（生物化学与分子生物学专业论文）植物雌激素的筛选及其作用机理的研究.pdf

植物雌激素的筛选及其作用机理的研究 中文摘要 妇女到了更年期和绝经期后，由于卵巢功能的退化，雌激素的 分泌水平下降，导致雌激素的靶器官产生一系列与雌激素缺乏相关 的病理改变如更年期综合症、骨质疏松，以及冠状动脉粥样硬化性 心脏病、神经退行性病变如a l z h e i m e r 病或老年性痴呆的发病率升 高等。( 雌激素替代疗法( e s t r o g e nr e p l a c e m e n tt h e r a p y , e r t ) 被用于 维持体、内的雌激素水平。由于雌激素在体内的广泛作用，长期e r t 会导致一些 , - 4 f l 所不希望的不良反应出现，如增加发生子宫内膜癌、 乳腺癌的危险性。 在寻找具有组织特异性的雌激素的过程中，一类植物中所含有 的具有雌激素样作用的非甾体类化合物一植物雌激素以其诸多优点 吸引了研究者的注意力。它们可以模拟雌激素对骨骼、心血管系统、 神经系统等靶器官的作用，却没有刺激子宫内膜增生的作用。它们 还可减少激素依赖性肿瘤尤其是乳腺癌的危险性，而且也未发现长 期摄入此类物质时对人类的不良反应。文 我们采用盲法从二十个天然产物样品中筛选具有较强雌激素样 作用的新型植物雌激素，并研究其作用机理，为新型植物雌激素的 临床应用奠定理论基础。 一、植物雌激素的筛选i 采用m t t 法，通过测定m c f 7 细胞在不同浓度样品作用下的 相对增殖效率( n e e ) ，检测二十个植物提取物样品的雌激素样活性。 根据对m c f 7 细胞增殖的影响的差异将样品分为三类：( i ) 对 m c f 7 细胞的增殖没有显著影响，( i 【) 有抑制作用，( i i i ) 有促进作用。 结果表明： 1 酚羟基对雌激素样活性很重要； 2 取代基团不同可能完全改变分子的作用； 型塑遂整鎏塑邈麴邈壁墼遂鋈圈鬯墼塑鍪塑墼圈豳塑鲤 3 植物雌激素的作用具有组织特异性。 选取第1 i i 类样品中的h u 7 一p a l l i d o l 进一步研究其作用机理。 二、p a l l i d o l 作用机理的研究 对于金雀异黄素( g e n i s t e i n ) 自4 2 作用机理已经有很多报道，为了解 p a l l i d o l 在细胞水平的作用机理，以g e n i s t e i n 为对照，应用m t r 法 测定p a l l i d o l 和g e n i s t e i n 对细胞增殖的影响；应用竞争性放射配体 结合实验检测它们与雌二醇( e s t r a d i o l ，e 2 ) 竞争性结合雌激素受体 ( e s t r o g e nr e c e p t o r ，e r ) 的能力，并利用报告基因检测它们是否具 有模拟雌激素与e r 结合后的反式激活作用。 ，。 g e n i s t e i n 在1 0 m 1 0 。6 m 浓度范围内促进m c f 7 细胞的生长， 1 0 。却订时抑制m c f 7 细胞的生长；p a l l i d o l 在1 0 g m 一1 0 巧m 浓度范围 对m c f 7 的增殖起促进作用，作用强度随浓度的升高而增强；两者 在浓度1 0 。6 m 时对e r 阴性的细胞株m d a m b 一2 3 1 和h e l a 的增殖 均没有显著影响， 1 0 4 m 时抑制这两株细胞的增殖。 g e n i s t e i n 在浓度 1 0 。6 m 时对小鼠成骨细胞的增殖有促进作用， p a l l i d o l 没有该作用。 g e n i s t e i n 在1 0 。8 m 1 0 - 6 m 浓度范围内可抑制1 0 - 9 me 2 诱导的 m c f 7 细胞的增殖；p a l l i d o l 10 。m g e n i s t e i ns t i m u l a t e st h ep r o l i f e r a t i o no fm o u s e o s t e o c y t e a tc o n c e n t r a t i o n 1o m p a l l i d o lh a sn oe f f e c to nt h ep r o l i f e r a t i o no fm o u s e o s t e o c y t e 。 g e n i s t e i ni n h i b i t st h ep r o l i f e r a t i o no fm c f 7i n d u c e db v10 - 电v ie 2a tl0 “ m lo 。