（运动人体科学专业论文）8周有氧运动对大鼠左心室肌蛋白质组差异表达的影响.pdf

摘要 研究目的：本研究采用蛋白质组学的方法，探讨持续中小强度运动对 大鼠左室肌蛋白质组的差异性表达的影响，初步筛选出在运动应激条 件下对心脏重塑发挥重要作用的目标蛋白质，从蛋白质组学定量与定 性的角度发现新的与中小强度有氧运动密切相关的蛋白质，为运动健 身以及慢性心血管疾病的运动康复治疗提供实验依据和理论指导。 研究方法：以2 0 只雄性s d 大鼠为研究对象，按照体重随机分为运 动组和对照组( n = l o ) 。运动组经8 周中小强度有氧运动( 6 0 7 0 v 0 2 一) 跑台训练后6 h ，与对照组同时麻醉处死，提取左心室肌的 全蛋白，进行双向凝胶电泳技术分离；运用b i op dq u e s t 图像分析软 件对双向凝胶电泳图谱进行分析，选取运动后差异表达量芝5 倍的蛋 白质点，用串联飞行时间质谱蛋白质仪( 切_ 一咄l f l e x - t o f t o f ) 进行质谱鉴定，以逆转录聚合酶链反应( r t p c r ) 对目标蛋白质的 基因表达进行m r n a 转录水平上的检测。 结果：经8 周中小强度有氧运动后，与对照组相比运动组大鼠心脏重 量指数增加了3 2 o ，具有显著性差异( p 5 倍的蛋白质点 t a b l e 2 l t h e p r o t e i ns p o t s w h c b ed i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n v o l t t r n e 5 f o l d sa t t e r8 w 。e b i t a l n i n g 叩 h一 _剐畦 州 拍 呻 椰 柏 硕士学位论文 衰 i8 周运动后差异表述量下调 5 倍的蛋白质点 t a b l e 3 - 1 t h e d 呻k 近b d o b w b o 踞d i a h 日i a le x p 麟i o n v o l u m e 5 f o 3 a f l e t 8 w e 吐s u 枷n m g s s p n a r ( k d a )p i v o l 啪e 1 8 9 54 30 6 852 15 8 1 7 7 0 7 85 4 459 47 2 2 0 9 1 3 9 7 1 55 47 3 2 1 6 37 7 1 1 7 7 5 6 9 6 2 1 4 81 3 8 4 7 87 t 51 25 2 0 0 3 4 4 石27 1 8 1 65 表达量 5 倍的点共有1 2 个，如表2 - 2 ，表3 - 1 。其中，上调的 点6 个，下调的点6 个。这些点的分子量在1 4 8 5 k d a 之间，更多 的集中在3 0 6 0 k d a ，而等电点在5 l o 范围内。整体来看，8 周运 动后发生显著变化的点集中于5 0 8 0 。 _ 一 囊j 裁蕾 ，尊 一k t - ， - 翻2 - 1 运动组与对照组蛋白质表达的差异图谱 f i g u r e 1t h ed i f f e r e n t i a l m a p s o f t h e p r o t e i ns p o t s w h o s e e x p r e s s i o nv o l u m eo n t h ee x e r c i s e g r o u pa n d t h ec o n t r o l g r o u p r a t s 说明：囝2 - 1 中有编号的点为差异表达量变化5 倍的蛋白质点。 8 周有氧运动对大鼠左心室肌蛋白质组差异表达的髟响 ：0#150 1 5 b “c “fcd fbe “f “cd f e “f r n 0 砑l2 i 2iq 舶3 - l8 周运动后差异表达量上调变化5 倍蛋白质点的柱状图 f 醣_ r d - 1t h eh i s t o g n u 砒o f t h e p r o t c l s p o t s 刊 o 睇m 雎氍n t i a le x p r e s s i o nv o l u m e w 5 f o l 血a f t e r 8 w c c k s 说明：柱状图的横坐标表示对照组和运动组的三张胶，缴坐标表示目标蛋白质点的表达 强度从图中可以看出运动后其表达量的变化情况。 图3 1 ( 上) 为8 周运动后差异表达量5 倍蛋白质点的柱状图。 表达量上调的点：2 2 2 2 号点( m r p l ：2 2 2 4 4 7 0 8 ) 在运动8 周后 上调5 2 倍：2 1 7 4 号点( m r p i ：3 0 7 3 7 7 0 3 ) 在运动8 周后上调 5 9 倍；1 8 7 4 号点( m r p i ：5 5 4 3 6 7 2 ) 在运动8 周后上调8 2 倍 2 2 7 4 号点( m r p h2 3 5 6 5 1 9 ) 在运动8 周后上调1 3 5 倍；2 2 0 7 号点( m r p i ：2 9 4 2 7 7 7 8 ) 在运动8 周后上调1 4 3 倍；1 9 1 4 号点 ( m r p i ：4 6 9 8 4 7 6 7 ) 在运动8 周后上调2 05 倍。 