（生物物理学专业论文）机械应力对人红细胞膜上物质跨膜转运的调控.pdf

复1 i t 大掌博- a - 论文 摘要 7 。婚内的细胞承受着各种形式的机械应力，包括流体流动产生的 、 _ _ - 。- 。一 切向剪切应力，压力产生的正应力，以及其他的机械刺激，比如邻 近细胞，胞外介质，内部细胞骨架的弹性等引起的伸张应力各种 类型的细胞，比如内皮细胞，心肌细胞，成纤维细胞，成骨细胞等 都能对机械应力产生响应所有这些都表明机械应力同温度、p h 、 化学等因素一样，是一种重要的影响细胞结构和功能的外界信息 心血管系统是一个复杂的分支网络，产生压力梯度运输血液到人体 各部分它会对机械压力产生响应以完成其生理功能在一定范围 内机械应力对其各种成分的修饰是一种生理适应，但如果过度则成 为病变一个例子就是心血管中局部血流的变化引起机械应力的波 动而改变血管壁的组成导致动脉粥样硬化或是心肌肥大了解机械 应力和心血管系统，特别是红细胞的相互关系对于阐明其生理、病 理功能的分子基础是非常重要的 已有报导伴刀豆球蛋白诱导不同类型的红细胞凝集，生理条件 下剪切应力能增加红细胞c a 2 + 的通透性剪切诱导的正常和镰刀形 贫血症红细胞的形变伴随有单价和二价阳离子通透的增加同样， 也观察到红细胞中体积敏感的离子运输红细胞结构简单，是研究 生命过程基本规律的理想材料红细胞膜，作为最经典的模型体系， 已经了解得比较清楚，大量最初从红细胞膜研究中揭示的秘密现已 不断被证明具有普遍的生物学意义细胞膜是细胞与外界交换物质、 能量和信息的界面，近年来大量的研究报道中就有很多是关于机械 应力对生物膜的影响机械应力对细胞膜的结构、物质通透性以及 一些与膜相连的酶的活性均可产生显著的影响但是，机械性信息 影响膜对物质通透的具体机制一直未得到阐明爿我们以红细胞膜上 u _ 。一 的葡萄糖运输蛋白( g l u t l ) 和阴离子交换蛋白( b a n d 3 ) 为研究 p _ _ 一一，、一 对象，从结构和功能上研究机械应力( 旋转流体，渗透压，药物诱 导的细胞形变等) 对它们的影响 蔓丘大掌博士论文 ig l u t l 是一个5 5k d a 的介导葡萄糖跨膜运输的整合膜蛋白，它 拥有1 2 个跨膜片段b a n d3 也是整合膜蛋白，它参与红细胞c l 和 h c o ，的交换以及c 0 2 的清除b a n d3 包括两个部分：5 2 - k d a 的羧 基段包埋在膜内拥有阴离子交换位点；4 3 k d a 的氨基段拥有细胞骨 架，血红蛋白和糖酵解酶的结合位点我们发现g l u t l 和b a n d3 的结构与功能会对机械应力产生响应并且对其结构基础进行了研 究我们支持膜上g l u t l 和b a n d3 靠的很近并能相互传递信息的 假说。 机械应力( 转速) 的提高伴随葡萄糖输入速率v 。的增加和输出 速率v 的降低，同时输出的半饱和常数k 。也降低，意味着亲和 能力的提高上述结果表明，红细胞膜的一个重要功能一葡萄糖 跨膜运输会对外界机械应力产生应答响应，这种响应有着重要的生 理学意义：在机械应力大的部位，红细胞变形剧烈，必需大量的葡 萄糖，因而红细胞表现为大量输入葡萄糖而尽量减少葡萄糖的输出， 这也和其它的文献报导相一致：a t p 能够调节人红细胞的糖运输 水分子顺渗透压梯度通过细胞膜导致细胞体积的变化，但哺乳动 物细胞内外渗透压得到很好的调控一个明显的例外是肾髓质细胞， 这些细胞的胞外渗透压可能超过1 ，5 0 0m o s m 许多证据表明渗透压 也是一种普遍的刺激因子在通过高渗的肾髓质以及通过肺部和外 周毛细血管进行h c o ，一运输，气体交换的过程中，红细胞的体积调节 机制对其体积的调节显得尤为重要红细胞渗透膨胀和收缩产生不 同的膜张力，这些张力作用于g l u t l 和b a n d 3 本身，或是膜脂质， 或是和g l u t l ，b a n d 3 相互作用的膜蛋白，使其对渗透压产生响应 和旋转流体的作用一样，我们的结果表明渗透压能调节g l u t l 的结 构和功能v 和k 。都随着渗透压的提高而增加 已有报导剪切应力作用于红细胞( 正常或镰刀形贫血症) 导致单 价和二价阳离子通透性的增加另一方面，剪切应力并不影响红细 胞的阴离子交换在我们的实验中，不管是修饰膜骨架，改变离子 强度，还是改变红细胞的代谢和年龄状况，b a n d3 都不对旋转应力 产生响应但有趣的是b a n d3 介导的n o r 的交换速率k 。