（应用化学专业论文）内江猪白细胞介素2的克隆和原核表达.pdf

摘要 摘要 白细胞介素- 2 ( i l 广2 ) 是动物细胞免疫的重要组分，是调节细胞免疫的关键 因子之一，也是疾病治疗免疫辅助剂，是医学上器官移植免疫学研究的热门攻关 课题。由于猪的器官与人的类似，医学上常采用猪作为人医药研究模型。目前， 有关猪i l 广2 在异源生物中表达的研究报道很少，加上猪品种间基因存在一定的 差异， 有必要进一步开展这方面的研究。本研究旨在克隆内江猪的i l 2 ，钡9 定 其d n a 序列，对内江猪i l 广2 进行原核表达，测定原核表达蛋自的生物活性，最 终获得一株新构建的能表达i b 2 的大肠杆菌，为i l 2 的大量生产和内江猪的开 发利用提供技术保障。我们在试验过程中，参照g e n b a n k 中猪i l 一2 的m r n a 序 列( x 5 8 4 2 8 ) 设计合成了一对引物，以从内江猪外周血淋巴细胞提取的总r n a 为模板，用两步p c r 法扩增出了长度为5 3 8 b p 的内江猪i i 厂2 片段。并将该基因 克隆到p m d l 8 t v e c t o r 载体上，经酶切鉴定及d n a 序列测定确定该基因片段 为内江猪1 l ，2 基因。该基因包括内江猪i l 2 基因的全部开放阅读框( o r n ，编 码1 5 5 个氨基酸组成的蛋白质。与g e n e b a n k 公布的猪i l 2 基因相比，在o r f 的2 4 5 位发生a t 、在2 5 7 位发生t a 的置换，并引起相应氨基酸序列发生 变化；同源性分析表明，二者同源性为9 9 6 。再分别利用在引物上所加的和 p e t - 3 2 a ( + ) 质粒本身所带的胁r 铂肺n 棚两个酶切位点，将p c r 扩增得到的 内江猪i l 一2 片段插入到p e t - 3 2 a ( + ) 质粒中，构建表达载体p e t - 3 2 a ( + ) i l 2 ，进而 转化进入大肠杆菌肛刀( d e 3 ) 。经酶切和菌落p c r 鉴定重组子，证实了表达载体 构建正确。以i p t g 诱导重组菌表达融合蛋白，经s d s p a g e 电泳分析，重组菌表 达了分子量约3 7 k d 的融合蛋白；证实了p e t 3 2 a “) 1 0 2 能够实现i l 2 的原核表 达。再用c o n a 刺激、活化后的淋巴细胞作为应答细胞，以所表达的内江猪i l 2 融合蛋白做待检测对象，用m ，仃法检测所表达的融合蛋白的生物活性，结果显 示，所表达的融合蛋白具有生物活性；并对淋巴细胞活化时间，m r r 用量，m t t 作用时间等试验参数进行研究，得出了m r r 法检测该蛋白活性的最佳条件。 本研究成功地构建了一株能表达内江猪，2 的菌株，该菌株有可能直接商 业化，对人体医学研究和动物疾病疫防具有重要意义。 关键词：内江猪，白细胞介素2 ，体外扩增，克隆，原核表达，m t t 法。 堕塑堡三查堂堡主兰垡堡壅 a b s t r a c t i n t e r l e u l 【i n 一2 ( 1 l 2 ) i sak e yc o m p o n e n tf b rc c l l u l a ri m m u n i t yi 1 1a n i m a l np l a y s i m p o r t a tr o k si nt h er e g u l a t i o no fi m m u n es y s t e m m e d i c a ls d e n c eh a sp a r t i c q l a r i m e r e s t si nt h er e s e a r c ho fl i ，2 h o w e v e r ，0 n l yf e wr e s e 盯c h e sh a v eb e e nr e 口o n e df o r i l r 2e x p r e s s i o ni np m k a r y o t a t h eo b j e c t i v e so ft h i ss t u d yw e r et oc l o n et h e i n t e r l e u l 【i n - 2o fn e i j a n gp 逾，t od e t e m i n ei i ，2d n a s e q u e n c e ，t oe x p r e s si i ，2g e n e s i n p r o k a r y o t e ，t od e t e r i j n et h eb i o l o 西c a la c t i v j t yo fp r o t e i ne x p r e s s i o ni nt h e p r o k a r y o t e ，f i n a n yt oo b t a j l lan e ws t r a i ne x p r e s s i n gp o r c i ei l 2 b a s e do nt h e n u d e o t i d es e q u e n c eo fp o r c i n ei l 2p u b l i s h e