（应用化学专业论文）新型复合载体PEISiOlt2gt的制备及对青霉素酰化酶的固定化研究.pdf

中北大学学位论文 新型复合载体p el si0 ：的制备及其对青霉素酰化酶的固定化研究 摘要 本文通过y 一氯丙基三甲氧基硅烷的媒介，将聚乙烯亚胺( p e i ) 化学偶联在硅胶微 粒表面，制备了新型复合载体p e i j s i o z ，最终制得了活性高且稳定性好的固定化青霉素 酰化酶。通过红外光谱、电导滴定对复合载体表面的化学结构与组成进行了表征；通过 测定复合载体表面p e i 的偶合量，考察了各种反应条件对复合载体制各的影响规律，实 验所得偶联反应的适宜条件为：反应温度9 0 9 4 。c ；反应时间5 h ；p e i 水溶液浓度为 4 5 9 1 0 0 m l 5 0 9 1 0 0 m l ；聚乙烯亚胺水溶液与氯丙基化硅胶质量比为5 ：l 。在实旅酶的 固定化过程中，考察了戊二醛用量、p h 值、固定化温度、固定化时间以及给酶量等条 件对固定化青霉素酰化酶表观活力、活力回收率等性能的影响，实验所得最优固定化条 件为：o 5 9 表面键合有9 p e i 的复合载体，使用1 的戊二醛，在p h 值为7 9 2 缓冲溶 液中，酶液用量o 0 5 m l ，于3 0 。c 下进行1 4 1 5 h 的固定化反应，所制固定化酶的活力 为1 1 8 u g ，活力回收率为4 6 。结合复合载体在固定化酶前的t 电位及酶固定化反应 过程的特点，探索了复合载体p e i s i 0 2 固定化酶的作用机理。研究结果表明：复合载体 p e i s i 0 2 表面带有大量的胺基，通过化学键合( 胺基的s c h i f f 反应) 与物理吸附( 质子 化胺基与酶分子的静电吸引作用) 两种作用将酶分子快速、高效地固定在载体上，充分 地保持了酶分子的构象，获得了较高活性的固定化酶。为了考察所制固定化酶的性能， 测定了游离酶与固定化酶催化反应的最适p h 值、最适温度、固定化酶的连续操作稳定 性、二者对金属离子的耐受性能及米氏常数。实验结果表明：游离酶和固定化酶催化反 应的最适p h 值分别为9 3 2 和7 3 4 ，最适温度分别为5 0 。c 和4 0 ，固定化酶具有赵好 的连续操作稳定性，且比游离酶具有较好的抗金属离子性能；二者的米氏常数分别为 2 3 8 l o m o l 几和5 4 4 1 0 2 m o l l 。 关键词硅胶，聚乙烯亚胺，复合载体，青霉素酰化酶，固定化 中北大学学位论文 s t u d i e s0 1 1t h ep r e p a r i n go fn o v e lc o m p o s i t es u p p o r tp e i s i 0 2 a n di m m o b i l i z a t i o no fp e n i c i l l i na c y l a s eo ni t a u t h o r ：w a n gx u p e n g a d v i s o r ：g a ob a o j i a o a b s t r a c t p o l y e t h y l e n e i m i n e ( p e i ) w a sc o u p l e dc h e m i c a l l yt o s u r f a c eo fs i l i c ag e lp a r t i c l e s t h r o u g ht h ei n t e r m e d i u me f f e c to fy c h l o p r o p 3 ，l t r i m e t h o x y s i l a n e ，t h en o v e lc o m p o s i t e c a r r i e ro fp e j s i 0 2w a sp r e p a r e d ，a n df i n a l l yi m m o b i l i z e dp e n i c i l l i na c y l a s ew i t hl l i g h e r a c t i v i t ya n ds t a b i l i t yw a so b t a i n e d t h ec h e m i c a lc o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r eo f t h es u r f a c eo f c o m p o s i t ec a r r i e rw e r ec h a r a c t e r i z e db yu s i n gf i t ra n dc o n d u c t m e t r i ct i t r a t i o nm e t h o d t h e i n f l u e n c e so fv a r i o u sf a c t o r so nt h ep r e p a r i n go ft h ec a r r i e rw e r ee x a m i n e dv i am e a s u r i n g c o u p l e da m o t m to fp e io nt h ec o m p o s i t ec a r r i e r t h ef a v o u r a b l er e a c t i o nc