（生物物理学专业论文）卵母细胞双电极电压钳放大器的研制.pdf

华中科技大学硕士学位论文 摘要 近年来，随着分子生物学和电生理技术的发展，卵母细胞表达系统成为研究离子 通道的重要手段。大量的实验采用卵母细胞表达系统研究离子通道与受体的功能和结 构。双电极电压钳技术是卵母细胞电生理研究的基本方法，而卵母细胞电压钳放大器 就成为卵母细胞电生理实验的关键仪器。 双电极电压钳技术是使用一个电压记录电极和一个电流注入电极，钳位控制器将 电压记录电极测量到的细胞膜电位与命令电压相比较得到误差信号并放大到很高的 值，用来调整电流注入电极的电压，最终使膜电位跟踪命令电压，同时检测出膜电流。 传递函数分析是卵母细胞电学模型和双电极电压钳位系统响应的基本分析方法， 系统的钳位速度、精度以及稳定性用这个方法可以得到全面的分析。放大器采用串联 电流测量或虚地电流测量的方式检测细胞膜离子通道的电流，电容补偿、液结电位补 偿、电极电阻测试和细胞电击穿是放大器的重要功能模块。放大器的整体结构包括膜 电位测量通道、命令电压设定通道、钳位控制器、高压驱动电路、高压直流电源、膜 电流测量和输出通道。 放大器在卵母细胞电路模型上的测试结果表明放大器实现了商的钳位速度、钳位 精度和钳位稳定性，能够满足卵母细胞电生理实验的要求。放大器中的高压放大电路、 串联电流测量和压控恒流源电路的设计还将进一步优化。 关键词：离子通道表达， 卵母细胞，双电极电压钳 华中科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rb i o l o g ya n de l e c t r o p h y s i o l o g y , o o c y t ee x p r e s s i o n s y s t e mh a sb e c o m ea ni m p o r t a n tm e t h o df o ri o nc h a n n e ls t u d i e si nr e c e n ty e a r s o o c y t e e x p r e s s i o ns y s t e mi sm o s t l ye m p l o y e di n t h ef u n c t i o n a la n ds t r u c t u r a lr e s e a r c ho ni o n c h a n n e l sa n dr e c e p t o r s t w o e l e c t r o d ev o l t a g ec l a m pt e c h n i q u ei st h eb a s i cm e t h o df o r o o c y t ee l e c t r o p h y s i o l o g i c a lr e s e a r c ha n do o c y t et w o e l e c t r o d ev o l t a g ec l a m pa m p l i f i e ri s t h ek e yi n s t r u m e n ti nt h ee x p e r i m e n t s t w oe l e c t r o d e sa r ee m p l o y e di nt h et e c h n i q u e ，o n ef o rm e m b r a n ep o t e n t i a lr e g i s t e r i n g a n dt h eo t h e rf o rm e m b r a n ec u r r e n ti n j e c t i o n t h ev o l t a g er e g i s t e r e db yo n ee l e c t r o d ei s c o m p a r e d 、村t i lc o m m a n dv o l t a g ei nac l a m pc o n t r o l l e rt of o r ma l le r r o rs i g n a l t h ee r r o r s i g n a li sa d e q u a t e l ya m p l i f i e da n dt h e na p p l i e dt ot h ec u r r e n ti n j e c t i o ne l e c t r o d et of o r c e t h em e m b r a n ep o t e n t i a lt of o l l o wt h ec o m m a n dv o l t a g e t h em e m b r a n ec u r r e n ti sm e a s u r e d s i m u l t a n e o u s l y t r a n s f e rf u n c t i o na n a l y s i si st h eb a s i cm e t h o df o ro o c y t em o d e lp a r