（应用化学专业论文）铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及重组干酪乳杆菌的构建.pdf

摘要 铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆及 重组干酪乳杆菌的构建 作者简介：章轶锋，男，1 9 7 4 年8 月生，师从成都理工大学唐善虎教授， 2 0 0 8 年6 月毕业于成都理工大学应用化学专业，获得工学硕士学位。 摘要 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，e c1 1 5 1 1 ，简称s o d ) 是一种广泛 存在于动物、植物、微生物中的金属酶，按金属辅基的不同可分为c u z n s o d ， m n s o d ，f e s o d 和n i s o d 。铜锌超氧化物歧化酶( c u z n s o d ) 是一种重要的 氧自由基清除剂，在体内自由基的产生与消除的动态平衡中起关键作用，主要催 化超氧化物阴离子自由基发生歧化反应，生成氧和过氧化氢，因而具有防御氧毒 性，增强机体抗辐射损伤能力，还可预防衰老，在一些疾病如肿瘤、炎症及自身 免疫疾病等的治疗中有良好的疗效，因此研究开发c u z n s o d 倍受人们的重视。 然而，目前c u z n s o d 大多是从天然动植物中提取，来源受到很大的限制，基因 克隆和表达方面的研究报道相对较少。 干酪乳杆菌是公认为安全的食品级微生物，但由于不含s o d ，导致其对氧 的耐受性较差，在有氧条件下生长较厌氧及微氧条件差，从而限制了其在工业中 的应用。若以干酪乳杆菌作为表达c u z n s o d 基因的受体菌株，可以集乳酸菌的 益生功能和c u z n s o d 蛋白的生物学特性于一体，有望开发出新一代功能性食品 及微生态制剂，干酪乳杆菌工程菌本身及其表达产物可直接应用于食品工业、医 药工业和保健业等领域，有着巨大的应用前景和潜在的商业价值。 本研究利用基因工程方法，构建大肠杆菌c u z n s o d 目的基因的表达重组 子，将其电转化至干酪乳杆菌，并对重组菌进行初步检测鉴定，为进一步研究 c u z n s o d 的表达对干酪乳杆菌生物学特性的影响、开发可直接食用型s o d 产 品或微生态制剂奠定基础。研究内容主要分为两个部分： 层c d 矗c u z n s o d 基因的克隆：根据g e n b a n k 中发表的s d d c 基因序列， 利用p f i m e rp r i m e r5 0 软件设计并合成了一对引物p 1 ( 5 g t gg a g c t a c g g a g g t c c t a t g a a a c g - 3 ) 、p 2 ( 5 c a g 鱼鱼! t a c a g c g g a t 丌g c g a c a 3 ) ；通过优化的p c r 反应条件，从ec d z im g l 6 5 5 的基因组d n a 中扩增 出长6 8 5 b p 的s 耐c 基因片段；通过t 4d n a 连接酶将其连接到克隆载体p m d l 8 t 成都理l ：人学硕十学位论文 中，构建重组质粒p t 吓以c ，再将其转化至大肠杆菌d h 5 a 中；然后提取质粒并 进行酶切、p c r 鉴定和序列测定。结果表明成功地克隆了e c d 厅c u z n s o d 基因 片段。 暖c d f fc u z n s o d 基因重组干酪乳杆菌的构建：利用软件设计并合成了一 对引物p f ( 5 c t gt c t a g aa t g a a a c g t l l t a g t c t g g c 3 ) 、p r ( 5 c g c a a g c t ta 盯a a t t a c a c c a c l a g g c a 3 ) ；以p t 哂以c 为模板进行p c r 扩增， 扩增产物克隆至p m d l 8 t 中，构建重组质粒p m d l 8 t 哂谢c ；双酶切后将s 以c 基因的全编码序列克隆至p m g 3 6 e 的劢口i 和砌di i i 之间的多克隆位点上，构 建表达重组子p m g 3 6 e 哂d d c ；然后通过优化的电转化条件( 电压2 5 k v ，电阻 1 0 0 q ，电容2 和f ) ，将p m g 3 6 e 心d d c 转化至干酪乳杆菌l 反c 口s d ，并对重组菌 株进行质粒抽提、p c r 鉴定、酶切鉴定。结果表明成功地构建了重组干酪乳杆 菌。这一技术平台为功能基因通过p m g 3 6 e 载体在干酪乳杆菌中表达而更好的发 挥转基因工程乳酸菌的双重功能开创了一条崭新的道路。 