（应用化学专业论文）DL—色氨酸的化学合成及其拆分.pdf

东南大学硕士学位论文 摘要 d 一色氨酸是一种非蛋白光学活性氨基酸，可作为药物中间体、非营养性甜昧剂、饲料添加荆、植 物生长剂。吲此，研究如何获得d 一色氨酸具有最要的理论意义和实际意义。 本论文采用化学法合成d l 一色氨酸外消旋体，然后用化学拆分法制各d 一色氨酸。 论文研究以苯肼为原料的合成方法，经过加成、缩合、环化、水解、脱羧、再水解等过程，得到 d l 色氨酸。反应总收率为4 3 6 ，产物纯度9 9 0 。论文对合成条件进行优化，得到合成d i 色 氨酸的较佳工艺条件。平行实验结果稳定，具有很好的重复性。通过对各步合成产物进行熔点测定、 h p l c 分析、元素分析和t r 分析，确定合成产物即为目标产物。 论文以d 樟脑磺酸作为拆分剂，对d l 一色氨酸进行化学拆分。首先使d l 一色氨酸和d 一樟脑磺酸反 应生成盐，nj t t 两种盐的溶解度不同将其分开，接着用氨水对d 色氨酸d _ 樟脑磺酸盐进行水解、 提纯，得到光学活性d 一色氨酸。直收率为3 9 8 ，纯度9 8 7 ，光学纯度9 8 。论文对拆分条 件进行优化，确定较佳的提纯工艺条件。通过对每步反应产物进行熔点洲定、旋光度测定、i r 分析、 h p l c 分析、元素分析和1 h - n i c ! r 分析，确定拆分产物即为目标产物。 对合成产物d l 一色氨酸外消旋体的形成过程及原理、用d 樟脑磺酸拆分d l 色氨酸的工艺原理、 等电点法提纯及拆分母液的消旋化原理等进行初步理论探讨。 关键词：光学拆分；d 色氨酸；d 一樟脑磺酸；d l 一色氨酸；苯肼 东南大学硕士学位论文 a b s t r a c t d t r y p t o p h a n ，an o n p r o t e i no p t i c a l l y a c t i v ea m i n oa c i d ，h a sb e e ne x t e n s i v e l yu s e da sm e d i c a l s e m i - p r o d u c t ，n o n n u t r i e n ts w e e ta g e n t ，f e e d s t u f fa d d h i v e s ，p l a n t sg r o w t h a d d i t i v e s ，s or e s e a r c ho ns y n t h e s i s o f d t r y p t o p h a n i so f g r e a t s i g n i f i c a n c eb o t hi nt h e o r e t i c a la n di np r a c t i c a ls i d e i nt h i sp a p e r , d l t r y p t o p h a nr a c e m a t ei s s y n t h e s i z e di n ac h e m i c a lw a y , a n dt h e nd - t r y p t o p h a ni s o b t a i n e db yc h e m i c a lr e s o l u t i o n d l - t r y p t o p h a n i s s y n t h e s i z e du s i n gp h e n y l h y a r a z i n e a sr a wm a t e r i a l b ya d d i t i o n ，c o n d e n s a t i o n ， c y c l i z a t i o n ，h y d r o l y s i s ，d e c a r b o x y l a t i o n ，r e h y d r o l y s i sa n do t h e rp r o c e s s e s i nt h i s p a p e r g e n e r a ly i e l di s 4 36 w i t hg o o dp u r i t yt h a ti sm o r et h a n9 9 0 m u c hw o r kh a sb e e n d o n ei nt h eo p t i m i z a t i o no fs y n t h e s i s p a r a m e t e r so f d l t r y p t o p h a n i n t h i sp a p e r , t h eo p t i m a lt e c h n i c a lp a r a m e t e r sw e r ef o u n df o ft h es y n t h e s i so f d l - t r y p t o p h a n p a r a l l e le x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u tw i t hq u i t es t a b l er e s u l t sa n dg