d( x 5 8 4 2 ，w ed e s i 鲷e da n d s y n t h e s i z e dap a i ro fp r i m e r s 1 o t a lc e l l u l a rr n a ，j s o l a t e d 丘o mc o n s t i m u l a t e d p e r i p h e 蹦b l o o dl y m p h o c y t e so fn e i j i a i l gp i g ，w 弱u s e da st e m p l a t et og e n e r a t e c o m 口l e m e n t a r yd n av i af c v e i s e 订酿s c 矗p t i o n t h e5 4 ( ) b 口d n a 蠹a 鲫e t sw e f e 锄p l i f i e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) ，a n ds u c c e s s f l l l l yc l o n e di n t ot - v e c t o l d n a s e q u e n c ea n “y s i sc 0 1 l 】! 直f m e dt h a tt l l ed n af r a 酎n e n tw a st h eg e n ef o fh ，2 e x p r e s s i o ni nn e i j i a n gp i g 1 _ l l i s 蛳c j i “n c l u d e dt l l ee n t 硫。王撑0 ft t i en e 蛳卸gp 远 i i ，2 ，a n de n c o d e dt l l e1 5 5 姗i n oa c i d so ft h ei l 2p r o t e i n d n as e q u c n c e 孤a l v s i s s h o w e dt h a tt h ed o n e ds e q u e n c ch a d9 9 6 s i m i l a i j t yw i l t lt h o s ep u b l i s h e do nt h e g e n e b 姐kf o rp i g ，o n l yh a d 柳or c p l a 吲n e n l sa ts j t e s2 4 5 ( a t ) a n d2 5 7 ( t 一 u s i n gt h ef e s t r i c t i o ne n d o n u d e a s es i t e so fg r ，册d 日跏d 五盯丘o mp e 汀3 2 a ( + ) ，t l l e d o e d 台a 脚e mw a sj n s c n e dt ot h ep l a 锄i dt oc o n s t n l c tp r o k 缸y o t i ce x p r e s s i o n 口l a s m i dp e t - 3 2 “舟i l 广2 t h i si o m b i n 皴tp l 啪i dw 舔t 姗s f o 咖c di m oe c o l i 口陀j e 3 ) t oe s t a b l i s han e wi l 2c x p r e s s i o s y s t 啪ar e i 曲证a i l ts v n c r e t i c p m t e i i lw i t hm wa b o u t3 7 k dw 勰i d e n t 塌e di nt l i i ss y s t e m b i 0 1 0 西c a la c t i v i t vo ft h e e x p r e s s e dr e m b i n a n tp m t e mw 鹞j n v e s t i g a t e dw i t l lm i tm e t h o da n ds i 旦皿i f i c a n t r e s u l tw a so b s e r v e dw h e nc o 刖o s t i m u i a t e dn c j i i a l l gp c r i p h e r a lb l o o dl v m p h o c v t e s c e l l sw e r eu s e d 鹤t h ef e s p o n s ec c l l s s t i m u l a t i o n6 m e ，m t tc o n c c n t r a t e ，a n dm t r r c a c i i o nt i m e 血t l l em t tm e l h o d 柚do t h e rp a r a m e t e r sw e r e 把s t e dt oo p t i m i z et h e c o n d i t i o n sf o rm e a s u r e m c n to ft l l ea c t i v i t yo ft h ef e c o m b i n a n tp m t e i i i i nt h