关键词：超氧化物歧化酶乳酸杆菌基因克隆载体构建 i l 成都理丁大学硕士学位论文 c l o n i n go fc o p p e i - - z i n cs u p e r o x i d ed i s m u t a s eg e n ea n d c o n s t r u c t i o no fr e c o m b i n e dv b c t o ri n 血咖易口c 站s ( 石s 西 i i l t r o d u c t i o no ft h ea u t h o r ：z h a n gy i f e n g ，m a l e ，w a sb o mi na u g l l s t ，1 9 7 4 ，w h o s e s u p e i s o rw a sp r o f e s s o r1 h n gs h a n h u h e 伊a d u a t e df 两mc h e n g d uu n i v e r s i t yo f r e c h n o l o g yi na p p l i e dc h e m i s t r ym a j o ra n dw a sg r a n t e dt h em a s t e rd e g r e ei nj u n e ， 2 0 0 8 a b s t r a c t s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) i sam e t a l - c o n t a i n i n ge i 亿y m ew h i c hc a nb ef o u n d a b u n d a n t l yi nm i c r o o 培a n i s m s ，p l 觚t so ra n i m a l s f 0 u rt y p e so fs o d e x i s ta c c o r d i n gt 0 t h ep r e s e n t0 fm e t a lc o f a c t o ra tt h ee n z y m e 拟i v es i t e ：c u z n s o d ，f e - s o d ，m n s o d a n dn i - s o d t h e yc a t a l y s et h ed i s m u t a t i o no fs u p e r o x i d e 卸i o nr a d i c a li n t om o l e c u l 缸 o x y g e na n dh y d r o g e np e r o x i d e 觚dr e l a t e dt ot h ef i l n c t i 咖sf o ra g a i n s to x y g c np o i s o n ， r e s i s t a n c et or a d i a t i o nd a m a g ea n da n t i a 百n g ，a n ds h o w e dc u r ee f ! f e c t si ns o m et u m o r s ， i n n a m m a t o r yd i s e a s e sa n ds e l f - i m m u n i t yd i s e a s e s c u z n s o dh a sb e e ns h o w n t ob e e a e c t i v ef o rt r e a t i n gi n n a m m a t i o n ，r e d u c i n gr e p e r f u s i o ni n j u r i e s ，a n dd e c r e a s i n gb 1 0 0 d p r e s s u r ei na n i m a lm o d e ls y s t e m s u n f o r t u n a t e l y ，t h i se i 亿y m ei sm a i n l ys e p a r a t e d 锄d p u r i f i c a t e df 如mo 唱锄i s mi nn a t u r e ，卸di t st h e r a p e u t i c p o t e n t i a l i sr e s t r i c t e db e c a u s e o fi t sl i m i t e da m o u n t b i o e n 百n e e r i n gt e c h n i q u e sm a ys o l v et h i sp r o b l e m h o w e v e r ， c u 玎e n t l y ，o n l yf e wr e s e a r c l l e sh a v eb e e nr e p o n e dr e l a t e dt oc u z n s o dg e n e ( j 以c ) c 1 0 n i n g 锄de x p r e s s i o n l 口c f d 6 口c f ，胁sc 口s p fi sg r a sb a c t e r i aa n dh a sb e e nu s e di nf o o da n d p h a n n s e u t i c a li n d u s t r i e se x t e n s i v e l y ：h o w e v e r ，t h i sb a c t e r i u ml a c k so fs o da n d c a n n o tb ec u l t u r e di na e r o b i cs y s t e m ，a n di t sa p p l i c a t i