6mw h i l ep a l l i d o lh a sn os u c he f 话c ta tt h es a m ec o n c e n t r a t i o n c i 强as h o w st h e5 0 i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o nf o rg e n i s t e i na n dp a l l i d 0 1 a t e0 9 5 1 0 4 ma n d0 3 2 1 0 6 mr e s p e c t i v e l y t h ea c t i v i t yo fl u c i f e r a s ei n c r e a s ew h i l et h ec o n c e n t r a t i o no fg e n i s t e i n a n dp a l l i d o l i n c r e a s i n g i 1 1t h e r a n g e 1o 。1 0 m l0 曲m a n dt h e a c t i v i t y i n c r e a s i n gc e a s e d a tl0 4 m t h er e s u l t sa b o v es h o w ： 1 p a l l i d o ls t i m u l a t e st h ep r o l i f e r a t i o no fm c f 7c e l lv i ae r - d e p e n d e n t p a t h w a y a t1 0 。9 m 1 0 。6 m ： 2 p a l l i d o li n h i b i t st h e p r o l i f e r a t i o n o fc e l l sv i a e r - i n d e p e n d e n t p a t h w a ya t10 4 m ； 3 p a l l i d o lh a sn oe f f e c to nt h ep r o l i f e r a t i o no fm o u s e o s t e o c y t e ； 儿 4 p a l l i d o lh a sn oa n t i e s t r o g e na c t i v i t y ； 5 p a l l i d o lb i n d se rw i t hh i g ha f f i n i t ya n de n h a n c et h et r a n s c r i p t i o no f r e p o r t e rg e ：n e k e yw o r d s ：e s t r o g e n ；p h y t o e s t r o g e n ；m t t a s s a y ；c o m p e t i t i v e r a d i o l i g a n db i n d i n ga s s a y ；t r a n s i e n t t r a n s f e c t i o n i l l 前言 雌激素( e s t r o g e n ，o e s t r o g e n ) 是一类甾体类激素的。雌二醇 ( e s t r a d i o l ，e 2 ) 是妇女绝经前体内主要的雌激素，也是作用最强的雌 激素，主要由卵巢产生。妇女到了更年期和绝经期后，由于卵巢功 能的退化，雌二醇的分泌水平下降。雌激素水平的下降或不规律变 化导致雌激素的靶器官产生一系列与雌激素缺乏相关的病理改变， 如出现更年期综合症，冠状动脉粥样硬化性心脏病、骨质疏松、 a l z h e i m e r 病或老年性痴呆等神经退行性病变的发病率升高等。雌激 素替代疗法( e s t r o g e nr e p l a c e m e n tt h e r a p y ，e r t ) 被用于维持体内 的雌激素水平，缓解更年期综合征，降低冠状动脉粥样硬化性心脏 病、a l z h e i m e r 病或老年性痴呆的发病率，治疗骨质疏松等。e r t 需 长期服药，由于雌激素在体内的广泛作用，一些人们所不希望产生 的副作用也随之出现。最突出的是雌激素促进子宫内膜增生，导致 子宫内膜癌发病率的升高。对于e r t 是否升高乳腺癌的发病率，各 家报道还不完全一致 i , 2 l 。 雌激素通过雌激素受体( e s t r o g e nr e c e p t o r , e r ) 起作用。e r 是一 个受配体激活的反式作用因子，即e r 与雌激素结合后，其构象发 生改变，继而形成二聚体，结合于染色质特定的d n a 序列一雌激 素反应元件( e s t r o g e nr e s p o n s ee l e m e n t ，e r e ) 上，调节特定基因的 转录【3 1 。雌激素对机体的广泛作用与配体的结构、e r 的亚型、雌激 素反应性基因启动子的类型、以及调节细胞对e r - 配体复合物反应 的共激活因子扣共抑制因子的性质和它们之间的平衡有关1 4 1 。