数量而变 得对冷害敏感( h u g l ye ta 1 ，1 9 9 2 ；m i q u e le ta 1 ，1 9 9 3 ) 。在此我们不讨论这些编码 去饱和酶的基因，只讨论一些编码在冰冻条件下能维持膜稳定性的多肽的基因。虽然这些 基因编码的多肽的氨基酸的序列不尽相同，但它们中的绝大多数具有共同的特性 ( t h o m a s h o we ta 1 ，1 9 9 9 ) 。c o r i s a 基因编码一种1 5 k d 的多肽，这种多肽导向于叶绿体( l i n e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。这种多肽加工后成为一种9 4 k d 的多肽( 被称为c o r l 5 绷) ，主要由一个含 1 3 个氨基酸的序列组成。这个序列不完全重复4 次。包含重复序列的区域可能形成两亲性 螺旋。这种多肽含有大量的a l a 、l y s 、g l u 和a s p ，这几种氨基酸占这种多肽所有氨基酸 4 首古| f 帅范人学硕士论文拟南芥c b f 3 等位基因a t c r a p 2 的克隆及抗寒功能研究 的6 4 。它缺乏p r o 、m e t 、t r p 、c y s 、a r g 、g l n 和h i s 。c o r l 5 a 在转基因植物中组成表达后， 转基因植物中含c o r l 5 a 的叶绿体比野生型植物中不含c o r i s a 的叶绿体更具耐冻性。c o r i s a 的作用并不局限于叶绿体。比较未经驯化的转基因植物和野生型植物，在一4 一8 c 的范围 内，含c o r l 5 a 的原生质体比不含c o r l 5 a 的原生质体更具耐冻性。c o r l 5 a 的表达不仅能增加 转基因植物的耐冻性，而且荧光素二乙酸染色实验表明c o r l 5 a 的表达能增加原生质膜的低 温稳定性( a r t u se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。由于c o r l 5 a 的表达只在一4 一8 的范围内增加原生质体 的存活率，因此c o r l 5 a 的表达只是阻止了hi i 相位的形成，而对膨胀引起的伤害的影响很 少或无影响。此外，c o r l 5 a 还对干旱和a b a 作出反应( t h o m a s h o we ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 c o r l 5 a 影响膜稳定性的机理仍不甚清楚。既然h 相位的形成主要发生在原生质膜与 各种内膜的双分子层之间，c o r i s a 又定位于叶绿体，因此c o r l 5 a 可能直接作用于叶绿体被 膜而增加原生质膜的稳定性。c o r l 5 a 是如何减少冰冻引起的hi i 相位的形成而影响膜稳定 性的呢? 对此，s t e p o n k u s 等( 1 9 9 8 ) 提出了一个假设：c o r l 5 a 改变叶绿体内膜的固有弯曲而 延缓冰冻引起的hi i 相位的形成。这个假设部分基于这样一个事实：c o r l 5 a 中的两亲性a 螺旋对单分子层的固有弯曲具有很大的影响，从而影响了单分子层形成hi i 相位的趋势 ( e p a n de ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 c o r 4 7 基因编码一种亲水性的多肽，是脱水素中的成员( g il m o u re ta 1 ，1 9 9 2 ) 。c o r 7 8 和c o r 6 6 所编码的多肽也是亲水性的( h o r v a t he ta 1 ，1 9 9 3 ) 。其h b a b a 能诱导c o r 7 8 的表 达，其表达物( c o r 7 8 蛋白质) 的数量较低温诱导表达所产生的表达物少( m o n t y l ae ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。由于c o r 7 8 蛋白质确实与冰冻耐性有关，因此编码这种蛋白质的c o r 7 8 基因也具有 耐冻作用。尽管拟南芥菜中c o r l 5 a 的表达能增加叶绿体和原生质体的耐冻性，但它的影响 很小。c o r l 5 a 的单独表达只能使叶绿体的耐冻性提高l 2 1 2 ，使原生质体的耐冻性提高约 1 ( a r t u se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。因此拟南芥菜中其它c o r 基因表达的协同作用更有利于大大地 提高耐冻性。 拟南芥菜中所有的c o r 基因的表达都伴随着转录激活因子c b f i 的超表达( s t o c k i n g e r e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。c b f l 只是一个小型基因家族中的一个成员。该家族编码3 个紧密相连的转 录激活因子。c o r 基因的表达涉及一个信号级联放大，c b f 基因的表达是其中较早的一步 ( g i l m o u re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。c b f l 编码一种含有a p 2 区域的转录激活因子，而这种激活因子 又能结合到c r t d r e 上。