o n sa r el i m i t e di ni n d u s t r y i f 锄 s o dg e n ei st r a n s f e r r e di n t ot h i sb a c t e r i u m ，i t s o x y g e ns t r e s sc a p a c i t ym a yb e i m p r o v e d t h e r e f o r e ，t h eo b j e c t i v e so ft h i sr e s e a r c hw e r et oc l o n es d d cf m mec d 雎， t oc o n s t n l c tas d d cv e c t o ra n dt ot r a n s f e r e di ti n t ot h e 口c 加1 6 口c f f z “sc 口s e as e r i e so fe x p e r i m e n t sw e r ec o n d u c t e d i nt h ef i r s tp a r to ft h i ss t u d y ；ap a i ro f p r i m e r s ，5 一g t g 鱼q ! a c g g a g g t c ( 了a t g a a a c g - 3 a n d5 - c a g 鱼q 王鱼堑 t a c a g c g g a l f r 丌g c g a c a - 3 ，w a sd e s i g n e dt oa m p l i f ys d d cg e n eb yp c r a c c o r d i n gt ot h ep u b l i s h e ds e q u e n c eo fec d 厅口d cg e n ew i t ht h es o f t w a r eo fp r i m e r p r e m i e f5 0 t h ep c r p r o d u c tw a se l e c t r o p h o r i s e da n di d e n t i f i e da sa5 2 2 b pf t a g m e n t i l i a b s t r a c t 1 1 l l es 耐cg e n ew a sc 1 0 n e di n t ot h ev e c t o rp m d l 8 - te a s ya n dt h er e c o m b i n 卸tw 筋 n a m e da sp m d l 8 h d d ca n dt h e nt r a n s f e h e di n t ot h ee c o l ic o m p e t e n td h 5 a i d e n t i f i c a t i o n sw i t hr e s t r i c t i o ne n z y m e s ，p c ra n ds e q u e n c i n gi n d i c a t e dt h a tt h e 圈口矗c g e n eh a db e e nc l o n e ds u c c e s s f i l l l y i nt h es e c o n do ft h i ss t u d y ；s d d cg e n ew a sf n r t h e ri n s e n e di n t o 勋口ia n dj 锄di i i m u l t i p l ec l o n i n gs i t e so f t h ee x p r e s s i o nv e c t o rp m g 3 6 e t h ep o s i t i v er e c o m b i n a n tw a s t r a n s f e r r e di n t o 叵c d 矗d h 5 a i d e n t i f i e dw i t hc o r r e s p o n d i n gr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e 勋口ia n d 上矗h di i la n dp c rm e t h o ds h o w e dt h a tt h es d d cg e n eh a db e e ni e c o m b i n e d w i t hp m g 3 6 ea sd e s i g n a t e da n dn 锄e da sp m g 3 6 e 咚d d c t h i sr e c o m b i n a i l tv e c t o r w a ss u c c e s s f u l l yt r a n s f e h e di n t ok c 幻蚰记f z m sc 口s 西b ye l e c t r o t r a n s f 6 肌a t i o nu n d e r 2 5 k v ，1 0 0 qa n d2 靴f t h i sr e s e a r c hh a se s t a b l i s h e dah i 曲- t e c h n j q u ep l a t f o m 