i ss t u d y w es u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e dam e t h o dt oc o n s t n l c ian e ws 垤a i no f d f o k a r v o t et h a t啪e x p r e s s e sp o r c i n ei i ，2 t h i ss t f a i nm a yh a v ep o t e n t i a l c o m m e r d a la p p l i c a t i o n si ns w i n ed i s e 够ep r e v e n t i o n k e yw o r d ：n e i j i a n gp 蟾，i l i t e d e u 】【i n - 2 ，g e n e ，p f o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，c l o n e ，m t t n l e t h o d 第一章引言 第一章引言 1 1 研究意义 内江猪是我国华北、东北、西北和西南地区开展主杂种优势利用的良好亲本 之一；现己被广泛推广至山西、北京、山东、辽宁、青海、甘肃、云南等2 0 多个 省，甚至出口至越南等国。 我国是猪肉产量和消费量世界第一大国，但令人遗憾的是我国也是世界上猪 病第一大国。据农业部的普查统计，全国猪的死亡率约为8 。1 2 ，每年因猪死亡 造成的直接经济损失可达上百亿元。目前存在我国的猪传染病大约有5 0 。6 0 种之 多，较常见的大约有3 0 种；流行的细菌病和病毒病都有不同程度的增加，其势头 也没有减弱的迹象。一些人畜共患病不仅带来了大量的经济损失，也严重地危害 了疫区人类的健康、安全。四川省作为全国养猪第一大省，更是深受其害。2 0 0 5 年有关猪的新闻排名第一的要属四川省猪链球菌传染人致死的事件。对待猪的疾 病时，传统的疫苗免疫和药物治疗方法因病原变异快、细菌耐药性不断增强等原 因而不能保证猪的健康；加入w 1 d 以后，对绿色食品中化学物质残留标准要求的 提高，传统的药物治疗更不能满足要求；因此，探索和研制高效猪免疫增强剂、 增强猪的抗病防御和免疫应答能力，提高疫苗保护率是当前传染性疾病最可靠的 简便途径。在预防传染性疾病方面开展研究不仅有很重要的学术价值，还有重要 的经济和社会意义。 细胞因子作为免疫增强剂不仅安全，而且可调节体液免疫和细胞免疫应答， 适用于多种抗原疫苗。 猪白细胞介素2 ( p i l 2 ) 作为猪体内免疫系统中重要成员之一，在治疗猪的 各种疾病方面已经越来越受到重视1 1 】1 2 】。白细胞介素2 ( 1 l 广2 ) 是糖基化的细胞因 子，属于造血因子家族。它是t 细胞生长增殖的主要细胞因子。而t 细胞的活化 又制约着整个特异性免疫应答。除了作用于t 细胞，1 0 2 能刺激n k 细胞的生长 和增强它们的杀伤功能，还能够激发b 细胞生长及抗体的产生l 射。 各种动物的i l 2 的d n a 和蛋白序列存在着差别，在种属上呈种属下行性， 一般是进化程度高的动物的i l 2 可以作用于进化程度低的动物【4 1 ，不同物种间i l 广2 成都理工大学硕士学位论文 的性质和研究方法都存在相似性。 对猪免疫系统的研究对提高猪的健康水平和促进畜牧业的发展有着重要的意 义，特别是去年四川境内爆发的猪链球病菌更使这方面的研究显得重要和迫切。 鉴于生物种属间差别会导致i i 广2 的d n a 序列和蛋白性质产生差别，研究具体物 种的i l 2 是非常必需的。对内江猪的i l 广2 进行d n a 克隆和对蛋白进行表达，不 仅对内江猪的疾病防止具有重要的意义，而且对物种问亲缘关系的判断和内江猪 基因资源的开发都有十分重要的意义。但是，目前还未见有关内江猪的i l 2d n a 序列和蛋白方面的研究报道。本课题拟在i l 2 的克隆和原核表达方面进行研究， 主要内容包括内江猪i l 2 基因克隆，构建原核表达的载体，并且将i l 一2 在大肠杆 菌皿刀( d e 3 ) 中以融合蛋白的形式表达，对表达产物进行鉴定。 本试验为“9 7 3 ”项目一部分( 编号2 0 0 4 c c a 0 1 8 0 0 ) 。本试验计划克隆内江猪 i l 2 的基因，与载体p 班二3 2 a ( 吣构建重组原核表达载体，转化进入大肠杆菌 皿卫( d e 3 ) ，表达融合蛋白；并且用m r r 法测定所表达蛋白的生物学活性。为内 江猪i l 2 的应用和对内江猪整个免疫系统的研究奠定基础。对综合开发内江猪资 源提供一定的参考价值。 1 2 研究现状 1 2 1 内江猪的产地与性状简介 内江猪主产于四川省内江市、内江县，以及内江市东兴镇一带，历称“东乡 猪”。建国以来，内江猪发展迅速，1 9 5 0 年产区仅有3 万多头种猪，1 9 8 1 年已达 1 2 5 万头，产区逐渐扩大到资中，简阳等四川各市、县。内江猪在国内推广的面 积广，己被大量引进到山西，北京等2 0 多个省市，还曾经出口到越南。该猪被毛 全黑，鬃毛粗长，体型大，体质疏松，头大，嘴简短，额面横纹深陷，额皮正中 隆起形成肉块，耳中等大、下垂；体格大，体质较疏松；体躯宽、深，悲腰微凹， 腹大、不拖地；臀部宽，稍后倾；四肢粗壮；皮厚，乳头粗大。