（应用化学专业论文）黄芩及其复方药的指纹图谱研究.pdf

江南大学硕士学位论文 摘要 黄芩复方口服液是由黄芩及其它中药提取物加工制成的口服液。目前全国有多家厂家 生产，临床反映疗效不一。为全面控制口服液质量，根据中药注射剂指纹图谱研究的技术要求， 需制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。因此，本文建立了黄芩与金银花两 味复方银黄口服液与黄芩、金银花与连翘三味复方双黄连口服液的指纹图谱及其原料药材黄 芩、金银花及连翘药材的指纹图谱。 首先，本文采用高效液相色谱h p l c 方法建立了不同产地黄芩药材的指纹图谱。以黄 芩苷的提取率以及色谱峰个数为指标，对黄芩药材的各种提取方法进行了考察；研究了流动 相、梯度洗脱条件及检测波长的选择对黄芩药材指纹图谱的影响，得到了优化的提取和测定 条件。采用夹角余弦和相关系数的方法来计算黄芩药材指纹图谱相对峰面积的相似度，结果 与实际样品分类相符合。 其次，本文还采用毛细管电泳c e 方法建立不同产地黄芩药材的指纹图谱。研究运行 缓冲液的浓度和酸度、检测波长及分离电压对黄芩药材指纹图谱的影响，得到了优化的测定 条件。进行精密度和重现性实验，各共有峰相对峰面积和相对保留时间的r s d 均小于5 。 最后利用相似度和聚类分析两种方法对1 0 批黄芩药材的毛细管电泳指纹图谱进行分析，结果 与实际样品分类及h p l c 方法结论相符合。 最后，本文利用h p l c 方法，建立了黄芩复方口服液一银黄口服液、双黄连口服液及 其原料药材黄芩、金银花与连翘的指纹图谱，且分别测定了两种口服液中黄芩苷和绿原酸的 含量。采用夹角余弦和相关系数的方法，计算口服液指纹图谱的相似度，表明口服液质量未 见显著差异。将口服液指纹图谱中的峰与原料药材黄芩和金银花的指纹图谱中峰相比较，对 其归属进行确认，大部分共有峰可以匹配。 关键词：h p l c指纹图谱黄芩复方口服液黄芩 摘要 a b s t r a c t r a d i xs c u t e l l a r i a eo r a ll i q u i dw a s m a d eo fs c u t e l l a r i a ea n do t h e rh e r b a le x a c t i o n s t h e ya r e p r o d u c e db ym a n yf a c t o r i e si no u rc o u n t r yc u r r e n t l y ，a n dt h ec u r a t i v ee f f e c ti sd i f f e r e n t i no r d e rt o c o n t r o li t sq u a l i t y ，i tw a sr e q u i r e dt h a ta l lt h ei n j e c t i o n sm a d ef r o mh e r b a lm e d i c i n e sa n dt h e i rr a w m a t e r i a l ss h o u l db es t a n d a r d i z e db yc h r o m a t o g r a p h i cf i n g e r p r i n t s o ，t h ec h r o m a t o g r a p h i c f i n g e r p r i n t so fy i n h u a n go r a ll i q u i d ，s h u a n g h u a n g - l i a no r a ll i q u i dt o g e t h e rw i t hi t sr a w h e r b a l s w e r ee s t a b l i s h e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yi nt h i sw o r k ， f i r s t ，am e t h o db a s e do nh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) t oe s t a b l i s ht h e f i n g e r p r i n to fr a d i xs c u t e l l a r i a ew a sd e s c r i b e d t h ec o n t e n t so fb a i c a l i ni nr a d i xs c u t e l l a r i a e e x t r a c t i o nw i t hv a r i o u sk i n d so fe x t r a c t i o nm e t h o d sw e r ed e t e r m i n e dt oc h o o s ea p p r o p r i a t e e x t r a c t i o nm e t h o d t h ee f f e c t so fm o b i l ea n dt h eg r a