o o dr e p e a t i b i l i t y f i n a l p r o d u c tw a s c h a r a c t e r i z e db ym e l t i n g p o i n td e t e r m i n a t i o n ，h p l c ，e l e m e n ta n a l y s i sa n d i r s p e c t r o m e t e r d l t u p t o p h a ni s r e s o l v e db yd - c a m p h o r s u l p h o n i ca c i da sr e s o l u t i o na g e n t t h ec h e m i c a lr e s o l u t i o n c o n s i s t so ft w o s t e p s ：f i t 3 t ，s a l t o fd t r y p t o p h a n d c a m p h o r s u l p h o n a t e w a ss e p a r a t e df r o ms a l to f l - t r y p t o p h a nd - c a m p h o r s u l p h o n a t eu s i n g t h ed i f f e r e n c eo ft w os a i l s i ns o l u b i l i t y , a n dt h e nf i n a lo p t i c a l l y a c t i v ed - t r y p t o p h a nw a sa c q u i r e db yh y d r o l y s i sa n dp u r i f i c a t i o no f t h em o t h e rs a l t f o rt h i sm e t h o d ，g e n e r a l y i e l do fd - t r y p t o p h a nw h o s ep u r i t yi sm o r et h a n9 8 7 i s3 9 8 w i t ho p t i c a lp u r i t ym o r et h a n9 8 0 i n t h i s p a p e r , f l a eo p t i m a lr e s o l u t i o np a r a m e t e r so fd l t r y p t o p h a n w e r ea l s od e t e r m i n e d i ne v e r ys t e po f r e a c t i o n ，t h er e s u l t a n ts e m ip r o d u c tw a sa n a l y z eb ym e l t i n gp o i n td e t e r m i n a t i o n ，r o t a t i o n ，i rs p e c t r o m e t e r , h p l c ，e l e m e n ta n a l y s i sa n dh - n m r m e c h a n i s mo f f o r m a t i o no f d l t r y p t o p h a n ，o f r e s o l u t i o no f d l - t r y p t o p h a nu s i n gd c a n a p h o r s u l p h o n i c a c i d ，o fp u r i f i c a t i o no fd t r y p t o p h a nb yi s o e l e c t r i cp o i n tm e t h o da n do fr a c e m i z a t i o no f r e s o l u t i o nf i l t r a t e w a si n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r k e y w o r d s ：o p t i c a lr e s o l u t i o n ；d - t r y p t o p h a n ；d c a m p h o r s u l p h o n i ca c i d ；d l t r y p t o p h a n ；p h e n y l h y a r a z i n e i t 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位沦文足我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或 其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 主1 1 纽垒1日期：q 生，生2 岁 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学 位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本人电子文档的内容和纸质论文的内容相致。