成年猪平均体长 1 4 j d 1 5 0 厘米，胸围1 2 0 1 3 0 厘米，高7 0 。8 0 厘米，体重1 6 0 公斤左右。具有适应 性强和杂交配合好等特点。 2 第一章引言 1 2 2 i l 一2 的简介 i l 一2 是人们发现的第一个细胞因子，在生理条件下，i l 一2 是由c d 4 ( + ) t 细 胞在受促有丝分裂素或异源物刺激后分泌的一种蛋白，它对维持正常免疫反应是 必需的；i l 一2 的大量表达还需要某些第二信号。静止的细胞不产生i l 一2 。在试管 内d e x a m e t h a s o n e 或c s a ( c y c l o s p o r i na ) 可抑制i l 一2 的合成。转化的t 和b 细胞，l a k 细胞，和n k 细胞可以分泌i l 一2 维生素e 可增加i l 一2 的产生。随着年 龄的老化，抗原和促有丝分裂素刺激合成i l 一2 的能力下降，因而细胞免疫反应能 力降低。 虽然只有t 细胞分泌i l 一2 ，但它可以刺激所有的类淋巴细胞，通过与细胞 表面的特异性i l 一2 受体的结合，发挥促使细胞增殖和分化的功能。n k 细胞可以 组成性地表达这些受体，而大多数t 和b 细胞的i l 一2 受体的表达则依赖于抗原 的刺激。i l 一2 不论对细胞免疫和体液免疫，还是原始和再次免疫反应都是极为重 要的。 早在2 0 世纪6 0 年代，一些学者发现多种来源于植物的外源凝集素如c o n a 、 p h a 等可在体外刺激 淋巴细胞的转化与增殖，从而起到有丝分裂原的作用。在丝裂 原刺激的淋巴细胞上清中具有可溶性丝裂原性因子，当时称为“淋巴细胞丝裂原 因子”、“致母细胞性因子”、“体细胞激活因子”。七十年代一些学者发现，将p i a 刺激的人脾淋巴细胞培养上清加入到体外培养的人自血病细胞或骨髓细胞中，可 导致其在体外增殖，当时将该上清称为“条件培养基”( c o n d i t i o nm e d i u m ，c m ) ， 因其具有诱导和维持t 细胞的生物活性，被称为t 细胞生长因子( tc e l lg r 0 w t h f a c t o r ，t c g f ) ，1 9 7 9 年第二届国际淋巴因予会议将其命名为自细胞介素一2 。i l 一2 的发现，为在体外长期培养t 细胞克隆提供了方便，同时也揭开了细胞因子网络 研究的序幕。自从w a s t o n 等首次纯化了小鼠i l 一2 之后，大鼠、人、长臂猿、豚 鼠、兔、猪、绵羊、牛以及鸡等的i l 一2 相继被证明。 i l 一2 主要是由t 细胞产生的。制备i l 一2 的主要方法是用动物的脾细胞或外周 血单核细胞，经丝裂原共同培养刺激后，在细胞的上清中即可产生i l 一2 。常用的 丝裂原有c o n a 、p a 等。此外，受到刺激的b 细胞、白血病细胞系、l a k 细胞、n k 细胞也可分泌i l 一2 。而未活化无反应性的t 细胞不产生i l 一2 。 3 成都理工大学硕士学位论文 1 2 2 1 猪i l 一2 的d n a 和蛋白质序列 从现有的报道资料看【5 】【6 l ，猪i l 2 基因开放阅读框长4 6 5 个b p ，编码1 5 5 个 氨基酸，前6 0 位核苷酸编码2 0 个氨基酸信号肽，后4 j d 5 位核苷酸编码1 3 5 个氨 基酸成熟片断。p i l 2 蛋白分子量为1 7 k d 左右，等电点为5 2 左右，疏水氨基酸占 4 j 0 左右，亲水氨基酸占3 6 左右，碱性氨基酸占1 0 左右，酸性氨基酸占1 1 8 左右。 猪i i ，2 基因序列由于猪品种和具体试验条件的差别而存在差异。与多数动物 的l l 广2 的同源性都超过8 0 ，但与鼠的同源性较低( 6 8 ) 。已报道的两种中国境内 猪的i l 2 的c d n a 编码序列与国外报道的有1 0 0 的同源性；但也不排除其它猪 种的序列与已经报道的存在差异的可能性f 5 】【6 】1 7 】。各猪种l l 2 基因前导序列差别很 大，蚰e y a m a 测得野猪p ，2 启动子序列长2 7 1 0 b p 。以下是l 矗m e y 锄a 测得的 野猪从1 a i a s i 辨a l 开始的前导序列。 5 _ t 小a 丁t o c t r c 彻1 研能“c o c t 仳附c g c c t c r c l a a t c a c i a i 玳a c a g t a a c c l c a a c r c ( 了 1 2 2 2i l 一2 在免疫系统中作用原理 ，2 是一种球形蛋白，由4 个主要的两性n 螺旋组成，它们呈反平行方式排 列，其疏水面构成一疏水核心。，2 在第3 位苏氨酸有一个糖基化位点。糖基化 程度的不同可影响其分子量和电荷。i l 2 属于造血因子家族。是由生物体c d 4 ( + y r 细胞在受促有丝分裂索或异源物刺激后分泌的一种蛋白。它是t 细胞生长增殖的 主要细胞因子，是t 淋巴细胞产生抗肿瘤细胞毒活性的重要辅助因子。它可增强 细胞毒t 细胞的杀伤活性。