（生物化学与分子生物学专业论文）小鼠巢蛋白基因在神经发育中的表达调控.pdf

1 0 1 0 2 乏 摘要 摘要 中等纤维蛋白是细胞骨架的一种主要组成成分，并在许多组织的发育过程中 交替表达和重新组装。巢蛋白( n e s t i n ) 属第六类中等纤维蛋白，在神经和肌肉 的发育过程中瞬时表达。利用小鼠p 1 9 胚胎性癌细胞( e m b r y o n a lc a r c i n o m a ，e c ) ， 我们详细分析了小鼠n e s t i n 基因5 上游区的启动予序列。该基因具有三个转录 起始位点，核心启动子中两个相邻的s p l 结合位点为启动子活性必需，并且转录 因予s p l 和s p 3 特异性结合于两s p l 位点。此外，过表达显性失活的s p l 和s p 3 显著抑制了n e s t i n 基因启动子的活性。以上结果表明通用转录因子s p l 和s p 3 维持了n e s t i n 基因的基础表达。 n e s t i n 基因的第二内含子具有中枢神经系统( c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m c n s ) 组织特异性增强子活性，然而负责调控该基因在神经发育过程中表达的转录因子 尚不明确。利用视黄酸( r e t i n o i ca c i d ，r a ) 诱导的p 1 9 细胞体外神经分化模型， 我们发现小鼠n e s t i n 基因在神经分化过程中表达瞬时上调，这一表达变化受到位 于该基因第二内含子中组织特异性增强子的调控。详细分析第二内含子中3 端 3 2 0b p 的核心增强子后发现，该增强子的活性在未诱导的p 1 9 e c 细胞中主要依 赖于p o u 、h r 吣i v 】r r f l 和s f l 位点，而在p 1 9 神经前体细胞中主要依赖于 s o x 、p o u 和h r e r x r 厂r t f l 位点。鸡胚电转和转基因小鼠实验均证实了小鼠 n e s t i n 基因第二内含予及其核心序列能指导报告基因在胚胎发育中的c n s 特异 表达，其中s o x 、p o u 、h r e r x r t f f l 等位点为该基因在鸡胚神经管( h h s t a g e 1 7 ) 中表达必需，而s f l 位点为该基因在初期神经管( h h s t a g e1 0 ) 中表达必 需。值得注意的是，通过对相关转录因子的表达及凝胶阻滞分析，结果提示在 p 1 9 细胞神经分化不同时期，p o u 家族的不同成员通过p o u 因子结合位点调控 了n e s t i n 的表达，即在未诱导的p 1 9 e c 细胞中，o c t l 和o c t 4 结合于p o u 位点， 而在p 1 9 神经前体细胞中，b m l 和b m 2 与该位点结合。以上结果阐明了同一p o u 位点在p 1 9 e c 细胞和神经前体细胞中对n e s t i n 基因表达调控的重要性。 n e s t i n 在小鼠成肌细胞c 2 c 1 2 的肌肉分化过程中表达也上调，我们发现该 表达变化由该基因的第一内含子调控。该内含子含有多个e b o x 顺式元件，并且 摘簧 在未分化的c 2 c 1 2 细胞中过表达b h l h 家族转添因子m y o d 熊促进第内含子 躲增强予活性。璃珏邀转实验疆示，该增强予靛搔导掇蠢基因凌生瓿节中表达。 关键词：巢蛋囱；p 1 9 臻鼹；增强子；申粒神经系统：p o u ：神经发育 a b s t l a c t a b s t r a c t s z h i g a n g i n ( b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y ) d i r e c t e db yd r n a i h ej i n g t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o no fm o u s e n e s t i ng e n ei nt h ed e v e l o p i n g c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m i n t e r m e d i a t ef i l a m e n tp r o t e i n sa r eo n eo ft h em a j o rc o m p o n e n t so fc y t o s k e l e t o n a n dt h e i re x p r e s s i o na n do r g a n i z a t i o na r er i g i d l yr e g u l a t e dd u r i n gd e v e l o p m e n to f m a n yt i s s u e s 。