o n d i t i o f i sa r e ：t h e r e a c t i o nt e m p e r a t u r eo f9 0 c 9 4 ，t h er e a c t i o nt i m eo f5 ha n dt h ec o n c e n t r a t i o no f 4 5 9 1 0 0 r a l 5 0 9 1 0 0 m lf o rp e is o l u t i o n ，t h er a t i oo fw e i g h to fp e is o l u t i o nt oc p s 1 0 2i s 5 ：1 w h e nt h ep e n i c i l l i na c y l a s ew e r ei m m o b i l i z e do nt h ec o m p o s i t ec a r r i e ro fp e i j s i 0 2 ，t h e e f f e c t so fv a r i o u si m m o b i l i z i n go nt h ea p p a r e n ta c t i v i t ya n dr e c o v e r yr a t i oo fa c t i v i t yo f i m m o b i l i z e dp e n i c i l l i na c y l a s ew e r ee x a m i n e d ，s u c ha st h ea m o u n to fg l u t a r a l d e h y d e 、p h 、 t i m e 、t e m p e r a t u r ea n dt h eu s e da m o u n to fe n z y m e t h ea p p r o p r i a t ei m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n s f o r0 5 9o f t h ec o m p o s i t es u p p o ap e f s i 0 2t ow h i c h9 o f p e lw a sl i n k e da r ea sf o l l o w s ；1 o f g l u t a r a l d e h y d e ，7 9 2o f p h ，3 0 。co f t e m p e r a t u r e ，1 4 1 5 ho f t i m ea n do 0 5 m lo f o r i g i n a l e n z y m es o l u t i o n u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h eo b t a i n e di m m o b i l i z e dp e n i c i l l i na c y l a s ep o s s e s s 1 18 u go fa c t i v i t ya n d4 6 o fr e c o v e r yr a l i oo fa c t i v i t y , w ee x p l o r e dt h ei m m o b i l i z a t i o n m e c h a n i s mo ft h ec o m p o s i t ec a r r i e rf o rp e n i c i l l i na c y l a s ew i t ht h ez e t ae l e c t r i cp o t e n t i a l so f t h ec a r t i e rb e f o r ee n z y m ew e r ed e t e r m i n e da n dt h ec h a r a c t e r so f i m m o b i f i z a f i o np r o c e s s t h e e x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e d ：o w i n gt oal a r g eq u a n t i t yo f ，a m i d oc o n t a i n e do nt h e m a c r o m o l e c u l a rc h a i n so fp e i ，t h e r ei sn o to n l yc h e m i c a ll i n k a g e ( s c h i f fr e a c t i o no fa m i d o ) ， b u ta l s oi sag r e a td e a lo fp h y s i c a la d s o r p t i o n ( e l e c t r o s t a t i ca d s o r p t i o nb e t w e e ne l e c t r i f e r o n s a n a i d oa n de n z y m em o l e c u l a r ) d u r i n ge n z y m eh n m o b i l i z a t i o no nt h es u r f a c eo fp e u s i 0 2 t h e 