雌激 素除对乳腺、子宫、阴道、卵巢、睾丸、附睾、前列腺等生殖器官 正常功能的维持起作用【5 j 夕r ，还对心血管系统 4 - 9 、中枢神经系统( i 】 和骨骼的生长、骨密度的维持 2 - 1 4 】起很多有益的作用： 1 雌激素对心血管系统的保护作用1 1 , 7 1 ：a 雌激素影响肝细胞脂 类代谢，升高高密度脂蛋白( h d l ) 胆固醇，降低低密度脂蛋白( l d l ) 胆固醇和甘油三脂，但脂类的变化通过什么环节对心脏产生有益作 用尚不明了，而且一些临床研究认为雌激素对心脏的有益作用中只 砑士鞔黝凌萋：撩鬻辫鬻黧蓊黎瓣鬻瀚黧戮艇黧篱骥黪鬻飘鬻慰翼黧醺 有1 1 3 到l 2 可归功于雌激素对脂蛋白的作用m 7 1 ；b 雌激素通过对 e n o s n o ( e n d o t h e l i a ln i t r i co x i d es y n t h a s e n i i r i co x i d e ) g 统的调节产 生对血管系统的有益影响1 4 , 1 3 1 。此作用分为快速作用( 雌激素直接激 活e n o s ) 和长程作用( 雌激素上调e n o s 的表达) 两种途径；并且认为 这两种作用都是通过雌激素与e r 的相互作用所介导。n o 是一个血 管扩张剂，它可与c g m p 协同作用，打开血管平滑肌细胞上的钙离 子激活的钾离子通道，从而引起血管的扩张。n o 还可抑制血小板 和巨噬细胞对动脉内皮细胞的黏附作用。c 雌激素促进损伤的血管 内皮细胞的修复。体外实验证实雌激素抑制血管平滑肌细胞的迁移 和增殖，促进血管内皮细胞的生长【7 1 。 2 由于成骨细胞、破骨细胞、巨噬细胞和t 淋巴细胞均有雌激 素受体存在，雌激素很可能对骨组织有直接作用。雌激素可抑制单 核细胞释放白细胞介素1 ( 几，1 ) ，而i l 1 是很强的破骨细胞刺激因 子；雌激素还可能通过对成骨细胞的直接作用而促进骨形成 1 1 。人 体在青春期的快速生长主要是雌激素的作用：雄激素不敏感( a n d r o g e n i n s e n s i t i v i t ys y n d r o m e ，a i s ) ) l 童发身期最大生长速度出现的年龄( 1 2 7 岁) 与正常儿童接近( 正常女孩和男孩分别为1 2 4 和1 3 9 岁) ，而且患 a i s 的4 6x y 女孩在摘除睾丸后再给予雌激素后很快出现快速生 长。另一方面，雌激素又促进生长板( g r o w t hp l a t e ) 的骨化，从而停 止生长。在纯合的e rd 突变的男性和芳香化酶( a r o m a t a s e ) c g t 乏病 人中发现尽管生殖器和体毛的发育正常，但由于他们的生长板不能 骨化，于是他们的生长就不会停止【h 1 。 3 雌激素对中枢神经系统的作用表现为：a 对卵巢一腺垂体下丘 脑轴的反馈调节；b 对神经元的保护作用，如明显改善绝经后妇女 的认知功能、降低a l z h e i m e r 病和老年性痴呆的发病率、加速中风 等神经损伤后的修复等。研究认为雌激素对神经元的保护作用与雌 激素依赖性的增强细胞存活、神经元再生，促进神经元轴突的萌发、 再生，及增强突触的传导等作用有关【h 1 。这些作用可能：a 通过对 神经递质受体的直接调节、抗氧化作用或是一些还没有发现的膜受 体起作用；b 通过与雌激素受体的作用调节特定基固如参与凋亡、 堕生塑选鳖鋈鎏蛰鍪邈鍪篱豳麴篓鋈塑筮邈避鋈塑鍪醚 轴突再生及营养的基因的表达【1 5 】。 为保留雌激素对特定组织的有益作用而避免其对其它组织的不 良影响，j k 4 f 致力于寻找具有组织特异性的雌激素，提出了选择， 生 雌激素受体调节剂( s e l e c t i v ee s t r o g e nr e c e p t o rm o d u l a t o r , s e r m ) 的概 念。如临床使用了2 0 年的乳腺癌化疗药物他莫昔芬( t a m o x i f e n ) ，可 抑制e r 阳性乳腺癌的生长，降低血清l d l 浓度，防止骨质疏松， 却有促进子宫内膜增生的作用 1 6 1 。 在对s e r m 的研究中，植物雌激素以其诸多优点吸引了研究者 的注意力。二十世纪初发现某些饲料植物对未成熟的动物诱发动情， 或者扰乱正常的生殖。二十世纪四十年代发现导致澳大利亚羊繁殖 不正常的主要原因是车轴草( t r i f o l i u ms u b t e r r a n e u m 上车轴草的一 种异黄酮组分金雀异黄素( g e n i s t e i n ) 与羊的不育有关【1 7 1 。随后发现其 它的一些植物成分或是植物成分的代谢产物也具有雌激素样活性， 植物中所含有的具有雌激素样作用的非甾体类化合物称为植物雌激 素( p h y t o e s t r o g e n ) 1 8 1 。近十年来发现了大量的具有雌激素样活- 陛的植 物成分，经提纯后进行了作用和作用机理的研究 t 8 - 2 1 】。目前认为有 四类非甾体类化合物具有雌激素样活性：异黄酮类( i s o f l a v o n e s ) 、 木脂素类( 1 i g n a n s ) 、可麦斯烷类( c o u m e s t a n s ) 及二羟苯甲酸内酯 类( r e s o r c y l i ca c i dl a c t o n e s ) t 2 2 1 。它们的分子结构与甾体类雌激素有差 异，却可以与e r 高亲和结合，激活受调控基因的表述，促进一些 激素敏感性肿瘤细胞( 如人乳腺癌细胞m c f 7 ，e r 阳性) 的生长等【1 8 。 2 1 1 。