a m e t e r sa n dc l a m p s y s t e mr e s p o n s e t h ec l a m ps p e e d ，a c c u r a c ya n ds t a b i l i t yo ft h ec l a m ps y s t e mc a nb e a n a l y z e db yt h i sm e t h o d t w os t r a t e g i e sc a nb eu s e df o rm e m b r a n ec u r r e n tm e a s u r e m e n ti n t h ea m p l i f i e r ：s e r i e sc u r r e n tm e a s u r e m e n ta n dv i r t u a lg r o u n dc u r r e n tm e a s u r e m e n t s o m e i m p o r t a n tf u n c t i o n a lm o d u l e si nt h ea m p l i f i e ra r ec a p a c i t a n c en e u t r a l i z a t i o n ，l i q u i dj u n c t i o n p o t e n t i a lb a l a n c e ，e l e c t r o d er e s i s t a n c et e s ta n de l e c t r i c a l c e l lp e n e t r a t i o n t h es y s t e m s t r u c t u r eo ft h ea m p l i f i e rc o n s i s t so fm e m b r a n ep o t e n t i a lm e a s u r e m e n tp a t h w a y , c o m m a n d v o l t a g es e t t i n gp a t h w a y , c l a m pc o n t r o l l e r , h i 。g hv o l t a g ed r i v e ru n i t , h i g hv o l m g ep o w e r s u p p l y m e m b r a n ec u r r e n tm e a s u r e m e n ta n do u t p u tp a t h w a y t h et e s tr e s u l t so ft h ea m p l i f i e ro no o c y t em o d e ls h o wt h a th i 【g hc l a m ps p e e d ，a c c u r a c y a n ds t a b i l i t ya r eo b t a i n e d i ti s e x p e c t e dt os a t i s f yt h en e e do fo o c y t ep h y s i o l o g i c a l e x p e r i m e n t s h i 曲v o l t a g ed r i v e ru n i t ，s e r i e sc u r r e n tm e a s u r e m e n tc i r c u i ta n dv o l t a g e c o n t r o l l e dc u r r e n ts o u r c ea r ee x p e c t e dt ob ef n l t h e ro p t i m i z e d k e y w o r d s ：i o nc h a n n e le x p r e s s i o n ，o o c y t e ，t w o e l e c t r o d ev o l t a g ec l a m p 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的 研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：芗、 日期：训哆年j 7 月j 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存和汇编本学位论文。 保密口，在 本论文属于不保密函。 ( 请在以上方框内打“”) 年解密后适用本授权书。 学位论文作者签名： 琴 ”1 指导教师签名：贿乏 日期：弘o f 年r 月l - 日日期：洲歹年、月厂曰 华中科技大学硕士学位论文 1 1 细胞电生理技术 1 绪论 研究生物体生理活动中的电现象，已经成为一个专门的学科，就是电生理学。电 生理学的产生与发展从一开始就是与电学的研究紧密相关的。电学仪器的发明决定了 电生理发展的各个阶段。电子仪器灵敏度和响应速度的提高为深入探知生物电本质创 造了条件。 