孤d w i l lc r e a t eab r a n d - n e wa v e n u ef o re x p r e s s i n gv a r i o u sf u n c t i o n a l g e n e s i n ia c t o b a c i l 】u s k e y w o i d s ：s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，l a c t o b a c i l l u s ，g e n ec l o n i n g ，v e c t o rc o n s t m c t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得一成都理王太堂或其他教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 晋嗡 o g 年易月 f 与 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解成都理王太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权盛都理王太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 学位论文作者导师签名 毯年 具，弓日 、j气 第l 章引言 1 1 超氧化物歧化酶 1 1 1s o d 概述 第1 章引言 1 9 3 8 年，m a n n 和k e i l i n 首次从牛红细胞中分离出一种蓝色铜蛋白( 血铜蛋 白，h e m o c u p r e i n ) 。1 9 6 9 年，m c c o r d 和蹦d o v i c h 发现这种从红细胞纯化而来 的含铜蛋白具有清除超氧阴离子自由基( 0 2 一) 的功能，将其命名为超氧化物歧 化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，e c l 1 5 1 1 ，简称s o d ) i 。 s o d 是广泛存在于生物体中的一类金属酶，按金属辅基的不同主要可分为 c u z n s o d ，m n s o d ，f e s o d 和n i s o d 。它通过催化下列反应0 2 一。+ 0 2 一+ + 2 h + h 2 0 2 + 0 2 将生物体内多余的并对细胞破坏力极强的超氧阴离子自由基岐 化产生过氧化氢和氧气，过氧化氢随后被体内的过氧化氢酶( c a t ) 或过氧化物酶 ( p o d ) 分解掉，从而解除0 2 一+ 所造成的氧化胁迫，因此在维持生物体内超氧阴离 子自由基的产生与消除的动态平衡中起着重要作用【2 l 。人们已对它进行了广泛的 研究，它是目前2 0 0 0 多种酶中研究报道最多的一种，也是当今生物学前沿研究 课题之一。对它的研究在自由基生物学方面具有十分重要的作用，受到生物化学 界、医( 药) 学界、化工界的高度重视。在临床应用中，s o d 具有抗衰老、抗辐 射、防治肿瘤、细胞信号传导、治疗心肌缺血与缺血再灌注综合征、治疗自身免 疫性疾病及某些心血管疾病等方面的作用【3 曲j 。此外，s o d 作为保健食品及化妆 品的有效成分也展示出广泛的应用前景。 1 1 2s o d 的理化性质 s o d 是亲水性蛋白质，在水中有较好的溶解性能，在结构己研究得较为清 楚的牛红细胞c u z n s o d 中，有3 1 0 个氨基酸残基，其中3 0 是极性氨基酸， 仅有3 左右的芳香族氨基酸残基，因此决定其具有较好的溶解性能( 李泽浩等， 1 9 8 5 ) 。s o d 又是一种酸性蛋白，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、 p h 以及某些理化性质表现出异常的稳定性，其主要的理化性质见表1 1 。 表1 14 种s o d 的理化性质 成都理：i ：大学硕+ 学位论文 对氰化物和h 2 0 2 的敏感性：所有的c u z n s o d 以及n i s o d 都对氰化物敏 感，lm m o 帆广2 m m 0 1 l 的氰化物浓度即可以使其活性完全丧失，而m n s o d 和 f e s o d 却不被氰化物抑制。长时i 刈用过氧化氢处理可使c u z n s o d ，f e s o d 和 n i s o d 明显失活，而m n s o d 不受影响； 吸收光谱特性：c u z n s o d 具有独特的紫外吸收光谱，由于色氨酸和酪氨酸 的含量较低，它在2 8 0 n m 处并没有最大吸收峰。c u z n s o d 的可见光最大吸收 波长都在6 8 0 姗左右，这反映了酶分子中c u 2 + 的光学特性。 1 1 3c u z n s o d 1 1 3 1c u z n - s o d 的分布 c u z n s o d 呈蓝绿色，分子量大约在3 2 0 0 0 d a 左右。从s o d 的定向进化角 度来说，c u z n s o d 是真核生物酶，主要存在于真核生物的细胞质、植物叶绿体 的基质和过氧化物酶体中，如各种动物血( 主要有猪、牛、羊、马、狗、禽类) 、 牛肝、猪肝、鸡肝、牛心、箭鱼肝( s w o r d i f i s hl i v e r ) 、菠菜叶、豌豆( g r e e np e a ) 、 面包酵母、麦叶、刺梨等生物体内。