d i e n te l u t i o na c i d i t y , u vd e t e c t i o nw a v e l e n g t h w e r ei n v e s t i g a t e d t h ed a t ao f f i a g e r p r i n t so fi 0b a t c h e so f r a d 缸s c u t e l l a r i a ew e r ep r o c e s s e dw i t ht w o d i f f e r e n t m a t h e m a t i c m e t h o d s ，a n d t h e r e s u l t s o f b o t h m e t h o d s w e r ec o n s i s t e n t w i t h t h e f a c t s 。 t h e n ，t h em e t h o db a s e do nh i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ) t oe s t a b l i s ht h e f i n g e r p r i n to fr a d i xs c u t e l l a r i a ew a sa l s od e s c r i b e d t h ee f f e c t so fc o n c e n t r a t i o na n da c i d i t yo f r u n n i n gb u f f e r , u vd e t e c t i o nw a v e l e n g t ha n da p p l i e dv o l t a g ew e r ei n v e s t i g a t e d t h i sp r o p o s e d m e t h o dd e m o n s t r a t e dg o o ds t a b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t yw i t hr s dl e s st h a n5 f o rb o t ht h er e l a t i v e r e t e n t i o nt i m ea n dt h er e l a t i v ea r e a s f i n a l l y , t h ed a t ao f f i n g e r p r i n t so f1 0b a t c h e so f r a d i xs c u t e l l a r i a e w e r ep r o c e s s e dw i t ht w od i f f e r e n tm a t h e m a t i cm e t h o d so fs i m i l i t u d ec o e f f i c i e n ta n dt h es a ss y s t e m ， a n dt h er e s u l t so f b o t hm e t h o d sw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h em e t h o do f h p l c f i n a l l y ，t h ec h r o m a t o g r a p h i cf i n g e r p r i n to fy i n h u a n go r a ll i q u i d ，s h u a n g h u a n g l i a no r a l l i q u i dt o g e t h e r 、i 也i t sm a t e r i a lo r i g i n a lm a t e r i a l sr a d i xs c u t e l l a r i a e f l o sl o n i c e r aa n df o r s y t h i a w e r ee s t a b l i s h e db yh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y a tt h es a m et i m e ，b a i c a l i na n d c h l o r o g e u i ca c i di nt h eo r a ll i q u i dw e r ea l s oq u a n t i t a t i v e l yd e t e r m i n e d t h ed a t ao ff i n g e r p r i n t so f o r a ll i q u i dw e r ep r o c e s s e dw i t ht w od i f f e r e n tm a t h e m a t i cm e t h o d s t h i sp r o p o s e dm e t h o dd e m o n s t r a t e d g o o ds t a b