中北大学学位论文 c o m b i n a t i o no fas p o to fc h e m i c a lc o v a l e n ta n dag r e a td e a lo fp a y s i c a la d s o r p t i o nr e s u l t si n f a s ta n ds t a b l ei m m o b i l i z a t i o na n de x c e l l e n tm a i n t e n a n c eo ft h em o l e c u l a i rc o n f o r m a t i o no f e n z y m e ，a n dl e a d st oh i 曲a c t i v i e z o ft h ei m m o b i l i z e de n z y m e f o re x a m i n i ngt h e p r o p e r t i e so fi m m o b i l i z e dp e n i c i l l i na c y l a s e ，s u i t a b l ep ha n dt e m p e r a t u r eo ff r e ee n z y m e a n di m m o b i l i z e de n z y m ec a t a l y s i sr e a c t i o nw a se x a m i n e d ，c o n t i n u e do p e r a t i o ns t a b i l i t ya n d s t a b i l i t yi nm e t a li o n i cs o l u t i o n a nw a ss t u d i e d ，a tt h es a m et i m e ，m i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n to f f r e ee n z y m ea n di m m o b i l i z e de n z y m ew e r ea l s om e a s u r e d t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e d t h eo p t i m u mp ho fe n z y m ec a t a l y s i sr e a c t i o nw e r e9 3 2a n d7 3 4 ，t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e w e r e5 0 a n d4 0 f o rf r e e e n z y r a ea n di m m o b i l i z e de n z y m e ，r e s p e c t i v e l y t h e i n m a o b i l i z e de n z y m ei sm o r es t a b l et h a nf r e ee n z y m et ot h em e t a li o n i cs o l u t i o n m aa n d m i c h a e l i s - m e n t e nc o n s t a n to fi m m o b i l i z e de n z y m ea n df l e ee n z y m ew e r e2 3 8 1 0 1 m o l l a n d5 4 4 1 0 2 m 0 1 l ，r e s p e c f i v e l k e y w o r d s s i l i c a g e l ，p o l y e t h y l e n e i n a i n e ，c o m p o s i t e c a r r i e r , p e n i c i l l i n a c y l a s e ， i m m o b i l i z a t i o n 原创、性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在指导教师的指导下， 独立进圩研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究 作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的 法律责任由本人承担。 论文作者签名： 五盘趔 日期： 型! ：2 关于学位论文使用权的说明 本人完全了解中北大学有关保管、使用学位论文的规定，其中包 括：学校有权保管、并向有关部门送交学位论文的原件与复印件； 学校可以采用影印、缩印或其它复制手段复制并保存学位论文； 学校可允许学位论文被查阅或借阅；学校可以学术交流为目的，复 制赠送和交换学位论文；学校可以公布学位论文的全部或部分内容 ( 保密学位论文在解密后遵守此规定) 。 签名：五鱼幽日期： 2 塑：! ! f 导师签名： 确锰警 日期：丑翌笪：i ：f 中北大学学位论文 1 1 引言 1 本课题的研究背景及意义 生物技术( b i o t e c h n o l o g y ) ，是以生命科学为基础，利用生物体系和工程技术原理， 提供商品性和社会性服务的综合性科学技术。