n e s t i n ，am e m b e ro ft y p ev ii n t e r m e d i a t ef i l a m e n tp r o t e i n ，i se x p r e s s e d i nt h ep r o g e n i t o rc e l l sd u r i n gn e u r o g e n e s i sa n dm y o g e n e s i s w ef i r s tc h a r a c t e r i z e d5 f l a n k i n gp r o m o t e ri nt h em o u s ee m b r y o n i cc a r c i n o m a 辑c ) p 1 9c e l l s p r i m e r e x t e n s i o ns h o w e dt h a tm o u s en e s t i nm r n aw a st r a n s c r i b e df r o ma tl e a s tt h r e e d i f f e r e n ti n i t i a t i o ns i t e s t w o c l o s e l y s p a c e ds p l ，b i n d i n g s i t e si nt h em i n i m a l p r o m o t e rw e r ec r i t i c a lf o rp r o m o t e ra c t i v i t y , a n ds p la n ds p 3p r o t e i n ss p e c i f i c a l l y b o u n dt ot h es p ls i t e s f u r t h e r m o r e ，o v e r e x p r e s s i o no fd o m i n a n t n e g a t i v es p lo rs p 3 m u t a n t ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t sp r o m o t e ra c t i v i t y t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h ek e yr o l eo f g e n e r a lt r a n s c r i p t i o nf a c t o r ss p la n ds p 3i nt h eb a s a le x p r e s s i o no fn e s t i ng e n e t h es e c o n di n t r o no fn e s f i ng e n ep o s s e s s e st h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ( c n s ) s p e c i f i ce n h a n c e r h o w e v e r , t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fe x p r e s s i o n a lr e g u l a t i o no f n e s t i ng e n ei nt h en e u r a ld e v e l o p m e n tr e m a i n e du n c l e a r p 1 9c e l l sc a l lb ei n d u c e db y r e t i n o i ca c i d ( & 鹞t od i f f e r e n t i a t ei n t on e u r a lc e l l s 讯t h i sp r o c e s s , t h ee x p r e s s i o no 薹 n e s t i nw a su p r e g u l a t e db yt h en e u r a le n h a n c e ri nt h es e c o n di n t r o no fm o u s en e s t i n g e n e u s i n g i no v oe l e c t r o p o r a t i o no fc h i c ke m b r y o sa n dt r a n s g e n i cm i c e ，w es h o w e d t h a t3 3 2 0 - b pf r a g m e n ti nt h es e c o n di n t r o no fo i o u s cn e s t i ng e n ei ss u f f i c i e n tt od r i v e r e p o r t e re x p r e s s i o ni nt h ed e v e l o p i n gn e u r a lt u b eo fc h i c ka n dm o u s ee m b r y o s ，a n d t h ep o u f a c t o r - b i n d i n gs i t ei nt h i s3 2 0 - b pm i n i e n h a n c e ri sn e c e s s a r yf o rr e p o r t e r e x p r