i l i t yo r a ll i q u i d c o m p a r e dt h ep e a k si nc h r o m a t o g r a mo fo r a ll i q u i d 、i t ht h o s eo fc r u d e h e r b s ，m o s to f t h e mc o u l db em a t c h e dw e l l k e y w o r d s ：h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ；f i n g e r p r i n t ；r a d i xs c u t e l l a r i a eo r a ll i q u i d i i 独创性声明 y9 1 ；7 s 5 7 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 4 一“ 签名： 苎型j 憋日期：伽以 年，一月谚日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：曼亟目苎导师签名：盗竺垒 日期：矿睥，明阳 江南大学硕士学位论文 1 1 前言 第一章绪论 中药作为中华民族的瑰宝，以其丰富的资源，独特的疗效，不良反应小而受到世人的瞩 目。同时，西药的研制难度越来越大，周期越来越长，投入越来越多，迫使许多国家将目光 转移至中药，这给中药走出国门带来了难得的机遇。但中药的化学成分复杂，质量难以控制， 是传统中药制剂的痼疾，这也成为中药跨出国门的“瓶颈”【1 】。 传统的中药质量控制与现代化学合成药品的质量控制技术有着根本区别。中药一般为复 方制剂，组方配伍讲究君、臣、佐、使；讲究药物组方配伍；讲究因人而异、天人合一、辨 症施治，处方有效成份极为复杂，大部分结构、作用机理尚不清楚。在现有条件下，以单一 化学成份分析的观点，不适合中药( 天然药物) 这一复杂成份分析。中药材生产过程复杂， 受多种因素的制约，这些都为其实现质量可控提出了新的课题【2 】。而中药指纹图谱具有整体、 宏观和模糊分析等特点，可以通过对中药整体特性的描述，采取适当模糊的处理方式，达到 整体质量控制的目的。目前， 美国食品药品管理局( f d a ) 、英国草药典、印度草药典、德 国药用植物学会、加拿大药用植物学会均接受指纹图谱的质量控制方法，这表明指纹图谱已 成为国际公认的控制中成药、天然药物质量的最有效的方法。因此，为实现中药质量标准现 代化并与国际接轨，国家食品药品监督管理局已下发了中药指纹图谱研究要求，首先要求对 中药注射剂进行指纹图谱研究，并正在抓紧进行指纹图谱库的建立工作，以逐步实现中药材、 中成药质量标准现代化【1 】。 1 2 中药指纹图谱 现代“指纹”鉴定始于1 9 世纪末2 0 世纪初的犯罪学和法医学。每人手指上都有指纹， 但人与人之间的指纹都是不同的。这种“唯一”的指纹就形成了可以据以鉴别每个人的特征。 同样，每一味中药的特性也干差万别【3 】。中药材或中成药经过适当处理后，利用现代信息采集 技术和质量分析手段得到的能够显现中药材或中成药性质的图像、图形、光谱的图谱及其数 据，称为中药指纹图谱。中药指纹图谱虽借用了法医学的概念，但又与其有所区别。它是在 制定中药质量评价的过程中针对中药中成分的复杂性以及缺乏用以鉴定成分所需的化学对照 品这一症结而产生的一种方法，它是指某种( 或某产地) 中药材或中成药经适当处理后，采用 一定的手段，得到的能够标示该中药材或中成药特性的共有峰的图谱。它强调物种“群体内 的唯一性”，要求图谱具备指纹特征，即专属、稳定、实用1 4 。 第一章绪论 1 3 中药指纹图谱建立的意义和原则 1 3 1 中药指纹图谱建立的意义 中药材和中药复方制剂能发挥治疗效果的物质基础是其化学成分。而中药材多为植物的 干燥器官，由于复杂的自然环境、社会状况以及我国历史上科技发展不平衡等多种原因，造 成了中药材在应用方面的复杂性。同一名称的中药材可能来自不同基源的植物。同一基源的 中药材由于产地不同、采收季节和生长年限不同而存在差别。一些中药材，特别是名贵药材， 常可见到伪品与正品相混淆。由于以上因素的存在，使得不同来源的同种中药材其化学组成 有可能相同，也有可能不同，这就必然影响到中医的临床疗效和中药的实验研究，并影响以 其为原料生产出的中成药的化学组成，从而影响其质量和疗效。此外，我国中成药品种繁多， 中成药生产过程中各工艺环节的稳定性等多种因素对产品的化学组成也具有重要的影响。现 行的中药质量标准中列入了显微鉴别、理化鉴别、含量测定等多种方法，尚不足以解决中药 的复杂性。中药指纹图谱是从宏观上整体把握中药质量，而不是分析单一的、少量的成分， 使评价中药质量更加科学化、标准化。通过指纹图谱可以鉴别样品的真伪优劣。因此，指纹 图谱的建立对中药研究有一定的指导意义，对指纹图谱中特征信号的确认，化学成分的表征， 进一步研究组分与药效之间的相关性，从而阐明中药的作用机制，能够更加客观地从整体上 评价中药的内在质量峰“。 1 3 2 中药指纹图谱建立的原则 中药指纹图谱是以系统的化学成分研究和药理研究为依托，体现系统性、特征性、重现 性三个基本原则1 7 】。