1 9 0 3 年，荷兰的e i n t h o v e n 教授发明了第一个弦线式电流计由一根纤细的导 线穿过磁场而构成。当电流通过导线时，能使导线与磁力线方向成直角地移动，移动 程度与电流强度成正比。这个装置可以灵敏地记录出心脏的各种不同电位一这就是人 类医学史上第一个心电图记录计。 1 9 2 2 年，美国科学家e r l a n g e r 和g a s s e r 发明了阴极射线示波器，可以记录神经 纤维上微小的电变化，即动作电位。这一方法学进步为深入细致的电生理研究打下坚 实基础，基本满足了电生理实验中灵敏度和速度两个关键的要求，他们也因此获得 1 9 4 4 年诺贝尔奖【2 j 。 澳大利亚生理学家e c c l e s 把微电极插入猫脊髓的前角细胞内记录电活动，还记录 神经与肌肉接头处的终板电位，发现其性质与神经元之间突触电位很相似，并且还证 明突触部位不仅有兴奋性递质，还有抑制性递质。英国生理学家h o d g k i n 和h u x l e y 共同合作，使用微电极和阴极射线示波器，以枪乌贼的巨大神经纤维为实验对象，深 入研究神经纤维上的动作电位，描述了静息电位和动作电位，即这些电变化是细胞膜 对n a + 和k + 的通透性发生一系列先后相继的变化而产生的结果，得到了著名的h h 方程o ，4 1 。这三位学者共享了1 9 6 3 年诺贝尔奖。由于他们的杰出工作，使得以金属微 电极和玻璃微电极为标志的近代电生理技术开始逐渐主导神经生理的研究。 1 9 7 6 年，德国人e n e h e r 和b s a k m a r m 发明了膜片钳技术，从生物膜上记录了离 子单通道电流，才直接证实了离子通道的存在，他们因此获得了1 9 9 1 年的诺贝尔医 学一生理学奖。八十年代初期发展起来的膜片钳技术，可以从分子水平直接了解生物 1 华中科技大学硕士学位论文 膜离子通道的开启与关闭、动力学、选择性和通透性等膜信，窟t 5 - 8 1 。 1 2 卵母细胞表达系统 1 2 1 卵母细胞研究 电生理实验的目的就是在细胞级水平了解离子通道的功能。通道是如何打开和关 闭的? 在电场中它是如何变化的? 细胞又是如何对通道进行调控的? 目前，对这些基 本过程的理解受表达模型系统的限制，无法找出一个十分合适的模型。大多数细胞都 同时表现为多个不同通道的作用，因此单独研究某一种离子通道的特性是很困难的。 通常使用通道阻断剂以及施加复杂的电压变化来达到研究的目的，但这样会丧失细胞 的一些生理活性。然而，即使如此，也不可能在完整的细胞上系统地操作通道基因， 消除其结构功能特征。 爪蟾卵母细胞表达系统就完全满足作为模型的条件。该系统是由g u r d o n 在1 9 7 1 年提出的们，用于研究基因表达控制的多种特性。将来自别的细胞的d n a 注入到卵 母细胞的细胞核中，或是将m r n a 注入到细胞质中，可以导致卵母细胞功能性蛋白 的表达。对于蛋白表达的早期研究，如球蛋白、干扰素以及各种病毒蛋白质，都很少 使用电生理学的方法。因此，早期电生理学和生物物理学在卵母细胞蛋白表达方面的 研究比较少。然而，在1 9 8 2 年，m i l e d i 和他的同事从适当的组织中分离出m r n a ， 并将其注入到卵母细胞中，发现多种不同的类型的离子通道和受体都可以在卵母细胞 中表达 1 0 1 。例如，将日本单鳍电鳐的电器官细胞中的m r n a 注入卵母细胞中，可以 得到功能性烟碱乙酰胆碱的表达；而将大鼠脑细胞中的m r n a 注入卵母细胞中，则 可以导致大量不同电压门控型和配体门控型的离子通道的表达，其中有电压门控型 n a + 通道，n m d a 和非n m d a 类型的谷氨酸受体，以及g a b a a 受体等等。卵母细 胞表达系统主要有如下优点： 1 从一只成年爪蟾身上可以一次性分离出上百个活性卵母细胞。这些细胞可以通过 外科手术的方式取出，而不需要杀死爪蟾。一只爪蟾可以反复使用多次，十分方 便。 2 华中科技大学硕士学位论文 2 卵母细胞的生命力很强，在试管内可以存活2 个星期，可以经受多次电极的穿刺 和微玻璃管的注入。而且，在实现分离之后，细胞的培养不需要使用很复杂的设 备。 3 卵母细胞很大( 直径可以达到1 3 m m ) ，容易注入d n a 和r n a ，以及某些具有膜 不渗透性的药物。 4 卵母细胞可以正确地表达注入其中的来自别处的r n a 。 5 卵母细胞自身只含有少量的通道( 主要是c a 2 + 激活的c l - 通道) ，对表达电流的影 响微乎其微。这使得特定通道的研究可以在相对独立的条件下进行。 6 克隆到卵母细胞中的表达加速了对特定蛋白的进化和分离。 近年来，随着分子生物学和电生理技术发展，卵母细胞表达系统成为了研究离子 通道的一种重要手段。大量的实验都采用卵母细胞表达系统，研究离子通道与受体的 功能和结构方面的特性【12 1 。 1 2 2 爪蟾卵母细胞 非洲爪蟾( x e n o p u sl a e v i s ) 是产于南非的一种爪蛙，卵母细胞是其卵细胞的发育 前期，储存在爪蟾的腹腔中。实验时，可以使用外科手术的方法将其取出，对爪蟾 并不会造成太大伤害，因此其来源非常丰富。