现代生物技术包括基因工程、细胞工程、 酶工程和发酵工程四大领域。酶工程是利用生物酶催化剂的特性，解决酶在医药、化工、 轻工、食品、能源和环境工程方面应用的技术。生物催化剂一酶的催化作用具有专一性， 只对特定底物起特定的反应，副产物少，可在温和条件下进行反应，因此在商业上具有 很强的竞争力，而酶本身是可生物降解蛋白质，不会引起环境污染，是理想的绿色催化 剂。但是，天然酶以游离酶的形式使用时存在着一些问题： ( 1 ) 酶不易回收，不能被 重复使用，造成催化剂浪费。( 2 ) 生产过程不能实现工业化的连续操作。( 3 ) 酶蛋白 污染产物，给产物的提取纯化造成困难，对于医药产品此问题尤为突出。因此，对于天 然酶的使用方式的研究具有重要的理论意义和生产价值。 1 2 酶的固定化及其意义 酶的固定化( m m o b i l i z a t i o no f e n z y m e s ) 是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域 内，形成固定化酶，使酶仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术 “1 。酶是由生物细胞产生并具有催化活性的一类特殊蛋白质。与游离酶相比，酶固定化 后，在保持其高效、专一及温和的催化反应特性的同时，与水溶性酶相比，其具有如下 优点：( 1 ) 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应。 ( 2 ) 固定化酶极易 与反应体系分离，可获得不被酶污染的、纯度较高的产物。( 3 ) 在大多数情况下，酶 在固定化后稳定性得到较大提高，可较长期地使用或贮藏。 ( 4 ) 固定化酶具有一定的 机械强度，可以搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，使反应过程能够管道化、连续化和 自动化。( 5 ) 酶的催化反应过程更易控制。如使用填充式反应器时，一旦底物不与酶 接触，即可使酶反应终止。( 6 ) 更适于多酶体系的使用，不仅可利用多酶体系中的协 同效应使酶催化反应速度大大提高，而且还可以控制反应使之按一定顺序进行。 ( 7 ) 辅酶固定化和辅酶再生技术，使固定化酶和能量再生技术或氧化还原体系合并使用，从 中北大学学位论文 而扩大其应用范围。 因此固定化酶的研究具有重要的实际意义。与此同时，固定化酶为研究细胞的多酶 体系提供了一种良好的模型，方便了酶促反应机理的研究，这在理论上具有重要的意义。 1 3 青霉素酰化酶 自从f l e m i n g1 9 2 9 年发现青霉素以来”，1 3 一内酰胺类抗生素由于疗效高，毒副作 用小，已发展成为一大类重要的抗感染类药物。它的抗菌作用机制是抑制细胞壁的合成。 其分子内的0 一内酰胺环的完整性是其具有抗菌作用的前提。由于天然青霉素的长期使 用，产生了抗药菌。抗药菌产生的酶类可以水解青霉素分子内的1 3 一内酰胺环，使之失 活。现己证明，所有的天然青霉素都含有一个相同的母核6 一氨基青霉烷酸( 6 一a p a ) ， 但它们的侧链结构是不同的，其中天然青霉素侧链基团的改变可增加1 3 一内酰胺环的稳 定性。若人工改变其侧链结构，就能改变各种天然青霉素的抗菌谱、水溶性、耐酸性及 抗1 3 一内酰胺酶等能力，即可得到各种半合成青霉素。而各种半合成青霉素具有杀菌广 谱，稳定性好，可口服等优点，因而在临床上迅速取代了天然青霉素。1 9 5 0 年，s a k a g u c h i 和m u r a o 在青霉素产生菌一产黄青霉( p e n i c i l l i u mc h r g s o g e n u mq 1 7 6 菌) 的培养液中发现 青霉素的酰基侧链可因酰胺酶的作用而脱落，于是人们对这种酶进行了深入研究，直到 1 9 5 9 年，b a t c h e l o r 等用酰胺酶获得6 - a p a 的结晶，使得青霉素酰化酶得以确认，这一 发现为酶法生产半合成青霉素提供了可能性。 1 3 1 来源及分类 青霉素酰化酶可分为b 一内酰胺酶( 打开青霉素分子的b 一内酰胺环) 和青霉素酰胺 水解酶( 裂解青霉素分子侧链部分) 两类，它们均可催化青霉素分子上两个酰胺键的水 解。但在实际应用中，青霉素酰化酶一般仅指青霉素酰胺水解酶( e c 3 5 1 1 l ，下文所 提青霉素酰化酶均指青霉素酰胺水解酶) 。广泛分布于自然界中的青霉素酰化酶 ( p e n i c i l l i na m i d a s ee c 3 5 1 11 ，简称p a ) ，可由细菌、放线菌、真菌、酵母等产生。根 据对基质的特异性不同，青霉素酰化酶可分为三种类型“：即青霉素g 酰化酶( i 型) ： 青霉素v 酰化酶( i i 型) 和氨基青霉素酰化酶( 型) 。i 型酶主要由细菌产生，分子量为 中北大学学位论文 6 7 0 0 0 1 0 0 0 ，等电点为6 5 6 7 ，大多数为胞内酶，优先水解青霉素g ，对底物专一性 要求不太严格，属非专一性酰化酶。i i 型酶主要由霉菌产生，对底物专一性要求很高， 仅水解青霉素v ，属于胞内酶。型酶高度专一水解氨基青霉素。