系统性：是指中药所含大部成分的种类，或指标成分的全部；特征性： 是指中药化学成分信息具有高度选择性，这些信息的综合结果能特征地区分中药的真伪与优 劣，成为中药自身的“化学条码”；重现性：是指所建立的指纹图谱在规定的方法和条件下， 在不同的时间、地点、操作人均能做出相同的指纹图谱，其误差在允许的范围内，保证其具 有通用性和实用性。 1 4 中药指纹图谱的分类 中药指纹图谱包括中药化学指纹图谱、蛋白指纹图谱、d n a 指纹图谱及生物效应指纹图 谱等。我们通常说的指纹图谱是指化学指纹图谱，是中药材、中药提取物或中成药经适当处 理后，采用一定分析手段，得到的能够标示该中药主要化学成分特性的色谱或光谱。 中药化学指纹图谱主要指中药混合成份的色谱( 如t l c 、2 d t l c 、t l c s 、g c 、g c m s 、 h p l c 、h p l c m s 、x 射线衍射、h p c e 、d n a 等) 、光谱指纹图谱( 如i r 、u v 等) 、波谱 2 江南大学硕士学位论文 指纹图谱( n m r 、m s 等) 。其中色谱方法用来分离特征成分；采用u v 、i r 、n m r 、m s 等 光谱方法鉴定化合物的结构，提高指纹图谱的可信度。 1 4 1 薄层色谱( t l c ) 指纹图谱 t l c 法作为一种常规方法，它具有快速、经济、可靠、操作简单、适应范围广、重现性 较好等特点，在中药研究中的应用一直非常广泛。2 0 世纪7 0 年代日本和我国学者就尝试以 薄层扫描图谱作为色谱指纹图应用于中成药分析。薄层色谱提供了一幅色彩斑斓的图像，形 象生动，易于辨认而用于中药鉴别的频率最高，比较适合原药材的指纹图像分析。在新药研 制中，几乎所有的新药都必须提供薄层层析谱，并需附有标准品或对照药材、阴性样品对照 的彩色照片。现代快速薄层扫描仪的发展以及各种配套设各的发展可以用来准确地对薄层板 上的斑点( 已分离斑点) 峰面积予以扫描测定，以各峰的峰面积与标准峰( 可以是已知有效成分 或特征成分，或是外标物质) 的比来量化中药材( 或中成药) 的质量。p o o l e 在“世纪之交的平面 色谱”一文中对t l c 法在过去的研究应用进行了综述，并指出了未来其可能的发展方向，认 为该法具有可任意改变固定相、同时平行多样品分离、检测简便不受时间限制、包含色谱信 息的设备( 即薄层板) 可贮存、可对所有样品进行色谱观测等优点【8 1 。 在实际的薄层层析鉴别中，有时因中药的成分性质相近而难以分开时，还可采用高效薄 层层析法( h p t l c ) ，该方法是采用更细、更匀的吸附剂，因而提高了分离效果，比经典薄 层色谱提高3 倍，最多可分离4 0 种组分。同时，点样量还可减少到o 1 儿以下，使原点直径 控制在i m m 内，展开时间缩短，展距缩小( 3 7 c m 1 0 1 5 m 呦，达到微量、快速和高效的目 的【9 】o 同时薄层色谱法也有它自身的不足，由于展开过程中薄层板在一个相对开放的系统中， 决定了外界条件( 如温度、湿度等) 对实验结果影响较大。因此，为了保持实验结果的一致性， 在试验过程中各项实验条件必须固定，在对样品进行t l c 指纹图谱检测时，须采用符合g l p 要求的薄层材料，最好随行标准提取物以与样品对照鉴定。 1 4 2 气相色谱( g c ) 指纹图谱 2 0 世纪5 0 年代兴起的气相色谱法，实现了分离与“在线”分析，以气体为流动相，具 有分离效能高、选择性好、灵敏度高、样品用量少和分析速度快等优点。且所得的色谱轮廓， 其重现性好、分辨率相对来说较好，由于是封闭系统色谱，外界影响的因素较少，稳定性较 好，检测设备可选性较大，特别适用于挥发性药材和制剂的指纹图谱的研究与应用。气质联 用技术更增强了其定性功能，不仅能区分不同中药中挥发性成分的差别，还可阐明被检成分 的结构。0 ( 2 和g c m s 用于中药指纹图谱研究时，含挥发性成分中药取样的代表性、合理性 对实验结果的稳定性影响尤为显著。凌大奎等【1 0 】用规范化的色谱分离条件测定了砂仁、当归、 苍术、柴胡、藁本和香附的挥发油成分的g c 的保留指数( g c r i ) ，从中选择若干代表性成分 3 第一章 绪论 的g c r i 组成各自的g c r i s 谱，并利用g c m s 和g c 傅利变换红外光谱( f t i r ) 对各主要成 分作出了定性鉴别。g c 也被用于中药复方制剂的检测，如吴忠等【】对仲景胃灵片及其原料 药小茴香、高良姜、肉桂、砂仁的石油醚提取部分进行了气相色谱研究，获得了较为可靠的 指纹特征谱图。 对于挥发性较差或热不稳定的液体、固体，需采用制备衍生物( 如酯化、硅烷化、酰化 反应等) 或裂解等方法增加挥发性，但增加了操作上的麻烦。 1 4 3 高效液相色谱( h p l c ) 指纹图谱 高效液相色谱( h p l c ) 是近3 0 年发展起来的一种具有高灵敏度、高选择性、高效、快 速的分离分析技术。h p l c 是以经典液相色谱法为基础，引入g c 的理论与实验方法发展而 成的分离分析方法。h p l c 分析对象广，它只要求样品能制成溶液，而不需要汽化，因此不 受样品挥发性的约束。