随着渗透 复旦大掌博士论文 压的提高而增加对细胞的控制在于力的平衡剪切应力和渗透压 是两种类型的机械力，它们的作用方式有所不同在膜上剪切力是 切向的而渗透力是垂直的显然膜蛋白对两者的响应是有区别的， 这也就是为什么b a n d3 只对渗透压而不对剪切应力产生应答的原 因已有报导b a n d3 构象的变化参与介导人红细胞的形变引起阳 离子通透提高的影响因子是膜张力而不是膜的变形性膨胀激活的 k c i 共转运体主要由细胞体积而不是细胞形状决定，等等看起来 足够的膜张力是膜蛋白响应机械应力的弘需条件b a n d3 的一个结 构特征就是它和很多膜蛋白比如膜骨架，糖蛋白，糖酵解酶系等相 互作用，结合旋转流体不能诱导任何阴离子运输变化的事实，显示 b a n d3 对机械应力的响应与g l u t l 不同 蛋白质的内源色氨酸荧光对局部微环境的变化极其敏感，因而 可以作为一种研究蛋白质局部构象及其动力学分析的探针已有报 导通过配体淬灭g l u t l 的内源荧光来研究其蛋白质动力学荧光淬 灭的稀释、内过滤，重吸收等效应已经使用乙酰色氨校正实验中 将加淬灭剂前后荧光强度的变化差值( a f ) 作为参数进行分析，因为 荧光的淬灭来自于g l u t l 的专一底物葡萄糖以及b a n d3 的特异性 抑制剂d i d s ，这样可排除膜上其它蛋白质色氨酸残基对内源性荧光 的贡献，也可以排除荧光强度测定中血影膜散射的影响血影膜已 去除骨架蛋白等膜外周蛋白，荧光的变化代表机械应力对g l u t l 和 b a n d3 的直接作用解离常数，k 。的降低意味着葡萄糖和g l u t l 以及d i d s 和b a n d3 结合能力的提高表明机械应力可能改变了 g l u t l 和b a n d3 的构象及色氨酸残基的微环境随着转速的提高， 葡萄糖和g l u t l 亲和能力加强，这也和葡萄糖输出k 。的变化相一 致随着渗透压的增加，k 。也表现出同样的变化趋势，表明渗透压 和转速一样可以改变g l u t l 的枸象火 根据膜双层偶联假说，两亲药物作用于红细胞膜导致膜张力、膜 曲率的变化，这为模拟机械应力的作用提供了一种新的途径【氯丙 嗪可以插入膜内侧引起膜向内弯曲成杯状已经知道氯丙嗪可以引 起红细胞的形变，不过还没有证据表明化学诱导的膜曲率的改变能 复旦大掌博士论文 激活阳离子的通透我们的结果显示氯丙嗪浓度的增加引起葡萄糖 输入的提高以及n o2 - - 通透的降低表明人红细胞膜上g l u t l 和b a n d 3 的转运特征敏感于氯丙嗪诱导的膜张力的改变并且不同于阳离子转 运在我们的实验条件下未发现氯丙嗪影响红细胞膜的流动性因 而可以排除膜脂流动性参与g l u t l 和b a n d3 对机械应力的响应 对转运体系温度依赖性的研究可以为我们提供有关结构重排的 信息实验表明红细胞膜葡萄糖跨膜运输和阴离子结合的a r r e h n i u s 活化能响应于机械应力它们的活化能都随着渗透压的提高或转速 的增加而降低并且可以发现机械应力诱导的葡萄糖运输活化能的 降低伴随葡萄糖运输和阴离子交换速率的提高这个结果是很容易 理解的降低活化能意味着膜上转运蛋白重排的热力学能障的降低， 从而使底物更易于转运这些结果揭示转运体系敏感于体外应力波 动的微小变化活化能和重排联系在一起，它们和机械应力之间的 关系表明转运体在不同构象状态问处于一种振荡平衡状态以随时应 付各种生理条件下不同方向的葡萄糖和阴离子的运输 有关报导认为膜上g l u t l 和b a n d3 组成一个大的复合体并介导 各种生理功能我们的实验结果支持这样的结论：红细胞膜上g l u t l 和b a n d3 紧密接触并且能够互相传递构象的变化信息升我们用阴离 u 子交换的特异性抑制剂，d i d s 作为探针研究g l u t l 和b a n d3 的相 互作用d i d s 的作用降低了葡萄糖输入速率v 。