图3 - 1 ( 下) 为8 周运动后差异表达量5 倍蛋白质点的柱状图。 1 8 9 5 号点( m r p i ：4 3 0 6 8 5 2 1 ) 在运动8 周后下调5 8 倍；1 7 7 0 号点( m r p i ；7 8 5 4 4 5 9 4 1 ) 在运动8 周后下调7 2 倍；2 0 9 1 号点 ( m r p i ：3 9 7 1 5 5 4 ) 在运动8 周后下调7 3 倍；2 1 6 3 号点( m r p i 7 7 1 1 7 7 5 6 ) 在运动8 周后下调9 6 倍；2 1 4 8 号点( m r p i 一_ 帚 _ ：f 塥蔓# 毫 o 0 o o o o 三搏 三“ ，忙繁卜_一厂 硕士学位论文 1 3 8 4 7 8 7 1 5 ) 在运动8 周后下调1 2 5 倍；2 0 0 3 号点( m r p i ： 4 4 6 2 7 1 8 ) 在运动8 周后下调1 6 5 倍。 3 3 质谱鉴定结果 选择8 周运动后差异表达量在5 倍以上的8 个蛋白质点，用 m a l d i t o f t o f m s 对这些蛋白质斑点进行检测，获得的肽谱和肽 段氨基酸结果在n c b i 数据库检索，最终鉴定出7 个蛋白质和一个未 知蛋白( 表4 1 ) 。 。 鉴定的2 2 2 2 号点是谷胱甘肽过氧化物酶1 ( g l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e1 ，g s h 一1 ) ，分子量为2 2 2 4 4 k d a ，等电点为7 6 6 ，在运动 后上调5 2 倍。 1 8 9 5 号点为4 3k d a 的c a m p 依赖性蛋白激酶i 型a 调节亚基 ( c a m p - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s et y p ei - a l p h ar e g u l a t o r ys u b u n i t ，p k a i a ) ，下调了5 8 倍。 1 7 7 0 号点为线粒体细胞色素b c 1 联合体亚基( c y t o c h r o m eb e l c o m p l e xs u b u n i tr i e s k e ，m i t o c h o n d r i a l ) ，分子量为2 9 4 2 7 k d a ，等电 点9 0 4 ，运动后上调了。1 4 2 倍。 1 9 1 4 号点为p - 烯醇酶( b e t a e n o l a s e ，m s e ) ，分子量为4 6 9 8 4 ， 等电点为7 0 8 ，运动后上调了2 0 5 倍。 2 1 7 4 号点为电压依赖性阴离子选择通道蛋白1 ( v o l t a g e d e p e n d e n ta n i o n s e l e c t i v ec h a n n e lp r o t e i n1 ) ，分子量为 3 0 7 3 7 ，等电点为8 6 2 ，运动后上调了5 9 倍。 8 周有氧运动对大鼠左心室肌蛋白质组差异表达的影响 1 7 7 0 号点为线粒体内膜蛋白( i n n e r m e m b r a n ep r o t e i n ， m i t o c h o n d r i a l ) ，分子量为7 8 5 4 4 ，等电点为5 5 9 ，运动后下调了7 2 倍。 2 1 6 3 号点为第1 7r h og t p 酶绑定蛋白2 ( r h o p h i l i n ，r h og t p a s e b i n d i n gp r o t e i n2 ) ，分子量为7 7 11 7 ，等电点为6 5 2 ，在运动后表达 量下调了9 6 倍。 2 1 4 8 号点是一个分子量为1 3 8 k d a 的未知蛋白，在运动后表达 下调了1 2 1 倍。 表4 - 1部分差异表达蛋白质点质谱鉴定结果 t a b l e4 - 1i d e n t i f i c a t i o no fs o m ed i f f e r e n t i a le x p r e s s e dp r o t e i ns p o t sb ym s 注：“t ”表示上调，“j ，”表示下调。 