对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化 合物尤为有利。在药品的质量控制，中药的成分研究等方面都是重要的分析手段，药典中鉴 别项下越来越多的使用到此方法。它给出的是高分辨率的轮廓图谱，重现性好、操作相对容 易，而且相比于薄层色谱是封闭系统色谱，在线操作外界影响因素小，色谱稳定性好，在线 检测设备可选性较大，很适合指纹图谱的实验研究和应用。因此，建立中药色谱指纹图谱， h p l c 方法是最基本的选择。同气相色谱( g c ) 一样，液相色谱联用技术是中药研究中最受 重视的手段。i - i p l c d a d 、h p l c m s 、h p l c - n m r 、h p l c m s m s 、h p l c e l s d 等联用技 术给复杂样品的分析带来了无限的活力，为中药研究提供了最丰富的信息，成为了中药指纹 图谱研究最强大的武器。程雅琴等 12 j 采用h p l c 指纹图谱法观察了同一生产单位不同生产批 次之间，以及不同生产单位之间人胎盘组织液制品主要色谱峰的变化。李菁【1 3 】利用h p l c 法 测定七叶皂苷钠，并用蒸发光检测器( e l s d ) 检测，得到了其h p l c e l s d 指纹图谱，对不 同注射用七叶皂苷钠样品的比较研究表明，h p l c - e l s d 指纹图谱准确地显示了样品的质量， 结果直观、可靠。但是，如果样品纯度不够，容易造成色谱柱中毒是高效液相色谱法用于构 建中药指纹图谱的缺点。 1 4 4 高效毛细管( h p c e ) 指纹图谱 高效毛细管电泳( h p c e ) 是近十几年迅速发展起来的一种新型分离分析技术，依据带电 粒子( 离子或胶粒) 在水相介质( 可加入缓冲液) 中受电场作用迁移速度的不同而实现分离 分析。h p l c 具有分离效率高、分析速度快、分离模式多、所需样品少、应用范围广、自动 化程度高、可直接分析水溶液等特点。自问世以来，发展极快，已经有毛细管区带电泳( c z e ) 、 胶束电动毛细管色谱( m e c c ) 、毛细管电色谱( c e c ) 和等速毛细管电流( c i t p ) 等多种分 离模式，可对动、植物类药中多类成分进行分离分析，特别适用于药味较多、化学成分复杂 的中药复方制剂，以及氨基酸、多肽、蛋白质和核酸等生物分子的测定。在生命科学、生物 4 江南大学硕士学位论文 技术和环境科学等领域显示了极其重要的应用前景，目前正广泛应用于天然药物研究之中。 胡平等【1 4 j 提取菟丝子种子中的植物蛋白，用 - i p c e 法进行生药鉴定，根据其电泳图谱，可有 效鉴别菟丝子的来源。王钢力等【l5 j 采用 - i p c e 的m e c c 的分离模式，对1 8 个卷柏属植物样 品的乙酸乙酯提取物进行测定，以相对迁移时间和相对峰面积为参数，建立了1 8 个样品的毛 细管电泳的指纹图谱。孙沂等【1 6 j 以6 0 甲醇溶液提取，采用毛细管区带电泳法( c z e ) ，建立 了1 0 批红花地道药材的指纹图谱。h p c e 以其高效、快速、简便且柱不易受污染而优于h p l c 法，但仍存在重现性较差、灵敏度较低等不足。 1 4 5 高效逆流色谱( h p s c c c ) 指纹图谱 高效逆流色谱( h p s c c c ) 是一种基于液液多级逆流萃取建立的色谱体系，以轻巧的聚 四氟乙烯螺旋管作分离柱，在行星式运动中连续地完成整个分配、传递、分离过程。其显著 特点是不用固相载体作固定相，克服了样品吸附、损失、峰形拖尾问题。它具有很好的适应 性，从理论上讲h p s c c c 可以适用于任何极性范围样品的分离，所以在分离天然产物方面有 其独到之处。它的分离度和重现性与h p l c 基本相同，但它操作更为简便，容易掌握。对样 品的预处理要求低，仅需一般粗提物即可。该技术的回收率高，能实现梯度操作，亦能重复 进样，在中药质量分析控制研究中，尤其在指纹图谱研究中有较好的应用前景。沈平婊【1 7 】用 h s c c c 技术对多种中药进行了指纹谱分析都得到了较好效果，可用于中药的质量分析和控 制。 1 4 6 红外光谱( i r ) 指纹图谱 瓜是以研究物质对红外辐射的吸收特性而建立起来的一种定性、定量分析方法。红外光 谱具有高度的特征性，对单一化合物来说，没有两个化合物的红外光谱是完全一致的，即每 一种化合物都有自己特征的红外吸收光谱。对中药而言，每一味中药都是由多种化学成分组 成的，中药复方更是如此，其红外光谱是其所含各种化学成分红外光谱的综合叠加。中药中 各种化学成分只要在质和量的方面相对稳定，并且样品处理方法按统一要求进行，则其红外 光谱也应该是相对稳定的。因此，不用分清混合物红外光谱各主要吸收峰的归属，只要在 4 0 0 0 4 0 0 c m 范围内比较光谱的差异即可。这种差异表现在三个方面：一是在某一波数处鉴别 的双方只有一方有明显的差异；二是在某一波数内，鉴别双方的光谱中，吸收峰的形状和强 度都有明显的差异：三是“指纹区”的面貌不同。