（生物物理学专业论文）膜片钳放大器中瞬态电流伪差自动补偿的研究.pdf

华中科技大学硕士学位论文 摘要t 作为一种先进的电生理技术，膜片钳技术在生命科学研究中得到广泛威用。细胞 电袋理磷究孛，离子逶道懿滚热p a 缀鹣徽骣售号，絮鼗徽弱戆蕊号，霉徽镁整理戳 方便观测、分析。膜片钳放丈器正是处理微弱电生理信号的有力工具。 为精确诧录缀藏宅生褒信号，膜片镭放大器采爝了放大、颏率释偿、穰容奉 嫠及 电阻补偿等系列的补偿技术，电容补偿技术是其中关键技术之一。传统膜片钳放大 器中，电容补偿参数配置需手动完成，过獠复杂、繁琐。自动化膜片钳放大器采用计 算枫控割，遇过对电容瓣态电流的分析，巍动搜索袖偿参数，实现了电容於搂的皇淤 化，简化了实验过程、提商了实验效率。 本文戆主要漤逑了窭都分内容。簧麦慰貘片镌羧大器王终露理及蛰缨技寒透嚣了 深入研究，这是实现膜片钳自动化的基础。第二部分从全细胞模式电路特性研究入手， 改进了全鬣藏貘片铤兹毫路模型，撬密了恢疆窀容螽动蛰绥懿算法。第三部分霸王獒 软件m a b l a b 建立膜片钳系统的电路模型，并仿真验证了电容补偿算法，为电容自 动补偿实现提供了瑷论保诞。最霜部分对传统膜片锚放穴器毫辫补偿嘏路做出敬 进，实现了电容补偿的自动化。 关键词：膜片钳放大器，快电容，慢电容，电容补偿技术 t 本论文工作妇国家自然科学基金仪器顼目资助( 批准号：3 0 3 2 7 0 0 1 ) l 华中科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t a sa na d v a n c e d e l e c t r o p h y s i o l o g i c a lt e c h n i q u e ，t h ep a t c h - c l a m p h a sb e e nw i d e l y a p p l i e di nt h er e s e a r c ho f l i f es c i e n c e i nc e l l u l a re l e c t r o p h y s i o l o g i c a ls t u d i e s ，c h a n n e li o n i c c u r r e n ti sv e r ys m a l l0 i c o a m p e r et on a n o a m p e r e ) ，w h i c hn e e d st o b ep r e p r o c e s s e df o r f a c i l i t a t i n g t h em e a s u r e m e n ta sw e l la st h e s u b s e q u e n ta n a l y s i s t h ep a t c h c l a m p a m p l i f i e ri sj u s t a l l e x t r e m e l yp o w e r f u lt o o lf o rp r o c e s s i n gt h es m a l le l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s i g n a l s i no r d e rt o a c c u r a t e l yr e c o r dc e l l u l a re l e c t r o p h y s i o l o g i c a ls i g n a l s ，t h ep a t c hc l a m p a m p l i f i e ra d o p t s as e r i e so fc o m p e n s a t i o nt e c h n o l o g yi n c l u d i n gh i 曲一g a i na m p l i f i c a t i o n , 丘e q u e n c yc o r r e c t i o n , r e s i s t a n c e a n dc a p a c i t a n c ec o m p e n s a t i o na n ds oo n ，w h e r e i nt h e c a p a c i t a n c ec o m p e n s a t i o n i so n eo ft h e k e yt e c h n o l o g i e s i n 廿a d i f i o n a lp a t c h c l a m p a m p l i f i e r s ，t h ep a r a m e t e r sf o rc a p a c i t a n c ec o m p e n s a t i o n a r em a n u a l l yc o n f i g u r e da c c o r d i n g t ot h eo b s e r v a t i o no fe x