除在保密期内的保密论文外， 允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论 文的公砸j ( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：墨1 丝到导师签名：越日期：q 晕车。2 第一章概述 1 1 氨基酸概述 1 1 1 氨基酸的定义 第一章概述 氨基酸( a m i n oa c i d ) 是羧酸分子中一个或一个以上氢原子被氨基取代后生成的化台物，其取代 的位置有、b 、y 6 3 之分。最早发现氨基酸的足英国化学家w o l l a s t o n ，他于1 8 1 0 年从膀胱结 石里分离出来一种物质，当时根据“膀胱”这个词，把它命名为胱氨酸。随后，人类经过1 5 0 年的努 力，在自然界中先后发现了很多种氨基酸，其中最常见的有2 0 种，它们都是羧酸分子中n 一碳原子 上一个氢原子被氨基取代而生成的化合物，故称为a 一氨基酸，结构通式如下： 1汐 r a 吐一一o h i n h 2 若r 不为氢原子，则该氨基酸具有不对称碳原子，因而具有光学活性。大多数n 氨基酸都具有 不对称的碳原子，均具有光学活性，存在d - 型和l - 型两种对映体“。 1 1 2 氨基酸的重要作用 氢基酸是组成蛋白质的物质基础，具有重要的生理功能，在食品、饲料、医药、化妆品及表面活 性剂等丁业方面已有，。泛应用。在食品t 业中，氨基酸可作为食品添加剂，主要用作食品营养强化剂、 增味荆等。在畜禽动物饲料中添加氨基酸可以充分提高饲料的利用率，壮省蛋白质饲料，促进动物生 长发育，改善肉质，提高产肉、产奶、产蚩量。在医学上，氨基酸町作为营养剂、代谢改善剂、抗溃 疡、防辐射、抗菌、治癌症等，其中，氨基酸的最大用途之一是制造氨基酸输液。某些氨基酸是合成 其它药物的原料，如丙氨酸以及天冬氨酸可用于合成维生素b s 的原料，色氨酸可用于合成抗癌药等。 甘氨酸、精氨酸等对肾功能有一定的保护作用”1 。在化妆品方面，由于氨基酸及其衍生物和人体皮肤 结构相似，因此它们易于被皮肤所吸收，可使老化和硬化的表皮恢复水合性和弹性，氨基酸还可用于 属膏、粉露液等中以改进化妆品的分散作用，润湿性和缓冲效应等。在表面活性剂方面，一些氨基酸 可作为化妆品配方中的乳化剂、头发整饰剂、调理剂和抗静电剂等，利用氨基酸良好的表面活性，可 将其普遍应用于洗发香波，特别是婴儿洗发香波，以促进泡沫和保护皮肤”。 1 1 3 氨基酸的生产及丌发概况 氨基酸的最早发现是在1 8 1 0 年，氨基酸的制造是从1 8 2 0 年水解蛋白质开始的。国际上氨基酸工 业生产始于2 0 世纪5 0 年代，其生产方法有水解法、合成法和发酵法( 包括酶法) 。目前，氨基酸的 主要生产国家有日本、美国、德国、法国、印尼、泰国、韩国、中国等。日本在氨基酸的研究开发、 生产技术、品种及产量上居世界领先地位。 东南大学硕士学位论文 我国氨基酸的生产起步较晚，是从2 0 世纪五、六十年代开始逐步发展起来的。解放初期只能生 产调味用的谷氨酸钠，其它产品很少，1 9 7 8 年召开了第一次全国氨基酸科研生产座谈会，促进了氨 基酸科研和生产的迅速发展。几十年来，我国合成氨基酸的科研和生产也获得了相应的发展。到目前， 谷氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸等的工业化生产已经形成r 一定规模，其它品种如乙酰蛋氨酸、三 甲赖氨酸等也在积极探索和试制。在生产技术方而，也由天然蛋白质水解提取法及化学合成法逐渐转 向微生物发酵法和酶合成法，生产 艺日趋成熟”3 。尽管如此，但与世界先进水平相比，差距还较人， 主要表现在品种还不齐全，尚有丝氢酸、色氨酸、组氨酸及精氨酸四种氨基酸依然依赖进口，产品的 质量还需进一步提高，生产规模小，生产水平低”1 。 近年米，随着科学研究的深入和各种新药的开发，人们对d _ 氨基酸的重要性有了深入的认识， 发现其在生命活动和药物制备中具有i 氨基酸所不能替代的地位，特别是作为b 一内酰胺类抗生素的 中间体，还有一些d r 氨基酸是农药和食l 昂添加剂的重要组成部分。与l - 氨基酸相比，d 氨基酸的种 类较少，只占自然界己发现的3 0 0 多种氨基酸的1 0 左右，其价格十分昂贵。现有的制备方法均存在 一定缺陷，有的合成步骤较长，有的手性助剂价格昂贵，有的光学纯度达不到要求等。冈此，至今 d 一氨基酸的制备在国际上仍是一个研究热点”1 。 在国内，南京工业大学用生化法制各了多种d 一氨基酸，其中，欧阳平凯教授完成国家科委九五 攻关项目酶法生产d 型氨基酸工艺的研究：韦萍教授完成江苏省教育厅项目诱变、诱导假 单菌合成系列d 一型氨基酸。中国科学院成都有机化学研究所用膜分离法拆分d i 。色氨酸得到d 一色氨 酸。华东师范大学和上海化学试剂研究所用酰基水解酶对d l 一色氨酸进行拆分得到d 一色氨酸。