随着化学计量学和计算机技术的快速发展， 近红外光谱分析已进入分析弱信号和多组分多元信息处理为基础的阶段，特别是上个世纪8 0 年代傅里叶变换在近红外光谱仪中的应用，增加光通量，提高了信噪比，使所得谱线平滑， 从而使近红外技术有效地应用于大量样品的高精度快速分析。运用近红外光谱测定中药样品 中所含的某种化学成分，首先要建立光谱特征与该成分含量之间的数字模型。具体过程如下： ( 1 ) 选择一定数量( 如6 0 份以上) 具有代表性的药材样品( 又称标准样品集) ；( 2 ) 用其它测试仪器 5 第一章绪论 或化学方法准确测定各份样品中要预测成分的含量，作为真实值；( 3 】用傅里叶变换近红外光 谱仪扫描标准样品，集中各份样品的近红外光谱图；( 4 ) 运用随机软件( q u a n t + 定量分析软件) 化学计量学方法、偏最小二乘法在计算机内建立该中药近红外光谱图和化学成分真实值之间 的化学计量学模型；( 5 ) 在以后运用该模型快速测定时还可以不断地进行检验和校准【1 8 l 。多组 分测定时，只须对标准样品集中各份样品进行多组分测定，建立各组分和样品的近红外光谱 图对应的模型即可。测定时只需扫描待测样品的近红外光谱，通过欲测成分的对应模型就可 以得到样品中该成分的含量。所以说傅里叶变换近红外光谱仪不同于液相色谱仪、气相色谱 仪等大型测试仪器，它测定样品成分含量的方法是建立在化学测定法或其他仪器测定基础之 上的，可以称为“再生”的测定方法。目前近红外光谱在中药材及成药定量方面的应用还不 是很多，但可以预见，随着研究的深入，傅里叶变换近红外光谱在中药测定中的应用将得到 进一步地拓展。另外通过傅里叶变换近红外光谱仪和定量、聚类分析软件还可对中药进行真 伪优劣的快速识别。 1 4 7 紫外光谱( u v ) 指纹图谱 u v 是由分子中电子能级的跃迁而产生的，当单色光照射被测物质后，物质对光线产生 吸收，记录仪记录下吸收度波长曲线。由于物质结构不一样，其紫外光谱也不一样。该法是 依据中药中一些含有不饱和结构的成分对紫外光有吸收而进行鉴别。由于不同中药所含成分 的不饱和程度有差异，因而导致紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强有差异，因而可用于鉴别。 许多中药含有不饱和成分，紫外光谱法又具操作简单、快速、重现性好、用量少等特点，故 目前应用十分广泛。但是，在用紫外光谱鉴别中药时，一些亲缘关系较近的药材，由于成分 相差不大，用常规紫外光谱法难以达到鉴别的目的，此时可采用多溶剂紫外光谱法，即分别 检测数种不同极性溶剂提取液的紫外吸收，通过综合比较其图谱的差异，亦可获得较好的鉴 别效果。袁久荣将传统的中医药理论的整体观与现代紫外可见光谱技术相溶合，创立了中药 鉴别紫外谱线组法，该法依照“物质相似相溶”及“物质的紫外吸收度具有叠加性”的原理， 用四种极性大小不同的溶剂，分别浸提中药样品中极性大小不同的化学成分，得四种浸提液， 再用紫外可见分光光度计扫描出浸提液的四条紫外谱线，形成一个谱线组，以谱线组的全部 吸收峰数、峰位为鉴别中药样品的依据。林玉莲【1 9 】组合利用紫外光谱法和一阶导数光谱对丁 香、母丁香及肉桂子进行了鉴剐。 1 4 8x 射线衍射指纹图谱 x 射线衍射法是2 0 世纪7 0 年代后迅速崛起的新型结构分析方法，当对某一物质进行衍 射分析时，该物质被x 射线照射而产生不同程度的衍射现象，物质的组成、晶型、分子内成 键方式、分子构型、构象等将决定物质产生特有的衍射光谱。如果该物质是一混合物，则所 得衍射图是各组分衍射效应的叠加。只要混合物的组成恒定，其衍射图就可作为该混合物的 6 江南大学硕士学位论文 特征谱图。由于衍射法获得的图谱信息量大，指纹性强，稳定可靠，因此可作为该物质定性 鉴别的可靠依据。该方法的优点是样品量小，测试后不易破坏样品，操作简单，信息量大， 结果稳定，客观，图谱指纹性强，既能反映中药材整体固有结构特征，又能表现来自局部成 分变化的图谱化与数值化，对于结晶度较好的矿物类药和部分动、植物类药的鉴别分析特别 适宜。但在进行衍射分析时，由于每一中药含有许多组分，每一成分含有衍射峰而产生相互 叠加，最后获得的衍射图会因各组分衍射效应的叠加而使衍射图显得较为复杂，从而给药材 鉴别带来困难。有人在傅立叶变换的基础上，找出图形的拓扑规律，从而获得了一些中药较 为简单且又能反映药材结构特征的图谱。周俊国等唧】对1 2 个不同产地的蛇床子样品进行了粉 末x 射线衍射分析建立了蛇床子的特征图谱，认为该法可用于种内不同产地样品的鉴别；张 莉莉等【2 l 】采用粉末x 射线衍射f o u r i e r 指纹图谱鉴定法对3 个石韦对照品和1 7 个石韦中药材 进行实验、计算分析，获得了石韦的标准x 射线衍射f o u r i e r 指纹图谱及特征标记峰值，可 用于中药材石韦的鉴定。 1 4 9 核磁共振( n m r ) 指纹图谱 n m r 类似于红外和紫外光谱，是另一种形式的吸收光谱。它可以获得化合物的包括各类 质子的化学位移、数量、偶合关系等多个结构信息。在无线电波( 波长1 0 c m 1 0 0 m ) 照射下， 中药成分的溶液中某些特定成分的元素原子( 通常选用h ) 可以吸收电磁辐射，以吸收频率为横 坐标，峰强度为纵坐标作图，即得该物质的核磁共振谱。