e s s i o n t h en e u r a le n h a n c e rm i g h tr e g u l a t en e s t i ne x p r e s s i o nt h r o u g hr e c r u i t m e n t o fc l a s svp o uf a c t o ro c t 4 , c l a s st tp o uf a c t o ro c t l ，a n dc l a s si i ip o uf a c t o r s a b s t r a c t b m l ，b i n 2t ob i n dt ot h es a m ep o uf a c t o r - b i n d i n gs i t e i np 1 9 e cc e l l sa n dp 1 9 n e u r a lp r o g e n i t o rc e l l s ，r e s p e c t i v e l y o u rf i n d i n g si n d i c a t ear o l ef o rt h es a m ep o u b i n d i n gs i t ei nn e s t i nr e g u l a t i o ni nb o t hp 1 9 e c c e l l sa n dp 1 9n e u r a lp r o g e n i t o rc e l l s w ea l s oc h a r a c t e r i z e dt h ef i r s ti u t r o no fm o u s en e s t i ng e n ed u r i n gs k e l e t a l m u s c l ed i f f e r e n t i a t i o no fm o u s em y o b l a s tc 2 c 1 2c e l l s t h ef i r s ti n t r o nm i g h tf u n c t i o n a ss k e l e t a lm u s c l e s p e c i f i ce n h a n c e ri nt h a ti tc o n t a i n ss e v e r a le - b o x e sa n di sh i g h l y i n d u c i b l eb yb h l ht r a n s c r i i o r i o nf a c t o rm y o d ，a n db ym u s c l ec e l ld i f f e r e n t i a t i o n 。t h e m u s c l ee n h a n c e rc o u l dd i r e c tt h er e p e o r tg e n ee x p r e s s i o nt om y o t o m e 。a ss h o w nb yi n o v oc h i c ke l e c t r o p o r a t i o n k e y w o r d s ：n e s t i n ；p 1 9c e l l s ；e n h a n c e r ；, c n s ；p o u ；n e u r a ld e v e l o p m e n t 中科院上海生命科学研究院 研究生学位论文声明 本人郑重声明： 1 ) 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容或属合作研究共吲完成的工作外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。 2 ) 所呈交的学位论文，实验结果均由相应的实验数据分析得出，实验数 掘真实可靠。 咳声明的法律结果由本人承担。 研究生学位论文版权使用授权声明 本人完全了解并同意遵守中科院上海生命科学研究院有关保留、使用学位论 文的规定，即：生科院有权保留送交论文的复印件和电子文件，并提供论文的目 录检索及借阅、查阅；生科院可以公布论文的全部或部分内容，可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制 手段保存和汇编本学位论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名导师签名日期： ，砌g 卅州 步扒 月鼋甜 弥 珈 咐 嗍 沦靴 第一章小鼠巢蛋白基因启动子的分析器定 第一节引言 第一章小鼠巢蛋白基因启动子的分析鉴定 中等纤维蛋白( i n t e r m e d i a t ef l a m e n tp r o t e i n ) 是细胞骨架的一种主要组成成 分，迄今为止人们己发现六类中等纤维蛋白。与微管和微丝相比，中等纤维蛋白 在许多组织的发育过程中交替表达并重新组装成细胞骨架。中枢神经系统 ( c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ，c n s ) 发育过程中，各类中等纤维蛋白不仅在特定的阶 段表达，而且其表达具有显著的细胞特异性【1 】。