近年 来，我们氨基酸课题组利用不对称转换和化学法相结合的合成路线制备了d 一脯氨酸、d 一组氨酸、d 缬氨酸、d 一苯丙氨酸及d 对羟基苯甘氨酸，部分已中请相关专利p “】。 1 2d 一色氨酸概述 1 2 1d 一色氨酸的性质 d 一色氨酸，又名d 一吲哚基一a 氨基丙酸，白色晶体，有特殊甜味，熔点f i 8 1 。c 2 8 2 ，分子 量2 0 4 2 3 ，旋光度 c t d ”- + 3 3 7 。( 1 2 ，h z o ) ，结构式为： 1 2 2d - 色氨酸的重要作用 h d 色氨酸是一种非蛋白光学活性氨基酸，具有特殊的生理学性质，在医药、食品、饲料工业以及 农业中均有一定的价值，可以作为非营养性甜味剂、饲料添加剂、植物生长剂。特别是在医药行业中， d - 色氨酸是抗痛剂和免疫抑制剂的重要合成前体。1 。d - 色氨酸足甜度最强的氨基酸之一，它的甜度可 达蔗糖的4 0 倍“。d 一色氨酸在人体内几乎不发生代谢作用，而且没有毒性，所以可作为非营养型甜 2 p z 专刚 第一童概述 味剂，适宜于肥胖症、高血压以及糖尿病患者食用。d 一色氨酸能被某些哺乳动物利用，对它们具有一 定的营养价值。d 一色氨酸作为植物生长素的合成原料，在豌豆、大麦和匹红柿体内能转化为吲哚一3 乙酸，而且d 一色氨酸相对于l 一色氨酸来说是更好的合成前体，更能刺激植物细胞和组织的生长。由 d 一色氨酸参与组成的一种脱氯肽可以作为抗癌剂。由d 一色氨酸和胸腺嘧啶组成的一种药物在临床上 可用于治疗恶性肿瘤，增强病人的免疫能力。1 。 1 2 3 市场需求和开发前景 近年米，随着肥胖症、高血压、糖尿病以及癌症患者数量的不断增长，导致非营养性甜味剂和抗 癌药物的需求量日益增长。因此，d 一色氨酸的市场用量将会较大，发展前景广阔。2 0 世纪7 0 年代中 期，科学j 二作者在人体内发珧了d 色氨酸，但未引起重视。到了8 0 年代后期特别是近几年，有关人 体及食物中d 一色氨酸的研究才越来越深入“1 。国外已有一些关于d 色氨酸的研究报告，而国内却刚 刚起步，且只限于实验室研究和中试开发，还未实现规模生产，主要依赖于进口。冈此，研究如何获 得d 色氨酸具有重要的理论意义和实际意义。 1 3d l 一色氨酸的化学合成方法进展 化学合成法就是利用有机合成和化学工程相结合的技术生产或制各氨基酸的方法。它的最大优点 是在氨基酸品种上不受限制，既| j 制备天然氨基酸，又可制备各种特殊结构的1 f 天然氨基酸1 。另外， 化学法合成外消旋体工艺比较简单，成本较低，因而得到广泛应用。 d l 一色氨酸的化学法合成，大致可分为以吲哚为原料的合成法和以苯肼为原料的合成法两类。 i 3 i 以吲哚为原料的合成法 ( i ) 由吲哚出发，经由3 - 眄j l 眯醛的合成珐 先将吲哚( i ) 转变为3 吲哚醛( i i ) ，再使之和马尿酸、乙内酰脲、硫代乙内酰脲等物进行缩 合反应，其缩合生成物再经还原及水解，即_ 口j 合成色氨酸( i i i ) 。 甲一回洲。叼洲2 i 眦0 。“ d hhh2 i i i 1 e l k s “”等将3 一吲哚醛( i i ) 和乙内酸脲( i v ) 在醋酸酐及醋酸钠存在下，缩合生成b 一吲哚亚甲 基乙 勾酰脲( v ) ，再用兰氏催化剂加氢还原而得到色氨酸乙内酰脲( ) ，最后用氢氧化钡水解就可 得d l 一色氨酸( 1 1 i ) ，收率为2 0 。 叙厂“。+ 篡c - - c 盯o ( c h s c o ) 2 0 。“意 骂汀2 菪。 c 了。 。驳一 东南大学硕士学位沦文 唐刚华等1 以甘氨酸( i v ) 为起始原料，在氢氧化钠存在下与苯甲酰氯反应生成马尿酸( v ) ， v 和3 一吲哚醛反应得4 一( 3 - 吲哚甲叉) 一2 - 苯基2 ( 嚼唑啉) 一5 - 酮( v i ) ，经水解得2 苯甲酰 氨基一b 一吲哚一3 一丙烯酸( v i i ) ，在氢氧化钠溶液中与铝镍合金作用生成a 苯甲酰氨基一b 吲哚一3 一 丙酸( ) ，水解得最终产物d l 色氨酸( i i i ) 。n lp 2 8 3 。c 。 c 6 h5 c o c l c h 2 c o o h n h 2 c h 2 。o o h 丙j 矿0 h c o c 。h ， v 印 h r mi 螋缸r “= c c o 唧o l l 等 ih 吖2 h c o o h h ；婴呵明3 掣h 该合成方法步骤繁多，产品的收率较低，生产成本较高，不利于大规模工业化生产。 ( 2 ) 由吲哚出发，经由3 - 二甲基氨甲基吲哚的合成法 此法是以哼i 哚( i ) ，二甲胺及甲醛为原料进行m a n n i c h 反应，生成3 - 二甲基氨甲基吲哚( i i ) ， 然后继续合成色氨酸( i i i ) 的方法。 钾一呵毗岬i z 一叮洲掣叫h一 “ ii i 1 s n y d e r 等“1 提出一种合成d l 一色氨酸的方法。即将3 一二甲氨甲基吲哚( i i ) 与碘甲烷反应形 成季铵盐( 1 v ) ，然后在二嚼烷存在下与乙酰氨基丙二酸二乙酯的钠盐缩合，其缩合物( v ) 水解、 脱去二氧化碳后得到乙酰色氨酸( v i ) ，再用碱水解即得到d l 一色氨酸( 1 1 1 ) 。