流行病学调查显示保持东方饮食习惯的人群激素依赖性肿瘤尤 其是乳腺癌的发病率远低于保持西方饮食习厨的人群，两者的主要 区别在于前者的饮食中植物性食品，尤其是豆类食品占很大比重 川。 两种大豆来源的异黄酮类植物雌激素金雀异黄素和大豆素( d a i d z e i n ) 与这种差异有关 2 4 , 2 5 1 。异黄酮类植物雌激素可降低血清总胆固醇、 l d l ，轻微缓解潮热等更年期症状；但对h d l 没有明显影响，它在 骨质疏松的防治上的作用各个报道还不一致【2 6 1 。植物雌激素在不同 的组织可表现出拟或抗雌激素样作用。目前还没有此类物质刺激子 宫内膜增生的证据，而且也没有发现长期摄入此类物质对人类有不 良作用。既然植物雌激素有雌激素样活性，又没有甾体类雌激素促 进子宫内膜增生的效应，而且还对乳腺癌的发生有预防作用，在e r t 中使用这样一种s e r m 将是比较安全的。 在本文中，我们从二十个天然产物样品中筛选具有较强雌激素 作用的新型植物雌激素，并研究其细胞水平的作用机理。 2 3 4 7 8 9 1 0 1 l 1 2 参考文献 d e c h e m e ya l a nh ，p e m o l lm a r t i n l d i a g n o s i s & t r e a t m e n t 刘新民等主译 京：人民卫生出版社1 9 9 8 ，1 0 5 5 1 0 7 6 c u r r e n to b s t e t r i c & g y n e c o l o g i x 现代妇产科疾病诊断与治疗北 郑怀美主编现代妇产科学上海：上海医科大学出版社1 9 9 8 ，4 9 1 5 0 4 沈翊诽主编真核基因表达调控北京：高等教育出版社1 9 9 7 ，2 3 5 2 4 9 k a t z e n e l l e n b o g e nb s ，c h o ii ，d e l a g e m o u r r o u x r e ta 1 m o l e c u l a r m e c h a n i s m so fe s t r o g e na c t i o n ：s e l e c t i v e l i g a n d s a n dr e c e p t o r , js t e r o i d b i o c h e mm o lb i o l2 0 0 0 7 4 ( 5 ) ：2 7 9 - 8 5 k a t z e n e l l e n b o g e nb s e s t r o g e nr e c e p t o r s ：b i o a c t i v i t i e sa n di n t e r a c t i o n sw i m c e l ls i g n a l i n g p a t h w a y s b i 0 1 r e p r o d 1 9 9 6 5 4 ：2 8 7 2 9 3 m e n d e l s o h nm e ，k a r a sr h ，m e c h a n i s m so fd i s e a s e ：t h ep r o t e c t i v ee f f e c t s o f e s t r o g e no nt h ec a r d i o v a s c u l a rs y s t e m ，n e w e n 9 1 j m e d 1 9 9 9 ，3 4 0 ：l 8 0 1 1 8 1 1 m e n d e l s o h nm e m e c h a n i s m so f e s t r o g e n a c t i o ni nt h ec a r d i o v a s c u l a rs y s t e m j s t e r o i db i o c h e m m 0 1 b i 0 1 2 0 0 0 7 4 ：3 3 7 3 4 3 s t a m p f e rm _ j ，c o l d i t zg a ，w i l l e t tw c ，e ta lp o s t m e n o p a u s a le s t r o g e n t h e r a p y a n dc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e n e w e n 甜j m e d 1 9 9 1 ，3 2 5 ：7 5 缸7 6 2 b e l c h e t zr e h o r m o n a lt r e a t m e n to fp o s t m e n o p a u s a lw o m e n n e w e n 9 1 j m e d 1 9 9 4 3 3 0 ：1 0 6 2 一1 0 7 l p f a f f d a u t o m d i o g a p l i c l o c a l i z a t i o no fr a d i o a c t i v i t yi nr a tb r a i na f t e r i n j e c t i o no f t r i t i a t e ds e x