除了作用于t 细胞，i l 2 能刺激n k 细胞的生长和增 强它们的杀伤功能，参与破坏肿瘤的过程；还能够激发b 细胞生长及抗体的产生， 诱导产生淋巴因子活化的杀伤细胞( l a k ) ，刺激许多免疫细胞产生多种细胞因子。 是整个免疫系统不可缺少的一种细胞因子。i l 一2 作为抗原的佐剂，能够刺激t ，b 细胞的扩增，增强抗原的免疫源性。 特异性i l 2 受体( i l 一2 r ) 是免疫抑制物质，会减弱机体的自分泌效应，抑制 己活化的t 细胞的克隆化扩增；i l 一2 通过与细胞表面的i l 一2 r 的结合，发挥促使 细胞增殖和分化的功能，通过t 细胞数量和功能的提高来增加机体的免疫功能。 4 第一章引言 虽然只有t 细胞可以分泌i l 一2 ，但它可以刺激所有的类淋巴细胞。b 细胞表面同t 细胞一样，也有大量的i l 一2 r ，i l 一2 的作用原理也相近。i l 一2 r 的过表达与移植排 斥、自身免疫性疾病及某些血液系统肿瘤等密切相关。因此，让i l 一2 和毒素共同 作用，借助i l 一2 与高亲和力的i l 2 r 的特异性结合和毒素介导的细胞毒效应以选 择性地将表面含有高亲和力i l 一2 r 的靶细胞杀死，可以防治上述的各种疾病。 i l 一2 的生物学活性是通过细胞膜上的受体调节的。被激活t 细胞可表达i l 2 受体，静止的t 细胞则不表达。激活的b 细胞和静止的单核白细胞很少表达这一 受体。i l 一2 受体的表达受i l 一5 和i l 一6 的调节。此外，还受i l - 2 r p 5 5 诱导因子 ( i l 一2 r p 5 5i n d u c i n gf a c t o r ) 、i l 一2 受体诱导因子( i l 一2r e c e p t o ri n d u c i n g f a c t o r ) 和i l 一2 r a 链抑制活性( i l 一2 r _ a l p h ac h a i ni n h i b i t o r ya c t i v i t y ) 的 调节。 i l 一2 r p 5 5 诱导因子；简称t i a ，是由h t i v 一1 转化的t 细胞所分泌，后 者是从成人t 细胞白血病患者分离的这一因子被鉴定为成人t 细胞白奴病衍生因 子。i l 一2 受体诱导因子：简称i l 一2 r i f 。它是在激活的t h l 细胞克隆的条件培养 基中发现的。它能诱导t h l 细胞克隆i l 一2 受体的表达和增殖。目前尚不清楚这一 因子是非是独特的因子。i l 一2 r i f 中至少有一种是与i l 一1 2 相同的。 i l 一2 ra 链抑制活性：又称为t a c 抑制活性，p 1 9 ，是由h i v 感染患者的粘附 细胞所产生的。h i v 感染的u 9 3 7 细胞也可分泌这一因子。p 1 9 分子研究尚不充分， 它无新毒性，与t n f a ，i f n a 或i f n g 不同它抑制正常被激活的t 细胞i l 一2 受体a 亚单位的表达，但不抑制6 亚单位的表达。它还抑制这些细胞i l 一2 的产生 和抑制正常t 细胞促有丝分裂素引起的增殖反应。 i l 一2 r 由3 个亚单位所组成：i l 一2 r 链，p 5 5 即t a c ( t c e l la c t i v a t i o n a n t i g e n ) ；i l 一2 rb 链，p 7 5 ( c d l 2 2 ) ；i l 一2 ry 链为p 6 4 。p 5 5 浓度为k d i s = 1 0 n m ，p 7 5 和p 6 4 为k d i s = 1 0 0p m i l 一2 r b ，i l 一2 r g 属i 型细胞素受体。 b 和y 链是属于生血受体超家族的成员，对配体的内在化和信号传递是必需 的。3 个亚单位均存在时亲和力最高；在n k 细胞上表达的有b 和y 亚单位，具 有中等亲和力，但具有功能性；在转染的成纤维细胞上表达有a 和b 亚单位，可 与i l 一2 结合，并具有较高的亲和力，但无信号传递能力。 高亲和受体( ( k d i s ”1 0p m ) 约占所有表达受体的l o 。由p 5 5 和p 7 5 所组成； 二者是配体结合的结构域，p 6 4 是信号传递成分。p 7 5 组成性地表达于静止的t 细 成都理工人学硕士学位论文 胞，n k 细胞和一些其它细胞系，而p 5 5 通常只在激活的细胞才表达。但是，许多 肿瘤细胞和h t l v 一1 感染细胞可组成性地合成p 5 5 。i f n g 可诱导单核细胞表达i l 一2 受体，这些细胞可变为细胞毒细胞。i l 1 3 可降低p 7 5 的表达。中亲和性受体( k d i s = l o op m ) 由p 7 5 p 和p 6 4 组成。低亲和受体( k d i s = 1 0n m ) 由p 5 5 单独组成。 p 5 5 由2 5 1 个氨系酸组成，胞外结构域长达2 1 9 个氨基酸，胞内结构域很短， 仅1 3 个氨基酸。p 5 5 基因定位于1 0 p 1 4 一p 1 5 。p 5 5 基因受核蛋白r p t 一1 的调节。 p 7 5 由5 2 5 个氨基酸组成，胞外结构域长达2 1 4 个氨基酸，胞内结构域为2 8 6 个氨基酸。