其收率对吲哚为4 5 ， m d 2 7 2 。c 2 8 0 。c 。 丁“2 n f h 旦。矿“州、“扔1 。 i 河。“2 。h c ：。“ 田呲蜒嫩批一 v 二l 四洲2 熙置丢 i h 4 飘 寸 第一章概述 该方法使用价格较高的碘甲烷等试剂，不利于生产成本的降低，而且该路线步骤较多， ：艺复 杂，实际应用较麻烦。 ( 3 ) 由吲哚直接缩合的合成法 s n y d e r 和m a c d o n a l d “”研究山一种简单的合成d i 一色氨酸的方法。即在乙酸和乙酸酐存在下， 用吲哚( i ) 和n 一乙酰氨基丙烯酸( i i ) 直接缩台，得到卅乙酰一d l 一色氨酸( i i i ) ，此物在氢氧化 钠溶液中水解即可得到d l 色氨酸( i v ) ，收率为5 77 ，m p 2 7 3 。c 2 7 6 。c 。 四+ ch ：= = = # 、c 。o 。o 。h 。j ：；耥 i i i 盯明2 n 篙c oc 叫h ：必呵叫箍渊 、m hq l o 凡h i 一 一h 。 由曲 此合成法收率较高，工艺简单，操作方便，但原料a 一乙酰氨基丙烯酸的价格昂贵，且国内难以 买剑，因此，目前用该法生产d l 一色氨酸是不可行的。若可使n 一乙酰氨基丙烯酸的价格降低，则该 法将是一条很有竞争力的合成路线。 1 3 2 以苯肼为原料的合成法 w a r n e r 和m o e “”1 以苯肼为坂料合成色氨酸。即在乙酸钠存在r ，将丙烯醛( i ) 和乙酰氨基丙 酸二乙酯缩台( i i ) ，缩合体( i i i ) 再与苯肼反应而生成苯腙( i v ) ，苯腙在i i z s o t 或b f 3 水溶液中回 流水解，环化得到化合物3 一哼l 哚基一甲基一乙酰氨基一丙二酸二乙酯( v ) ，将此化合物水解脱羧可得 d l 色氨酸( ) ，i n p 2 8 10 c 2 8 3 。 c h ，一c h c ho+chn h c o ch 3 c 0 0e t i i na o e t c o o e t o h c ( c h2 ) 2 c - - n h c o c h3 c o o e t i f h 2 s o4 o i - bf 1 即1 比i 怒：麓詈叙7 1 吨h 2 c n h z 0 。” h h v 该合成路线步骤较少，原料苯肼来源丰富，价格便宦，因此，该法是一条较理想的合成路线。 通过对两类合成路线的分析比较，可以看出，以苯肼为原料的合成法是一条较理想的合成路线。 因此，论文选用该方法合成d l 色氨酸外消旋体。 1 4 d l 色氨酸的光学拆分方法进展 获得手性化合物单一对映体的方法主要有以下几种：( 1 ) 天然来源；( 2 ) 以天然手性化台物为底 5 船 c n ：飞h h 上 oh ， 、。 东南大学硕上学位论文 物合成光学活性物质；( 3 ) 不对称合成：( 4 ) 外消旋体的拆分。由( 1 ) 和( 2 ) 两种方法获得光学活 性化合物的种类是有限的，由( 3 ) 得到的大多数为i _ 型对映体，而用( 4 ) 的方法既可得到l 型对 映体又可得到d 一型剥映体，这是一种获得旋光性化合物的十分重要的方法，据报道大约有6 5 的非 天然手性药物是由外消旋体或中间产物的拆分而得到的“。外消旋体是由相等数目的对映体分子所组 成。在气态、液态以及在溶液中，外消旋体通常是理想的或近似理想的混合物。因此，在这些状态之 下，除去对偏振光所呈现的性质不同之外，外消旋体和纯对映体应当具有相同的性质。例如，它们具 有相同的沸点、折射率、液态密度和红外吸收光谱。在这些情况下，是无法直接将对映体分开的。光 学拆分方法就是将一种化合物的光学活性体从这种化合物的外消旋体中分离出米的过程”。在各立 体异构体中，往往只有一个具有所需要的生物活性，固此，需要将外消旋体的两个对映体拆分开来。 氨基酸的光学拆分方法大致可分为三类：物理化学法，包括优先结晶法、置换结晶法和色谱法 等；化学法( 又称为非对映体法) ；酶法。对于d l 色氨酸，主要的拆分方法有以下几种： i 4 j 化学拆分法 化学拆分法就足通过化学反应的方法，用手性试剂将外消旋体巾的d 一型和l 一型两种对映体转化 为非对峡体，然后利用非对映异构体之间的物理性质和化学性质的差异将其分开的方法i ”1 。 拆分试剂就是可与剥映异构体作用使其转变为非对映异构体而将其分离的试剂。一个适宜的拆分 剂必须具备以下几个条件，即拆分剂易于回收、廉价、旋光度高、易与被拆分的化合物反应、形成的 两个j f 对映异构体的溶解度要有较大的差异等。 化学拆分法在许多情况下都是行之有效的，虽然有些拆分试剂价格昂贵，但在拆分厉可以不经过 分离而直接套用，适当降低了成本。因此，该法仍是目前工业l 广泛使用的种拆分技术。此法的 关键是选择好拆分剂，使其达到使用周期长，易回收的目的。 李叶芝等”“用新型手性拆分试剂r ( ) 四氢噻唑一2 一硫酮一4 一羧酸 简称r ( 一) t t c a 对d l 一色氨酸酯 等六种氨基酸酯进行r 手性拆分，分别得到r ( ) t t c ad ( ) 色氨酸酯盐( 吲体) 及光学活性l 一色氨酸 酯，过滤，得到r ( 一) t t c a d ( 一) 一色氨酸酯盐固体，用氢氧化钠溶液进行水解，乙酸乙酯萃取，经过 分离得到了光学活性色氨酸酯，收率为8 7 7 ， n n “= 一8 3 0 。