硕士学位论文 图4 - 1 为2 2 2 2 号点( 谷胱甘肽过氧化物酶t ) 的一级和二级质谱 图，其中二级所取肽段峰值为1 9 5 7 9 5 3 圈4 4 2 2 2 2 号点的质请图( 上) 一级质谱田( 下) 二级质潜图 f i g o n 4 t a e m s 8 n d m s m s m a 胂0 f 2 2 2 2 p 眦hs p 眦( l ) m s ( r ) m s m s 3 4r t p c r 实验结果 8 周有氧运动对大鼠左心宣肌蛋白质组差异表达的影响 挑选质谱鉴定的两个蛋白质点c a m p 依赖性蛋白激酶i 型一调 节亚基和p 烯醇酶进行r t - p c r 实验，测得c a m p 依赖性蛋白激酶 i 型吨调节亚基和b _ 烯醇酶的m r n a 相对净光密度值如表5 - l 。 表5 - 1 目标蛋白m r q a 相对光密度值表 t i b l e5 - 1 t h e f a b l e o f t a r g c t p r o t e i n m r n a q 呻o p t i c a ld e n s i t yv a l u e n a _ m 对照组运动组 注：最水p 0 , 0 5 与对照组相比 对熙组c a v i i ，依赖性蛋白激酶i 型调节亚基m r n a 相对光 密度值为o 6 8 i - 0 1 8 0 7 1 。运动组c a m p 依赖性蛋白激酶i 型- 珏调节 亚基m r n a 相对光密度值为09 3 - 0 3 2 4 5 2 。运动组m r _ n a 相对光 密度值较对照组m r n a 相对光密度值有所上调；对照组b - 烯醇酶 m r n a 相对光密度值为2 2 5 ：t ：1 4 1 2 5 3 ，运动组b - 烯醇酶m r n a 相对 光密度值为1 7 6 0 9 8 4 7 1 ，运动组m r n a 相对光密度值较对照组 m r n a 相对光密度值有所上调。 圈争l 目标蛋白m r n a 相对光密度值柱状图 f i g u r e 5 - 1 t i m h i s t o g r a mo f t a r g e t p r o t e l n m k n a 0 1 ) p s i t e o p t i c a l d e m i t y v a l u e 说明：图5 - 1 为目标蛋白质点m r n a 相对光密度值柱状图，从图中可以看出目标蛋白 对照组与运动组删a 相对光密度值的表达情况 硕士学位论文 4 分析与讨论 中小强度的有氧运动是目前专家学者所提倡的运动健身强度， 在该强度运动下，能有效地提高心肺功能水平，增强体质健康。左 心室肌在心脏泵血的过程中，其射血路程最长，所受的负荷最大， 所产生的动能也最大。因此，对左心室肌的研究有着重要的实践和 理论意义。国内常芸等研究表明3 0 3 1 1 ，长时间的有氧运动能够使心 脏的形态和功能都发生改变。蛋白质作为生命活动的直接执行者、 生物体中最重要的组成成分和功能执行者，心脏形态和功能的改变 必然导致心脏蛋白质发生变化。导致蛋白质的降解、流失、交联、 变性等。通过对中小强度有氧运动条件下左心室肌蛋白质的表达数 量，表达水平以及它的修饰状态的研究，可以发现对中小强度有氧 运动敏感的特异性蛋白质，探寻在中小强度有氧运动中心脏功能的 变化，运动健身强度。 4 1 中小强度有氧运动对心脏形态学的影响 长期的有氧运动能够使心脏发生形态结构的改变，不同的运动项 目心脏所发生的适应性变化不同，一般耐力项目运动员心脏以心腔扩 大为主，心室厚度随着心腔内径的扩大而成比例的增大，心肌细胞体 积和肌纤维数量相对不变，为心脏扩大。力量项目运动员心脏以心壁 增厚为主，心容积和心腔内径并无明显变化，其室壁厚度与左室内径 比值增大，为心脏肥大【3 2 1 。 8 周有氧运动对大鼠左心室肌蛋白质组差异表达的影响 心脏重量是反映心脏肥大的重要指标，由于心脏绝对重量受到体 重的影响，所以一般采用心脏相对重量，即心脏重量指数作为判断心 脏肥大的指标。 本研究结果显示，大鼠经过8 周中小强度有氧运动后与相应对照 组相比，心脏重量增加了1 7 ，而心脏重量指数分别增加3 2 0 。 其中，心脏重量指数的增加具有统计学意义( p 0 0 5 ) ，差异显著。 这一研究结果也提示：长期中小强度有氧运动后心脏发生了适应性变 化，发生了心脏肥大，与常芸 3 3 1 王娟【1 8 】等的研究结果一致。实验结果 显示，心脏绝对重量增加的百分比为1 7 ，差异不显著，没有统计学 意义。原因可能是本实验采用的运动模型是中小强度的有氧耐力运动 模型，心脏在结构上的变化以心腔扩大为主，心肌肥大为辅，有别于 力量训练形成的运动心脏以心壁增厚为主的结构特点。 结果表明长期中小强度有氧运动后心脏产生了一定程度的肥 大，由此可以推测，肥大后的心肌收缩力增强，泵血功能也得到提高。 4 2 双向电泳图谱分析 在双向凝胶电泳图谱中发现，运动组的左心室肌蛋白质组与其对 照组相比，有部分蛋白质点的表达发生了显著变化。