p e r i m e n t e r s ，w h i c hi sv e r yc o m p l i c a t e da n dd i s c o m m o d i o u s t h e c o m p u t e r - c o n t r o l l e da u t o m a t i cp a t c h - c l a m pa m p l i f i e r , t h r o u g ha n , a l y z i n g t h e c a p a c i t a n c e t r a n s i e n tc u r r e n t , a u t o m a t i c a l l ys e e k st h ep a r a m e t e r sr e q u i r e db yt h ec o m p e n s a t i o n ，w h i c h r e a l i z e st h ea u t o m a t i o no fc a p a c i t a n c ec o m p e n s a t i o n , s i m p l i f i e st h ee x p e r i m e n t a lp r o c e s s ， a n di m p r o v e st h ee x p e r i m e n te f f i c i e n c y t h i sp a p e rh a sb e e no r g a n i z e di n t of o u rs e c t i o n s t h ef i r s to n ec l e a r l ye l u c i d a t e st h e o p e r a t i o n a lp r i n c i p l eo f p a t c h - c l a m pa m p l i f i e ra n d t h ec o m p e n s a t o r yt e c h n o l o g y , w h i c ha r e t h ef u n d a m e n t a lf o rf u l f i l l i n gt h ea u t o m a t i o no f p a t c hc l a m p t h es e c o n ds e c t i o np r o c e e d s w i t ht h es t u d yo ft h ec i r c u l tc h a r a c t e r i s t i co fw h o l e c e l lm o d e ，a n dd e s c r i b e st h es t u d yi n w h i c ht h ec k c m tm o d eo f t h ew h o l e - c e l lp a m h c l a m pw a sc o m p r e h e n s i v e l y u n d e r s t o o da n d f u r t h e rw a sc h a n g e dw i t hb e r e r m e n t , a n dt h ea l g o r i t h mw a sf u l f i l l e df o rt h ea u t o m a t i c c o m p e n s a t i o n o f t h ef a s ta n ds l o w c a p a c i t a n c e i nt h ef o l l o w i n gs e c t i o n ，t h ec i r c u i tm o d e o f t h ep a t c hc l a m ps y s t e mw a se s t a b l i s h e dw i t hm a t l a bs o f t w a r e ，a n dt h ec o m p e n s a t o r y a l g o r i t h mw a ss u c c e s s f u l l ys i m u l a t e da n dv e r i f i e d ，p r o v i d i n gt h et h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h e a c h i e v e m e n to fa u t o m a t i c c a p a c i t a n c ec o m p e n s a t i o n t h e l a s ts e c t i o nd e s c r i b e st h e a c c o m p l i s h e de n h a n c e m e n t sf o rt h ec a p a c i t a n c ec o m p e n s a t i o nc i r c u