目前，人们已测定出 大肠杆菌( e c o l i ) ，嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌( k l u y r e r ac i t r o p h i l a ) ，粘节杆菌( a r t l u o b a c t e r v i s c o s u s ) ，巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) ，雷氏普罗威登斯菌( p r o v i d e n c i a r e t t g e r i ) 来源的青霉索g 酰化酶及球形芽孢杆菌( b a c i l u ss p h a e r i c u s ) 来源的青霉素v 酰化酶的 全部序列“3 。其中结构和功能研究的比较清楚的是e c o l i 来源的青霉素g 酰化酶( p a ) 。 1 3 2 催化机理 青霉素酰化酶主要由其t 3 1 一丝氨酸残基发挥水解酰基作用”7 一。从青霉素酰化 酶和苯甲基磺酰氟( p m s f ) 的复合物结构可以推断出酶促水解反应是通过酶活性中心 和底物分子形成一个四面体中间物进行的。四面体中磺酸基团与半缩醛非常相似，且这 一四面体的形成和解体是一个可逆的过程。羧基的质子化使得其羰基碳原子更容易发生 亲核反应。从青霉素酰化酶与苯乙酸的复合物结构中可以分析出t 3 1 一丝氨酸残基处 于有利于进攻羰基碳原子的位置。而青霉素酰化酶1 3 1 一丝氨酸残基附近不存在组胺 酸和游离的羧基，因此要提高其羧基的亲核能力，其邻位必须有碱性基团的存在。就青 霉素酰化酶活性中心而言，其唯一碱性基团为丝氨酸提供的n 一氨基。虽然n 一氨基可 以直接与丝氨酸残基上的羧基相互作用，但这需要一个水分子起键桥作用来调节a 一氨 基氮原子的碱性。蛋白质中自由氨基的等电点一般为6 8 7 9 之间，因此无电荷的a 氨基可以从水分子中直接接受一个质子，使水分子起到碱的作用，接受丝氨酸羧基提供 的质子。青霉素酰化酶催化活性位点上存在一个氢键网，因此这一结构可支持水分予起 键桥的作用。丝氨酸可形成三个与四面体相关的氢键，a 一氨基的氮原子也可形成一个 与四面体相关的氢键，这些相互作用可把不带电荷的氨基氮原子上的一对孤对电子引到 起键桥作用的水分子上，从而有利于质子从丝氨酸上通过水分子形成的键桥转移到a 一 氨基上。青霉索酰化酶水解青霉素最佳p h 值为8 2 ，这一要求与n 氨基必须是无电荷 地与配体连接是相一致的。 丝氨酸亲核进攻羰基碳原子后形成一个氧负离子四面体中间物，它通过丝氨酸所带 中北大学学位论文 的酰胺基团及丝氨酸相邻基团上的氮原子之间的相互作用而使这个四面体保持稳定，当 释放催化产物6 一氨基青霉烷酸( 6 - - a p a ) 时，这个四面体中间物就发生解体。接着酰 化酶受到水分子的进攻而产生另一个四面体中问物，这个四面体中间物也通过丝氨酸所 带的酰胺基团与丝氨酸相邻基团上的氮原子之间的相互作用而稳定，当催化反应的副产 物苯乙酸被释放时，这个四面体结构就发生解体。 1 3 3 青霉素酰化酶的应用 1 3 3 1 在1 3 一内酰胺类抗生素合成中的应用 ( 1 ) 催化水解反应 6 一氨基青霉烷酸( 6 一a p a ) ，7 一氨基头孢烷酸( 7 - - a c a ) 以及7 一氨基脱乙酰 氧基头孢烷酸( 7 一a d c a ) 是半合成b 一内酰胺类抗生素的母核结构。最初，它们主要 通过化学去酰基法进行生产，但这种方法的过程非常复杂。因此，条件温和，不涉及高 温高压和有毒试剂的酶法水解工艺暗示了很好的替代前景”1 。利用青霉素酰化酶对苯乙 酰基专一水解的特性，可实现b 一内酰胺母核结构的酶催化生产。 ( 2 ) 催化合成反应 半合成b 一内酰胺抗生素，包括青霉素类及头孢菌素类，具有抗菌谱广，毒性低， 耐某些菌生产的b 一内酰胺酶等优点。近年来，来源于细菌和真菌的青霉素酰化酶已被 广泛应用于1 3 一内酰胺抗生素合成的研究。6 - a p a ，7 一a c a 和7 - a d c a 的许多酰化衍生 物均可用酶法合成。 不同类型侧链进行合成反应可得到不同的半合成b 一内酰胺抗生素“。利用6 - a p a 及相应侧链羧酸或侧链脂为前体底物的合成方法，目前已成功地合成了许多青霉素类抗 生素；以7 - a d c a 及其相应的侧链结构为前体底物，许多头孢菌类抗生素也得以合成“。 在酶法半合成b 一内酰胺抗生素中，对反应体系的改良和构建工作已有了一些报道，已 报道的体系有水相体系“”，有机共溶相体系和两液相体系“4 3 等。 1 3 3 2 对映体合成中的应用 青霉素酰化酶对苯乙酸基团具有高度的选择性，不仅可催化b 一内酰胺环上苯乙酸 中北大学学位论文 基团的解离，同时还可以催化苯乙酰基团从其它胺，醇或肽链上水解离去。利用其对对 映体选择特异性可将青霉素酰化酶广泛应用于氨基酸、酯类以及某些高级醇的制备过 程。在医药生产工业中，利用青霉素酰化酶进行外消旋体拆分以及不对称合成更重要。 青霉素酰化酶具有广泛的底物特异性及高度的对映体立体选择性，若将两者结合起来， 即可用于许多单一构型光学异构体药物的生产，用此拆分技术可以大规模、高效率地得 到某些光学纯度很好的产品。例如使用青霉素酰化酶酰化一个顺式的外消旋体 ( 2 r , 3 s ) ，( 2 s ，3 r ) 杂环丁酮( 其为抗生素l o c a r b e f 的中间体。”) ，就取得了较好的效果。 同样使用e c o l i 来源的青霉素酰化酶在1 0 的丙酮水溶液中水解拆分2 一芴基烯丙基甲 醇也取得了较好的效果。 