1 h n l v i r 指纹法鉴定植物类中药是基 于对鉴定方法的要求、1 h n m r 图谱的特点和一个假设建立起来的。对鉴定方法，要求可靠、 灵敏、简便、价廉。1 i - i n l v l r 图谱具有单一性、全面性、定量性、易辨性的特点。一个假设是： 以一定的程序，可获取植物类中药的特征性化学成分( 或化学成分组) 的总提取物，同时这些 特征的化学成分的含量是相对固定的。因此，在规范的提取、分离程序下，植物类中药的 1 h n m r 图与植物品种问存在严格的对应关系，没有混淆的可能性。图谱中的信号强弱反映了 混合物中各组分的相对含量。在对特征总提物进一步分离得到单体后，通过结构鉴定和n m r 研究，可以对指纹图谱中的各特征谱线进行归属。袁卫梅等田】对天麻、肉桂和牡丹皮的 1 h n m r 指纹图谱进行了研究，分别显示了其主要成分的特征共振信号，可作为这三种中药 的相对标准图谱，分别作为鉴别其品种的参照；秦海林等- 2 4 对人参、天麻、黄连、虎杖、 何首乌和掌叶大黄，唐古特大黄分别选择适当的提取分离工艺，制备其特征总提取物，在n m r 波谱仪上测定中药的1 h n m r 指纹图，对特征总提取物进一步分离，得到单体化合物后，通 过结构鉴定和n m r 研究，以对指纹图中的各特征谱线进行归属，结果表明，所研究的各种 植物药的1 h n m r 指纹图均有高度的特征性和重现性。 1 4 1 0d n a 指纹图谱 现代分子生物学研究发现，中药材所依赖的生物资源“物种”的多样性是由于其基 7 第一章绪论 因多态性的结果。而基因的多态性可在分子水平上检测，这更能代表其变异的遗传标记。d n a 指纹图谱多运用聚合酶链反应0 7 r c ) 从不同生物样品中人工合成d n a 片段，这种d n a 片段 的大小、数目因不同生物而异，因而称之为d n a 指纹图谱。d n a 指纹图谱技术包括a p p c r ( a r b i t r a r y p r i m e rp c r ，引物聚合酶链式反应) 和r a id ( r a n d o ma m p l i f i d p o l y m o r p h i s m ，随机扩增 多态性) 两种指纹图谱技术。由于d n a 分子标记技术直接分析的是生物遗传因子而非表现型， 所以结果可不受环境因素、样品状态和材料来源等外界条件的影响，因此为中药品种鉴别中 极为可靠的手段。限制性内切酶片段长度多态性( r f l p ) 是最常用的构建d n a 指纹图谱的方 法，但该法较为费时费力。而随机扩增多态d n a ( r a p d ) 标记可以在特异d n a 序列不清楚的 情况下检测d n a 的多态性，近几年来得到了较广泛的应用。中国中医研究院中药研究所的 曹晖是国内较早进行该课题研究的学者之一，他先后对苦地胆、蒲公英和人参等同它们的混 淆品进行了比对、鉴别。 1 4 1 1 分子生物色谱指纹图谱 现代分子生物学的发展，逐步阐明了体内神经介质、酶、受体在生命活动中所起的调节 作用。分子生物色谱是把生物体内活性物质如酶、受体、传输蛋白等固定于色谱填料中，利 用中药中活性成分与它们的相互作用，将色谱分离与分子生物医学二者的新成果紧密结合起 来，建立有效成分指纹分析质量控制方法，并为组合中药的研究提供有效分子的结构信息。 对于有效成分尚未清楚的中药，由于分子生物色谱以生物活性分子问广谱的相互作用为基础， 也可利用其指纹分析法进行快速的质量监控。 1 5 中药指纹图谱的构建技术要求 1 5 1 实验要求 构建指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板等必须固定厂家和型号规格，试剂、测定条件等也 必须相应固定制备图谱时必须做到实验操作技术的标准化、规范化。 1 5 2 药材的来源 药材均应固定品种、药用部位、产地、采收期、炮制方法等；药材如需经过特殊炮制( 如醋 制、酒制、炒炭等) ，则应制定原药材和炮制品的指纹图谱，供试品的取样方法应保证供试品的 代表性和均一性。 江南大学硕士学位论文 1 5 3实验样品的制备 根据药材或中成药所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制 备，尽可能考虑到不同成分的兼容性，如样品需要提取、纯化，应对不同的提取溶剂等进行考察， 力求最大限度地保留样品中的化学成分，尽可能使其主要成分在指纹图谱中得到体现【2 5 1 。 1 6 色谱指纹图谱的建立 1 6 1 色谱指纹图谱的指标和参数 归一化面积值：选择某个色谱峰，以它的峰面积作为基准，某化合物的峰面积与它作比 较，由此得到一系列的面积比值。共有峰：在一些可作比较的样品中，具相同a 值的峰是相同 的组分，并认为在1 的比较窗口范围内其比较结果是可信的。这些具相同相对保留值的色谱 峰成为两个( 或多个) 样品的共有峰。重叠率：标准样品与待鉴样品两者的共有峰数乘以2 ， 除以两者出峰数之和，其计算公式为：重叠率= 共有峰数2 ( 标准药材峰数+ 待鉴药材峰数) n 强峰：在众多的色谱峰中，按其面积值的大小，选择列前的几个色谱峰为强峰。这几个强峰的面 积和占整个面积应 7 0 。