h o r m o n e s s c i e n c e1 9 6 8 ，1 6 1 ：1 3 5 5 1 3 5 6 z h uy ，y e np ，c h i nw e ta 1 e s t r o g e na n dt h y r o i dh o r m o n ei n t e r a c t i o no n r e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o n p r o c n a t l a c a d s c i u s a 19 9 6 ，9 3 ：12 5 8 7 - 1 2 5 9 2 s m i t h e p ，b o y dj ，f r a n k g r e t a 1 e s t r o g e n r e s i s t a n c ec a u s e d b y a m u t a t i o ni nt h e e s t r o g e nr e c e p t o rg e n e i na m a n n e w e n 9 1 j m e d 1 9 9 4 3 3l ：1 0 5 “1 0 6 1 m o r i s h i m aa ，g m m b a c hm m ，s i m p s o ne r e ta 1 a r o m a t a s ed e f i c i e n c yi n d 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 l 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 m a l ea n df e m a l es i b l i n g sc a u s e db yan o v e lm u t a t i o na n dt h ep a y s i o l o g i c a l r o l eo f e s t r o g e n s c l i n e n d o c f i n 0 1 m e t a b 19 9 5 8 0 ( 1 2 ) ：3 6 8 9 - - 3 6 9 8 r i t z e ne m ，n i l s s o no ，g r i g e l i o n i e n eg ，e ta 1 e s t r o g e n sa n dh u m a n g r o w t h j s t e r o i db i o c h e m m 0 1 b i 0 1 2 0 0 0 7 4 ：3 8 3 3 8 6 g a r c i a s e g u r al m ，a z c o i t i ai ，d o n c a r l o sl l n e u r o p r o t e c t i o nb ye s t r a d i 0 1 p r o g n e u r o b i o l2 0 0 l ，6 3 ( 1 ) ：2 9 6 0 d a r d e sr c ，j o r d a nv c ，n o v e la g e n t st om o d u l a t eo e s t r o g e na c t i o n b rm e d b u l l 2 0 0 0 ，5 6 ( 3 ) ：7 7 3 - 7 8 6 h a r b o m e j b ，m a b r yt j ，m a b r yh t h cf l a v o n i o d s 戴伦凯等译黄酮类化 舍物北京：科学出版社1 9 8 3 ，3 3 0 3 3 1 m a r t i np e ，h o r w i t zk b ，r y a nd s ，e t a 1 p h y t o e s 仃o g e ni n t e r a c t i o nw i t h e s t r o g e nr e c e p t o r s i nh u m a nb r e a s tc a n c e rc e l l s e n d o c r i n o l o g y 1 9 7 8 1 0 3 ：1 8 6 0 1 8 6 7 w a n gt y ，s a t h y a m o o r t h yn ，p h a n gj m m o l e c u l a re f f e c t so fg e n i s t e i no n e s t r o g e nr e c e p t o rm e d i m e dp a t h w a y s c a r c i n o g e n e s i s1 9 9 6 ，l7 ( 2 ) ：2 7 1 2 7 5 m i k s i c e kr j c o m m o n l yo c c u r i n gp l a n tf l a v o n o i d sh a v ee s t r o g e n i ca c t i v i t y m 0 1 p h a r m 19 9 3 ，4 4 ：3 7 4 3 m a k e l as e ta 1 