1 3 3 3 水解保护基团的作用 正确引入和去除保护基团，对控制许多有机合成过程非常重要，尤其对复杂的多功 能分子的高选择性合成过程而言更是如此，如核苷、寡糖、多肽的合成以及某些天然产 物的连接等。青霉素酰化酶对底物的专一性由酶分子侧链酰基基团决定，其活性中心可 接收各种含有苯乙酰胺及苯氧基乙酰胺的底物进行催化反应。因此，青霉素酰化酶可被 广泛用于有机合成过程中基团的水解去除。 ( 1 ) 肽链合成中的脱保护基团 肽链合成中保护基团的选择决定于去保护作用参数。当处理那些对酸、碱和温度敏 感的分子时，保护基团的选择就更受限制。甲酰基团常被用于保护肽链上的氨基基团， 然而，其去保护过程要求在强酸性条件下才能进行，因此这对生产极为不利。青霉素酰 化酶水解苯乙酸衍生物可在温和条件下进行，因此可用苯乙酰基替代甲酰基用于肽键合 成中的氨基保护，最后利用酶解来去除这一保护。 ( 2 ) b 一内酰胺化合物中氨基上保护基团的去除 酶解去除酰基基团在b 一内酰胺类抗生素的合成中具有普遍意义，具有临床疗效的 b 一内酰胺类抗生素中间体7 - a c a ，7 一a d c a 和6 - a p a 等均可由化学方法从青霉素g 和 青霉素v 出发通过四氢噻唑环化学扩环作用后变成二氢噻唑嗪而产生。但在此扩环过程 中，不稳定的自由氨基需变成苯乙酰胺或苯氧乙酰胺而被保护起来，扩环反应后再用青 中北大学学位论文 霉素酰化酶来去除这一保护。不仅如此，扩环过程中更为重要的是保护羧基，羧基的保 护基团要求在扩环反应中必须稳定，且在扩环后易于除去。应用酯化反应保护羧基，扩 环完毕后可以通过青霉素酰化酶连同氨基的保护基团苯乙酰一起水解除去，此反应完全 且水解产率较高”。 ( 3 ) 核苷酸上氨基保护基团的去除 寡核苷酸合成过程中，为防止产生不需要的侧链反应，碱基上的氨基必须全部加以 保护。如果变为其它酰胺类化合物，去保护过程则要求在强碱性条件下进行。如果选择 将氨基酰化为苯乙酸胺，反应结束后，用青霉素酰化酶即可水解去除苯乙酰这保护基 团。 ( 4 ) 巯基上保护基团的去除 青霉素酰化酶可水解与半光胺酸的巯基基团相结合的苯乙酰胺，从而释放其巯基基 团，许多有机合成反应中要求用苯乙酰胺保护巯基，这样，利用青霉素酰化酶的水解能 力可在反应结束后释放巯基。 1 4 青霉素酰化酶的固定化 目前，在世界范围内百分之八十以上的天然青霉素都是用来生产半合成青霉素的。 6 一氨基青霉烷酸( 6 - a p a ) 是生产半合成青霉素的关键性中间产物。目前，临床上广泛使 用的近2 0 种半合成青霉素全部来自6 - a p a 。临床上对半合成青霉素的大量使用，使 6 - a p a 成为世界上的主要医药产品之一。6 - a p a 的生产包括5 个步骤：青霉素的生产； 酶的生产；酶的固定化；青霉素的酶促水解；6 - a p a 的提纯。其中，青霉素和酶的生产 都已有成熟的工业发酵工艺，6 - a p a 的提纯一般根据酶促水解体系的特点来确定，而青 霉素酰化酶的固定化则是6 - a p a 生产中的最关键步骤。可见研究青霉素酰化酶的固定 化意义重大。由于固定化青霉素酰化酶是在工业生产中应用最成功的几个固定化酶之 一，因此其固定化及反应器的研究也是固定化酶研究中最活跃的领域。 1 4 1 青霉素酰化酶的固定化方法 人们对酶的固定化方法研究很多，大体上可分为以下几类： 中北大学学位论文 ( 1 ) 吸附 吸附法是利用离子键、物理吸附等方法将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖、多孔玻 璃和离子交换树脂等载体上的固定化方法”。吸附法研究开发较早。工艺简便，处理条 件温和，可回收利用，酶的高级结构及酶蛋白质的活性中心不易被破坏，是这种方法的 显著特点。这种方法对载体的选择范围很大，涉及天然或合成的无机材料、有机高分子 材料。吸附过程可同时达到纯化和固定化酶的目的。所制固定化酶失活后可重新活化， 载体可再生。世界上第一个获得工业化应用的固定化酶即是2 一氯乙基二乙胺基盐酸盐 ( d e a e ) 交联葡聚糖( s e p h a d e x ) a 2 5 吸附的氨基酰化酶”“。但由于这种方法主要依靠 蛋白质和载体间的次价键结合力连接，因此作用力较弱，在溶液离子强度、p h 、温度等 条件发生改变时，酶易脱落。通过吸附法，国内外科研人员选择不同载体进行了很多研 究。s q u i b b 公司利用膨润土吸附环状芽孢杆菌( b a c i l l u sm u r c u l a n s ) 来源的青霉素酰化酶， 用予工业生产6 - a p a l “1 。李晓芬等”1 通过改变酶的固定化条件，对p a 在介孔分子筛 m c m 一4 1 上的固定化进行了考察，由于p a 主要是通过物理吸附固定于载体上，因此尽 管固定化酶活力最高可达3 7 5 6 9 u g ，但其使用稳定性却不理想。薛屏等”“人以含铁分 子筛m c m 4 1 为载体通过吸附法制得固定化酶，所制固定化酶的活力最高达7 8 2 u g ， 但连续使用6 次后，固定化酶活力保持仅为4 9 4 。刘红霞等”以层状材料一水滑石 ( l p h ) 为载体，采用不同酸性氨基酸插层后，通过直接吸附法固定化p a ，取得了较好 的固定化效果。石家骥等。