卵母细胞的发育一共有六个阶段( i 到 v i 期) ，但在一般的实验中只使用v 期和v i 期的细胞，因为这两期的细胞比较大， 直径在l 1 2 m m 左右，如图1 1 中所示。 f _ 泡联z 物械 物傲 图1 1v 期和v i 期的卵母细胞 从图中可以看出，爪蟾卵母细胞可以分为颜色不同的两个部分：黑色的动物极半 华中科技大学硕士学位论文 球和白色的植物极半球。动物极半球中包含着细胞核。卵母细胞膜上的通道分布是不 均匀的，在注入外来的m r n a 后，尽管受体在整个细胞上进行表达，但得到的表达 却是不均衡的f 1 4 】。这一点对于全细胞记录没有什么影响，但对于单通道记录来说却很 重要。 1 3 卵母细胞电压钳记录 卵母细胞上最常用的电生理测量是双电极电压钳。电压钳是用于研究电兴奋和化 学兴奋的细胞膜及其膜蛋白的一种强有力的方法 1 5 】。离子通道的开放和关闭行为引起 带电离子流入或流出细胞，同时可能产生动作电位，即膜电位和膜电流同时变化。电 压钳方法就是将膜电位钳制在实验设计的电位，同时测量出膜电流值，从而获得离子 通道电导的变化规律和特征。 吒 吃 图1 2 双电极电压钳原理示意图 双电极电压钳使用两个电极，一个电压记录电极m e l 和一个电流注入电极m e 2 。 通过一个高增益的差动放大器将细胞内电极m e l 测得的细胞膜电压和命令电压 吒比较，并将差值放大。放大器的电压增益4 通常大于1 0 3 。输出电压可以产生电 4 卜 华中科技大学硕士学位论文 流，m ，经过m e 2 流入到细胞内，经由膜阻抗流出细胞，从而改变胞内电压v m ( 反馈 变量) 。输出电压k 不断对进行调整以保证跟随k 。电流，m 由电流测量电路a 测得。 1 4 本课题的主要工作 目前国外有用于卵母细胞实验的钳位放大器，如a x o n 公司的a x o c l a m p - 2 b 和 g e n e c l a m p 5 0 0 m 18 1 ，w a r n e r 仪器公司的o c 7 2 5 c 1 9 】和n p i 公司的t e c 系列仪器 1 2 0 ，但国内还没有用于卵母细胞实验的钳位放大器。 本课题旨在从电子学和电生理学的角度探索对卵母细胞表达系统施行电压钳位 和离子通道电流测量的实验方法，全面分析卵母细胞电压钳电子学模型的基本原理，并 最终完成卵母细胞电压钳放大器的整机电路设计和测试。 - h _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ h _ h - _ _ _ _ 一 5 华中科技大学硕士学位论文 2 卵母细胞电压钳放大器的原理分析 本章对卵母细胞钳位放大器的基本原理做了详细的分析，这些原理是进行放大器 电路设计的基础，只有充分地理解了这些基本原理才能够对设计出性能良好的放大器 实际电路。 根据放大器所需要实现的功能，本章主要讲述了：双电极电压钳的基本原理；电 流钳的基本原理；细胞膜电流测量的基本原理，包括串联电流测量方式和虚地电流测 量方式；电容补偿原理；液结电位补偿原理；辅助细胞穿刺原理。 2 1 卵母细胞的电学模型 细胞是一个很复杂的实体对象，它的具体结构和机能至今还没有研究得十分透 彻。对于不同的细胞来说，其电生理特性也不尽相同，因此必需使用正确的细胞模型 来模拟细胞的电学特性，以保证实验研究的可靠性。在进行仪器设计之前，必须建立 一个合适的细胞模型。用于电压钳电路分析和测试的细胞模型示于图2 1 2 ”。 图2 1 用于电压钳电路的分忻和测试的细胞模型 6 华中科技大学硕士学位论文 静息的细胞膜由膜电阻r 。和腹电容c k 并联组成，膜时间常数r r a = r 。c 。与r 。 串联在一起的电池点斋。表示静息膜电位。与这些分量并联的是可变电阻r 。，它代表所 有可激活膜电阻的总和，由于静息膜电阻归在了r 。上，所以细胞静息时r 。是无穷大。 在激活时r 。变为有限值，同时通过离子电流口2 1 。离子电流由v m 与厶的差值所驱动， 匠代表激活的离子通路的离子电势，月。的值是依赖于电压和时间的函数。r 。表示与 膜串联的电阻。 见l 和r 。2 分别表示电压检测电极m e l 和电流注入电极m e 2 的电阻。通过m e i 电极记录到的电压n 一般不等于细胞膜电位，只有当足上不存在电压降( 月。= 0 或 五n o ) 时，才会有h = 。以后的分析中我们都假定r q = 。 在我们用传递函数研究电压钳的动态性能时，静态的晶。是不需要的。在后面的 分析中，如果不特别说明一般性限制条件， 可以直接加入到的计算值里去。另外， 我们都假定e 。p 等于零，e 唧的非零值也 在电压钳的阶跃变化建立时，细胞通常都 还没有来得及激活，r 。可以视作无穷大；激活以后，r 。的变化成为影响电压钳的重要 扰动量，我们会专门讨论见的变化对电压钳位的影响。图2 1 所示的有源卵母细胞的 电学模型在传递函数分析时简化为无源模型，在无源模型中略去了静息膜通路中的 e 一和整个可激活膜通路。在以后的讨论中，如不特别说明，我们都基于简化的无源 细胞电路模型，细胞膜用膜的复阻抗z m 来表示。 