( c - o 1 7 5 ，c 2 h s o h ) ，光学纯度为6 9 1 0 。 专利g b 8 4 2 8 3 9 ”“报道用樟脑磺酸作为拆分剂来拆分d l 一色氨酸，方法为：将d - 樟脑磺酸溶于水中， d l 一色氨酸加到甲醇巾形成悬浮溶液，混合两溶液，在一定温度下搅拌数小时，过滤，得到的白色固 体即为d 一色氨酸d 一樟脑磺酸盐。d 一色氨酸d 一樟脑磺酸盐经过重结晶和水解，可得光学纯度为9 4 s 的d 一色氨酸。 1 4 2 优先结晶法 优先结晶法又称接种法，该法是利崩氨基化台物的物理性质，在外消旋体化合物的饱和或过饱和 溶液中，加入一种旋光异构体作为品种，诱使与该品种相同的异构体析出，从而达到分离的目的。 此法般要求外消旋体能够以外消旋混合物的形式存在，或者外消旋体以外消旋化合物的形式存 在，但其溶解度远大于相应的对映体的= 徭! f 解度，此时才能够采用优先结晶法进行拆分”“。但色氢酸外 消旋体及其对映体不满足上述条件。据文献报道，色氨酸的某些盐类，如色氨酸赖氨酸盐”4 “1 、色氨 6 第一章概述 酸盐酸盐。”，色氨酸铵盐。7 1 等却有上述性质，可采用优先结晶法拆分色氨酸的盐类。该方法总收率较 高，原理简单，但同时存在几点明显不足，如步骤繁琐，不能连续生产，设备利用率低。另外，结品 过程中不可避免的会出现产品夹带另一种对映体的现象，影响产品的质量。这些不足使得该方法的使 _ | j 受到一定限制，影响工业化生产。 i c h i r os a s a j i ”“等使用氨水作为拆分剂，以水作为溶剂，与n - 乙酰一d l 一色氨酸在7 5 1 2 , 反应生 成n 乙酰一d l n 色氨酸铵盐，降温到5 5 。c ，加入少量n _ 乙酰d 色氨酸铰盐后逐渐降温到4 8 。c ，搅拌， 析出晶体，过滤，干燥，得到针状晶体即为n 一乙酰d 一色氨酸铵盐，收率为3 3 7 ，m p 1 9 9 2 c ， n 。”= 一2 4 8 。( c - 4 ，h 2 0 ) ，将晶体溶于水中，用稀酸处理可得到n 乙酰一d 一色氨酸。h a l b e r t ”4 1 等将1 j 1 赖 氨酸溶解于水中，在9 0 。0 加入n - 乙酰一d l 一色氨酸与其反应，降温，加入n 乙酰d 一色氨酸l 赖氨 酸盐，降温结晶，即可得到卜乙酰d 色氨酸l 一赖氨酸盐，收率为5 1 8 ，m p1 9 9 。c 1 9 9 。c ， ? 5 = 一1 3 2 。( c = 4 ，m 0 ) 。用盐酸水解可得到n 一乙酰一d 一色氨酸。 i 4 3 酶法 酶法拆分就是用完整的微生物细胞或从微生物细胞中提取的酶作为催化剂，使外消旋体中的一种 旋光异构体选择性的降解或反应，从而将两种对映体分开。生物催化剂的区域立体选择性强、反应 条件温和、操作简便、成本较低、公害少，且能够完成一些化学方法难以完成的反应。但是生物拆分 法也有菌种筛选困难、酶制剂不易保存和运输、价格昂贵、产品后处理工作量大以及通常只能得到 种对映体等缺点”。 用丁d l - 色氨酸拆分的酶主要包括酰化酶，酰胺酶和色氨酸酶，下面分别进行叙述。 ( 1 ) 酰化酶法 酰化酶( a c y l a s e ，e c35 _ l1 4 ) 的立体特异性是l 一型，即它可将合成得到的n 乙酰一d l 一氨基 酸中的n 乙酰l 氨基酸水解生成l 一氨基酸，而不作用于它的对映体n _ 乙酰d 一氨基酸，n 乙酰一d 一 氨基酸经过化学水解即可得d 一氨基酸。 韩沾元等“”利用从药用淀粉酶制各的固定化氨基酰化酶来水解dl 一色氢酸，得到光学和层析纯 d 色氨酸，产率为6 4 。廖本仁等”在d o n a l d 方法的基础上，通过选择性水解合成n 乙酰d l 色氨 酸，然后在酰基水解酶的作用下对其进行拆分，得到d - 色氨酸。 ( 2 ) 酰胺酶法 i 一酰胺酶也是一种立体特异性酶，它来源丁动物内脏和一些微生物，能选择性的水解d l 氨基 酸酰胺中的l 一氨基酸酰胺，而对d 一氨基酸酰胺不水解。过滤，将母液酸化、浓缩后，可得到d - 氨基 酸酰胺，再对其进行水解就可得到d 眦氨基酸。 已有文献”2 报道用带有酰胺酶的微生物水解d l 一色氨酸酰胺中的l 色氨酸酰胺，没有发生水解 的d 色氨酸酰胺经过化学水解得到d 色氨酸，收率高达9 2 。 ( 3 ) 色氨酸酶法 肠杆菌属、变形杆菌属等类微生物可产生色氨酸酶( e c 4 1 9 9 1 ) ，在正常情况下，色氨酸酶能 催化d l - 色氨酸消旋体中的l 一色氨酸降解生成吲哚、氨和丙酮酸，但在高浓度的氨和丙酮酸条件下， 7 东南大学硕士学位论文 它也能催化吲哚、氨和丙酮酸而生成l 一色氨酸。“，而且吲哚对色氨酸酶有一定的抑制作用，因此， 要选用合适的溶剂和乃法除去吲噪、氨和丙酮酸，以促进反应的进行，最终可得到纯度较高的d 一色 氨酸。 韦和平”5 。等构建色氢酸酶基因t 程菌，并h j 改进的方法测定色氨酸酶基因工程菌的活力，筛选 出活力较高的色氨酸酶基因工程菌。