对机械应力的响应， 表明d i d s 作用后b a n d3 的变化能够通过某种途径传递到g l u t l ， 并改变了g l u t l 对机械应力的响应f 同时根据荧光淬灭的结果，d i d s 可以影响葡萄糖和g l u t l 的结合，庆之亦然，葡萄糖作用后也能影 响d i d s 和b a n d3 的结合再次证明红细胞膜上g l u t l 和b a n d3 的相互作用c o n a ，是凝集素的一种，它和b a n d3 上的糖链特异性 结合c o n a 的作用改变了d i d s 通过b a n d3 对g l u t l 响应机械应 力的模式实验中c o n a 的结合并未影响d i d s 对b a n d3 阴离子交 换的抑制作用，看来机械信号能够从b a n d3 传导到g l u t l ，而且糖 链可能参与这个过程 另一方面，我们也研究了细胞骨架在机械响应中的作用结果表 i v 复旦大掌博士论文 明c e ，一种和膜骨架特异性结合的药物并不影响g l u t l 和b a n d3 对各种机械应力( 旋转流体，渗透压，氯丙嗪诱导的形变) 的响应 而且在有关血影膜的实验中，都已经去除了形变骨架，但仍然观察 到机械应力的影响这些表明红细胞膜骨架可能在机械信号从b a n d3 到g l u t l 的传递中起的作用并不大 人红细胞膜物质通透性对不同机械应力刺激的响应是其对血管 系统中复杂的力学环境的生理适应，这种响应是通过多种途径而产 生的不同类型的机械应力( 旋转流体，渗透压，氯丙嗪诱导的形 变) 对红细胞膜葡萄糖运输和阴离子交换的影响是不同的葡萄糖 运输对这些应力都能产生响应，而阴离子交换则不受旋转流体应力 的影响表明不同的物质运输对外界物理刺激都有着独特的响应途 径和模式孰械应力可以直接作用于g l u t l 和b a n d3 本身引起其 i 结构的变讹，表现在功能上红细胞通过改变其物质通透性以响应这 些机械应力作为红细胞膜上最重要的两种蛋白质，g l u t l 和 b a n d 3 ，它们能够靠得很近以组成复合体，接收细胞信号并可以在彼 此间进行转递，以调节彼此的结构和功能，适应其循环过程中复杂 的机械应力 v 复旦大掌博士论文 a b s t r a c t c e l l si nb o d ya r es u b j e c t e dt ov a r i o u sf o r m so fm e c h a n i c a lf o r c e s ，i n c l u d i n gt h e t a n g e n t i a ls h e a rs t r e s st h a ti sd u et of l u i df l o wa n dt h ev o l u m es t r e s st h a ti sd u et o o s m o t i cp r e s s u r e ，a n dt oo t h e rm e c h a n i c a ls t i m u l is u c ha st e n s i l es t r e s se x e r t e db y n e i g h b o r i n gc e l l s ，t h em o r p h o l o g i cs t r e s sb yd r u g ，a n dt h ei n t e r n a lt e n s i o no ft h e c y t o s k e l e t o n i ti sw e l lk n o w n t h a tt h ec a r d i o v a s c u l a rs y s t e mg e n e r a t e sa n a p p r o p r i a t e p r e s s u r eg r a d i e n t f o rt h e d e l i v e r y o fb l o o df l o wt os e r v em e t a b l o l i ca n do t h e r f u n c t i o n a ln e e d so ft i s s u e t h er h e o l o g i c a lf u n c t i o n so ft h es y s t e mr e s u l tf r o mt h e c o o r d i n a t e da c t i v i t i e so fi t s c o m p o n e n tc e l l s ，e s p e c i a l l yt h ee r y t h r o c y t e s t h e s e a