2 2 电压钳基本描述 电压钳电路的目标是控制细胞的膜电位，同时测量出需要完成这一钳位控制所需 要的电流。知道了膜电位和膜电流，膜阻抗就可以直接计算出来瞄l 。 细胞膜离予通道的打开和关闭引起离子电流，也可以形成细胞膜上的动作电位， 而膜电位的变化又会影响该离子的通透性的变化。膜电位和膜电流的互相耦连，对膜 蛋白机理的研究构成很大的障碍，因而人为使膜电位在一定时间内维持在一个固定水 平，是解决这个问题的方法【2 4 1 。电压钳技术是通过插入细胞内的微玻璃电极向细胞内 补充电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的反向离子流，这样即使膜通透性发生变 华中科技大学硕士学位论文 化时，也能控制膜电位的数值保持不变，经过离子通道的离子流与经微电极施加的电 流方向相反，数量相等，因此可以定量测定细胞兴奋时的离子电流。膜通透性的改变 是十分迅速的，但如果使用的负反馈钳位系统有足够好的高频响应，就可以连续快速 自动地调整注入电流，达到保持膜电位恒定的目的。钳位系统的响应性能是我们要重 点讨论的问题。 电压钳的实验构造主要是单电极( s e v c ) 和双电极( t e v c ) 两种，根据不同实 验的细胞类型要求使用不同的记录方式2 5 1 。对于尺寸很大的细胞通常使用双电极电 压钳，其操作简单，使用方便，记录效果也比较好，只是因为同时插入了两根电极， 对细胞的伤害比较大。对于小的细胞，则可以选择单电极电压钳方式。对卵母细胞来 说，双电极电压钳是合理的，也是通常采用的方法。后面会讨论卵母细胞的特点和对 钳位系统的要求。 2 3 理想的双电极电压钳 顾名思义，双电极电压钳是在一个细胞上使用两个独立的电极，其基本原理如图 2 2 所示。其中电极m e l 是电压检测电极，负责检测细胞膜电位；电极m e 2 是电流 注入电极，负责向细胞中注入电流，以改变细胞的膜电位。 m 图2 2 双电极电压钳 _ - 。1 _ - 。_ 1 _ _ 。- _ - - 。_ 。_ 。_ - 。_ 。_ _ _ - 。- _ 。_ 。_ _ _ - - - 。_ _ 。_ 。_ _ _ _ _ - _ 。_ _ 。- 。_ 。_ _ _ _ - - 。_ - _ _ 。_ _ _ - - 。- 。_ _ _ 。_ 。+ _ 1 。i _ _ _ - 。_ _ _ 。_ 。_ _ _ ，- _ _ _ _ _ - 8 华中科技大学硕士学位论文 电压检测电极m e l 通过一个单位增益缓冲放大器a l 对细胞膜电压进行记录。 a 2 是一个高增益差动放大器，它将圪与命令电压屹相减，得到误差电压占，并放大爿 倍。由放大器a 2 的输出电压所产生的电流经过电流注入电极m e 2 流入到细胞内，可 以造成细胞内电压的变化。放大器a 2 输出电压的极性决定了注入电流的方向。 根据图中所示，可以得到双电极电压钳中细胞膜电压和命令电压k 的基本关 系：= 圪一v j a 。从表达式中可以看出，当爿一。时，就可以得到= k 。实际电 路设计中，4 是有限的，但a 越大就越接近。一般情况下，保证电压放大增益 a 1 0 3 ，就可以近似认为是与k 相等的。 要得到良好的电压钳位特性，必须满足以下几点【2 6 】：1 ) 钳位准确度。增益“必 须很大，以保证在细胞膜电导或是m e 2 电极电阻发生较大变化时，尽可能地接近 k 而保持不变。2 ) 良好的动态特性。电压钳位的建立必须很快，也就是说电压钳位 必须能够跟随命令电压k 以及细胞膜电导的快速变化，将细胞膜电位牢牢钳制在设定 的命令电压值。3 ) 较高的精确度。电压钳位应该是对进行单独控制。溶液中的电 压分布变化，以及电极上串联电阻的电压都会对的检测和控制带来不好的影响， 设计中应该采用特定的补偿电路消除无效电压量，提高控制精确度。 2 + c i 吒 图2 3 理想的双电极电压钳原理图 双电极电压钳电路的最简构造示于图2 3 。由r 。l 和a l 构成单位增益反馈通道 华中科技大学硕士学位论文 前向通道包括差动放大器a 2 和尺。2 与细胞串联构成的衰减器；圪是a 2 的输出； 是前向通道的输出：“是反馈变量。 双电极电压钳实际上是个负反馈自动控制系统，通过对电压误差的不断校正而 达到保持细胞膜电压恒定的目的。反馈系统方框图如图2 4 所示。 图2 4 理想的双电极电压钳传递函数方框图 前向通道由a 2 、r c 2 和细胞负载构成，它的传递函数f 例： f ： 二塑 v o ( s ) 一心( j ) 。南4 - ( 2 j ) 占f l 其中 肛彘 b z ， r m + r 吐 、7 f p = ( 氏8 心) c m ( 2 3 ) 符号i l 表示并联，k 是( a 2 的输出) 被细胞负载和r e 2 构成的衰减器分压的直 流衰减系数，r d 是通过r c 2 对细胞膜充电的时间常数。 这是一个单位负反馈，可以得到系统的闭环传递函数： 赡( s ) v o ( s ) s f 。