d i e t a r ye s t r o g e n sa c tt h r o u g he s t r o g e nr e c e p t o r - m e d i a t e d p r o c e s s e s a n ds h o wn o a n t i e s t r o g e n i c i t y i nc u l t u r e db r e a s tc a n c e rc e l l s e n v i r o nh e a l t h p e r s p e c t1 9 9 4 ；1 0 2 ：5 7 2 5 7 8 许铭，徐光植物雌激素在肿瘤细胞中的作用国外医学肿瘤学分册 2 0 0 0 ，2 7 卷增刊：6 2 6 5 d a n nj e j r c a n c e r e p i d e m i o l o g y i n p o p u l a t i o n s o ft h eu n i t e ds t a t e s - e m p h a s i so nh a w a i ia n dc a l i f o m i a - a n dj a p a n c a n c e rr e s 1 9 7 5 3 5 ：3 2 4 0 - 3 2 4 5 a d l e r c r e u t zh ，m a r k k a n e nh ，w a t a n e b es p l a s m ac o n c e n t r a t i o no f p h y t o e s t r o g e n si nj a p a n e s em a n l a n c e t1 9 9 3 ，3 4 2 ：1 2 0 9 1 2 1 0 x u x ，w a n gh j ，m u r p h yp a ，酊a 1 d a i d z e i ni sa m o r eb i o a v a i l a b l es o y m i l k i s o f l a v o n et h a ni sg e n i s t e i ni na d u l tw o m e n jn u t r 1 9 9 4 ，1 2 4 ：8 2 5 8 3 2 v i n c e n ta ，f i t z p a t r i c kl a s o yi s o f l a v o n e s ：a r et h e yu s e f u li n m e n o p a u s e ? m a y o c l i np r o c2 0 0 0 ，7 5 ( 1 1 ) ：1 1 7 4 - 1 1 8 4 5 第一部分檀物雌激素的筛选 植物雌激素( p h y t o e s t r o g e n ) 是一类来源于植物的具有弱雌激素样 作用的非甾体类化合物【”。已有大量实验证明1 1 - 6 1 植物雌激素可模拟 内源性雌激素与雌激素受体的相互作用过程，如促进动物子宫的增 生，刺激雌激素敏感性细胞的增殖等。 雌激素的检测方法有动物实验和细胞培养等。动物实验是通过 观察待测样品对小鼠子宫的增重效应评价样品的雌激素样活性；细 胞培养多使用雌激素受体( e s t r o g e nr e c e p t o r , e r ) 阳性的人乳腺癌细 胞株m c f 7 ，通过检测样品对m c f 7 增殖的促进作用来间接反映待 测样品的雌激素样活性。与动物实验相比，细胞培养具有灵敏，快 速，操作简便等优点【7 1 。 我们应用m t t 法，通过细胞培养从本校药学院天然药物化学教 研室胡昌奇教授提供的二十个天然产物样品中筛选具有较强雌激素 作用的新型植物雌激素，为新型植物雌激素的作用机理研究奠定基 础。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 细胞株 m c f 7 细胞株( 人乳腺癌细胞株，雌激素受体阳性) 购自 a t c c ( a m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n ) ，常规培养于含1o 小牛血 清和5 n g m l 牛胰岛素+ 1 0 0 i u m l 青霉素+ 1 0 0ug m l 链霉素的含酚 红r p m l1 6 4 0 ，含5 c o ，的3 7 。c 温箱中。 1 1 2 检测样品 天然产物样品由本校药学院天然药物化学教研室胡昌奇教授提 供。 i 1 3 试剂 r p m i1 6 4 0 ( 含不合酚红) 、购自g i b c o b r l 公司；二甲亚砜 丝丝丝羔竺鍪鋈釜鳖i 鳖l 鎏墼鍪霪羹篓麴墼塑豳墼幽l | 鲤塑垒 ( d i m e t h y ls u l f o x i d e ，d m s o ) 、牛胰岛素( b o v i n ei n s u l i n ) 、金雀异黄 素( g e n i s t e i n ) 、1 7p 一雌二醇( 1 7p e s t r a d i o l ，e 2 ) 购自s i g m a 公司； d e x t r a nt 7 0 购自p h a r m a c i a b i o t e c h 公司；胰蛋白酶、小牛血清购自 实生公司。