研究发现，8 周中小强度有氧运动后差异表达在两倍以上点蛋白质点有7 1 个，其 中运动后上调两倍以上的点有3 3 个；运动后下调两倍以上的点共有 3 8 个。差异表达5 倍以上的点共有1 2 个，其中表达两上调的有6 个， 表达两下调的有6 个。其分子量主要分布在3 0 - - - 8 0 k d a 的范围内，等 电点值主要集中在5 5 - 8 0 的范围。差异表达1 0 倍以上的点有5 个， 硕士学位论文 其中上调的3 个，下调的有2 个。 本研究并未发现有新增或缺失的蛋白质点，而史绍蓉、刘田、龚 丽的研究结果显示：持续大强度运动或力竭运动后，心房肌和心室肌 均出现多个多个“缺失的点，原因可能是运动强度过大，对心肌产生 损害。刘建荣、袁爱国、王娟 1 6 , 1 8 , 2 1 1 的实验显示：中等强度运动后左 心室肌和右心室肌未出现任何新增缺失的蛋白质点，只在右心室发现 一个缺失的点，而未发现新增的点。原因可能是训练负荷未引起心肌 强烈的应激。本实验未发现新增或缺失的点，可能是训练负荷相对较 小，并未引起心肌强烈的应激反应，这也从可以说明通过长时间中小 强度的有氧运动训练后，心脏产生的可能是良好的适应性改变，这一 改变对提高心肌收缩力，加强心脏的泵血功能具有非常重要的意义。 4 3 目标蛋白质的差异表达分析 本研究通过对8 周中小强度有氧运动后，运动组与对照组大鼠左 心室肌的2 - d e 图谱进行比较，发现运动后表达量上调5 倍以上的总 数为6 个，下调4 5 以上的点6 个。对其中8 个蛋白质点进行质谱鉴定， 共鉴定出7 个蛋白质：分别为c a m p 依赖性蛋白激酶i 型a 调节亚基， 谷胱甘肽过氧化物酶1 ；线粒体细胞色素b c l 联合体亚基，p 烯醇酶， 电压依赖性阴离子选择通道蛋白1 ，线粒体内膜蛋白，第1 7r h og t p 酶绑定蛋白2 以及一个分子量为13 8 4 7 8 k d a 的未知蛋白。 4 3 1 中小强度有氧运动对对心肌抗氧化相关酶的影响 在运动后鉴定的差异表达的蛋白质点中，2 2 2 2 号点为谷胱甘肽 过氧化物酶l ( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e1 , g s h 1 ) 。谷胱甘肽过氧化物 8 周有氧运动对大鼠左心室肌蛋白质组差异表达的影响 酶1 属于谷胱甘肽过氧化物酶的一种亚型。谷胱甘肽过氧化物酶是生 物体内一种重要的含硒酶，是由m i l l s 于1 9 5 7 年在牛红细胞中发现的 一种重要的保护性酶，它在红细胞中可使血红蛋白不受h 2 0 2 氧化分 解。 g s h 1 是第一个被发现的哺乳动物硒蛋白。也称为细胞谷胱甘肽 过氧化物酶，主要分布在组织细胞的细胞区、线粒体和红细胞中，是 该家族分布最广泛的酶，g s h 1 是一个水溶性四聚体酶，含2 0 1 个氨 基酸，三维空间结构显示其由4 个亚基组成，每个亚基各含1 个硒原 子，与第3 5 位的半胱氨酸结合1 3 4 。g s h 1 主要催化还原可溶性的氢 过氧化物( h 2 0 2 ) 和一些有机氢过氧化物，从而阻断活性氧自由基对 机体的进一步损伤。硒构成了g s h 1 的活性催化基团，因此硒对其 生物功能起着重要的调节作用。有研究表明硒摄入的缺乏可引起 g s h 1 基因表达和蛋白活性下降【3 5 】研究已证明：心脏对缺硒敏感性很 高，缺硒与克山病、动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病的发生发展 有明显的相关性【3 6 3 7 3 8 1 。 在医学领域，有研究发现g s h - p x 与肿瘤的抗药性有关，许多肿瘤 组织中发现有g s h - p x 的异常表达。s i n g h 等【3 9 】也观察到人膀胱癌组 织中的g s h - p x 活力高出正常组织约1 5 倍，并认为增高的g s h - p x 可能与其内在抗药性有关。单中杰t 4 0 等的研究也证明了这一点。 目前很多研究已证实，g s h 1 是大血管病变的发病风险的强相关 因子。f o r g i o n e 等f 4 1 1 对杂合的g p x - 1 缺陷小鼠的研究发现，小鼠冠 状动脉和大动脉的组织学发生改变：血管周动脉外膜纤维原细胞沉 硕士学位论文 淀，炎性细胞增加，内膜增厚，导致心脏和血管结构异常。有研究报 道，g s h 1 活性最高组和活性最低组的心脏血管事件发生率分剔为 7 o 和2 0 8 ，g s h 1 活性最高组患者的相对危险度为o 2 9 ，g s h 1 活性 增高和心脏血管事件风险呈负相关【4 2 】。 在运动医学领域，对g s h 1 的研究相对较少。