p 7 5 基因含有1 0 个外显子，长达2 4k b 定位于2 2 q l l 一1 2 ；鼠受体定 位于1 5 一e 。 p 6 4 是i l 一2 受体的第三个亚单位，称为g 亚单位。鼠和人g 亚单位在核苷酸水 平上和氨基酸水平上有约7 0 的同源性。这一受体亚单位对高和中等亲和性i l 一2 受体是需要的，但它自身并不与i l 一2 结合。存在有两种受体类型：一是扩b g 异 三聚体；另一是b g 异二聚体。编码g 亚单位的基因位于人染色体x q l 3 ，约有4 2 k b ，含有8 个外显子。这一基因与s c i d x l 基因( x 一1 i n k e ds e v e r ec o m b i n e d i 舢u n o d e f i c i e n c y ) 在同一位点。最近研究表明，i l 一2 的g 亚单位受体也是i l 一4 和i l 一7 的受体成分；可能也是i l 一1 3 受体的成分。这些发现可以解释x 连锁的免 疫缺损症患者免疫缺损的严重性。 g 皿单位2 6 7 3 1 7 位氨基酸直接与p 7 5 的穿膜区i 临近，涉及i l 一2 介导的信号 传导。此外，i l 一2 受体还与许多蛋白相关( p 2 2 ，p 4 0 ，p l o o ) ，后者可能涉及受 体链的构象改变，受体介导的细胞内吞作用，阻及进一步的信号传导过程。一种 已鉴定的9 5 k 蛋白称为细胞粘附因子一1 ( i c a m 1 ) ，它可能定位于i l 一2 受体的细 胞与细胞接触区域，可能介导旁分泌活性( p a r a c r i n ea c t i v i t i e s ) ，如在i l 一2 介导的t 细胞的激活。 另外一种与p 7 5 相关的蛋白是酪氨酸特异性蛋白激酶，称为1 c k 在l c k 阴 性细胞系上酪氨酸蛋白激酶的特异性抑制物可抑制i l 一2 诱导的细胞增殖，这提示 还有其它激酶与i l 一2 受体相关：已鉴定的有二种激酶，称为f y n 和l y n 。另 外，i l 一2 受体的信号传导还由v a v 所介导。 激活的淋巴细胞持续分泌t a c 抗原4 2k 片段。这一片段在血清和血浆中存在， 即为可溶性i l 一2 受体( s i l 一2 r ) 这一可溶性受体的浓度在不同的病理情况下是 第一章引言 不同的，感染，自身免疫性疾病，白血病，或在器官移植后，水平可以增加到1 0 0 倍。s i l - 2 r 水平与h i v 引起疾病的严重性相关，在其它情况下也可作为一种诊断 指标。 在所有的细胞中，只有n k 细胞，可能还有y6 + t 细胞可以组成性地表达 i l 一2 受体，不需要抗原刺激。所以，它们组成i l 一2 的直接效应细胞，大约1 0 的 周围血单形核细胞( p k ) 为n k 细胞，因此，在正常情况下，周围血中有1 0 亿个 n k 细胞；大约9 0 的n k 细胞仅表达i l 一2 受体的7 5 k d 蛋白，它只对高浓度的i l 2 起反应，而其余大约1 0 的n k 细胞可表达i l 一2 受体的两种分子，这些细胞可对 低浓度的i l 一2 起反应。 1 2 2 3 重组i l 一2 表达的研究进展 以大肠杼菌做宿主：由于原核表达无修饰作用，大肠杆菌表达的i l 2 没有糖基， 为多聚体状态：以包涵体形式存在于细胞质中；提纯后需要复性【踟。另外，因为没 有糖基，在4 时保存的时间不会超过一周。 大肠杆菌表达后可以用盐酸胍溶解的方法来获得i l 2 【9 1 。但是这种方法的复性 效果不好，整个透析复性过程太过烦琐，极易使p i i ，2 恢复为沉淀状态。严琳1 1 0 】 等用去垢剂十二烷基肌氨酸钠( s k l ) ，使诱导出的包涵体完全溶解；童接进行透 析复性，不进行梯度透析，已取得了良好的效果。另外，在复性过程中，很可能 会形成无活性的异构体或多聚体，可以采用定点突变技术对某一氨基酸进行重新 克隆表达l l l j 。 以酵母做宿主：在酵母中表达的i l 2 可以实现糖基化，具有生物活性。酵母表达 时可以使外源蛋白表达盾分泌到培养液上清中f 埘。便于酵母的生长和蛋白的正确 折叠、修饰。不过酵母表达体系也存在着缺点，例如：质粒稳定性欠佳、传代中 容易丢失，转化后酵母的生长会受不同程度的抑制等【1 3 】。 因为酵母内源分泌性蛋白较少，所以分泌到上清中的外源蛋白纯度较高。但 是随着培养液中酵母浓度的增加，其它一些酵母细胞内物质，例如蛋白水解酶也 会相应增加，导致p i b 2 被降解1 1 4 l ；不过，酵母本身的蛋白分泌途径便于将i l - 2 蛋白从细胞中运到蛋白酶低的地方。实际应用中常用蛋白酶缺陷菌株来提高外源 成都理工大学硕士学位论文 蛋白的产量和质量，如菌株p e p 4 _ 3 l ”l 等。酵母表达体系中，有时候连接到外源蛋 白上的糖基数目和类型跟哺乳动物存在差别，应用时容易产生免疫源性问题。但 是可以通过直接突变以剔除糖基化识别位点来解决。 以哺乳动物细胞和昆虫细胞为宿主：在哺乳动物细胞中表达可以不经过诱导而长 期分泌p i l 广2 。哺乳动物细胞健全的分泌系统可以使i l 2 分泌于培养上清中，不用 复性就可得到活性产物。