1 9 7 4 年，p u g e t 和m i c h e l s o n 首次在原核 生物p h o t o b a c t e r i u ml e i o g n a t h i ( 共生发光杆菌) 中发现c u z n s o d 【。此后， 研究人员又陆续从c a u l o b a c t e rc r e s c e n t u s l 8 j ( 新月柄杆菌) 、p s e u d o m o n a s d i m i n u t a ( 缺陷假单胞菌) 、x a n t h o m o n a s ( p s e u d o m o n a s ) m a l t o p h i l i a 【9 j ( 嗜麦 芽假单胞菌) 、b r u c e l l aa b o r t u s 【1 0 l ( 流产布氏杆菌) 、l e g i o n e l l ap n e u m o p h i l a 【1 l 】 ( 嗜肺性军团病杆菌) 以及a c t i n o b a c i l l u sp l e u r o p n e u m o n i a e ( 类胸膜肺炎放线 杆菌) 、n e i s s e r i am e n i n 西t i d e s ( 脑膜炎双球菌) 、p a s t e u r e l l am u l t o c i d a 【1 2 j 等原 核生物中也发现存在有c u z n s o d 。1 9 9 4 年，b e n o v 和f r i d o v i c h 通过氰化 物抑制，渗透休克等方法在大肠杆菌中发现了c u z n s o d ，该蛋白存在于细 胞壁和细胞膜之间的周质空间，它们与真核生物的c u z n s o d 有关，只是少数氨 基酸残基序列不刚1 3 j ，其编码基因s 训c 位于大肠杆菌染色体3 7 1 m i n 处，毗 2 第1 章引言 邻于胁，和s d 拈基因。 研究发现，各种高等动物c u z n s o d 的同源性比它们和低等动物及植物间的 同源性要大得多。不同来源的c u z n s o d 在氨基酸序列上显示出明显的进化保守 性和高度的序列同源性，如人与高等动物、箭鱼、果蝇、植物、真菌及光合自养 细菌的同源性分别为8 2 、6 7 、6 2 、5 6 和1 8 ( 陈淮杨等，1 9 9 6 ) 。另外， 植物细胞浆和叶绿体之间的c u z n s o d 差异显著，这可能是叶绿体和细胞浆中的 c h z n s o d 有着不同的进化关系。 1 1 3 2c i u z n s o d 的结构 c u z n s o d 一般由两个相同亚基构成，每个亚基含一个c u 原子和一个z n 原子。c u z n s o d 结构上的同源性还表现为：( 1 ) 与金属辅基相连和参与肽链内 部二硫键形成部位附近的氨基酸残基相同；( 2 ) 富含甘氨酸残基，它们的大量存 在和均匀分布有利于形成酶分子的高级结构；( 3 ) 氨基酸序列中都有一个位于分 子结构表面的超可变区，可能与免疫学性质有关；( 4 ) 羧基末端有一序列同源性 很高的区域，在此区域有一个精氨酸( 衄1 4 1 ) ，对酶活力的维持起关键作用。 c u z n s o d 高级结构的信息来源于x 射线衍射晶体结构分析。以牛红细胞 c u z n s o d 为例( 如图1 1 所示) ，该酶由两个结构相同的亚基构成，亚基结构 核心是一个由八股反平行的b 折叠和三个无代表性结构的环组成的具有拓扑性 的桶( b 桶) 【1 4 】，整个结构含a 螺旋较少。两个亚基之间通过非共价键的疏水作 用结合，两个c i l 原子之间相距3 3 8 砌，同一亚基中c u 、z n 相距0 6 3 姗。 c u z n s o d 的活性部分是一个椭圆形的口袋，其外缘一边由，n l l l 3 5 、g l v l 3 6 、 m a l 3 8 和g l y l 3 9 组成，另一边由g l y 5 9 、p r 0 6 0 、h i s 6 1 、p h e 6 2 和g l n 6 3 组成， n r l 3 5 和加蕾4 1 构成口袋两侧，c u 、z i l 与6 个组氨酸( h i s ) 残基和1 个天 图l - lc i i z n s o d 的高级结构 圈l - 2c u z n s o d 结构示意图 冬氨酸( 舡p ) 形成狭长的袋底，其中c u 原子分别与h i s 4 4 ，h i s 4 6 ，h i s 6 1 ，h i s l l 8 配位，z i l 则与h i s 6 1 ，h i s 6 9 ，h i s7 8 和a s p 8 1 配位，c u 、z i l 共同连接h i s 6 1 组 成“咪唑桥”结构( 如图1 2 所示) ，c u 靠近于溶剂面，b 桶边缘的心1 4 1 有辅 3 成都理+ i ：大学硕十学位论文 助引导底物向c u 离子靠近的作用；z n 则包埋于疏水基团中，起稳定酶结构的作 用。