+ 塍+ 1 上式中，令s 趋迸于0 ，可以得到系统对k 阶跃信号的稳态响应n ( 2 4 ) 华中科技大学硕士学位论文 a = a k l + l ( 2 5 ) 这里，a 是钳位电路强制膜电位跟踪命令电压k 在直流或低频段的精度，对 于极大的卢值，满足卢p l 的条件时，吐趋进于i 。 为便于以后的分析，我们将式2 4 的传递函数写戍标准形式 其中 对“j 1 鬻：当 ( 7 6 ) k ( j ) s z o + 1 、。 - r o2 i 备 r o = r e 2 c h ( 2 7 ) ( 2 8 ) 令k ( 5 ) = v g s t 对上式作反拉普拉斯变换，可以得到理想双电极电压钳系统的阶跃响应 2 7 1 ： v m ( t ) = a 圪【1 一e x p ( 一t l r o ) 】f 0 ( 2 9 ) 可见( f ) 以时间常数r o 指数上升到终值d 圪，1 0 9 0 上升时间卉是 _ = 2 2 匈 f 2 1 0 1 对“胁 l r r 2 2 2 r e 2 c m & ( 2 11 ) 可见，在理想电压钳时，只要满足f x l ，增加钳位增益就可以降低上升时间， 而且膜电阻就不会影响，r 。 从双电极电压钳的系统传递函数中可以看出，它相当于一个低通滤波器其3 d b 的转折频率户3 是 正3 = ( 2 s r r o ) 。1( 2 1 2 ) 当f d l 时，可以近似得到： _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - _ - 一 i l 华中科技大学硕士学位论文 厶2 暑 b 。一3 2 死r c 2 c m 毕” 因此，增加钳位增益可以直接增大v m 跟随k 变化的带宽。 2 4 实际的双电极电压钳 在实际的实验过程中，影响双电极电压钳系统动态响应特性的并不是只有细胞膜 电容，还有其它一些频率依赖性元件。它们主要包括：1 ) c i 。，由m e l 电极的玻璃管 杂散电容和缓冲放大器的输入电容组成；2 ) c z ，电路中所引入的用于调节钳位相位 超前( 零点) 的可变电容；3 ) g ，电路中所引入的用于调节钳位相位滞后( 极点) 的可变电容；4 ) c x ，两支电极由于相互靠近而产生的耦合电容。在实际电路设计和 具体实验当中，必须充分注意以上电容对系统性能的影响【2 8 i 。 2 4 1 双电极电压钳的电流阶跃响应 双电极电压钳的电流阶跃响应： ，m = 警【1 + 奠玉e x p ( - t 0 ) 1 t 0 ( 2 1 4 ) mz o 其中r m = r 。c - ，表示细胞膜时间常数。 当命令电压v o ( o 产生一个阶跃电压之后，细胞膜电流厶( 0 在t = - o 时刻将产生一个 尖峰，随后按照指数函数的形式衰减至终值a v g r 。因为k t k l ，动 l 时近似为v g k ，在大的膜电导情况下，假定r 。= l o k q ，r 。2 = 1 m q ，k 近 似为0 o i ，圪= 1 0 0 r n v 时，k 为1 0 v 。对于输出线性摆幅1 5 0 v 的输出放大器，稳 态时驱动能力是足够的。因此输出放大器的高电压摆幅是要解决膜电容的快速充电， 从而加快电压钳位的速度。 2 5 电流测量原理 卵母细胞电压钳实验的最终目的就是为了测量各种条件下通过细胞膜的离子电 流。膜电流测量的方法有很多种，实际中最常用的就是串联电流测量方式和虚地电流 测量方式，而双电极虚地电流测量方式是对虚地测量方式的改进，是目前最好的一种 电流测量方式。 2 5 1串联电流测量方式 串联电流测量是直接对电流注入电极上流过的电流进行测量，如图2 6 所示。在 钳位调节输出电流厶流到电流注入电极的通路中串联一个采样电阻，采样电阻两端的 电压差正比于电极电流厶，通过一个高输入阻抗的差分放大器a 5 检测出电压差，也 就等于得到了厶值。由于钳位输出放大器是高电压输出( 本设计中是士1 8 0 v ) ，所以 1 4 华中科技大学硕士学位论文 放大器a 5 的输入共模电压范围必须高于士1 8 0 v ，由于要在这样高的共模信号中检拾 差模信号，放大器a 5 必须具有高共模抑制比。其反相输入端的输入漏电流必须很小， 才不致由于在高阻抗端的电流吸收导致电流测量误差。 i 。i 图2 , 6 串联电流测量原理示意图 电流厶并不是全部都通过细胞膜流入了细胞，其中有- - d , 部分电流通过c w ( 电 流注入电极未屏蔽部分的电容) 和c ( 对地屏蔽的电容) 流走了。对于中低频信号， c 0 和c s h 所形成的容抗非常大，流过它们的电流，w 和厶比细胞膜电流厶要小得多， 常常可以忽略不计，因此l o = i m 。而对于高频信号，c 。和c 矗所形成的容抗变小了，使 得i o = l 。+ 厶。其中只有如是实验所需要的数据，必须从，m 中消除厶和。假定 g + g h c ，可以得到以下公式： k = 毪筹c 掣帆 ( 2 1 8 ) b r 。o + 1 ) 4 ” 、 从公式中可以看出，当r 。c o = r c 2 ( c 。h + c w ) 时，由c 0 增加的极点可以抵消c h 和c 。形成 的零点。