张宜龙【4 3 1 发现少 年在功率自行车上运动3 0 m i n 后红细胞g s h p x 活性显著升高，这说 明长时间有氧运动能有效升高g s h p x 活性，增强机体清除自由基的 功能。史亚丽等m 认为在较短时间运动后机体g s h p x 活性高，而长 时间亚极量运动后，尤其是力竭性运动后机体内g s h p x 活性下降， 这可能是力竭运动对机体强烈的应激刺激导致自由基急剧增多，超出 g s h - p x 的清除能力所致。陈琳的研究发现，实施运动处方后安静状 态和实施最后一次运动处方后健身车组和踏台阶组血清g s h p x 活 性均比其相对照值显著升高【4 5 1 。 在本实验中，通过8 周中小强度的有氧运动，g s h 1 表达量上 调了5 2 倍，推测可能是长期有氧训练使机体心功能增强，提高了机 体的抗氧化能力，从而提高了心脏在运动条件下对活性氧自由基的清 除能力，有效防止运动过程中氧自由基对心脏的损伤，因此可以推测， 长期中小强度的有氧训练能够使机体的抗氧化系统得到加强。 4 3 2 中小强度运动对心肌能量代谢相关蛋白的影响 鉴定的1 9 1 4 号点为p 烯醇酶( b e t a - e n o l a s e ) 。p 烯醇酶属于烯 醇酶家族，烯醇酶是1 9 3 4 年l o h m a n 和m a v e r h o f 在研究肌肉提取物 中磷酸甘油酸向丙酮酸转换的过程中发现的。它既可催化糖酵解过程 8 周有氧运动对大鼠左心室肌蛋白质组差异表达的影响 中2 磷酸d 甘油酸( p g a ) 向磷酸烯醇式丙酮酸( p e p ) 的转化， 又可在糖原合成过程中，催化逆向反应，即作为磷酸丙酮酸水合酶， 使p e p 向p g a 转化1 4 6 。在脊椎动物中，烯醇酶存在三种同工酶= 扒 p 、俨刀。a - e n o l a s e 在许多组织均存在，f i - e n o l a s e 几乎仅见于肌肉组 织、7 - e n o l a s e 则主要存在于神经元和神经内分泌组织。0 t 、p 、1 , - e r m l a s e 分别由3 种不同的基因所编码，所有的e n o l a s e 的活性形式均为二聚 体，既由两个亚基组成，目前已知有5 种形式的组合，、p p 、w 、 a 艮a r t 8 1 。烯醇酶随着个体发育阶段的不同而表现不同组合形式，胚 胎时期以骶为主，成年后的心肌中a p 和郎逐渐增多，骨骼肌中以 p p 为主，脑组织中则主要为a t 和伊9 】。 ，由于p - e n o l a s e 仅存在于肌肉组织中，因此 ；- e n o l a s e 又称为肌肉 特异性烯醇酶( m u s c l e s p e c i f i ce n o l a s e ，m s e ) ，在正常情况下，血清 中的m s e 水平很低，然而在肌肉损伤时，随肌细胞坏死程度加重， m s e 水平明显升高【5 0 1 ，有研究显示，在肌病和急性心肌梗塞病人血 清中m s e 明显高于正常人，而其他疾病如肝病，冠心病和糖尿病 m s e 不升高，国外有文献报：i 彭5 1 】血清m s e 在肌营养不良和急性心肌 梗塞患者升高，国内金：i 苣t l t 5 2 1 等的研究也证明了这一结果，且推论检 测血清m s e 对诊断肌病和急性心肌梗塞是特异性的。同时的研究还 表明，血清m s e 水平没有年龄和性别差异。只有当一定量的肌细胞坏 死后，位于肌组织中的酶即释放出进入外周血中，因此，目前已经将 m s e 活力的升高作为诊断肌损伤和急性心肌梗塞的有力佐证。 硕士学位论文 本研究显示，在经过8 周中小强度的有氧运动后，大鼠左心室肌 中的m s e 表达量上调了2 0 5 倍。揭示在中小强度运动有氧运动过程 中有肌损伤现象的发生。推测中小强度的有氧运动也有可能会造成运 动性心肌损伤中小强度中肌肉的损伤机制是如何，有待进行进一步 的研究。 2 2 0 7 号点经质谱鉴定为线粒体细胞色素b c 1 联合体亚基，它由 2 7 4 个氨基酸构成。线粒体细胞色素b - c 1 联合体亚基位于线粒体内膜 上，构成泛醇细胞色素还原酶联合体，即细胞色素b - c l 联合体。细 胞色素b c l 联合体构成线粒体的呼吸链，它由1l 条肽链组成，以二 聚体的形式存在，每个单体包括两个细胞色素b 、1 个细胞色素c l 和 一个铁硫蛋白。细胞色素b c 1 联合体的作用是催化电子从辅酶q 传 给细胞色素c t 5 3 1 。 细胞色素b - c 1 联合体亚基作为线粒体呼吸链的重要组成成分， 参与呼吸链中电子传递过程。在本实验中，细胞色素b - e l 联合体亚 基的表达量上调了1 4 2 倍，说明线粒体呼吸链的电子传递过程得到 了加强，线粒体中a t p 的合成增加，线粒体对机体的能量供应充足。 我们可以推论，经过8 周中小强度的运动后，心脏能量代谢体系得到 了良好的增强。 