特征指纹：由一系列色谱峰所组成，是样品间的共性共有峰 的集合，它反映了它们品种的特性。特征指纹的相似率：以特征为基础，求待鉴药材与标准药 材间的相似程度。特征指纹的差异率：以每个特征指纹峰与其相应的标准特征指纹峰的面积 归一化值之间的差与标准特征指纹面积归一化的比值来表示两者的差异程度，总差异率则是 将每个特征指纹峰的差异率求和即得。1 。 1 6 2 指纹图谱的建立步骤 按选定的色谱法建立图谱：选定适宜的参照峰：通过参照峰和各色谱峰的比较求出 相对保留时间值和相对峰面积值：比较时采用窗口为1 ( 或根据实际情况决定) 的尺度来决 定样品间相对保留值的异同，其差异在窗口内者可认为其相同，通过对不同样品间的比较，确 定它们的共有峰：以特征指纹为依据，以所有参与的样品为对象，对每个特征指纹峰求取列 表，即得该品种的标准特征指纹谱，以它作为鉴定所需的比较标准。将待鉴样品的指纹谱与 标准样品的指纹谱进行比较，求取待鉴样品中特征指纹峰的差异率和样品特征指纹的总差异 率。 1 6 3 指纹图谱数字化 中药指纹图谱单凭直观观察很难判别，也不准确。指纹图谱的数字化可以科学地进行图谱 的比较，实际应用中借助于化学计量学和计算机技术将数字化指纹图谱的数字编制成软件以 第一章绪论 供使用，目前中药指纹图谱的计算机解析方法有模糊信息分析法、人工神经网络法及灰色关联 度聚类法等。 1 6 3 1 人工神经网络法 1 9 9 0 年以来，人工神经网络( a r t i f i c a l n e u r a l n e t w o r k ，a n n ) 技术在中药研究领域得到了 大量地应用。它运用相关技术获取全面反映中药内在质量的电信号或图像，综合评价中药。可 以用色谱法( g c 、h p l c 等) 反映中药中化学组分状况：用光谱法反映中药中各种原子的化学环 境：用显微技术( 显微镜、电镜等) 及其他技术反映药材的形态特征。应用a n n 可以更客观、公 正地评价中药。 1 6 3 2 主成分分析 该方法将分散在一组变量上的信息集中到某几个综合指标( 主成分) 上的探索性统计分 析。余杰等通过主成分分析和空间投影变换方法获取中药材质量的特征指纹图谱，对野生、 栽培桑白皮及其伪品共4 2 个样品进行了测定。结果表明，样品鉴别的准确率达到9 0 5 。 1 6 3 3 聚类分析法 它是模糊集理论的重要应用，主要是将实际当中模糊性的问题通过数学手段实现一定的 归类分析其几何意义是：在m 维空间中分布着n 个样品，同类样品相聚集，异类样品相分离。这 样就把中药鉴定这一复杂问题简化为聚类分析的数字问题，通过计算机处理，即可实现中药的 真伪鉴别。”。 1 6 3 4 相关系数与夹角余弦法 中药色谱指纹谱相似度常用的计算方法，一般采用两种算法来进行，一种是相关系数法 另一种是向量夹角余弦法。利用相关系数可以确定两种属性之间的关系，其计算公式为： 相关系数= 向量夹角余弦法是将中药指纹谱数据视为多维空间中的向量，使指纹谱的相似性问题转 化为多维空间中的两个向量间的相似性问题。其计算公式为： 江南大学硕士学位论文 夹角余弦= 置鬈 公式中x 。为某个样品对应保留时间下的峰面积或峰高，y i 为n 批样品( 庀1o ) 对应保留时间下的平均峰 面积或峰高( 对照指纹图谱) 。 计算中药指纹图谱的相似度需先对样品的指纹图谱谱峰进行谱峰匹配，再确定对照指纹 图谱。对照指纹图谱的选择和确定，可以选择典型样品的指纹图谱作为对照指纹图谱，也可选 择共有模式目前，专家更倾向于采用共有模式作为对照指纹图谱。有关共有模式的算法，一般 采用两种算法进行一种是平均矢量( 重心) ，另一种是中位数矢量。其公式分别为： 平均矢量= ( x l j ，x e j ，x ，x q ) n 中位数矢量= m e d i a n ( x l j , x 2 j ，, x u ，x n i ) 式中，x u 为当保留时间r t 气时的数据 一般来说，两种计算方法所得结果基本上一致。由于这两个公式都不算太复杂，因此完全 可以利用e x c e l2 0 0 2 强大的数据处理功能来计算。 把每个色谱指纹图谱都可以看作一组对应保留时间下的峰高( 或峰面积) 的数值，可将这 组数值看作多维空间中的向量，利用c o s x 值来定量表征指纹图谱间的相似性。如果c o s x 越接 近1 则说明两个向量越相似。程翼宇等1 对3 个批次参麦注射液产品指纹图谱相似性的计算 结果表明，夹角余弦测定适于分析评价不同批次间药品的稳定性。王龙星等啪3 根据向量夹角法， 利用计算机对1 1 个不同产地及炮制方法的吴茱萸样品的液相色谱指纹图谱分析，结果表明能 较好地定量评价指纹图谱间的相似性，并清楚的区别了汤洗7 遍后这种炮制方法对指纹图谱 的影响。 1 7 中药指纹图谱的研究重点及关键问题 1 7 1 中药指纹图谱的研究重点 1 7 1 1 中药指纹图谱的测试 针对中药材、炮制、饮片以及中药复方药制剂，研究不同的样品制备方法及有效组份的 切割方法。运用包括色谱、光谱以及多维、联用的分析技术，全面开展指纹图谱的测试，建 立具有普适性意义的、规范化的中药指纹图谱。涉及的具体问题包括中药有效组份的提取分 离方法、色谱分离分析条件、中药指纹图谱分析方法的规