已有文献报道”，用大肠杆菌等微生物所产生的色氨酸酶来拆分 d l 一色氨酸，制得的d 一色氨酸的收率和光学纯度均较高。 1 4 4 膜拆分法 膜拆分法具有快速方便、能耗低、可连续生产的特点，有良好的应用前景，但该技术的研究才刚 刚起步，要同时获得高选择性和高渗透率比较困难。 龙远德和黄天宝”“将氨基取代的b 环糊精分子共价键合于聚乙烯醇上，制得带有8 环糊精基 团的聚合物膜，并崩此膜拆分了d l 一酪氨酸、d l 色氨酸和d l 一苯丙氨酸，效果良好。三种氨基酸在反 应1 0 h 1 5 h 后，d 一对映体与l 一对映体之间的绝对量差值达到最大。色氨酸的对映体过量值最大时为 2 5 4 。他们”“还制备了一种新型光学分离膜，即带有l 脯氨酸手性选择子的交联聚乙烯醇膜，并对 d l 一酪氨酸、d l 苯丙氨酸羊d l 一色氨酸进行拆分，结果获得纯度较高的d 一色氨酸。m a r u y a m a 等人“ 用具有双亲侧链的聚l 一谷氨酸膜来拆分d l 一色氨酸和d l 一酪氨酸，并且发现聚l 一谷氨酸膜的螺旋结 构和主、侧链的有序结构能使它们辨认d 和l 氨基酸，陔膜尤其对色氨酸表现较好的立体选择性。 1 4 5 毛细管电泳分离 毛细管电泳是2 0 世纪8 0 年代新兴的一种分离分析技术，它具有高效、快速、简便等特点，被广 泛应用于药物、生物、大分子、临床医学等领域。在手性分离方匠，毛细管电泳显示了巨大的潜力。 毛细管电泳手性拆分出现的时问较短，发展较快，但还存在些不足之处：如由丁缺乏能在更高层次 上对现象作系统阐述的规律，所以在方法的使用上还带有一定的盲目性：技术的发展不是很成熟以及 拆分的量较少等。 g i r n b a u m 等“”把牛血清白蛋白( b a s ) 在毛细管中用戊二醛化学交联成凝胶，采用毛细管凝胶亲 和电泳方式实现了对色氨酸对映体的拆分。s a n d r a 等用牛m 清蛋白、a 酸性糖蛋向和纤维素酶作手 性选择子，分离色氨酸；y a n g 等用人血清蛋白作添加剂在1 0 m i n 内完成色氨酸的分离”“。 通过对几种拆分方法的分析对比，结合实验条件和实际情况，论文选用化学法拆分d l 一色氨酸。 1 5 研究目的、思路及主要内容 1 5 1 研究目的 本课题研究目的是通过对d i 色氨酸外消旋体的合成及手性拆分技术的研究，得到光学活性d 一 色氨酸，为d 色氨酸的工业化生产提供一条可供选择的合成路线。同时对化学合成d l 一色氨酸及光学 第一章概述 拆分的过程进行相关理论分析，为寻求制备相关d - 氨基酸的新方法提供理论依据。 1 5 2 研究思路及主要内容 本课题的研究思路：结合原料来源及工艺特点，寻找合理的d l 色氨酸的合成方法，并对化学拆 分方法和酶拆分方法进行分析对比，根据当前技术发展水平和拆分荆性价比选择合理的手性拆分剂及 化学拆分方法。 本课题以苯肼为原料，合成外消旋体d l 色氨酸，接着以d 樟脑磺酸作为拆分剂，用化学法拆分 d i 。色氨酸，制备光学活性d 一色氨酸。具体研究内容包括： ( 1 ) d l 一色氨酸的化学台成。 a ) 以苯肼为原料，制备d l 一色氨酸外消旋体； b ) 通过对物料配比、反应时间、反应温度等因素的试验及优化，确定较佳的反应条件； c ) 对产品进行熔点测定、i r 分析、元素分析和h p l c 分析； d ) 对合成产物d i ，色氨酸外消旋体的形成过程及原理进行初步理论探讨。 ( 2 ) d l 色氨酸的化。学拆分。 a ) 以樟脑磺酸作为拆分剂，拆分d l 色氨酸； b ) 通过对溶剂配比、反应温度、反应时问等因素的试验及优化，确定较佳的反应条件； c ) 对产品进行熔点测定、旋光度测定、i r 分析、h i ，l c 分析、元素分析和1 i tn v i r 分析； d ) 对用d 樟脑磺酸拆分d l 一色氨酸的原理、等电点法提纯披拆分母液的消旋化原理等进行初 步理论探讨。 ( 3 ) 讨论以苯肼为原料合成d l 色氨酸的方法及用d _ 樟脑磺酸拆分d l 色氨酸的方法的呵行性 和推广应用前景。 9 东南火学硕士学位论文 2 1 引言 第二章色氨酸的化学法合成 d l - 色氨酸的化学法合成主要有两种，即以吲哚为原料的合成法和以苯肼为原料的合成法。论文 以苯肼为原料合成d l 一色氨酸外消旋体，路线如f ： c h ，= 一c hcho+ c6 h5 n h n h 2 即 h na o h c lhn h c oc h 3 型! 旦! ! o i l c ( c l二二二二二二_ - 卜i l ( i o ，。h 2 c c 。c 。：。，： hhh2 自h co c h3 c o o e t l2 ) 2 一c n h c o c h 3 c o oe t h 2 s o4 叫2 c ( c o 2 e t ) 2 。等汀i 洲3 。h c o o hnhc o ch c on hc och 。 3，强7 n， v e 坷c “3 c 。h 。：c 。