4 3 3 中小强度有氧运动对心肌c a m p 依赖性蛋白激酶l 型一q 调节亚 基的影响 c a m p 依赖性蛋白激酶是一种由细胞内的第二信使c 舢帅激活的 一种蛋白激酶，全酶由四个亚基组成：两个催化亚基( c 亚基) ，两 8 周有氧运动对大鼠左心室肌蛋白质组差异表达的影响 个调节亚基( r 亚基) 。当外界信号作用于相应的受体后，引起体内 c a m p 浓度升高。c a m p 于r 亚基结合( 每个r 亚基上有两个c a m p 结合位点) ，同时释放出催化亚基c 亚基，c 亚基与底物结合使特定 蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸磷酸化而发挥作用【跚 本次实验后质谱鉴定的1 8 9 5 号点为c a m p 依赖性蛋白激酶i 型a 调节亚基( c a m p - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s et y p ei - a l p h ar e g u l a t o r y s u b u n i t ，p k ai a ) ，c a m p 依赖性蛋白激酶i 型吨调节亚基由3 8 1 个 氨基酸构成。质谱鉴定发现8 周中小强度的运动后p k ai a 的表达量 下调了2 4 亿9 。p k a i a 是一种二聚体蛋白，二聚体的两个原体通过两 个二硫化物相结合，存在于所有组织中，在细胞生长和分化中起重要 作用。有研究表明，p k a i i 主要在正常非增生组织和生长抑制的细胞 表达，而肿瘤细胞中p k a i 水平升高，p k a i 和它的调节亚基r i o t 在 人癌细胞系和原发性肿瘤中一般过表达，并且诱导癌基因如r a s 的转 化嘲研究显示酗，r i a - 和p k a i 的过表达于乳腺癌患者的不良预后有 关揭示p k ai a 的高表达和癌细胞的出现有密切关系。我们的研究发 现，长期的中小强度运动后p k ai a 表达量下调了5 8 倍。可能由于 系统中小强度的训练，阻断了癌基因的表达。 4 3 4 中小强度有氧运动对心肌电压依赖性阴离子选择通道蛋白1 和线粒体内膜蛋白的影响 本次质谱鉴定的2 1 7 4 号点为电压依赖性阴离子选择通道蛋白1 ( v o l t a g e d e p e n d e n ta n i o n - s e l e c t i v ec h a n n e lp r o t e i nl ，v d a c 硕士学位论文 ) ，v d a c 于1 9 7 5 年首次被发现，它是存在于线粒体外膜上的3 1 k d a 膜蛋白，能在线粒体外膜上形成亲水性电压门控通道，作为一种转运 阴离子、阳离子、a t p 以及其他代谢物进出线粒体的通道蛋白，它通 过与c a 2 + 、a t p 、谷氨酸、n a d h 以及不同蛋白质相互作用，调节着 线粒体外膜的通透性，从而控制着线粒体的功能，在维持线粒体及细 胞活性方面发挥重要功能f 5 7 1 。v d a c 在电压低子3 0 m v 的时候，分离 的v d a c 插入到脂质体后能形成直径4 r i m 的孔，电导系数较大，此 时的孔具有阴离子的选择性【5 8 1 。 1 7 7 0 号点经质谱鉴定为线粒体内膜蛋( i n n e rm e m b r a n e p r o t e i n , m i t o c h o n d r i a l ) ，也称为腺苷酸转运蛋白( a d e n i n en u c l e o t i d e t r a n s l o c a t o r , a n t ) ，a n t 位于线粒体的内膜，能介导a d p 和a t p 的交换，将a t p 转运到细胞质中。a n t 有三种形式：a n t l 、a n t 2 、 a n t 3 。它们分别是由不同的受调控的核基因所编码，其同源程度为 7 7 - - , 7 9 1 5 9 1 。a n t 在线粒体内、外膜的交接点处形成“非特异性孔 道 ，通过它的开放、关闭以及与一些凋亡调控因子的互动，参与组 织细胞凋亡的调控，它是蛋白与蛋白、蛋白与脂质相互作用网络中的 关键分子，是受b c l 和b a x 家族控制的凋亡开关，是多种凋亡调节因 子的靶点【6 0 6 1 1 。 线粒体渗透性转变孔( m i t o c h o n d r i ap e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n p o r e ，m p t p ) 是细胞在应激状态或受损后c a 2 + 浓度超过正常生理范围 时在线粒体膜上所形成的一种通道。目前普遍认为m p t p 主要由三种 蛋白共同组成：v d a c ，a n t 以及亲环素d ( c y c l o p h i l i nd ，c y p d ) 【6 2 】。 