选择c o 的值就可以补偿掉c w 和c s h 对，m 测量所造成的影响。 串联电流测量方式原理比较简单，但是却有其较大缺点：1 ) 一般情况下c s h c w ， 需要补偿的电容比较大，一旦没有补偿完全，将会带来较大的误差。2 ) 补偿不完全 的串联输出网络加重了钳位输出放大器的高频负载，会对电压钳位的阶跃响应产生影 华中科技大学硕士学位论文 响。为了将影响消除到最小，r 。应该是电极电阻r 。2 的l ，3 或更小，使得电流检测的 灵敏度和带宽都很难做到很高，电流测量的噪声也会较大。3 ) 当使用1 8 0 v 高压输 出时，差分放大器的设计将会很麻烦，因为市售的集成运算放大器都只能工作在低得 多的共模电压输入范围内。实现高输入电压的高输入阻抗放大器的代价也很高昂。为 了避免以上的问题，可以使用虚地电流测量方式0 2 9 1 。 2 5 2 虚地电流测量方式 虚地电流测量方式使用一个单独的专用电极从低电压端进行电流的测量，从而避 开了对电压钳位的影响和高电压电路的麻烦，其原理示意图如图2 7 中所示。 v o 图2 7 虚地电流测量原理示意图 r 。和c k 是膜电阻和膜电容；c ；是电流注入电极浸入液面部分的朱屏蔽电容；c s h 是由于接 地屏蔽引起的电容；a 6 是理想的运算放大器( 无限增益，零偏置电流) ：g f 和c f 足反馈网络。 放大器a 6 是一个理想运算放大器，假定其增益无穷大，漏电流为零，实际电路 中可以使用低噪声的f e t 输入运算放大器达到近似的效果。运放的正向输入端接地， 根据运放的“虚短”和“虚断”原理 3 0 1 ，反相输入端的电压被强制在零电位，且没有 电流流入。流过电极的全部电流都注入了由电阻r f 和电容c f 组成的反馈网络，由此 华中科技大学硕士学位论文 便可以测量出实际电流值。流入反馈网络的电流矗中只包含，m 和厶，已经没有电流 如，而且一般情况下c w r c 2 c 0 ，反馈网络处于过补偿状态，使得如的测量产生一个阻尼 响应：如果r f f r e 2 c w ，反馈网络处于欠补偿状态，使得，m 的测量产生过冲。因为补 偿的效果取决于风2 ，而它又是一个不确定的值，因此实验中最好的补偿方法是尽量 减小c 。的值( 如尽可能地将屏蔽网延伸到电极尖端) ，并且适当设定c f 的值，使得 在r 。2 所有的取值范围内都产生个轻微的过补偿。总的说来，c 0 的值是比较小的， 细胞膜电流记录的带宽可以达到很大：从d cn ( r f g ) 。实际电路设计中，运放a 6 的电位增益带宽应该达到1 m h z 或是更多，以使得虚地钳位的高频响应达到很高。而 m 和c f 所组成的反馈网络的阻抗应该尽可能地小，以得到良好的信噪比。 2 5 3 双电极虚地电流测量方式 在电流测量中，浴池的电阻凰是无法消除的，其值大约在几k q 左右。由于风 上有细胞膜电流流过，因此形成一个浴池电压。由于卵母细胞的膜电流常在数十微 安，经常在数十甚至1 0 0 m y 。在电压钳实验中，无法将与细胞膜电压区分开来。 也就是说，电压检测电极m e l 所记录到的电压其实是细胞膜电压和浴池电压 之和这将会给电压钳位带来很大的误差。例如，当注入电流，m = 1 0 p a ，r b = 2 k _ q 时， 误差电压将达到2 0 m v 。 双电极虚地电流测量方式是对虚地电流测量方式的一种改进，它使用两个电极进 行细胞膜电流的检测，目的就是为了消除浴池电极电阻如所带来的误差，其基本原 理如图2 8 所示。 华中科技大学硕士学位论文 图2 8 双电极虚地电流测量原理示意图 s e n s e 电极是电压检测电极，它通常放置在尽量靠近细胞表面的位置，通过盐桥 或是别的方式连接到虚地电路，其电极电阻为风2 。由于该电极与运算放大器的反相 输入端相连，因此电极上没有电流流过，风2 上也就不会产生电压降，从而保证了细 胞膜外的电压为零，不再有钳位电压误差出现。另一个电极i b a a a 放置在浴液中，用 于测量细胞离子通道电流。通常认为i b 棚电极尖端的电压和s e n s e 电极的电压相等， 都是信号地。那么可以得到输出电压的计算公式：k = 一( r b t + g f ) 1 8 加 。在一般情况下 r b l ： 4 # k ，进而市 础三红。假定心l = r c 2 ，那么有“c i 之舡，如果c 备= 1 0 0 n f ，= l o p f ，那么, u _ 1 。厶、厶和 。分别表示电极电流、补偿电流和输入 漏电流。在没有电容补偿的情况下，由于c _ 的存在，电极上产生电流厶，使得a 1 的 输入电压和膜电压之间产生误差。采用补偿后，厶气。一厶，只要保证厶瓢。，就可以消 除电极电流，补偿输入电容的影响。k = c 。警，l = c 。( 。一1 ) 盟d t ，如果调节n 使( _ 。1 ) = c 吣就可以使得厶= 正。，就是说调节放大器a 2 的放大增益，就可以实现对 不同输入电容值的补偿。 - h - - h _ h _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ - - - _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - r 一一 2 0 华中科技大学硕士学位论文 2 7 液结电位补偿原理 微玻璃电极检测到的电压值不仅仅是细胞膜电压，还包括电极的液结电位。当不 同的导体相互接触时，就会产生结点电位【3 3 】。细胞电生理测量中最常用是银丝电极， 使用前需要对其进行氯化处理，在其外形成一层氯化银表面。在通常情况下，微玻璃 管电极中所充灌溶液的c l 浓度和浴池溶液中的c l 。浓度不同。因此，在电极入水后 它和浴池溶液之间将会产生电势差，形成的稳定的结点电位，称为液结电位。液结电 位对电极的影响非常大。例如，对于双电极电压钳实验中的电压检测电极m e l 来说， 假定实际细胞膜电压为一6 0 m v ，液结电位为1 0 0 m v ，那么检测出的膜电压为4 0 m v ， 如果要实现对细胞进行一5 0 m v 的电压钳位，则会出现相反的结果，因此必需使用一 定的方法消除液结电位。 液结电位的消除方法比较简单。虽然液结电位的产生的随机的，涉及的因素很多， 但是对于某一根电极的某一次具体穿刺，液结电位都是一个固定值。可以设定一个直 流偏置电压，在检测出的电极电压中减去该电压值，就可以消除所有的液结电位。 2 8 电极电阻测试原理 实验者在装上新的电极之后，首先要进行电极电阻的测试。测试方法是让电极进 入浴池溶液，测量探头输入端与地之间的电阻。用于卵母细胞实验的微电极电阻一般 在l m n 1 0 m f 2 。如果测试出的电极电阻太小可能是玻璃电极前端太粗细或者开口 太大，甚至尖端破损；如果测试出的电极电阻太大，可能是玻璃电极尖端太细或者开 口太小，严重时电阻近于开路，则可能是电极抛光时玻璃熔融过渡而堵塞了开口，或 者是电极冲灌液中有未能逸出的气泡。因此，电极电阻测试是一个非常有用的功能， 使我们仅凭借电极的电参数就可以有效地控制电极的制作质量，判断电极是否达到实 验使用的要求。 常用的电路设计方法是通过一个电流注入电阻向电极注入一个恒定电流，一般是 1 0 h a ，这个1 0 h a 的恒流就会在电极电阻上产生标度系数为1 0 m v m f 2 的压降，这个 电压显示在数字面板表上，就可以读出电极电阻值。 华中科技大学硕士学位论文 由于读出的值实际上是电极入水时的电极电压，它含有液结电位引起的电极偏置 电e ，所以要先补偿掉电极偏置电压以后才能进行电极电阻的测试。 2 9 辅助细胞穿刺原理 在使用微玻璃电极对细胞进行穿刺时，由于细胞膜很柔软而且有定的韧性，通 常会把细胞膜压出一个凹坑，却又无法穿透。这时，就需要使用仪器进行辅助穿刺了。 解决的方法有好几种，最古老也是最常用的就是轻轻敲打微操纵器，使得微玻璃电极 产生机械振动，帮助穿刺。但这种方法很不科学，随意性很大，无法实现校准和精确 重复，操作技术难度较大。因此，最好是使用电学的方法实现穿刺。 一种辅助穿刺的方式称作振荡穿刺( b u z z ) ，其方法是通过微玻璃电极产生一个 短暂的高频振荡电流，带动细胞膜更容易穿刺。振荡电流的持续时间定要控制好， 即要保证不能太短，否则无法顺利地完成穿刺，又要保证不能太长，以免对细胞造成 损害。 另一种方辅助穿刺的方式称作极化穿刺( c l e a r ) ，其方法是是向细胞中注入一 个很大的正向或是负向电流阶跃。与振荡穿刺一样，电流阶跃的幅度定要控制好。 在传统电压钳放大器中，振荡穿刺的实现是通过使电容补偿电路振荡得到的，阶 跃穿刺的实现需要相应的附加电路。 华中科技大学硕士学位论文 3 1 总体设计框图 3 放大器的电路设计与实现 卵母细胞钳放大器的整体电路框图如图3 1 所示。它包括两个独立的探头电路， 主板和电源板。探头电路包括电压测量探头和双电极虚地浴池探头。主板包括电压测 量电极通道、电流注入电极辅助功能通道、电流监测通道、命令通道、钳位控制器模 块、电流驱动模块和辅助电路。电源板提供主板和探头所需的士1 5 v 、5 v 和士l s o v 电 源。本章将逐一解释这些电路的设计。 图3 1 放大器电路总体设计框图 3 2 膜电位测量通道的设计 膜电位测量是作为双电极电压钳的反馈通道，除了完成膜电位测量这一根本需要 以外，这个通道还要完成电极电容补偿、电极电阻测试和b u z z 这几个辅助功能。 华中科技大学硕士学位论文 3 2 1 电压测量探头的设计 电压测量探头电路见图3 2 。玻璃微电极信号通过电极夹持器( p i p e t t eh o l d e r ) 连 接到探头的电极输入端子，这是一个阻抗5 0 d 的b n c 端子。运算放大器a 7 0 1 接成 跟随器形式，信号在v d t a g ep r o b eo u t p u t 得到单位增益输出。c 7 0 3 是用于电极电容 补偿的注入电容，r 7 0 1 是用于电极电阻测试的注入电阻，电极电容补偿和电极电阻 测量电路的设计将在后面给出详细的说明。 图3 2 电压测量探头电路图 由于细胞动作电位信号一般在m 0 0 m v 范围内，故而在这一类型的生理放大器中 一般采用1 0 倍的膜电位信号进行处理，以提高系统的信噪比。本机