其它试剂为国产分析纯。 1 1 4 培养液和溶液 培养液a ：含酚红r p m i1 6 4 0 + 2 5 m mh e p e s ； 培养液b ：不舍酚红r p m i1 6 4 0 + 2 5 m mh e p e s ： 培养液c ：培养液a + 1o 灭活的小牛血清+ 1 0 0 i u m l 青霉素 + 1 0 0 “g m l 链霉素； 培养液d ：培养液c + 5 n g m l 牛胰岛素； 培养液e ：培养液b + 10 d c c 处理的小牛血清+ 5 n g m l 牛胰 岛素+ 1 0 0 i u m l 青霉素+ 1 0 0 g m l 链霉素； 细胞消化液：0 0 5 胰蛋白酶+ 0 0 2 e d t a 于p b s 。 1 2 方法 1 2 1 m t r 法中细胞数与吸光度间的线性关系 1 2 1 1 9 6 孔板中不同浓度细胞的接种 常规培养的m c f 7 和h e l a 细胞近融合时消化，重悬于培养液c ， 以血细胞计数板计数。9 6 孔细胞培养板中加入细胞，使h e l a 细胞浓 度为0 5 1 0 2 l 、1 1 1 0 3 孑l 、2 2 1 0 3 孑l 、4 4 1 0 3 1 j t l 、6 6x1 0 3 1 孑l 、8 8 1 0 3 孑l 、1 1 x1 0 4 孑l 、2 2 1 0 4 t ；t b 、4 4 1 0 4 孑l ，每浓度五复 孑l ：m c f 7 细胞浓度为1 2 1 0 3 ：t l 、2 5 1 0 3 孑l 、5 7 1 0 3 孑l 、1 1 1 0 4 孑乙、2 3 1 0 4 1 t l , 、4 6 1 0 4 ：f l ，每浓度五复孔。2 4 小时细胞贴壁 后进行m t t 分析。 1 2 1 2m t t 分析 参考p l u m b l l 3 1 等：9 6 孔板每孔加5 0 “i5 m g m l 的m t i ( 溶- f f - - p b s ) 于2 0 0 “l 培养液中，4 小时后小心移出各孔内的培养液，每孔内加 入2 0 0 ld m s o + 2 0 “ls o r e n s e n s 甘氨酸缓冲液( o 1 m 甘氨酸 + o 1 mn a c l ，以0 1 n n a o h 调节p h 至1 0 5 ) ，振摇使紫色f o r m a z a n 结晶完全溶解，3 0 分钟内使用5 7 0 n m 滤光片于b i o r a d5 5 0 酶标 仪测定吸光度。 7 碾 张教；麓蘩瓣懑嚣鬟蒸鍪蘩；藩羹灞溺鹂爱溯瀚黼女粒鳓遗 1 2 2 二十个样品用m c f 7 细胞进行的初步筛选 1 2 2 1 样品的溶解 样品称量使用m e i t l e ra e 2 4 0 天平，精度为1 0 一g 。e 2 和样 品溶于d m s o 。梯度稀释样品得到高( 1 0 之m ) 、中( 1 0 4 m ) 、低( 1 0 击m ) 三个浓度的母液，作用于细胞时稀释1 0 0 倍于培养液e 中分别对应 于终浓度1 0 。4 m 、1 0 。6 m 、1 0 罐m 。 1 2 2 2 葡聚糖包被的活性炭( d e x t r a nc o a t e dc h a r c o a l ，d c c ，f o r b o v i n es e r u mt r e a t m e n t ) 处理小牛血清 5 9 活化的活性炭+ o 5 9 d e x t r a nt 7 0 悬浮于1 0 0 m l 双蒸水，室温搅 拌四小时以上，分做两份，3 0 0 0r p m 离心5 分钟，弃上清；取一份沉 淀，加入5 0 m l 已灭活的小牛血清，室温轻微搅拌2 小时，7 0 0 0r p m 4 离心2 0 分钟；上清倒入另一份d c c 中，室温轻微搅拌2 小时，7 0 0 0 r p m4 c 离心2 0 分钟，上清再于4 离心7 0 0 0r p m 2 0 分钟，以0 2 2 “m 微孔滤膜过滤除茵，一2 0 c 4 采存- 备用。 1 2 2 3m t t 法测定细胞相对增殖效率( r e l a t i v ep r o l i f e r a t i o n e f f i c i e n c y , r p e ) 常规培养于培养液d 的m c f 7 细胞近8 0 融合时换培养液e ， 2 4 小时后常规消化，重悬于培养液e ，以血细胞计数板计数。9 6 孔 板中加入细胞，使细胞浓度约为2 1 0 3 孔。2 4 小时后换液，力a x 待 检测的样品，计为第0 天。各浓度的样品1 ：1 0 0 稀释于培养液e ， 每浓度五复孔，每种样品至少重复三次。以1 1 0 0 的d m s o ( 溶于 培养液e ) 为阴性对照，l o 母me 2 为阳性对照。第2 天( 加入样品 后4 8 小时) 换液，保持9 6 孔板各孔作用因素不变。第4 天进行m t t 分析，方法同1 2 1 2 。