4 0 8 周有氧运动对大鼠左心室肌蛋白质组差异表达的影响 m p t p 使线粒体膜的通透性发生改变，造成线粒体膜电位降低、a t p 衰竭、氧化磷酸化去偶联、线粒体大幅度肿胀、外膜破裂、内外膜间 促凋亡因子的释放等，从而细胞发生凋亡或坏死【6 3 】。 v d a c 和a n t 作为线粒体内的两种重要蛋白质，在经过8 周中 小强度的有氧运动后，v d a c 的表达量上调了5 9 倍，而a n t 的表 达量则下调了7 2 倍蛋白对调节细胞代谢、维持细胞内钙稳态和调控 细胞死亡均发挥了重要作用。推测长时间的中小强度运动可能造成细 胞发生凋亡，这可能和运动训练中的持续时间和训练密度有关，具体 机制有待进一步实验进行确证。 4 3 5 中小强度有氧运动对心肌第17r h og t p 酶绑定蛋白2 的影响 2 1 6 3 号点经质谱鉴定为第1 7r h og t p 酶绑定蛋白2 ( r h o p h i l i n , r h og t p a s e b i n d i n gp r o t e i n2 ) ，分子量为7 7 11 7 k d a ，等电点为6 5 2 。 第1 7r h og t p 酶绑定蛋白2 属于r h og t p 酶家族。r h og t p 酶家族 是一类含有r h o 型g t p 酶结构域的酶，属于r a s 超家族的成员。r h o g t p 酶是重要的肌动蛋白( a c t i n ) 细胞骨架及脊椎动物细胞形态异质 性的调节器【删。 r h og t p 酶在真核细胞的许多基础性生命活动过程中都起关键 的作用。反应于细胞外信号r h og t p 酶作为分子开关诱导a c t i n 细胞 骨架组织的相应改变，以引发大量不同的生物反应包括：形态形成、 趋化性、细胞生长和运动以及细胞周期过程等。同时，r h og t p 酶对 于肿瘤的发生发展有重要作用，几乎在所有肿瘤细胞中细胞骨架都有 不同程度的改变【6 5 】。 硕士学位论文 在本次实验结果中，通过8 周中小强度有氧运动后，第1 7r h o g t p 酶绑定蛋白2 的表达量下调了9 6 倍，推测可能是长期的中小强度 有氧运动对细胞的生长造成了一定的影响，引发分子开关并诱导肌动 细胞骨架组织的相应改变。由此推测，长期的中小强度运动也可能使 心肌细胞发生损伤。具体机制有待进一步实验进行论证。 4 3 6 未知蛋白 本次质谱鉴定的2 1 4 8 号点为未知蛋白，等电点为5 3 9 ，分子量 为1 3 8 4 7 8k d a 。在本次实验中下调了1 2 1 倍。该蛋白的功能未知， 推测可能是对运动应激比较敏感的一类蛋白质，了解其结构和功能， 可能对补充中小强度的运动对运动健身的作用有着积极的意义。 4 4 目标蛋白r t - p c r 结果分析 从质谱鉴定的蛋白质中选取了两个蛋白进行m r n a 表达的分析， 结果显示这两个蛋白的的表达与蛋白表达水平均不一致，在8 周中小 强度有氧运动后，运动组p 烯醇酶表达量上调，而其m r n a 的表达 水平则出现下降。c a m p 依赖性蛋白激酶i 型a 调节亚基的蛋白水平 表达量下调，其m r n a 的表达水平则出现上调。 p 烯醇酶的m r n a 相对光密度值运动组与对照组相比略有下调， 但结果不具有统计学意义，说明p 烯醇酶的m r _ n a 表达运动组和对 照组是一致的。而p 烯醇酶的m r n a 表达水平和其蛋白表达水平不 相一致，说明8 周中小强度有氧运动后，影响p 烯醇酶蛋白水平表达 的因素并不是在基因的转录与翻译过程中发生变化，推测可能是在蛋 白的合成过程发生了某些变化。c a m p 依赖性蛋白激酶i 型a 调节亚 8 周有氧运动对大鼠左心室肌蛋白质组差异表达的影响 基m r n a 相对光密度值运动组与对照组相比上调，结果具有统计学 意义。c a m p 依赖性蛋白激酶i 型吨调节亚基的m r n a 表达水平和 其蛋白水平表达相反。推测影响蛋白表达水平改变是发生在其基因的 转录与翻译过程中。 基因与蛋白质之间并不存在一一对应的线性关系，m r n a 水平与 蛋白水平也不一定呈正相关。这是因为在蛋白质合成过程当中存在许 多的调节因素如转录水平的调控、翻译水平的调控，以及刚合成的多 肽链多数是没有功能的，需要通过信号肽的切除、二硫键的形成、氨 基酸测链的修饰、多肽链的折叠等一系列的加工后才能成为有生物功 能的蛋白质。 硕士学位论文 5 结论 5 1 经过长时间有氧运动后，大鼠左心室肌蛋白质组发生了明显变 化。 5 2 质谱鉴定目标蛋白质点的变化表明，采用中小强度有氧运动可 使心肌能量代谢水平提高、心肌抗氧化能力增强，运动大鼠心脏出现 良好的适应性变化。 5 3 采用长期的中小强度有氧运动，也有可能造成运动性心肌损伤。 