昆虫细胞表达体系可以实现i l 广2 跟其它蛋白同时表达， 而且可以在活体昆虫内实现表达吼 1 2 2 5 体外重组i l 2 的应用现状 治疗猪的各种疾病时，大量的化学药物会造成猪品质下降，威胁人类的健康。 p i i 厂2 是机体内自己产生的免疫调节因子，可以被机体代谢，不残留，无副作用， 因此是治疗猪疾病的有效药物。例如今年在四川部分地区发生的猪链球菌传染病， p 1 0 2 有明显的治疗效果，这早在2 0 0 2 年就有报道1 1 6 1 。 作为佐剂应用：作为佐剂的应用试验研究有两种方式：是完整表达出的蛋白形 式，二是以质粒的形式。p l b 2 蛋白跟疫苗一起按一定的浓度混合，按照常规制备 方法制备含有p ，2 的疫苗，注射进入猪的体内；或者在注射疫苗后再继续注射 p i l 2 蛋白，因为p i l 广2 的作用有一个半衰期，在一定时间内会失去作用，所以要 连续注射p i l 2 。正是由于p i i ，2 在猪体内有一定的半衰期、为了保证体内p i l 2 的量维持在一定的水平，可将来表达的真核p i i ，2 质粒载体直接作为佐剂跟疫苗一 起注射到猪的体内，在生物体内进行表达，可使p i b 2 持续地释放而发挥作用。 作为融合蛋白应用：在载体韵构建阶段，把p ，2 基因跟其他蛋白基因重组在一个 载体中，从而表达得到融合蛋白；图1 1 为融合蛋白表达时载体的构建过程： 8 第一章引言 图1 1 p i l 广2 融合蛋白的表达载体的构建 f j 9 1 1c o n s t n l c t i o no fe x p r e s s i v e v e c l o ro fs y n c r e 血p r o i e i n ( p i l 2 ) 图中标注的p i l 2 代表p i i ，2 的c d n a 序列，p 代表另外蛋白或多肽的c d n a 序列，圆代表载体。a ，b ，c ，d 点分别为基因序列不同的酶切位点，分别被限 制性内切酶所作用。p i b 2 单独表达时，只要到3 步骤就可转染细胞；4 ，5 ，6 步 是i l 2 基因跟其他蛋白形成融合蛋白时的构建步骤；图的最后一部分更为特殊， 是另一蛋白跟i i 广2 连成一个长基因片断，中间无载体碱基的间隔而共同表达。 现在应用较多的还是处于质粒阶段的双表达，构建好融合蛋白的载体质粒， 直接作用于生物体，在体内进行表达。融合蛋白的应用，避免了两种质粒共同免 疫时可能存在的细胞摄取不成比例而造成影响免疫应答效果的现象，更能增强局 部免疫应答，缩短免疫应答的潜伏期。 被包裹以更好的发挥作用：李惠【1 7 】等运用离子交联法制各了壳聚糖包裹的i l _ 2 质 粒，并在小鼠身上应用成功，值得借鉴以应用于猪：将壳聚糖溶液和质粒溶液水 浴预热、混合既得纳米质粒；经纳米粒度分析仪测得纳米粒径为4 5 i l n l 左右，凝胶 阻滞分析也得知质粒被完全的包被；被壳聚糖纳米颗粒【1 8 】包裹的i l 2 质粒，它的 免疫增强效果跟没有被包裹的质粒免疫效果差不多，重要的是由于含有包被，能 有利于质粒分子进入细胞，防止质粒被体内其他组织蛋白吸收和体液核酸酶对 d n a 的降解。 肿瘤患者静脉注射i l 一2 后表现有较大的毒性反应，包括发烧、寒战、全身无 力、出疹、恶心、呕吐、低血压等。但是，毒副反应仅在使用大剂量时才能出现， 即相当于治疗麻疯或艾滋病有效剂量的l o o l o 倍。使用i l 一2 出现的毒副反应 是由于t n f 一的释放所引起的。研究表明，由抗原激活的t 、b 细胞和1 0 n k 细 胞可表达高亲和力的受体，它可为低浓度的i l 一2 所饱和，所以，l 临床使用大剂量 i l 2 是不必要的。低剂量静脉输注或皮下或皮内间歇注射就可维持低水平、无毒 性、i l 一2 受体饱和的有效浓度。 临床上使用i l 一2 治疗肿瘤的主要问题是i l _ 2 的毒性问题。i l - 2 治疗可以 引起次级细胞因子复杂网络的产生，其中主要是前炎症性细胞因子， i l 一1 ，i l 一6 ，i 卜8 和t n f 。这些细胞因子导致循环免疫系统细胞( 粒细胞，淋巴细 胞和单核细胞) 和内皮细胞的激活。被激活的免疫细胞粘附于内皮细胞以及随之 9 成都理工大学硕士学位论文 在局部过量产生细胞因子和炎性产物是i l _ 2 引起毒性反应的主要病理过程。 激活的淋巴细胞和中性粒细胞参与内皮细胞的损伤过程；白细胞的激活刺激 它们产生细胞因子，蛋白酶，氧基，一氧化氮以及表达多种粘附分子。 i l 一2 本身对内皮细胞不发生作用，但i l 一2 诱导的次级细胞因子激活内皮细 胞；它们的作用包括改变粘附分子的表达，进一步产生细胞因子，形成前促凝状 况和产生血管活性物质ii l 一1 和t n f 在此过程中起关键作用。 在动物的应用方面，i l 一2 主要用于治疗感染性疾病。动物试验和临床试验表 明，相对低剂量的i l 一2 还可治疗菜些以细胞免疫为主的感染性疾病，包括艾滋 病、乙型肝炎、结核、麻风等。 1 3 研究思路： 本课题拟采用聚合酶链式反应( p c r ) 对内江猪的i b 2 的基因进行体外扩增。利 用p c r 扩增后在d n a 末端所带的a 碱基，跟t 载体连接，构建克隆载体，测定 其序列。