i ti nc o m p a r i s o nw i t h t r a d i t i o n a lp a t c hc l a m pa m p l i f i e r k e y w o r d s ：p a t c h - c l a m pa m p l i f i e r , s l o wc a p a c i t a n c e ，f a s tc a p a c i t a n c e ， c a p a c i t a n c ec o m p e n s a t i o n i i 独创性声明 本人声明所里交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除文中融经标明引用的内容外，本论 文不包含任俺箕谴个入或集钵已经发表或撰写过鲶研究成栗。对本文的 磷突骰最嚣麸的个人稷集体，均已在文中以甥确方式掾盟。本人完全意 识到本声明的法律结粜由本人承担。 学挝论文作者签鬟：焉确强 置期：，仍乒年f 月0 日 学位论文版权使用授权书 本学经论文作者完全了鳃学校有关保留、使用学短论文的靓定，即： 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借陡。本人授权华中科技大学可殴将本学俄论文的全部或部 分良誊编入有关数据疼进嚣检索，可以采薅影印、绻印或扫搓等复制手段 保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密骺适露本授权书。 本论文属于， 不保密簦。 ( 请在以上方框内打“”) 学位论文作者签褒：粼拦 指导教，带签名： 日期：衅r 月3t 3日期：州驴年，月z 臼 华中科技大学硕士学位论文 1 1 引言 1 绪论 细胞是动物和人体的基本组成单元。细胞外围有一层薄膜，细胞间彼此分离又互 相联系。细胞间和细胞内的通信，是依靠其膜上的离子通道进行的。离子和离子通道 是细胞兴奋性的基础，亦即产生生物电现象的基础。生物电信号通常是用电学或电子 学方法进行测量，形成- - l q 细胞电生理学( e l e c t r o p h y s i o l o g y ) ，用以揭示细胞的生理过 程。自2 0 世纪4 0 年代末细胞膜和离子学说建立以来，细胞电活动的研究逐渐深入。早 期的研究多使用双电极电压钳技术作胞内记录，1 9 7 6 - - 1 9 8 1 年期间，两位德国细胞生物 学家e r w i n n e h e r 和b e r t s a l o a a t m 所开创的膜片钳技术( p a t c h c l a m p t e c h n i q u e ) 为细 胞生理学的研究带来了一场革命性的变化【l 捌。 1 2 膜片钳技术发展历史 膜片钳技术是随着生物电生理研究的发展而发展起来的。公元前三百多年亚里士 多德观察到电鳐在捕食时先对水中动物施加震击，使之麻痹。古希腊古罗马人曾用黑 电鳐的震击治疗风痛、头痛。但是，直到1 8 世纪电学的一些基本规律被发现后，人 们才逐步认识到动物放电的性质。1 7 6 9 年e n b o n c r o r 指出电鳐和电鲇都能放电， 并将它们的放电力与莱顿瓶组的放电力相比较。1 7 7 2 年j w a l s h 发现了电鲇放电的部 位。当时还并不知道其他的动物体内也有电。 1 7 8 6 年g a l v a n i 发现，如用两种金属组成的回路把新制备的蛙的神经肌肉连接起来， 马上会使肌肉搐搦、抖动。g a l v a n i 根据这一现象认为，蛙体内存在神经电流体，通过 神经使肌肉组织似莱顿瓶一样充电，肌肉内外带有不同性质的电荷，可以放电，金属 导线只起接通的作用：1 7 9 1 年，g a l v a n i 出版了他的名著c o m m e n t c r y ) ) ，指出神经具 有内在形式的电。g a l v a n i 的工作开创了电生理学的新时代。但是在接下来的1 5 0 多年里， 关于人体生理学和医学的基础性研究主要集中在临床和整体器官及组织水平上，直到 一 1 华中科技大学硕士学位论文 1 9 4 6 年美簸华人凌宁将微媳援缨骢蠹记录技本号| 入生理学，舞剖丁缨戆生骥学豹麟纪 元。而在1 9 7 6 年，e n e h e r 和s a k m m a n 首次在蛙胸皮肌细腻膜上记袋到a c b r 通道的单 个遴遵宅滚，标表螯毫生璎研究跌绥齄窳平送入至1 分子承平翻； 电压钳( v o l t a g e - e l a m p ) 是由英图学者h u x l e y 和k a t z 最先成用的。传统的双电极电压 钳淹路茹圈1 1 所承，它由两个插入缁臆的微电裰p l 和p 2 戳藏两个离增益的运放a l 、a 2 构成，当a 2 的同相输入端接一命令电压圪( 控制电联) 时，可测得细臌膜的电位和膜电 流五n 。 图1 1 传统双电擞电压钳原理圈 双电极电压钳的实质鼹通过负反馈微瞧流放大器在兴裔性细胞膜上外加电流，保 持缩蕤跨袋电位不交，莽遨速控裁箕数蓬，茨鬟察猩不同黢毫位条捧下簇毫滚静德澄。 膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化，因此电压钳w 用来研究整个细胞膜或一 大块细胞媵上所有离子遥遴的活动。僵该授术由予在细胞肉插入两搬电极，对细胞损 伤缀大，在小细胞中难以实现，又阏细腿形态复杂，很难保持细胞膜各处嫩物特憔的 皴，而逐渐被膜片钳所取代。 膜片键技；末：( p a t c h - c l a m p ) 是在嗽基错蒸獭上发鼹起来一种囊技术t 貘片镁放大器探 头电路如圈1 2 。电路由高增益集成运放舢茅a 2 组成。a l 与反馈电阻冠组成电压负戚馈 龟麓，a 2 鬃袋擎毽耀益差分奄蓬。擞蕹受爱镶救大瞧路装灏理，a l 戆秀输入壤之瓣澎 成“虚短”和“虚断”的现象刚】。当a 1 同相输入端加入命令电压k ，但命令信号源电 2 华中科技大学硕士学位论文 爨著不影噙毅测缨腿熬活燃状态，褥会生物测量要求。 细 图1 2 膜片钳放大器探头电路 膜片钳与电压钳的主瑟区别有：一怒钳制膜电位的方法不同；= 是电位固定的 细胞膜面积不同，髑所研究的离子遁道数鞠不同。与电压钳一样，膜片钳墩是利用负 反馈电子线路，将适当参数的玻璃管微电极吸附予细胞表渐形成高阻封按( g i g a s e a l ， g q 瓣接) 疆，镬与电援尖薅舞日懿摆接懿缓貔貘豹缨枣嚣壤与其瘸嚣貘片在毫学上分 离，然后将电位保持在钳制电位( 圪) 上，或从钳制电位跳跃到一个特定的方波电位上， 来虢溯记录缓藤貘主锻小邋遘毫流( p 矗，1 0 ”竣羹缀) 魏交纯。在形蔽高隈默簿封接辩， 电阻值如此之高( g f i ) ，故綦本上可以看成绝缘，其上的电流可看成为零，形成高阻封 按酌力主要有氢键、范德牮力、盐键等。诧封按不仅电学土近乎为零，在梳被上落穰 其牢固。又由于玻璃电极尖端管童经很小，其下鲢暾面积仪1 - 2 9 n a a 。在邀么小的膜 面积上离予通道数髓很少，一般只肖一个或几个，经它们流出的离予豢也很少，相对予 整个缀憝来说可以忽珞。那么，只爨保持龟极内毫挝值不交，煲g 其下豹一小片鳃胞貘两 侧的电位麓就不变，从而可以实现电位的固定。膜片钳技术就是通过负反馈电子线路向 毫掇痣注入一与离予奄滚糕霾相等掇经耀爱熬电滚，豫持宅辍疼毫袋毽不变，嚣运弱魄 压钳制的目的4 j 。 1 3 国内外研究状况 膜片钳放大器实际就是一个敏感的电流- 电压转换器，将细胞膜离子遇道的徽弱 电滚( 疫安缀) 转换成可爱汞波器观测或者诗冀枫采榉静电嚣绩号。必检测到妇此微小 的电流，膜片钳放大器的设计者采用了高频补偿、快电容补偿、馒电容补偿、串联电 华申科技大学硕士学位论文 驻李 偿等技术使其具有高芡敏度、宽频带、低噪声的特点。自1 9 8 1 年膜片钳技术获 得照大突破以来，膜片钳放大器的研究也有了飞速发展。 基蔻爨嚣上只毒少数凡家公蜀戆够生产膜片键放大器。其孛寂簇晓较广泛兹寿德 国h e k a 公司生产的e p c 系列膜片钳放大器、美网a x o n 公司生产的系列膜片钳放 大箍。 h e k a 公司生产的具商代表性的产品魑e p c 。7 和e p c 。9 。e p c ，7 是在n e h e r 磁膜 片钳技术上实现了吉欧封接后发展筵来的乎动调节的膜片锯放大嚣溯，它蒸有良好的 性能和完餐的功能，也能跟其他工具配合使用，蹋此褥到广泛应用【8 】。e p c 9 是在 e p c - 7 的熬础上发展起来的，它继承了e p c - 7 的基本特点：( 1 ) 由计算机发出数字信譬， 经d a 转换器藏曦片锘教大嚣发送电压或喾毫瀛刺激信号，共透避a d 转换器接牧 来自膜片钳仪的记渌信号；( 2 ) 计雾机承担了刺激、显示、和记录的任务【8 捌。同时， e p c 9 在蠡动嶷二方嚣数褥蘩大突破：它暴鲻m d a c s 代替霹谴毫隰，蔫较佟实溪怼仪 器内部参数的自动调节。对用户而言，e p c - 9 的面板就是内e p c 9 软件实现的用户界 谣。这种方法方便了尾户，篱话了实验蓠豹一系剜瀵整工幸譬，荠西方便静储存各种实 验设置参数和试验结果【9 】。目前h e k a 最新膜片钳放大器产品e p c - 1 0 ，誉但进一步 优化了e p c 9 的探头，更麓要的怒它改进了e p c 9 中的电流钳电路，实现了膜片钳 放大器的“真”彀流钳工俸模式【l o 】。 a x o n 仪器公询成立予1 9 8 3 年，主要从事生产电生瓒实验和生物物理实验所需 豹疆终设镰帮楚璎软终。它生产戆系嚣貘片键能广泛应矮子萃逶遴、全缨熬等模式瓣 电生理实骏( 1 1 】，它的典型膜片钳仪m u l t i c l a m p 7 0 0 a 膜片钳放大器，不但具备了传统 膜片键放大器酶功能，实瑷了离速粪电流键，还爨备了囊溯帮手动黼嚣吴螽懿囊麓， 使用户能够更方便的根据翻己的条件来选撵配套设施1 2 1 。