5 4 目标蛋白质的基因表达水平与蛋白质表达水平不完全一致，表明 运动对蛋白质的表达可能与上游基因有关也可能是与下游的翻译， 修饰有关。 8 周有氧运动对大鼠左心室肌蛋白质组差异表达的影响 参考文献 1 3 卢义锦，姚士硕人体解剖学 m 高等教育出版社，2 0 0 1 ，4 ( 1 ) ：2 5 6 2 5 7 2 孟秋云，李效良，张福业高血压病患者血压晨峰现象与左心室肥厚的想关性研究 j 中华临床医师杂志( 电子版) ，2 0 0 8 ，1 1 ( 2 ) 1 - 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p r o t e c t i v ee f f e c t so fe x e r c i s e j m e ds c is p o r t se x e ，2 0 0 3 ，3 5 ( 5 ) ： 3 6 7 11 m c m u l l e nj r ，r e n n i n g sg l d i f f e r e n c e sb e t w e e np a t h o l o g i c a la n dp h y s i c a lc a r d i a c h y p e r t r o p h y ：n o v e lt h e r a p e u t i cs t r a g i e st ot r e a th e a r tf a i l u r e j c l i ne x p p h a r m a c o lp h y s i 0 1 2 0 0 7 ，3 4 ( 4 ) ：2 5 5 6 2 1 2 张松江，史绍蓉急性大强度力竭运动大鼠骨骼肌比较蛋白质组学研究 j 体育科学， 2 0 0 6 ，5 1 3 张松江，史绍蓉急性力竭运动后大鼠骨骼肌蛋白质组差异性表达的研究 j 中国运动医 学杂志，2 0 0 6 ，2 4 ( 5 ) 1 4 史绍蓉，刘田，龚丽等一次性力竭运动对大鼠心房肌蛋白质组表达的影响 j 中国运 动医学杂志，2 0 0 9 ，2 8 ( 4 ) ：3 9 1 3 9 4 1 5 龚丽，史绍蓉递增负荷运动对大鼠心房肌蛋白质组影响的研究 j 中国康复医学杂志， 2 0 0 8 ，2 3 ( 2 ) ：1 0 7 1 0 9 ，1 1 3 1 6 刘建荣运动心脏重塑过程中大鼠心房肌的比较蛋白质组学研究湖南师范大学硕士学 位论文，2 0 0 8 ，6 1 7 史绍蓉，袁爱国，王娟等中等强度运动对大鼠心室肌蛋白质组差异表达的影响 j 体 育科学，2 0 0 8 1 8 王娟中等强度有氧运动对大鼠右心室肌蛋白质组差异性表达的影响湖南师范大学硕 硕士学位论文 学位论文，2 0 0 9 ，6 1 9 史绍蓉，刘田，龚丽等一次力竭运动后大鼠心室肌蛋白质的差异表达 j 中国运动医 学杂志，2 0 0 8 ，2 7 ( 2 ) ；1 4 4 1 4 8 2 0 3 刘田，史绍蓉，龚丽等长期递增负荷训练后大鼠心室肌蛋白质组的差异性表达 j 中国运动医学杂志，2 0 0 8 ，2 7 ( 6 ) ：6 9 7 - 7 0 1 2 1 袁爱国运动心脏重塑过程中大鼠左室肌蛋白质组差异表达的影响湖南师范大学硕 士学位论文，2 0 0 8 ，6 2 2 y a 0 - y u a nh s i e h e f f e c to fe x e r c i s et r a i n i n go nc a l p a i ns y s t e m si nl e a na n do b e s e z u c k e rr a t s j i n tjb i o ls c i 2 0 0 8 ：4 ( 5 ) ：3 0 0 3 0 8 2 3 b e d f o r dy 0 ，t i p t o nc 虬w i l s o nn c ，e ta 1 m a x i m u mo x y g e nc o n s u m p t i o no fr a t s a n di t sc h a n g e sw i t hv a r i o u se x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e s j t h ea m e r i c a n p h y s i 0 1 0 9 i c a ls o c i a t y 1 9 7 9 ，1 2 7 7 - 1 2 8 3 2 4 b r a d f o r d ，m m ar a p i dq u a n t i t i e so fp r o t e i na n ds e n s i t i v eu t i l i z i n gt h em e t h o d 2 5 3 2 6 2 7 2 8 f o rp r i n c i