例如，在小鼠胚胎神经发育的 早期，神经板分裂旺盛的神经干细胞表达波形纤维蛋白( v i m e n t i n ) ，神经管闭 合后的神经上皮细胞( n e u r o e p i t h e l i a lc e l l ) 及辐射状胶质细胞( r a d i a lg l i a lc e l l ) 表达巢蛋白( n e s t i n ) 。成熟的神经元在表达神经纤维蛋白( n e u r o f i l a m e n t ) 之前， 通常会表达c t - i n t e m e x i n 。绝大多数成熟的神经元表达三种不同分子量的神经纤 维蛋白，星形胶质细胞则表达胶质纤维酸性蛋白( g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n ， g f a p ) ，一些大脑核团和外周神经系统( p e r i p h e r a ln e r v o u ss y s t e m ，p n s ) 会表达 外周蛋白( p e r i p h e r i n ) 。n e s t i n 也在骨骼肌的早期发育过程中与波形纤维蛋白共 表达，两者成为骨骼肌中的主要中等纤维蛋白【2 ，3 】。随着骨骼肌的发育成熟， n e s t i n 和波形纤维蛋白持续下降，并被逐渐上调的结蛋白( d e s m i n ) 所代替。因 此，一些中等纤维蛋白也被作为个体发育阶段特定细胞类型的分子标记f 4 】。 n e s t i n 作为中等纤维家族的一员，因其在大鼠中枢神经系统前体细胞中的特 异性表达而被克隆【2 】。大量证据已表明，n e s t i n 的表达与神经干细胞的增殖状 态密切相关【5 】。小鼠胚胎的原位杂交实验表明n e s t i nm r n a 可在e 7 7 5 天中检 测到，而e 1 0 5 天在整个神经管的神经上皮细胞和辐射状胶质细胞的软膜面终足 ( h a le n d f e e t ) 中表达【6 】。随着神经前体细胞分化成为成熟的神经元和胶质细胞， n e s t i n 表达下调并分别被神经纤维蛋白和g f a p 代替【6 ，7 】。在脊髓的腹侧运动神 经元和端脑边缘层神经元中，n e s t i n 基因表达的下调和细胞停止增殖进入分化状 态密切相关。小鼠胚胎1 5 5 天后，n e s t i n 主要在发育端脑的室管膜层( v e n t r i c u l a r z o n e ，v z ) 和室管膜下层( s u b v e n t r i c u l a rz o n e ，s v z ) 中表达；新生小鼠中n e s t i n 主要在发育尚未完成的小脑中表达。正常成年组织通常不表达n e s t i n ，但其表达 第一章小鼠巢蛋白基因启动子的分析罄定 仍可见于神经干细胞存在的区域，包括v z 、s v z 、海马和嗅球等 6 - 1 0 1 。这些观 察证明绝大多数处于增殖状态的神经干细胞都表达n e s t i n ，因此，n e s t i n 是c n s 神经干细胞的重要标记f 2 ，6 ，7 ，1 1 1 。此外，n e s t i n 还在肌肉、胰腺、发囊、心脏和 睾丸等组织的发育过程中也有瞬时性表达【3 ，1 2 1 5 】，提示n e s t i n 的表达可能是许 多组织内具自我增殖能力和有限分化潜能前体细胞的共性 1 6 1 。近年来许多实验 还表明，包括c n s 、肌肉、胰腺和牙齿等多种组织损伤后，n e s t i n 的表达也瞬 时上调 1 7 2 1 1 ，提示n e s t i n 可能与神经系统和肌肉等组织的损伤修复过程有关。 在c n s 神经上皮肿瘤如神经胶质瘤( g l i o m a s ) 、成胶质细胞瘤( g l i o b l a s t o m a s ) 中n e s t i n 也有表达，且恶性肿瘤中尤为显著；肿瘤组织中n e s t i n 主要在肿瘤细 胞和或内皮细胞中表达。因此，n e s t i n 可能有助于肿瘤的诊断 1 6 ，5 8 1 。 大鼠和人的n e s t i n 基因已相继被克隆【2 ，1 1 】。1 9 9 4 年，z i m m e r m a nl 等人利 用转基因小鼠技术发现，大鼠n e s t i n 基因第二个内含子中，存在调控n e s t i n 基 因在c n s 表达的增强子序列；而在第一个内含子中，存在着可能调控该基因在 肌肉组织中表达的增强子序列1 2 2 1 。我们实验室先后完成了小鼠n e s t i n 的c d n a 和基因组d n a 的克隆 2 3 ，2 4 1 。小鼠n e s t i n 的c d n a 全序列5 9 8 3b p ( g e n b a n k a c c e s s i o nn o a f 0 7 6 6 2 3 ) ，编码一个含有1 8 2 1 个氨基酸的蛋白质。推测出的氨基 酸序列分析显示，小鼠n e s t i n 具有中等纤维蛋白的典型特征，包含一一个较短的6 个氨基酸组成的n 末端、a 螺旋杆状区及一个由近1 5 0 0 个氨基酸组成的c 末 端；并且与人、大鼠、仓鼠n e s t i n 有较高的同源性( f i g 1 - 1 1 ) 。