半胱氨酸c y s 5 5 和c y s l 4 4 的- s h 基之间形成的二硫键是c u z n s o d 中唯一 的一对链内二硫键，对维持酶结构的稳定也起着重要作用。 1 1 3 3c u z n s o d 基因表达及调控 由于天然酶来源有限，c u z n s o d 在应用方面受到很大限制。基因工程是广 开酶源，获得低成本c u z n s o d 的有效途径。 赵敏顺等( 1 9 9 0 ) 运用化学方法合成了h c u z n s o d 全基因，首次在大肠杆菌 中获得了高效表达。h a l l e w e l l 等( 1 9 9 1 ) 报道了用t a c l 启动子指导人的c u z n s o d 基因在大肠杆菌中的高效表达，他们还利用酵母甘油醛磷酸脱氢酶启动子指导该 基因在酵母中的高效表达，产生可溶的具有正常酶活性的h c u z n s o d 。鉴于重组 的h c u z n s o d 在体内半衰期很短，施惠娟等( 1 9 9 9 ) 对r h c u z n s o dc d n a 基因 加以改造，他们以r h c u z n s o dc d n a 为模板，通过p c r 反应将r h c u z n s o dc d n a 中的c v s 6 改变成a 6 ，并最终得到了高表达的突变的r h c u z n s o d 。y o o 等( 1 9 9 9 ) ， 将人c u z n s o d 结构基因克隆到含甘油醛磷酸盐脱氢酶基因启动子的酵母表达 菌中，重组质粒产生约占总细胞蛋白6 的h c u z n s o d ，且表达的s o d 具有酶活 性。d u a n 等( 2 0 0 0 ) 将含c u z n s o d 编码域的甘薯c d n a 片段插入表达病毒的谷 胱甘肽s 转移酶( g s t ) 基因，再将构建的质粒导入大肠杆菌中，成功地使可溶 性g s t - s o d 蛋白得到了高效表达。向华等( 2 0 0 0 ) 首次进行了h c u z n s o d 在食 品级微生物乳酸乳球菌中的克隆和高效表达，其表达产物有可能不经过传统的纯 化工艺而直接应用于食品及化妆品领域，发挥其保健或护肤功能。李雪莲等 ( 2 0 0 7 ) 采用r t - p c r 技术从人胃总r n a 中分离扩增h c u z n ? s o d 的c d n a ，与酿 酒酵母交配因子( m f ) a 信号肽编码序列融合，将融合基因插入大肠杆菌酵母 细胞穿梭型质粒p y e s 2 0 ，构建真核分泌表达质粒p y e s m s ，并转化入酿酒酵母 的缺陷型菌株i n v s c l 中，在半乳糖诱导下，首次在酿酒酵母中克隆和分泌表达 了有生物活性的h c u z n s o d ，该酵母工程菌株的成功构建为开发h c u z n s o d 的 基因工程产品奠定了良好的基础。 c u z n s o d 基因大多数属管家基因，故其表达量相对比较稳定。h a n 等通过 研究发现，酵母c u z n s o d 的基因表达受到铜离子的诱导，c u 作为一种过渡金 属在c u z n s o d 的转录和翻译的修饰中起调控作用，缺少c u 2 + 会降低c u z n s o d m r n a 的合成，同时影响酶的激活。此外，c u z n s o d 的表达还受到温度的影响， 当玉米于1 5 条件下培养时，c u z n s o d 的活性比在2 0 培养时活性明显提高。 番茄细胞质和叶绿体c u z n s o d 的表达与其所在的植物器官有关，胞质 c u z n s o d 的转录产物主要集中在那些非光合成器官( 如根、茎和成熟果实) 中， 叶绿体c u z n s o d 的转录产物主要位于进行光合作用的叶片中。而在茎尖、花蕾、 幼苗和嫩叶中这两种c u z n s o dm r n a 水平均较高( p e r lt r e v e s 等) 。 4 第1 章引言 小鼠c u z n s o dm 砌叮a 的5 u t r 结合有6 5 k d 的s o d r b p ( r n a 结合蛋 白) ，该蛋白是m r n a 的翻译抑制子，可能是调节c u z n s o d 表达的关键因子之 一( g u 等，1 9 9 6 ) 。s e o n g 等( 1 9 9 7 ) 发现s p l 和c 但b p 家族调节h c u z n s o d 的转录，s p l 结合在c u z n s o d 的上游区域，激活与c u z n s o d 相连的g 盯的 表达，扩大s o d 基因表达的生物细胞范围，而c e b pa 和c e b pb 则可激活 c u z l l s o d 的表达。n i c h o l s ( 2 0 0 0 ) 还对肋m p 砌6 “馏如厂彤形中s o d 基因的转 录情况进行了分析；发现s e c a 与s o d 构成一个3 7 k b 的转录单位，转录起始点 在靶叫的起始密码子a t g 上游1 0 0 b p 处。 1 2 干酪乳杆菌 干酪乳杆菌( l 口c 幻施c 玎觑sc 口5 d ) 属于乳杆菌属( 口c 幻施c f 舰5 ) ，革兰氏阳 性不产芽孢，无鞭毛，不运动，兼性异型发酵乳糖，不液化明胶，接触酶阴性， 最适生长温度4 2 4 5 ，g + c 含量为4 5 6 4 7 2 。