各样品孔吸光度均值与对照孔吸光度均值的 比值定义为相对增殖效率( r e l a t i v ep r o l i f e r a t i o ne f f i c i e n c y ，r p e o 统计检验使用t 检验，显著性差异定为p 0 0 5 。 2 结果 2 1m t t 分析中，细胞数量与吸光度之间的线性关系 分别以m c f 7 和h e l a 细胞为模型，按照实验方法所述进行m t t 8 分析，线性回归结果- i 口t ( f i g 1 ) 。m c f 7 细胞( a ) 在细胞数从1 2 1 0 3 孑l 到4 6x1 0 4 孑t , 、吸光度从0 0 7 4 o 0 0 1 7 到1 2 9 6 土o 0 3 9 4 ； h e l a 细胞( b ) 在细胞数从0 5 l 时孔到1 1 1 0 4 ：t t 、吸光度从0 0 6 7 士o 0 2 8 7 到o 7 7 2 土0 0 2 3 3 的范围内均存在良好的线性关系，以m t t 法来间接反映细胞在外界刺激作用下的增殖效应是可行的。 3 0323 43638404 2 4 44648 l o go o n c ：n t r a t l o ni l o g m ) 3 d3 23 43 53 8 4o42 l o gc o n c e n t r a t i o n ( l o g m ) f i g 1t h e l i n e a rr e l a t i o n s h i po fc e l ln u m b e ra n dt h em t t f o r m a z a b p r o d u c t i o n ( a ) m c f 7 ， ( b ) h e l a c e l l sw e r ep l a t e di n9 6w e l le e l lc u l t u r ep l a t ea tar a n g eo fc o n c e n t r a t i o n sa n d a l l o w e dt oa d h e r ef o r2 4h o u r s c e l l sw e r ei n c u b a t e d 讪mm 兀f o r4 h m e d i u mw a s r e m o v e da n dm t t - f o r m a z a nc r y s t a l sw e r ed i s s o l v e di nd m s oa n ds o r e n s e n sg l y c i n e b u f f e r ( o 1m 出y c i n e ，0 1m n a c l ，p h 10 5 ) t h ea b s o r b a n c ew a sm e a s l l r e da t5 7 0 n m v a l u e sw e r e e x p r e s s e d a sm e a n s d ，：c o r r e l a t i o nc o c f f i c i e n t 9 蚰 o 卜n a o 们 蛐 帖 蜩 啦 o 卜啡凸。 堑兰丝丝墨生：鋈塑受i 茎i 一：量茎二二 二堑壹釜鋈邈鎏耋萋墼 2 2 二十个样品用m c f 7 细胞进行的初步筛选 以m c f 7 细胞的增殖为效应终点筛选具有雌激素样作用的样 品。应用m t t 法间接反映分析终点的活细胞数，各作用因素组所得 的吸光度均值与d m s o 作用组所得的吸光度均值之比定义为相对增 殖效率( r p e ) 。根据r p e 的不同，将所检测的二十种样品分为三 大类： 一、对m c f 7 的增殖没有显著影响的样品( f i g 2 ) ，包括h u 2 、 h u 5 、h u 8 、h u 1 0 、h u 1 1 、h u 一1 9 共六个样品； 2 0 1 _ 5 固 皇 1 。o o5 0 0 料 i h 一： l们阡 一一 l州 0- 9 864 l o gc o n ce n f t a t i o n ( l o gm ) 豳d ms o 口e s t r a d i o h 一2 h 5 h 8 h l0 口h 一1 l h 19 f i g 2s a m p l e st h a tw i t h o u te f f e c to nt h eg r o w t ho fm c f 7 c e l l sw e r ei n c u b a t e dw i 也t h e i n d i c a t e dc o n c e n t r a t i o n so f s a m p l e si np h e n o lr e df r e er p m i1 6 4 0s u p p l e m e n t e dw i t h1 0 d c ct r e a t e db o v i n es e r u ma n d5 m g m lb o v i n ei n s u l i nf o r4 d a y s t h em e d i u m w a s r e p l a c e d o nd a y2w h i l et h ei n d i c a t e dc o n c e n t r a t i o