h 曲 2 2 药品和主要仪器 绝对乙醇( 自制，含量9 99 5 ，制备方法见文献”“) 丙烯醛( 工业级，昆山年沙化i j 厂) ， 乙酰氨基丙二酸二乙酯、苯肼、醋酸、冰醋酸、氢氧化钠、硫酸氢钠、无水乙醇( 均为分析纯 上海化学试剂有限公司) 金属纳( 分析纯，华东师范大学化工厂) 浓硫酸( 分析纯，南京化学试剂厂) 盐酸( 分析纯，汕头市原陇化工厂) 傅立叶变换红外光谱仪( p e 一6 8 3 型) 元素分析仪( c h n 一0 一r a p i d 型) 高效液相色谱( h pt 0 5 0 型) 1 0 第二章色氨酸的化学法合成 b 型熔点管 2 3 苯腙合成工艺研究 2 3 1 合成方法 将4 0 9 乙酰氮基丙二酸二乙酯( i i ) 、9 0 m l 绝对乙醇钠加入四颈瓶中，在冰盐浴中剧烈搅拌 使温度不超过0 。c ，在此温度下缓慢滴加1 4 6 m l 丙稀醛( j ) ，时间3 0 m i n ，滴完厉继续搅拌3 h ，放 置1 h ，朋冰醋酸中和过量的钠，再加入4 5 r n l 乙酸，搅拌几分钟历，滴加2 0 m l 苯肼，缓慢升温至 5 0 。c ，加入1 6 m 水，搅拌均匀，静置过夜，析出品体，过滤，用少量无水乙醇洗涤，得到晶体。滤 液再) j h k6 0 m l 的水，静置过夜，又得到品体。重复数次，合并晶体，h j 无水乙醇重结晶，得到目标 产物( i v ) 。收率约为7 9 ，r n p 1 4 3 。c 1 4 4 。c ( 来校j e ) ( 文献”“值为1 4 2 。c 1 4 3 ) 。 2 3 2 苯腙合成实验 苯腙的合成分两步进行，首先乙酰氨基n - - - 酸二乙酯和丙稀醛进行加成反应，接着加成产物和 苯肼缩台生成目标产物苯腙。物料配比、反应温度等都影响产物收率。 2 3 2 1 物料配比对产物收率的影响 反应物料的浓度是影响化学平衡的主要因素之一。因此，要将物料摩尔比选在一个比较合适的 范围。本实验将物料摩尔比n ( 乙酰氨基丙二酸二乙酯) ：n ( 内烯醛) ：n ( 苯肼) 分别设为1 0 0 ： 10 0 ：1 0 0 、1 0 0 ：10 5 ：l _ 0 0 、10 0 ：1 1 0 ：1 、1 0 0 ：i 1 5 ：1 0 0 、1 0 0 ：1 2 0 ：1 0 0 和1 0 0 ： l2 5 ：1 0 0 ，实验结果见表2 。1 所示。反应温度为0 。c ，其它条件同2 3l 的合成方法。 表21 物料配比对产物收率的影响 从表21 司阻看到，随着物料摩尔比n ( 乙酰氨基丙二酸一二乙酯) ：n ( 丙烯醛) ： n ( 苯肼) 的 增大，产物的收率逐渐上升，当物料摩尔比大于1 0 0 ：1 1 5 ：l0 0 时，产物的收率上升的很少。因 此将物料摩尔比选择为i i ( 乙酰氨基丙二酸二乙酯) ：n ( 丙烯醛) ：1 3 ( 苯肼) - - 1 0 0 ：1 1 5 ：1 0 0 。 东南大学硕士学位硷文 2 3 2 2 反应温度对加成产物收率的影响 丙烯醛和乙酰氨基丙二酸二乙酯进行加成反应时，反应温度是影响产物收率的一个重要因素。 温度太低，反应速度较慢，温度过高，丙烯醛会发生自身缩合反应而生成大量的副产物，另外，丙 烯醛的沸点较低( 5 2 5 口c ) ，这也决定了反应温度不能太高。实验将反应温度分别设为一5 、一2 、o v 、2 、6 、1 0 ，实验结果如图2 - 1 所示。实验的物料配比为n ( 乙酰氨基丙二酸二乙酯) ： ( 丙烯醛) ：n ( 苯肼) - i 0 0 ：1 1 5 ：1 0 0 ，其它条件同2 3 1 的合成方法。 反应温度( ) 图2 - 1 反应温度对苯腙收率的影响 由图2 - 1 可以看出，随着反应温度的升高，产物的收率先上升后下降，在一2 。c 0 。c 产物的 收率达到最高。因此取2 。c - - 0 。c 为最佳反应温度。 2 3 2 3 较佳工艺条件下的验证实验 由实验得到的较佳丁艺条件为：物料摩尔比为n ( 乙酰氨基丙二酸二乙酯) ：n ( 丙烯醛) ：n ( 苯 肼) = i 0 0 ：1 1 5 ：l _ 0 0 ，加成时反应温度控制在一2 。c - - 0 。c ，其它条件同2 31 的合成方法。 在较佳t 艺条件下，平行实验结果见表2 2 所示。 表2 2 较佳工艺条件f 的平行实验 从表2 2 的结果可以看出：四次平行实验苯腙收率都在7 9 左右。因此，实验得出的较佳上艺 条件有着很好的重复性，产物收率较高，约为7 9 。 2 3 3 产物的表征 产物的i r 谱图( k b r 压片) 如图2 - 2 所示。1 5 1 9 ，6 5 c m l 和1 6 0 0 6 5c m l 为苯环的骨架振动吸收 峰；1 7 3 1 7 9c m l 为- - c 0 0 一中的c = o f 申缩振动吸收峰；7 0 0 0 4c m 。和7 5 4 0c m 。1 为单取代苯环；3 3 6 71 5 1 2 第二章色氨酸的化学法合成 c i n 。1 和3 2 7 2 6 5c _ 1 为酰胺中n h 的伸缩振动吸收峰； 1 6 5 9 1 9c f f l 为n = c h 中c = n 的伸缩振动吸 收峰；1 4 9 6 5 1c f f l 。为一c h ：的弯曲振动吸收峰； 1 4 3 8 6 5e m1 为- - e f t ：c h 。中- - c h 。的