r t - p c r 实验 发现，n e s t i nm r n a 在小鼠大脑发育过程中存在一个上调和下调的过程，表达 高峰出现在胚胎第1 4 天，其后表达量逐渐下降；而在小脑的发育过程中，出生 后第五天为n e s t i n 的表达高峰 2 5 1 。n e s t i n 在小鼠眼睛原基、晶状体及视神经的 发育过程中也存在瞬时性表达f 2 6 】。我们还发现在原代培养的新生小鼠的小脑颗 粒细胞中，n e s t i n 在神经突以及生长锥的中央区域存在较强的分布，提示n e s l i n 可能参与了轴突延伸时生长锥的导向作用以及神经元间神经联系的建立1 2 7 。 我们实验室在n e s t i n 方面的研究工作已有多年累积。通过筛选小鼠细菌人 工染色体( b a c ) 基因组文库，我们得到的小鼠n e s t i n 基因组序列全长2 3 3k b ， 该基因由4 个外显子和3 个内含子组成( f i g 1 - 1 2 ) 。在n e s t i n 基因5 上游区虽 然不存在组织特异性调控元件 2 2 1 ，但与n e s t i n 基因基础转录活性相关的顺式元 件及其作用因子尚未鉴定。本论文对小鼠n e s t i n 基因5 上游启动子区域( g e n b a n k 2 第一章小鼠巢蛋白毕囡启动了的分析鉴定 a c c e s s i o nn o a y 3 3 1 1 8 5 ) 进行了详细分析。利用引物延伸方法，我们首先考察了 该基因的转录起始位点。n e s t i n 在小鼠p 1 9 胚胎性癌细胞( e m b r y o n a lc a r c i n o m a , e c ) 中有表达，通过在该细胞中瞬时转染n e s t i n 启动子的系列缺失和定点突变 质粒，我们分析了n e s t i n 启动子的核心序列以及其中对启动子活性具贡献的顺 式作用元件，并利用凝胶阻滞( e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t y s h i f ta s s a y , e m s a ) 和染 色质免疫沉淀实验( c h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n ，c h l p ) 确认了相应转录因子 与核心启动子的结合。此外，我们还发现n e s t i n 基因启动子在多种哺乳动物细 胞内能促进报告基因表达。 h d r o d c - t l r m i n a | d o m l d nd d 懈m 抽- d 科” 73 1 4 i 朝 m r a m , h h z 影兹盔 = = = = = = = = = 二= = 二3 c o o h ，3 1 4 o p a t m 2 j e o o h 9 4 j 2 h m - n n h l 裁翌筮 = = = = 二= = = = = 二 c o o h i *舯 1 2 1 1 船 i - k j m s t a r h 一盛甄= = = = = = = = = = = = = 二 e o o h * 7 1 f i g 1 1 1 s c h e m a t i ca l i g n m e n to fm o u s e ，r a t h a m s t e r , a n dh u m a nn e s t i n p r o t e i n s h a t c h e db o x e sr e p r e s e n tt h ec o n s e r v e dc o i l e d c o i lm o t i f so ft h ei fr o d d o m a i n c o m p a r e dt oo t h e rl f s n e s t i nh a sa l lu n u s u a l l ys h o r ta m i n o t e r r a i n a l h e a dd o m a i na n dal o n gc a r b o x y - t e r m i n a ld o m a i n p o s i t i o n so ft h ea m i n oa c i d s a r en u m b e r e dw i t hr e s p e c tt ot h ef i r s tr e s i d u eo fe a c hp r o t e i n 。