菌体长短不一，两端方 形，常成链；菌落粗糙，灰白色，有时呈微黄色；生化反应能发酵多种糖【1 引。干 酪乳杆菌存在于人的口腔、肠道内含物和大便及阴道，也出现在牛奶和干酪、乳 制品、饲料、面团和垃圾中。近年来，干酪乳杆菌由于其对宿主营养、免疫、防 病等显著的益生功效，越来越成为研究、开发、生产的焦点。 1 2 1 乳酸菌的益生作用 乳酸菌几百年来一直用于食品和饮料的加工制作，它们单独或混合以及和酵 母菌一起用于发酵工业，尤其在乳制品加工方面起着重要作用。早在1 9 0 8 年e m e t c h n i k o f ! f 就在他的长寿说( t h ep r o l o n g a t i o no fl i f e ) 里科学地揭示了乳酸 菌及其发酵制品具有保健作用和医疗效果，认为促使人衰老的原因之一是肠道内 细菌的腐败作用，当摄入乳酸菌或它的发酵制品时，可以建立一个肠道菌群的平 衡体系，从而抑制对人体有害无利的腐败微生物的繁殖，预防有机体在肠内积累 吲哚、酚等有害物质。近十几年来的研究表明，乳酸菌可能的作用包括：增加肠 内益生菌，减少有害茵；增加食物的营养价值，减少乳糖不耐症；免疫赋活作用， 抑制肿瘤、活化巨噬细胞、产生肿瘤坏死因子、干扰素、i g a 抗体等；降低胆固 醇；降血压作用。 1 2 1 1 增加肠内有益茵，减少有害茵 乳酸菌大多能够活着通过胃到达肠道定植，或者通过发酵生成物产生抗菌机 制阻碍其它菌定植，或者抑制肠内有害菌促进肠内有用菌的增殖，发挥整肠的作 用【1 6 1 。经口投入的乳酸菌能在肠道存活而不能定植的话，每天坚持摄取乳酸菌也 成都理上大学硕士学位论文 可以起到抑制有害菌和整肠的效果。此外，在乳酸菌中，几乎所有属的代表性菌 株都可以产生一些具有抑菌或杀菌作用的细菌素，对其它细菌具有拮抗作用，可 以抑制有害菌的生长繁殖，使它自身成为肠道中优势菌群，促进人体的健康【1 7 1 。 1 2 1 2 免疫赋活作用，活化巨噬细胞、产生肿瘤坏死因子、干扰素、l g a 抗体等 乳酸菌可以强烈刺激机体的免疫机能，无论是实验室还是临床上的结果都肯 定了这一点。s h i 删n 等【1 8 j 报道了来源于母乳喂养的婴儿粪便中的b b e n l e 热死菌 体对和免疫增强有关的l g a 的产生有增强作用。嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物 乳杆菌等菌体食用后可活化单球巨噬细胞的活性，增强全身性免疫应答u9 。经常 食用酸奶可增加免疫球蛋白i g g 、i g e 、t 细胞和巨噬细胞的产生而提高免疫增强 效果，这主要和酸奶中的乳酸菌有关。 乳酸菌抑癌发生的机理很复杂，主要研究结果归纳有：通过吸附、抑制、去 除等途径来减少致癌物质和致癌物前体【2 0 】；抑制能产生致癌物质的细菌的增殖 【2 1 】；降低肠道内的p h ，使与致癌作用有关的酶活性及胆汁酸水解活性降低；缩 短肠内容物在肠道的滞留时间，使变异原及早排除体外；乳酸菌本身的免疫赋活 作用等。干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、乳脂链球菌及各种双歧杆菌的菌体或酸奶上 清均具有相当强的抗肿瘤活性。加热处理的肠球菌e f 2 0 0 1 也对肿瘤有很强的抑 制作用。再者通过乳酸菌可以使变异原诱导染色体异常减少8 0 1 2 2 。，也许是抑 癌的原因之一。 1 2 1 3 降低胆固醇 乳酸菌可以降低胆固醇，每天坚持喝酸奶能够使血清中的胆固醇降低。 t a r a n t o 等瞄j 用老鼠作实验，先给实验鼠吃乳酸杆菌，每天1 0 4 细菌数，连续7 天，再给食高胆固醇饲料，和对照组相比，其总胆固醇下降2 0 ，三甘油脂下降 3 3 ，l d h h d l 降低1 7 。乳酸菌能降低胆固醇机制还不清楚，m a n n 等认为 乳酸菌可产生3 羟基戊3 甲基二酸( h m g ) 而抑制了胆固醇合成时所必须的羟基 戊二酰辅酶a 还原酶活性；r a o 等认为发酵乳中的乳清酸衍生的代谢产物可降低 胆固醇浓度；g i l l i l a n d 等认为乳酸菌可将胆固醇有效的同化或将其捕获使之不能 进入血液；a v e r 等认为是由于乳酸菌可使胆汁酸盐脱抱合而变得难于吸收。 1 2 1 4 降血压作用 乳酸菌具有降血压作用在几种乳酸菌中已有报道，并且起作用的物质也各不 相同。高血压患者口服干酪乳杆菌的菌体自溶物的热水抽提液( l e x ) ，每天两次， 每次4 0 0 m g ，连续3 个月后血压明显下降；粪肠球菌f k - 2 3 热水抽提液也具有 降低血压的效果，且对f 常的血压完全没有影响，进一步分析结果证实起作用的 物质是分子量在1 7 万的r n a 。瑞士乳杆菌发酵的酸奶也具有降低血压的功能， 6 第l 章引言 有效物质是两个小肽v r a l p r o p r o ( v p p ) 和i l e p m p r o ( i p p ) 1 2 4 1 ，研究认为这两个 小肽形成的空间结构和降血压药物络活喜的主成份结构很相似。 此外，乳酸菌还可以通过束缚抗原、破坏抗原而减轻过敏反应症状和提高机 体抗氧化能力而有助于延缓衰老。 1 2 2 作为益生菌的干酪乳杆菌 长期以来，国外对干酪乳杆菌的健康促进作用做了较多的研究，而国内在这 方面的报道非常有限。