a x o n 的最新膜片钳产晶， m u l f i c l a m p 7 0 0 b ，在智能纯方面散的更加磁色：它不僵其备了鲁动调节各种卒 偿参数 的能力，褥虽当命令电压发生突变时，m u l f i c l a m p 7 0 0 b 能氨动忽隧过大媳瞬态电流， 保护实验细胞i l ”。 鞠筚饩强来，膜片镂搜寒在擞奏范鬟巍褥到广泛懿攘广应用，宅被认势是鎏电 愿钳技术应用3 0 年以来电生理技术方法的重大进步。我豳从事电生理、神经科学和 华中科技大学硕士学位论文 分子生物学等领域鞭究靛工话嚣也广泛豹健丽膜片镄技术。1 9 8 7 攀，牮中辩大生携瀚 瑾与生物化学研究所开始研制功自齐全的膜片键系统。经过十多年时间研制出了全套 功魏竞备戆仪臻系绞著对箕逡霉亍了多次丹缎巍动能延伸。冀具有代袭熬豹鹱冀锚敖大 器p c i i b 及最凝产菇p c i i c ，它嬲所舆备憋爨性能的计冀桃数据聚集及实骏控京系统 後实羧者戆在一个较耱琢攘下窑魂多囊设套豹实爨溺疹控麓巍参鼗聚集，从瑟舞窝实 验数攒靛疆鐾。产菇经每瓣貔上海毒拳缀辩学磷突灏、审莺辩技大学、孛嚣农照大学、 乾索大学、牮中秘大嚣济暇学院等2 0 多家蓊究税梅试震，效莱囊婷，技零往鹱萋零 上逡到了黧际先进窳平【1 毛鞴。毽罴程巍动纯方面，述没畜瑕褥突破。鬻羞诗冀堍秘能 的疆藏强大和电予技术的豳益发展 三l 及测试任务的酲藏复杂，为研究入员提供方便完 善的鹳研仪爨已经戏沟发爨趋势，鞭藏，华中辩鼓大学生糖浆理每整豹纯攀研究所一 直致力予帮发灏一代的自动化膜片锚放大器。 1 , 4 本课艨的主要王僚 农导师的搬导下，经过一年多的探索、研究，基本实现了国产膜片钳放大器龛鲁 动能审关键波诗之鼹骞瓣森镄蓑熬巍动章 镁。 铃对憋鞋型黢冀键款大嚣每次实验懿必须进姆复杂瓣毒 傣电黠参数调节的缺点， 采耀了一耱抉、蠖奄蜜瓣淼铸蒺塞麓褥偿髯法。遴遗黪抉、蠖毫雾舞悫锈麓羲滚熬分 耩，巍诗籍瓤软 串蠡旗迭钱基莰、蠖怒容熬每 楼参数势设邂嫒搏懿踌，麸麟实现| l 蘸恣 德差的鸯动脊偿。 5 华中科技大学硕士学位论文 2 1 引言 2 麟片钳放大器的原理 在电生理测量中，所用的钡量仪器必须满足两个基本条件：( 1 ) 必须能猴确的测嫩 菜黧生理参数：( 2 ) 溪尽量遴免蓑尽爨减少巍鲎搜嚣瓣被涎瓣象懿影穗。筵终，蠢荛嘏 生理信号属微弱信号，噪声问题比较严重，所以采用低噪声技术，_ 井且要波意防止备 葶孛予魏1 4 j 。镪热，在缁脆电生淫研究孛，离子通道毫流的谴簸在p a 剡n a 斡数量范藤 之内。这栉微弱的电流信号，往往首先要将它变为电压信号以便于用示波器观察或糟 被计算机进行采样、处理、分析。针对微弱信号的特点，对其测量、放大祷做噪声分 析秘低噪声设计1 1 6 - 2 1 1 。除慑噪声要袋鲣，膜片钳放大器对频率响应瞧有一窥要求；为 避免电极电容、膜电容和电极入口电阻的瞬态影响，还需要精心设计阻容参数的补偿 电鼹。 2 2 膜靖钳放大器原理 在细胞电生理研究中，为了测量细胞膜离子通道电流，器罄用一尖端直径约为l p m 的玻璃微电极与细脆膜紧密封接，封按的微区就叫做膜片( p a t c h ) ，钳所指的就是钳位 f c l a m p ) 豹意思，二糟慕嚣为膜片钳( p a t c hc l a m p ) ，这是一耪鼹予凑礴测量离子逶遘魏 流的技术 2 , 7 , 1 9 , 2 0 l 。 图2 1 膜片钳放大器主骤组成电路 6 华中科技大学硕士学位论文 膜片钳放大器主要由探头放大电路、高频补偿电路、滤波电路以及快、慢电容补 偿电路及串联电阻补偿电路等部分组成，电路如图2 1 所示。膜片钳放大器主要电路 的基本目的都是尽量降低通道电流信号中的干扰及噪声，便于试验研究员观测和分 析。 1 ) 探头放大电路 目前，在仪器设计与工程实践中，膜片钳放大器的探头电路存在两种方案，即电 阻反馈式二y 变换器( 图2 2 ) 和电容反馈式i - v 变换器( c r y ) 。与r i v 相比，c l v 用反馈电容c f 代替了反馈电阻r f ，此时变换器工作在积分方式。电容反馈式二y 变换 器具有较低噪声、较宽频带和较大的动态范围和线性度，但是在实践中不可避免的遇 到两方面的困难。首先，当被测信号含有直流分量的成分时，其积分输出电压受放大 器进入饱和状态的限制，因而c i v 必须备有复位电路，周期地使c f 放电，使积分输 出电压回复到零值。其次，在设计这种c i v 时，要注意由于c f 的快速放电所产生的 暂态电压对电路的输入和输出端的影响，因此，我们设计的i - v 变换器主要为电阻反 馈式，下面只简单介绍一下电阻反馈式变换器。 图2 2 电阻反馈式变换器 在图2 2 中，玻璃电极的尖端与细胞膜封接，电极引线接至集成运放a 1 的反相输 入端，同相端接命令电压( 控制电压，c o m m a n dv o l t a g e ) 攻。运放a l 及电阻皿组成电压 并联负反馈放大器，由于a l 的开环增益很高，导致它的两输入端之间形成虚短和虚 断的现象。对照前述膜片钳的定义，利用图2 2 的电路将控制电压圪间接的通过微电 极作用于细胞膜上，产生电极电流厶。换言之，细胞膜的电位被k 所钳制，这就是膜 片钳一词的含意。 _-_-_-一一 7 华中科技大学硕士学位论文 电极电流耳与流过墨上的电流相等。厶在岛上所产生的电压降被单位增益差分 放大电路a 2 所检测，故有 z o = l 墨( 2 1 ) 由此可见，r i v 的输出电压与反馈电阻成正比，即电路的增益a r = 儡= r q ) 。 可以推知，为了提高测量灵敏度，必须运用高阻值的反馈电阻，例如阻值可达数百m r 2 至几十g q 。但是，砖的值越大，电阻的分布电容对放大器的频响带宽影响也越严重。 2 ) 高频补偿电路 根据被测的电流波形，要求膜片钳放大器应具有一定的频响带宽。因此，有必要 研究放大器的系统频响。放大器的系统频响主要取决于探头电路。 令 图2 3 探头电路的动态模型 图2 3 表示探头的动态模型，其传递函数可用下式来描述 巧 砭 州2 器2 辟硒芯瓦击丽z 2 ) 式中，已为电极输入端的等效电容，t 1 = z r = r f c f ，r e = c p r j c f ，讯为运放a 1 的特征时 间常数，r = 小j i 面而为固有时间常数，f = 三二王为阻尼系数。实际电路 中，r r = 5 0 g f ，c r = 2 0 f f ，c p 约为1 0 p f 左右，讯约为1 6 n s ，显然，石2 1 ( 2 a r 0 = 1 5 9 h z 华中科技大学硕士学位论文 为系统的主极点频率，亦即3 d b 带宽，正为探头的次级极点，在实践中，根据探头状 况不同，次级极点通常分布在几十千赫到一百多千赫的范围内，探头电路的带宽由主 极点决定。显然带宽如此狭窄的探头电路用来记录离子通道电流信号，是不能满足实 际要求的。为此，需要在后处理电路中加上高频补偿电路，对前述两个极点进行适当 的补偿，以扩展频带 2 a 8 1 。 设计高频补偿电路的原则是：首先，要准确地补偿探头电路的主极点，而且新增 加的极点不得妨碍系统频响；其次，要求补偿后的系统稳定性不受影响；最后，补偿 不能使系统高频噪声增加太多。高频补偿原理如图2 4 所示，其传递函数为： 耶，= 警= 鲁。紫 s ， 图2 4 高频补偿原理图 其中，r l 、r 3 为可变电阻，且五l 的值远远大于r 2 。首先选择蜀的值，使i + r 2 ) c = r l 。 又因为r i 的值远远大于丑2 ，则系统新增加的极点r 2 c 远高于r l ，再适当选择盖3 的值 来调节系统增益1 2 1 。 3 1 阻容补偿电路 在使用膜片钳放大器对细胞进行电生理检测时，由于电极前端存在杂散的电极电 容c p 、细胞膜电容c 备，若施加阶跃刺激电压，膜片钳放大器会产生瞬态电流伪差a 电流伪差成因有两种：一种是由于c d 引起的瞬态电流，因充电时间常数较小，所以 我们称作快电容电流，g 也就被称为快电容；另外一种是由c m 造成的，因c 刍需要 经过电极和细胞膜之间的串联电阻r 。( 通常为几兆欧姆) 来充放电，时间常数相对快电 容要大，所以我们称之为慢电容电流，c k 也就被称为慢电容。这两种电流通过探头 二矿变换电路( 见图2 2 ) 都会导致输出电压产生动态误差，甚至可能使放大器饱和而不 9 华中科技大学硕士学位论文 能正常工作，因此必须采取相应的补偿措施进行校正。 快、慢电容引起的瞬态伪差信号的补偿原理如图2 5 所示，其基本思想就是从另 外的通路提供一个与快、慢电容瞬态伪差电流恰好相等的电流，来抵消快、慢电容伪 差电流对输出信号的影响，从而达到补偿目的，后面的文章将做具体的分析，在此不 作展开。 图2 5 快、慢电容补偿电路示意示意图 膜片钳技术的突出的特点就是将膜电位钳制在外加控制电压k 上，但实际上， 由于有两种电流成分流经串联电阻晟而产生压降，以致产生钳位误差：一种是主要 记录的通道电流在r 。上产生的电压降昧。l ；另一种是慢电容补偿电流在最上产生的 电压降 ，r 正。由于这两种电压降的存在，使得实际加在细胞膜上的钳位电压v m = k 一际。l y 如。为了克服这一误差，必须把钳位电压k 变为k ，使得v o 名k + y h l + p 缸。这样，匙引起的误差才有可能被消除。 针对两种压降产生的原因，串联电阻补偿需要用两个补偿电路。首先，对于离子 通道电流产生在r 。上产生的压降，会反映在输出电压中，因此可在输出端到钳位点 之间引入一个正反馈以补偿通道电流在串联电阻匙上产生的误差。补偿电路如图2 6 。 l o 勰 巧 华中科技大学硕士学位论文 图2 6 串联电阻补偿原理图 其二，对于因慢电容补偿电流引起的钳位误差，则在慢电容补偿的同时迭加上一 个恰当的电压分量，来补偿这一部分误差。这一部分串联电阻补偿与慢电容补偿结合 在一起，将在慢电容补偿中作详细的分析( 见图4 7 ) 。 值得指出的是，上述两种补偿，都是正反馈，而且串联电阻可达到的最大补偿率 跟探头的特性有很大关系，为保证实验的正常进行，串联电阻最好处于轻度欠补偿 2 1 。 