b o l dn u m b e r s i n d i c a t et h ep e r c e n t a g eo fa m i n oa c i di d e n t i t yb e t w e e nd i f i e r c n tp r o t e i ns e q u e n c e s a n dm o u s en e s f i n ( y a n gj ，e ta 1 2 0 0 1 ，b i o c h i m b i o p h y s a c t a 、 雒i 瞄轴$ c t t o m i ed n a # x 7 蝴 # x s p n x 9 m 仙辩n 档嘲m r n a f i g 1 - 1 2 o r g a n i z a t i o no ft h em o u s en e s t i ng e n e t h ep o s i t i o no ff o u rg e n o m i c d n a f r a g m e n t ss p a n n i n gt h en e s t i ng e n ei ss h o w nr e l a t i v et ot h en e s t i nt r a n s c r i p t ( c h e n gl e ta 1 2 0 0 0 ，a c t ab i o c h i m b i o p h y s 鼢) 3 - 第一章小鼠巢蛋白基幽启动了的分析攀定 第二节材料与方法 一、实验材料 限制性内切酶、d n a 连接酶以及常用修饰酶为n e we n g l a n db i o l a b s 或 t a k a r a 产品。细胞培养用耗材购自c o m i n g 公司；胎牛血清( f e t a lb o v i n es e r u m ， f b s ) 购自h y c l o n e 公司；d m e m f 1 2 细胞培养基( d u l b e c o sm o d i f i e de a g l e s m e d i u ma n dh a m sn u t r i e n tm i x t u r ef 1 2 ，1 ：1 ) 、胰蛋白酶e d t a ( o 5 t r y p s i n ，5 3 m m e d t a - 4 n a ，1 0 x ，l i q u i d ) 及细胞转染试剂l i p o f e c t a m i n e 购自g i b c o 公司。 双荧光报告基因检测试剂盒( d u a l - l u c i f e r a s er e p o r t e ra s s a ys y s t e m ) 购自 p r o m e g a 公司。 显性失活形式的s p l s p 3 质粒由德 u n i v e r s i t yo f s a a r l a n dm e d i c a lc e n t e r 的 g e r a l dt h i e l 教授惠赠。 二、实验方法 1 报告基因质粒的构建 常规分子克隆操作如酶切、连接、电转化及质粒的抽提鉴定参考分子克隆手 册【2 8 卜荧光素酶报告基因质粒所用的载体均为p g l 3 一b a s i c ( p r o m e g a ) ， p g l 3 b a s i c 不含启动子，可用于寻求外源基因的启动子区域。为减少克隆扩增 过程中发生重组的几率，宿主菌选用了由美国菌种保存中心d r m b e r l y n 赠送的 。株据称可使c o l e l 系列载体拷贝数降低近1 0 倍的e c o l i 衍生菌g b e1 8 0 。 n e s t i n 启动子缺失至核心启动子( p n e s p 一1 6 1 + 1 8 3 ) 的一系列质粒采用合适酶切 位点构建，具体参见文献【2 9 】。核心启动予内的系列缺失质粒采用p c r 引入酶切 位点构建，即正向引物带m l ui 位点，反向引物带x h oi 位点，以含小鼠n e s t i n 基因5 上游区7k b 的质粒d n x 7 为模板得到的p c r 产物经m l u i 及x h o l 双酶切 后，与经同样酶切处理的载体p g l 3 b a s i c 连接得到各缺失质粒。各质粒所用引 物及引物序列参见t a b l e1 2 1 。 核心肩动子内的定点突变采用两次p c r 三片段连接法，即将待突变序列设 计成一合适的酶切位点x 带入引物序列，以带m l ui 位点的正向引物与带酶切位 点x 的反向引物的p c r 产物经m l u i 及内切酶x 双酶切后得到片段a ，以带酶 切位点x 的正向引物与带x h ol 酶切位点的反向引物的p c r 产物经内切酶x 及 4 第一章小鼠巢蛋白基冈启动于的分析鉴定 x h oi 双酶切后得到片段b ，片段a 、b 与经m l ui 及x h oi 双酶切处理的载体 p g l 3 一b a s i c 一起连接，即得到将特定序列突变成酶切位点x 的定点突变质粒并 可用内切酶x 酶切鉴定。小鼠n e s t i n 基因一1 6 1 + 1 8 3 核心启动子中，原序列 5 - g a 躞c c l t t t c c g c c c g g - 3 将上游s p l 位点( 下划线) 突变后为 5 - g a 艘c t t t t c c g c c c g g - 3 并构建成突变质粒p n e s ps p l ( u ) 。