近年来，干酪乳杆菌由于其营养作用、食疗功效和安全性 而得到了深入地研究，成为具有显著益生作用的乳酸菌发酵剂，在乳制品生产广 泛地应用陋j 。研究发现，干酪乳杆菌可显著地增强细胞免疫功能，促进1 1 1 1 细 胞的发育，诱导多种细胞因子的产生，预防i g e 介导的过敏反应等功能【2 引。此外， 热杀死的干酪乳杆菌对糖尿病模型小鼠具有明显的预防发病作用，对小鼠受抗原 刺激后的i g e 产生具有显著抑制作用【2 7 ，矧。干酪乳杆菌对促进宿主抗各种类型的 感染，特别是条件致病菌诱导的感染，具有强有力的作用。干酪乳杆菌的保护作 用，主要是通过它的活性，促进宿主的巨噬细胞处理抗原( 采用t 细胞依赖性或 t 细胞非依赖性方式) ，导致血液单核细胞活动至感染部位，提高抗菌作用。干 酪乳杆菌对由假单胞杆菌引起的感染，具有良好的保护潜能。通过口服干酪乳杆 菌，能促进网状内皮系统，包括宿主巨噬细胞的功能活性( 溶酶体酶和吞噬作用) 。 干酪乳杆菌发酵乳制品具有调节人体血压的作用，1 w a s e 等人发现，食用l 彻s 西 t m c 0 4 0 9 和s 咖e 瑚9 础池s t m c l 5 4 3 制成的发酵乳后8 小时收缩压下降 7 5 m m h g 。 不少学者探讨了干酪乳杆菌及其发酵乳制品对免疫缺损患者的作用。口服用 干酪乳杆菌制作的发酵乳，具有重要的临床应用价值，因为它们能增强免疫应答 引诱系统，并增进巨噬细胞功能，其主要可能是由于乳杆菌在乳品发酵过程中产 生的特定物质( 如酪蛋白肽) ，或由于微生物自溶产生的细胞壁成分，在增进宿 主免疫功能上起到了重要作用。在微生物研究的基础上，人们普遍认为，干酪乳 杆菌是保健功能最强的乳酸菌之一。因为其蛋白质水解能力强，促进吞噬细胞活 性增强的效果较好。体外实验已经证明，干酪乳杆菌具有黏附在肠粘膜表面的能 力，并可进入肠淋巴结和身体其它器官，这种能力可能与其免疫激活作用有关。 因此，干酪乳杆菌受到众多研究者们的关注，开发含有干酪乳杆菌的益生菌制品 正成为当前研究的热点之一。 1 2 3 干酪乳杆菌在乳制品中的应用 二十世纪五十年代以来，各国研究人员对发酵乳的生产技术和影响其感官性 质的因素有了较深刻的理解，发酵乳制品的生产逐步实现了现代化、规模化。随 7 成都理大学硕士学位论文 着细菌学研究的深入，除了普通的乳酸菌( 德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球 菌等) 的生物学特性被公认以外，一些对人体有益的干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌等 益生菌群在人体肠道的存在及其特殊功能也逐渐被人们所认识，从而引发了发酵 乳制品生产的第三次革命，掀起了益生菌乳品研究开发的热潮。国内外对干酪乳 杆菌等益生菌及其产品发生了很大兴趣，企业界、医学界已不断开发出新产品。 研究报道，许多种食品都可以作为干酪乳杆菌的载体，如糖果、果冻等。然而， 这些食品大都不能使干酪乳杆菌维持较高的活菌数以充分发挥其益生作用。牛乳 是一种营养丰富和完善的大众化食品，以牛乳作为载体，投放干酪乳杆菌到牛乳 中，开发具有健康功效和不同风味特性的干酪乳杆菌乳制品，无疑会极大提高牛 乳的附加产值。同时，人们很容易接受和购买品质优良的益生菌乳制品来预防疾 病、促进健康。因此，含有大量干酪乳杆菌等益生菌的乳制品是营养与保健功能 兼备的理想食品之一，它们的研究和开发愈来愈受到人们的广泛关注。具有益生 作用的干酪乳杆菌目前也被广泛应用于液体奶、发酵乳和干酪等乳制品的生产加 工中。日本非常有名的发酵乳y a k u l t 的发酵剂就含有干酪乳杆菌，它是日本 市场上极受欢迎的乳饮料。此外，达能的a c t i m e l 、n u t r i c a 公司的f y o s 、德国的 f i t 、瑞士的s y m b a l a n c e 、a k t i f i t p l u s 都是含有干酪乳杆菌的益生菌乳制品。 近期研究发现，干酪中的益生菌虽然没有经过发酵乳益生菌那样经历过低p h 值 驯化，但由于前者含脂率较高，所以干酪可能比发酵乳更适合作干酪乳杆菌的载 体【2 9 1 。 1 3 乳酸菌基因工程 乳酸菌是一类广泛用于食品工业的革兰氏阳性细菌，利用基因工程技术可对 其性状进行改造，近2 0 年中，人们构建了多种载体，并在乳酸菌中表达了多种 蛋白。作为人体的正常菌群，乳酸菌己被用于胃肠道、阴道的微生态治疗。表达 抗原的乳酸菌工程菌可经粘膜免疫诱导保护性免疫或免疫耐受。因此，深入研究、 利用乳酸菌基因工程技术有着深远的意义。乳酸菌包括有2 3 个属，各属之间的 差异很大，即使是同一属也有很大差异。如口c 幻施c i 池s 属包含5 0 多个种，在 生化、生态、分子生物和免疫方面各有不同的特征。l 出场厂“e c 施和i 膨删绷伽优 的d n a 中g + c 含量约为5 0 ，而l 口c 而如础f 觑s 和l e 觑e f f c 肌的d n a 中g + c 含量约为3 6 。它们d n a 的g + c 含量的差异反映出各个种之间有很大的不同； 在转录和翻译的控制水平上，种与种之间也有很大的区别，这暗示着从一个