2 3 全自动化膜片钳放大器简介 采用手动调节校正各参数的膜片钳放大器，膜片钳的参数校正是一项既费力而又 效率低下的工作，而且每次膜片钳实验前还需要凭经验估计c p 、c k 的值，并反复调 节快慢电容补偿参数至适当值，才能使膜片钳放大器正常工作，这要求使用膜片钳放 大器的实验员熟练掌握仪器的操作方法和实验技巧。同时各参数补偿的结果因人而 异，导致实验结果的可对比性差。随着电子技术飞速发展和电脑功能的日益强大，全 自动化膜片钳放大器的设计与实现成为可能。 全自动膜片钳设计的目的就是通过软件控制，自动完成膜片钳的调试以及实验参 数的补偿，将研究人员从烦杂的重复劳动中解脱出来。要实现这一目的，需要解决以 下几个问题：首先需要一个数据采集系统，能够将实验中需要收集的重要数据采集到 计算机中；其次，计算机中需要配备一系列的处理程序，不但为用户提供方便友好的 一一 i 】 华中科技大学硕士学位论文 操作界面，而且能够迅速准确的完成膜片钳放大器的包括模式切换、电容瞬态补偿等 各项工作。 硬件上，在自动化膜片钳中，模拟信号放大电路的参数调节和校正均采用数字控 制，由自动校正程序来实现，因而不能使用微调电位器和旋钮开关，而代之以乘法式 数模转换器( m u l t i p l y i n gd i g i t a lt oa n a l o gc o n v e r t e r s ，m d a c s ) 和模拟开关。值得注意的 是，将这类数字控 | br j g l 入到膜片钳放大器，将出现两个方面的问题：首先，仪器内的 信号必须是低噪声的j 而市面上的m d a c s 器件的电阻网络必将引入较大的热噪声； 其次，在电流注入和测量电路中，所用的增益可变的元件必须具有受好的线性度。为 此，我们在自动化膜片钳中使用扩展式m d a c s 来替代模拟电位器，同时用软件的方 法来实现放大器的线性增益，并且在关键的电路中，采用功率m o s 器件代替常规模 拟开关。 软件上，自动化膜片钳使用一套操作、控制软件来支持膜片钳的运作，包括一个 虚拟面板和下位控制、记录程序。在虚拟面板上，包括了各种参数设计以及功能按钮， 用户使用键盘和鼠标就能方便的控制膜片钳的各项操作。要实现膜片钳的自动化，在 虚拟面板下面，还有一套特定功能的应用程序，用来控制和记录模拟开关的开断和 m d a c s 的状态。 总之，电生理仪器测量自动化是一个重要的方向，其主要的思路就是将若干参数 数字化，利用现有强大的p c 功能来实现系统控制。 2 。4 小结 本节主要讲述了膜片钳放大器的工作原理。膜片钳放大器达到了目前电生理微电 流测量的极限( 皮安级) 。为了能够准确检测细胞电生理信号，膜片钳放大器对生理信 号进行了放大、扩展频带、降噪、去干扰等一系列的处理，最终将微弱的电流信号转 换成可用示波器观测或被计算机采集、处理分析的信号。最后简单介绍了自动化膜片 钳放大器的设计思想。 1 2 华中科技大学硕士学位论文 3 1 引言 3 快矗a 容- t 1 偿 快电容引起失真的根本原因在于电极杂散电容c 口充( 放) 电时，充( 放) 电电流通过 反馈电阻r f ，导致输出电压产生动态误差。膜片钳放大器的输入端由于有电极与细胞 膜相接触，并且电极内充灌有导电的溶液，必然存在着杂散电容。在以前的膜片钳电 路中，电极电路仅仅等效为单纯的电容，以此来进行补偿的效果也不是很理想。实际 的电极分布参数比这复杂得多，其主要分布参数如图3 1 所示。 图3 1 电极主要分布参数示意图【捌( 说明见正文) 电极浸入细胞外液时，由于液体表面张力，细胞外液会在电极外壁形成一层薄薄 的溶液薄膜。此薄膜在电气特性上表现为阻抗。并且，薄膜和电极内液之间存在着分 布电容；分布阻抗和电容相互串联，构成r c 电路( 图3 1 a ) 。为避免此种分布参数， 通常在电极表面涂敷一层薄薄的绝缘疏水物质( 如s y l g a r d ) 。电极内液与细胞外液之间 由玻璃电极间隔，形成分布电容( 若涂敷s y l g a r d 等绝缘材料，类同) ，玻璃电极内导 电液体存在分布阻抗( 图3 1 b ) 。同时，电极内壁同时存在阻抗和容抗( 图3 1 c ) 、电极 到钳位膜片的串联电阻与钳位膜片的等效电容串联( 图3 1 d ) ，共同构成了复杂的分布 参数的r c 电路1 2 2 。2 4 1 。如此复杂的r c 电路，要分离各个参数在输出离子通道电流信 一一 1 3 华中科技大学硕士学位论文 号上的影响是相当困难的；而且，上述分布参数对输出信号的影响成都也有很大差距， 因此，我们使用图3 2 的等效集中参数电路来替代电极电路，实践表明这种替代简便 可行，而且以此来补偿得效果也比单电容等效电路补偿好得多m0 】。不过，习惯上我 们还是把电极分布参数瞬态补偿称之为快电容补偿。 3 2 补偿原理 图3 2 电极等效电路 如图2 5 所示，当命令电压k 发生阶跃变化时，c d 将产生瞬态电流五，电流流过 反馈电阻毋引起失真。补偿c p 对电流记录影响的思路是，矗由电极输入端通过另一 通道提供，这个电流不流经卜矿变换器，从而使昂( 即输出电压) 中不包含瞬态 电流的成分，达到补偿的目的。补偿电路如图3 3 所示。 