继而跟其他物种的i l 2 进行核酸比较、分析它们的亲缘关系、分析核酸 编码的蛋白的性质。再利用所得到的克隆片段跟质粒p e t - 3 2 a ( + ) 构建表达载体， 继而转化进入表达宿主大肠杆菌说2 i ( d e 3 ) 进行表达。再利用i l 广2 可促进c o n a 活化细胞的性质，用m 丌法鉴定所表达蛋白的活性。图1 2 描述了整个试验的具 体操作过程。 l o 第一章引言 原核 围不1 虬 + 一刺激细胞表达l l 七 r i 总r n a + 一p c r 扩增 r 的d n a + 一转化进入细菌 - _ 一抽提质粒一 r 诱导培养得i l 矗蛋白 i 鉴定 图1 2本次试验的操作流程 f i 9 1 2n e 丑o wd i a g f a mf o fe 印e r i m e n t a lp r o t o c o l s 克 隆 表达 活性检测 成都理工大学硕士学位论文 第二章试验材料与方法 2 1 主要试验仪器与材料、试剂 2 1 1 主要试验仪器 本试验所使用的主要仪器有美国珀金埃尔默公司生产的g e n e a m pp c r s y s t e m2 4 0 0 型p c r 仪：德国s i 舯a 公司生产的2 k 1 5 型冷冻高速离心机；德国 h e r a e u s 公司生产的p r i m or 型台式高速离心机；美国m i l l i p o r c 公司生产的m i l l i q i i 型纯水仪；日本s a n y o n 公司生产的m c 0 1 钆u 型细胞培养箱；哈尔滨市东联电 子技术开发公司生产的h z s d 型恒温水浴摇床；北京六一电泳仪厂生产的d f c 型恒压恒流电泳仪；美国u 、r p 公司生产的凝胶自动成像系统；江苏苏净集团安泰 公司生产的8 5 v 2 8 型生物安全柜；美国应用生物系统公司生产的a b i3 7 3 0 型d n a 自动测序仪：直径为2 2 0 n m 一次性过滤器便q 于成都晶美公司) 等。 2 1 2 试验材料、载体和菌种 购于内江猪厂的雌性三月龄内江猪一头；四川农业大学动物生物技术中心郭万 柱教授保存和免费提供的p e t - 3 2 a ( + ) 质粒、大肠杆菌d 砸a 、大肠杆菌既刀( d e 3 ) 。 2 1 3 主要试剂及其配制 限制性内切酶d r ，和脚n 棚、溶菌酶、a m v 反转录酶、t 4 d n a 连接酶、异 丙基一p 半硫代半乳糖苷( 叮g ) 、十二烷基磺酸纳( s d s ) 、甘氨酸、过硫酸氨( p b s ) 、 丙烯酰胺( a c r ) 、双丙烯酰胺( b i s ) 、n ，n ，n ，n 一四甲基乙二氨m e d ) 、d t t 、e d ，i a 、 t r i s - b a s e 、t 载体试剂盒、d n am a r k e r ( d l 2 0 0 0 ，& 胡埘1 4 ) 等购自大连宝生物公 司。d n a 回收试剂盒、凝胶回收试剂盒购于上海( y g e n 公司。p c r 反应试剂盒、 焦碳酸二乙酯( d e p c ) 、r p m l l 6 4 0 培养基购于北京天为时代公司。t r i z o l 试剂 购自美国g i b c o b r l 公司。1 1 l i a z o l y lb l u et c t r a z o l i u mb r o m j d e ( m t t ，需避光保存) 、 二甲亚砜( d m s o ) 、透析袋、氨苄青霉素( a m p ) 、d n a 酶、淋巴细胞分离液、 第二章试验材料与方法 t r i t o n x - 1 0 0 、还原型谷胱甘肤( g s h ) 、氧化型谷胱甘肽( g s s g ) 等购自成都晶 美公司。 d - h a n k s 液配制方法；称取n a c l4 o g 、k c lo 2 9 、n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 00 0 6 9 、k h 2 p 0 4 0 0 3 9 、葡萄糖o 5 9 、o 4 酚红液2 s m l 、n a h c 0 31 1 9 加三蒸水至5 0 0 m l 高压 灭菌，4 保存备用。 抗凝剂配制方法：称取枸橼酸三钠2 o g ，加三蒸水5 0 m l ，高压灭菌，4 保存备 用。 l b 培养基配制方法：称取研p t o n e1 0 9 、y e a s te x t r a c t5 9 、n a a1 0 9 加重蒸水至 1 0 0 0 m l ，用2 mn a o h 调p h 值至7 o ，1 5 磅( 1 0 5 k 幽湖2 ) 高压蒸汽灭菌2 0 m i n ；固 体培养基按1 l 液体培养基中加1 5 9 琼脂粉配制，1 5 磅( 1 0 5 k 咖2 ) 高压蒸汽灭菌 2 0 i n i n 。 t b e 溶液配制方法：称取t r i s2 1 6 9 ，硼酸l l g ，e d t a1 4 8 9 加重蒸水2 0 0 m l 溶 解。 3 0 a c r b i s 储存液配制方法：称取a c r2 9 9 、b i s1 9 、加蒸馏水1 0 0 m l ，棕色瓶避 光4 保存。 1 s m t d s -