3 1 采用氧化铝吸附法制各固定化酶，虽然载体价廉易得，固定 化方法简单，但所得固定化酶容易在高离子强度和高p h 值下解吸，造成固定化酶活力 下降。此外科研人员还对p a 在多孔玻璃。”、粉末状膨润土2 6 16 2 0 1 型担体上进行了 固定化酶的研究”1 。宫崎和成等人将青霉素酰化酶琥珀化，增加其酸性，使其能够以很 强的吸附力吸附在2 一氯乙基二乙胺基盐酸盐( d e a e ) 一纤维素，d e a e 一葡萄糖上，用 来裂解青霉素生产6 - a p a 。 ( 2 ) 共价结合法 共价结合法是将酶分子通过共价键结合到非水溶性载体上。与吸附法相比，这种固 酶方法要求条件苛刻，反应激烈，操作复杂，常常引起酶蛋白的高级结构发生变化，并 导致酶活性中心受到不同程度的破坏，且固定化酶的活力回收率相对较低。这种方法最 大的优点是酶与载体结合牢固，稳定性好，即使高浓度的底物溶液和盐类溶液也不会使 中北大学学位论文 酶蛋白脱落。此方法是固定化酶研究中最多、最活跃的一类方法，近年来已发展了很多 廉价的载体材料，通过多种方法活化载体使之表面获得能与酶结合的反应基团，进而与 酶进行共价结合。对于不同的酶，其酶蛋白的氨基酸组成不同，因此要针对不同的酶选 用不同的共价结合载体。一般来说，酶分子上可供连接的功能团有：n 一氨基或e 一氨 基：a 、b 一、y 一羟基：巯基或羟基；咪唑基；酚基等。载体上的环氧等基 团通常在温和条件下可直接与活性物质上的_ n h 2 、_ 二1 0 h 等基团反应偶联。其它的基一 团则需要一个活化过程，常见的活化法有重氮法、溴化氰法等。“2 。此外，载体性质会 在很大程度上影响固定化酶的性质，因此利用共价法固酶的载体一般应具有较大的比表 面积和较多的可供化学反应的活性基团，良好的机械性能和物理形状。常用的载体的功 能基团有o h 、一n h 2 、c o o h 、c h o 等。在载体设计上，与酶共价结合的功能 基团可以直接在载体上形成或者通过活化而产生”“”1 ，使载体表面形成能够使酶分子固 定的功能基团。含芳香氨基的载体以亚硝酸处理可形成重氮盐，在中性或偏碱性的条件 下，重氮离子攻击酶分子酪氨酸的酚基或组氨酸的咪唑基而形成偶氮键。例如以聚苯乙 烯为载体，在苯环上引入重氮盐基团后，就可与酶分子酪氨酸中的苯酚基或组氨酸中的 咪唑基进行偶联反应，从而将酶分子固定化在聚合物表面。 近来，l i u 等”4 利用一种新的聚合方法合成了由醋酸乙烯酯与二乙烯苯聚合的小球。 载体置于乙醇中在1 8 。c 2 0 。c 下加n a o h 水溶液处理1 4 h ，用0 一硫酸酯乙砜基苯 胺( s e s a ) 等活化剂对载体活化后，进行了p a 的固定化。以s e s a 活化并用戊二醛进 行交联，固定化p a 水解青霉素g 的活性为6 3 5 u g ( 湿重) ；而经二苯醌活化后，固定化 酶的活性高达8 5 2 u g 。以上研究表明，载体经过活化后，利用共价结合的方式进行固定 化，固定化酶具有较高的活性和稳定性。但是，载体进行预活化，不论采用哪种方法， t ：j - 都使得固定化p a 的制备工艺复杂化且不易控制，因而这种方法在实际应用中受到了限 制。 p o n r a t h n a m 等研究了大孔交联甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 共聚物载体的制各”， 并以此载体的环氧基为功能基团采用共价法制备了固定化的p a 来生产6 - a p a 。”。刘 建国等。”合成了甲基丙烯酸羟乙酯一苯乙烯二元共聚物球状珠体，经环氧氯丙烷活化后 用于固定化p a ，所制备的固定化p a 活力可达3 6 0 u 幢( 于重) 。薛屏等”用甲基丙烯酸 缩水甘油酯( g m a ) 和n 一乙烯毗咯烷酮( n v p ) 两种单体，以n ，n 一亚甲基双丙烯酰胺 中北大学学位论文 ( m b a a ) 为交联剂，通过反相悬浮聚合技术合成了亲水性大孔g m a - n v p - m b a a 三元 共聚物载体用于固定化p a ，所制固定化酶活力稳定值可达6 0 1 u g 。f o n s e c a ，l p 等报 道，通过硅烷化活化的硅凝胶载体共价结合青霉素酰化酶，得到了固定化产率、操作稳 定性、酶负载量及载体重新利用能力均较高的固定化酶。 ( 3 ) 交联法 交联法是用多功能试剂使酶与酶或微生物细胞与细胞之问互相交联而使其得以固 定化的方法。用这种方法固酶时，在酶分子和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的 交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内的交联。根椐使用 条件和添加材料的不同，还能够产生不同物理性质的固定化酶，常用的交联试剂有戊二 醛，双重氨联苯胺，4 , 47 一二异硫氰二苯基- 2 ，27 二磺酸，l ，5 一二氟- 2 ，4 一二硝基苯等。 交联法操作简单，但反应条件比较激烈，固定化酶活回收率一般较低。宋建彬等以壳 聚糖为载体，以戊二醛为交联剂固定化p a ，通过对固定化条件的探索，获得了酶活力 为6 6 7 u g ，回收率为5 0 左右的固定化青霉素酰化酶。k o b a y a s h i ，k o b e e 等报道，采 用六亚甲基二异氰酸酯及对羟基苯甲醛作为偶合剂，将青霉素酰化酶固定到树脂d i a i o n c r 2 0 的官能团上，可改善固定化酶的稳定性。 ( 4 ) 包埋法 包埋法是指将酶包埋于聚合物中的固定化方法，此法反应条件温和，不需要化学修 饰酶蛋白的氨基酸残基，酶活回收率较高。因此可以应用于许多酶、微生物或细胞器的 固定化。但包埋法存在产物与底物的传递速率较低等缺点，仅适用于小分子底物的催化 反应。其基本原理是单体与酶溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应。将p a 固定于载 体材料的网格中，固定化时保护剂和稳定剂的存在不影响酶的包埋产率。 包埋法分为凝胶包埋法和微囊包埋法。凝胶包埋法是将酶分子包在高聚物格子中， 此法既可以将包有酶的凝胶切成小块使用，也可将酶直接包埋在珠状聚合物中使用，后 者可以使固定化酶机械强度提高1 0 倍，并改进酶的脱落情况。微囊化包埋法是将酶溶 液或悬浮液包裹在膜内，膜既能使酶存在于类似细胞内的环境中，又阻止酶的脱落或直 接与微囊外环境接触，小分子底物则能迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出来。此法 包埋的酶量很多。 p r a b h u n e 等。”报道将p a 溶液，丙烯酰胺单体溶液及藻酸钠混合后，再将混合液滴 中北大学学位论文 入甲酸钙溶液中，聚合后用戊二醛、藻酸钙溶液依次处理，得到了均一、球形、具有生 物活性的多孔聚丙烯酰胺凝胶颗粒。聚丙烯酰胺的亲水性较好，以其为载体时，通常都 采用包埋法制备固定化酶，但反应条件较苛刻，容易导致酶失活，而且载体不易表征， 存在着较大的扩散阻力。在酸溶液中氢醌，甲醛缩聚合成的凝胶型树脂是多种酶和蛋白 质固定化的有效载体，将p a 固定于此载体上，可用于裂解青霉素g 生产6 - a p a ，在合 适条件下，固定化酶的活性可达2 0 0 0 u g ( 干载体) ，活力收率保持在5 0 1 左右。 ( 5 ) 其它方法 除了上述4 种方法单独使用外，研究人员还将它们结合使用。黄晨等“以丝素膜为 载体，以戊二醛为交联剂，通过共价交联法固定化p a ，但所得固定化酶的活性较低。 m a c e o 等“23 将p a 以多点共价结合的方法固定在环氧载体上，这种方法既可以很好地稳 定酶的三级结构，又能显著地提高酶的稳定性( 比游离酶提高1 0 0 倍) 。h s i a u 和c h i a n g 等将含有p a 的大肠埃希氏菌细胞直接氢埋在甲基丙烯酰胺和n ，n 。亚甲基二丙烯酰胺 的共聚物中，在水解过程中可以通过控制p h 值来消除产物6 - a p a 对p a 的抑制作用m ”1 。 用该法制各的固定化细胞的p a 活力较高，而且可以反复使用多次。虞和慈等“”将p a 先吸附在明胶上，再用戊二醛进行交联使酶与明胶牢匿| 地结合，明胶本身失去水溶性， 得到理想的固定化酶。另外，新物理手段的应用也为传统方法的改进提供了良好条件。 光交联法具有反应条件温和、易控制交联度及对酶活性影响不大的优点。朱天民等“o 用紫外光照射酶与含醛基光敏高分子的混合物，得到固定化酶。该法不仅使酶被光交联 凝胶包埋，而且酶还可与载体骨架共价结合，提高了固定化酶的稳定性。在反胶团中进 行酶反应是近十年来出现的一种新技术，与传统的固定化方法相比，其具有其独特的优 点：酶包埋于反胶团中可增强其稳定性，减少酶的固定化操作步骤，使其保持较高的活 性。何志敏等“7 1 将p a 包埋于二一( 2 一乙基己基) 琥珀酸双酯磺酸钠( a o t ) 异辛烷 反胶团中，对p a 水解青霉素g 制备6 一a p a 进行了研究。在反胶团酶反应体系中，青 霉素g 盐与酶液能够通过整合作用溶入水池从而构成“微反应器”，并且由于表面活性 剂的存在，又可使酶不与有机溶剂直接接触，可更好地保护酶的催化活性部位。另一方 面，产物苯乙酸可转入有机相，6 - a p a 则处于相界面，两者均可通过界膜面离开反胶团 相，因此可减弱其对反应的抑制作用，从而提高反应转化率。无载体酶的固定化技术包 括交联酶技术、交联酶晶体技术及交联酶聚集体技术。交联酶技术是在优化条件下，不 1 0 中北大学学位论文 需任何载体，使用双功能团试剂直接将游离酶进行交联，戊二醛是常用的交联剂。交联 酶晶体技术一般分两步：酶的批量结晶和酶的化学交联，应用较多的交联剂仍然是戊二 醛。交联酶聚集体技术与交联酶晶体技术相似，其制备过程也分为两步，最终形成的交 联酶聚集体技术是一种超分子结构“。无载体固定化技术是青霉素酰化酶固定化的新技 术，具有较好的发展前景。 1 4 2 固定化青霉素酰化酶的载体 大量研究表明，酶制剂的工作稳定性好坏是关系到其工业化应用成败的关键。固定 化青霉素酰化酶成功地用于6 - a p a 工业生产的实例，充分体现了固定化对酶使用稳定 性的贡献，这也更加激发了人们对p a 固定化载体材料的研究热情。目前，关于p a 固 定化载体以及固定化方法的研究报道屡见不鲜。大体来讲，固定化p a 的载体可分为两 大类： ( 1 ) 无机类载体 无机材料具有较高的机械强度和较好的化学稳定性，其结构和表面性质也较容易控 制，适合于酶的固定化。无机材料用于酶的固定化，其突出的优势是载体材料可以重复 使用，不存在材料的后处理问题。一般地讲，无机载体比有机载体的成本要高，但由于 具有可重复使用的优点，利用无机载体在很大程度上降低了固定化的成本。无机材料用 于青霉素酰化酶的固定化已进行了一些研