；原序列 5 - g a c c g c c c c t t t t 蚴g 一3 将下游s p l 位点( 下划线) 突变后为 5 - g a c c g c c c c t t t t ca a 9 0 _ 鲤_ c g - 3 并构建成突变质粒p n e s ps p l ( d ) + ；原序列 5 g 避醒c t t t 缸歪竖鳄g 一3 将两s p l 位点( 下划线) 均突变后为 5 一g a g g a 鳗c t t t t c g 丛g 一3 并构建成突变质粒p n e s ps p i ( u ，d ) + ：原序列 5 - c c c g g c g g g a g t a - 3 将a p 2 位点( 下划线) 突变后为5 - c ca g 巡a g t a - 3 并构建成突 变质粒p n e s p a p 2 ：原序列5 - g g a 盛i t 世4 t a c c 一3 将t a t a 1 i k e 位点( f 划线) 突 变后为5 - g g a 幽c t a c c 一3 并构建成突变质粒p n e s pt a t a l i k e + 。 各突变质粒所用引物及弓| 物序列参见t a b l e1 - 2 1 。以上所有质粒的d n a 序 列均经酶切鉴定和d n a 测序得到确认。 t a b l e1 - 2 - 1s e q u e n c e so fp r i m e r su s e df o rc o n s t r u c t i o no fp l a s m i d s n u c l e o t i d e si n i t a l i ca r er e c o g n i t i o ns i t e sf o rr e s t r i c t i o ne n z y m ei n t r o d u c e dt op r i m e rf o r c o n v e n i e n td i g e s t i o no ft h ep c rp r o d u c ta n dc l o n i n gi n t ov e c t o r m u t a t e dn u c l e o t i d e s 、v e i b u n d e r l i n e d a l lp c rr e a c t i o n sw e r ep e r f o r m e db yu s i n gp n x 7a st e m p l a t eu n l e s ss t a t e d a c o n s t m c t sp r i m e rs e t s p n e s p + 6 4 h 1 8 3 p 9 5 f p 9 5 r p n e s p - 1 1 | + 7 3 p l1 4 f 伊1 1 4 r p n e s p + 2 8 + 1 3 1 p 1 1 6 h _ p 11 6 r p n e s p - 1 1 | 1 3 1 p 1 1 4 e 停1 1 6 9 p n e s p - 1 1 + 1 1 2 p l l 4 f p 1 1 9 r p n e s p + 2 8 + 1 3 8 p l l 6 胛9 5 r p n e s p - 1 6 1 + 2 7 p l l 7 a f p l l 8 b r r p n e s p 一1 6 1 | + 1 8 3 p 1 2 0 f 伊1 2 0 r p n e s p a p 2 p 1 1 7 a f p l l 7 a r , p l l 7 b f p l l 7 b r p n e s p t a t a - i i k e 。p 1 1 7 a f p 1 3 0 a r p 1 3 0 b f p 11 7 b r p n e s ps p l g o ) + p l l 7 a f p 1 3 1 a r p 1 3 1 b f 伊1 1 7 b r p n e s ps p l ( d ) p 1 1 7 a f p t 3 2 a r ，p 1 3 2 b f p 1 1 7 b r p n e s ps p l ( u , d ) p l1 7 a f p 1 3 3 a r ( p n e s ps p i ( d ) + a st h et e m p l a t e ) ， p 1 3 2 b f p 1 1 7 b r0 n e s p - 1 6 1 + 1 8 3a st h et e m p l a t e ) 5 第一章小鼠巢蚩白幕斟启动子的分析燎定 b p r i m e r s s e q u e n c e s p o s i t i o n s p 9 5 f 5 - g a g a a c g c g t a t g a a t a c c c t c g c t t c a g c t c - 3 + 6 4 8 5 p 9 5 r 5 - g a g a c t c g a g g t g g a g c a c t a g a g a a g g g a g t 一3 + 1 6 2 ，+ 1 8 3 p 1 1 4 f 5 - g a g a a c g c g t g g g c t g t g i g t t g c a c t 一3 1 l + 6 p 1 1 4 r 5 - g a g a c t c g a g g g g t a t t c a t a c t c c c g - 3 + 5 7 + 7 3 p 1 1 6 f 5 - g a g a a c g c g t t a g g g a c c g c c c c t t t t - 3 + 