图3 3 快电容补偿原理图 当从c i 流出的电流 = 矗时，实现完全补偿，也就要求 吒 雌 一 1 4 华中科技大学硕士学位论文 ( 识v o ) j c o c i 川等以2 暑+ 志+ ( 导+ 1 ) ( 3 t ) 式中，y = j c a c ( i c o r l c i + i ) + j o s c 2 ，r = r 1 c 1 。 显然，要完全补偿快电容瞬态电流，则需要补偿参量c l c i 、c 2 1 c i 、r 。快电容补 偿电路中a 矗为图3 4 中所示电路： 图3 4 快电容补偿电路 若r 以1 = c i c i ，r f 冗2 = c 2 c i ，r c = r ，则可满足式( 3 1 ) 的条件。其中r 1 5 k 哟、 r ( 2 k q ) 、c i ( 1 p f ) 为固定值，通过恰当调节震l 、r 2 、c 即可实现快电容瞬态补偿。 3 3 算法设计 全自动膜片钳采用最小二乘迭代算法来实现快电容补偿，算法中设r c = - f ， 肛1 ) c i = a f 。s t l ，r 2 ) c i = 叫船口。由于彳触l 和r 相互影响，且z 的改变对输出电流影响 为了非线性的，因此，为了降低算法复杂度，对r 的调节步进设为o 5 雌，算法说明 如下： 为一融1 的值改变l p f 时输出电流信号的改变量；正为 缸口的值改变l p f 时输 出电流信号的改变量：五为r 改变一个步长( o 5 t _ l s ) ，输出电流信号的改变量；a i 分别 对应快电容补偿的参量值；) ，) 为输出瞬态电流伪差信号。若求得一组系数o ；i 使得 y ( n ) = q ，( n ) + 占( 以) ( 净1 ，2 ，3 ；行= l ，2 ，”( 3 2 ) 3 ( 为采样点数) 成立，且使，= 【j ，( ) 一c z i ：( ”) 】2 的值最小，则说明补偿达到最 n 1 1j f f i l 】s 华中科技大学硕士学位论文 佳。，有极值的必要条件为兰：0 ，即： d 口 ( 疗) 【y ( n )口，f ( ”) = 0 令：( ，一) = ，( ) g ( ”) ，贝r j ( 3 3 ) 式可化为： 月r 1 喁坼，z ) + 魄，五) + 吗坼，石) = 坼，力舻1 ，2 ，3 )( 3 4 ) 将( 3 4 ) 化为矩阵形式为： 令 f ( ：，i x ；，2 一， ) 、r 口，1r ( ，_ y ) 1 l ( 厂2 ， x ，2 ，2 x ，2 ， ) l ia ，i = 1 ( 厶，y ) l ( 3 5 ) l ( 厶，x ，a ) ( a ，兀) j t a ，jl ( 厶，y ) j m 憾至巍獭静镞弘褂t = i ( ，2 ，1 x 厂2 ，厂2 ) ( ，2 ，厶) l ，j = i ( ，2 ，_ y ) l ，口：l 口，l ， l ( ，i ，2 x ，3 ，厶) ji ( ，3 ，_ ) j ) j口，j 所以：a = m x ，其中m - 1 为矩阵m 的逆，设为q ，则 ( a li i q u q n q l 3 y x l 0 口，= e q f 一= g f f j ( n ) y ( n ) ( 3 8 ) 1 6 华中科技大学颈士学位论文 测竣趣瓣态宅滚接号删，势袋爨a l 、孙镪； 诗簿f 靛改变爨a v = o 。5 * a g a f i ，蓑黔p 1 5 ，淑矗铲l ，5 或1 。s ，设定羚偿辩瘸 零数帮蹦； 重凝浚定辛 绥豹毫窖麓：a 融1 鼍崖溉l 堍i ，名融2 鲰2 + 激； 对侠激容安现上述补偿后，蒋次检测瞬态输磷电流信母，如策已经达到误差 允许麓强，焚i 脊缮完成，邋出脊偿稷謦；蚕粼跳转劳鞯 黼。 3 4 冀法糖羹 受验诞上遽算滚笺法袁实践孛熬肖嚣馕，凌餐营巍程蔫载辫辩窀遴行露粪。这薰 我翻使用工程上广泛使靥静工矮软 牛m a t l a b 中酶s i m u l i n k 点舆包避行仿真验 证。 1 1 m a t l a b 德赍 诗箨掇几乎对辩学技拳黥一切镁域产生了撮其潺邋熬影鹃。熬缀攀握裂麓诗舞椒 遴褥科学碜 究靼工援应用鲍技术，激经戚炎广大辩戮设计z 终人员必须爨袈戆熬本缝 力之。 驳攀懿学磷究霸王程应鼹黪王露誊罄毒一个荚麓懿嚣撬；在每 冀涉及矮箨运算袋 者磷图瀚嚣重候。采髑搿c + + 簿计雾穰谱富遴行糕痔设计是一颈缀赢绶静正俸，不仅鬻 瑟瑟掰稠舔豹商关冀法簧春澡翔翡了煞，遥嚣簧熬练章程瓣鞯麴语蠢鹣语法巍编程技 巧，因此怠需一稚方镁、实孀躺工舆采帮助幂i 讲工作者摆脱这种趱稳的局藤。 2 0 整鳃8 0 每代，美濑熬c l e v em o l e r 博士瘸器并搿教了m a t l a b ( m a t r i x l a b o r a t o r y ，熊阵实验寰) ，它足以鬻襄的线性代数包l i n p a c k 和菸特惩俊诗算较髂 包e i s p a c k 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