c r t d r e 是一种d n a 调节元素，能刺激转录而对低温和水分缺乏作 出反应。c r t d r t 存在于c o r l 5 a 、c o r 7 8 、c o r 6 6 和c o r 4 7 等基因的启动子上，因而成为c o r 基因表达的调节物。c b f l 的组成超表达不需要低温刺激就能诱导上述受c r t d r e 控制的c o r 5 首都师范大学颈十论文拟南芥c b f 3 等位基凼a t c r 4 p 2 的克隆及抗寒功能研究 基因的表达而提高耐冻性( j a g l oo t t o s e ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。这种c o r 基因的协同作用比c o r l 5 a 单独表达的作用强。c o r l 5 a 单独表达并不能使拟南芥菜的耐冻性显著地提高，而这些基因 的c r t o r e 调节子和c b f l 的超表达可使拟南芥菜的耐冻性提高3 3 。这些c o r 基因的表达 能起到稳定原生质膜的作用。l i u 等( 1 9 9 8 ) 的结果表u 蝈c r t d r e 调节子的表达不仅提高了 耐冻性，也提高了耐旱性，因此c o r 基因的基本作用就是防止细胞免遭脱水伤害。 1 3 2 抗氧化酶 超氧化歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、过氧化物酶( p o d ) 、抗坏血酸过氧化物酶 ( a p x ) 、谷胱甘肽还原酶( g r ) 等抗氧化酶和抗坏血酸、谷胱甘肽、细胞色素f 、铁氧还蛋白、 甘露糖醇、类胡萝h 素和d 一生育酚等抗氧化剂，构成了植物的抗氧化系统，保护植物免 受活性氧的伤害。s o d 作为植物抗氧化系统的第一道防线，清除细胞中多余的超氧阴离子 自由基，有关s o d 与植物耐冷性的文献很多。 h 2 0 2 水平升高是冷害下氧化胁迫的标志。它一方面可引起脂质过氧化，对膜造成伤害， 另一方面可引起光合系统各种酶的失活。h 2 0 2 也可与超氧自由基经h a r b e r w e i s s 反应生成 羟自由基，对细胞进一步伤害。氧化胁追过程中，c a t 对维持体内氧化还原平衡是必不可 少的。转c a t 反义m r n a 的番茄植株中，c a t 活性受到抑制，对氧化胁迫的敏感性增加，证实 c a t 在番茄的抗氧化胁迫系统中起作用。 1 4 植物转录因子的结构和功能 转录因子，又称反式作用因子，是一类能与真核生物基因启动予区域中的顺式作用元 件发生特异性相互作用的d n a 结合蛋白，通过它们之间及其他相关蛋白之间的相互作用， 激活或抑制转录。从蛋白质结构分析，转录因子一般含有4 个功能区，b p d n a 结合域，转 录调控域( 包括激活和抑制域) ，寡聚化位点以及核定位信号。但是不同的转录因子可能缺 少某一结构域，如转录调控域或特异的d n a 结合域。转录因子通过这些功能区域，在特定 的时间进入细胞核内与启动子顺式作用元件或与其他转录因子的功能区域相互作用来调 控基因的转录表达。 1 4 1 d n a 结合域 d n a 结合域是指转录因子识别顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸序列，相同类型 6 首都师范人学硕i j 论文拟南芥c b f 3 等位基岗a t c r a p 2 的克隆成抗寒功能研究 的转录因子d n a 结合域氨基酸序列较为保守。植物转录因子中比较典型的d n a 结合域有 b z i p ( 碱性亮氨酸拉链) 结构域、锌指结构域、 1 a d s 结构域、m y c ( 碱性螺旋一环一螺旋) 结构 域、 1 1 ，b 结构域、h e m e o 结构域、a p 2 e r e b p 结构域、w r k y 结构域等。转录因子d n a 结合域 的特定氨基酸序列决定它们与顺式作用元件识别及结合的特异性。 1 4 2 转录调控域 同一家族转录因子的主要区别在于它们的转录调控结构域各不相同，转录调控结构域 包括转录激活域( t r a n s c r i p t i o na c t i v a t i o nd o m a i n ) 和转录抑制域( t r a n s c r i p t i o n r e p r e s s i o nd o m a i n ) 两种，它们决定转录因子功能的差异。近年来，对转录激活域进行了 广泛深入的研究，对转录抑制区的研究相对较少。 典型的植物转录激活域是与d n a 结合域分开的，一般由3 0 1 0 0 个氨基酸组成，该结构 域常见有4 种特征：富含酸性氨基酸，富含脯氨酸，富含谷氨酰胺和富含丝氨酸苏氨酸。 有的转录因子可同时具有几个激活结构域。这些结构域可能是转录因子与其他蛋白质接触 作用的区域。 1 4 3 核定位信号 核定位信号( n l s ) 是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的核定位区域，转录因子进 入细胞核的过程受该区域的调控。不同转录因子的核定位信号序列、所处的位置、数量有 所不同。有些转录因子进入细胞核的过程是通过1 个至数个核定位信号区进行，而没有n l s 区的转录因子则靠与具有n l s 区的转录因子相互作用进入细胞核它与d n a 结合区也是各 自发挥作用的。 1 4 4 寡聚化位点 寡聚化