2 8 4 4 p 1 1 6 r 5 - g a g a c t c g a g g a g t a g c g g e g a c a g t g - 3 + 1 1 5 + 1 3 1 p 1 1 8 b r 5 - g a g a c t c g a g g g c c t t a a c c c n t a g a g - 3 + l o “2 7 p 1 1 9 r 5 - g a g a c t c g a g c c a g e g g a a g c g g a g g a 一3 + 9 6 h 1 1 2 p 1 2 0 f 5 - g a g a c t c g a g g g g c c c a g t t c t g t g c a - 3 1 6 1 a 1 4 5 p 1 2 0 r 5 - g a g a a c g c g t t g g a g c a c t a g a g a a g g 3 1 + 1 6 6 “1 8 2 p l l 7 a f 5 。- g a g a a c g c g t t g g g g c c c a g t t c t g t - 3 1 6 3 ，_ 1 4 8 p 1 1 7 a r 5 - t c a t a c t l r a a t t c g g c c z p 翟c 足叠a a a a e - 3 + 4 0 + 6 7 p l l 7 b f 5 - c c 2 2 c c g a a i t c a g t a 垃a a t a c c c t c 譬c 一3 + 4 9 + 7 7 p 1 1 7 b r 5 。- g a g a c t c g a g g g a g c a c t a g a g a a g g g - 3 。 + 1 6 5 “1 8 1 p 1 3 0 a r 5 - a g g g t a a e a t c t c t c c c g c c g g c c g g g c 一3 + 4 7 “7 4 p 1 3 0 b f 5 1 _ c g 职a 空臣曲t c c t a c c c t c 2 c c t c a g c t c - 3 + 5 7 + 8 5 p 1 3 l a r 5 1 - g a a a a 雠巡t c c c t a g g c c t t a a c c 一3 + 1 8 + 4 5 p 1 3 1 b f 5 1 _ t a 2 职a g g a t c c c t t t t c c 舟x c g 岛c c g 旦- 3 + 2 8 ，+ 5 6 p 1 3 2 a r 5 唧c 卫卫c a a t t c q r a a a a 鼎窟c g m c c c 一3 + 3 0 + 5 7 p 1 3 2 b f5 _ c t i l i c g a a t t c g o c 2 留c 盘臣g a 业t a t 旦a a - 3 + 4 0 + 6 8 p 1 3 3 a r 5 - 卫c c 2 2 c 笆a a t t c | a a a a f 驶窖a t c c i c c c 一3 + 3 0 + 5 7 2 细胞培养 小鼠胚胎性痛细胞p 1 9 、f 9 ，大鼠神经胶质瘤细胞c 6 ，人成神经母细胞瘤 细胞s h s y 5 y ，小鼠成纤维细胞n i h 3 t 3 以及中国仓鼠卵巢细胞c h o 等细胞 贴壁生长于2 5c m 2 培养瓶中，培液为5m l 含1 0 f b s 的d m e m f 1 2 ，2 - 3 天 传代一次，细胞培养二 f3 7 ，5 c 0 2 的培箱中。传代时，先吸去原有培液， 再用p b s 洗一遍，然后加入0 5m lt r y p s i n e d t a ( 1 x ) 3 7 消化3 4 分钟，以 每培养瓶约3 1 0 5 个细胞接种。 1 1d m e m f 1 2 细胞培养液的配制( 1 0 0 0m 1 ) d m e m f 1 2 ( 1 ：1 ) ，1 0 0 0m l 用粉剂：青霉素( p e n i c i l l i n ) ，3 1m g ；链霉素 ( s t e p t o m y c i n ) ，5 0m g ：碳酸氢钠( n a h c 0 3 ) ，2 2g 。调p h 值为7 2 ，加去离 子水定容至1 0 0 0m l ，0 4 5u m 滤膜过滤，室温放置过夜，次日目视无菌后使用。 2 ) 磷酸生理盐水缓冲液( p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e ，p b s ) 的配制( 1 0 0 0 m 1 ) 6 第一章小鼠巢蛋白基冈启动子的分析鉴定 磷酸一氧钾( k h 2 p 0 4 ) ，0 2g ；磷酸氢_ 二钾( k 2 h p 0 4 ) ，2 9 9 ：氯化钠( n a c l ) ， 8 0g ；氯化镩( k c i ) ，0 2g 。调p h 值至7 2 ，高压灭菌后使用。 3 ) t r y p a nb l u e 染色液：活细胞染色用，o 5gt r y p a nb l u e 溶于1 0 0m lp b s 中。 3 细胞转染及荧光素