d a p t i v ec h a n g e s ，w h e na p p r o p r i a t e ，a r eb e n e f i c i a lf o rt h eb o d yt oc o p ew i t ha l t e r e d h e m o d y n a m i cd e m a n d s ，b u tt h e ym a y b ei n a p p r o p r i a t ea n dd e t r i m e n t a lu n d e rs o m e d i s e a s es t a t e s e x a m p l e so f p a t h o l o g i c a ld e f e c t sr e s u l t i n gf r o mm e c h a n i c a ls t r e s s e s a r ea t h e r o s c l e r o s i sa n dc a r d i a ch y p e r t r o p h yc o n s e q u e n tt op r e s s u r eo v e r l o a da n dt h e a l t e r a t i o n si nv a s c u l a rw a l lg e o m e t r ya n d c o m p o s i t i o n t h a ta r ei n d u c e db yc h a n g e si n l o c a lf l o wc o n d t i o n s e l u c i d a t i o no ft h ei n t e r p l a yb e t w e e n r h e o l o g i e a la n dm o l e c u l a r e v e n t si se s s e n t i a lf o rt h e u n d e r s t a n d i n g o ft h em o l e c u l a rb a s e so ff u n c t i o n a l a d a p t a t i o n sa n dp a t h o l o g i c a lf u n c t i o n so f t h ec a r d i o v a s c u l a rs y s t e m i th a sb e e nr e p o r t e dt h a ts h e a ri n d u c e dd i f f e r e n to ft h ea g g l u t i n a t i o no fh u m a n e r y t h r o c y t e sb yc o n c a n a v a l i n 气a n dp h y s i o l o g i c a ls h e a rs t r e s s e se n h a n c et h ec a 2 + p e r m e a b i l i t y o fh u m a ne r y t h r o c y t e s h e a l t ho rs i c k l ec e l la n e m i a e r y t h r o c y t e s d e f o r m e d b y s h e a r r e s p o n d m o n o v a l e n ta n dd i v a l e n tc a t i o n sw i t hi n c r e a s e d p e r m e a b i l i t y s i m i l a r l y , v o l u m e s e n s i t i v ee r y t h r o c y t ei o nt r a n s p o r tw a s a l s oo b s e r v e d b e c a u s eo ft h es i m p l i c i t yo ft h es t r u c t u r eo ft h ee r y t h r o c y t e ，t h i sp h y s i c a l l yi n d u c e d r e s p o n s ei sp a r t i c u l a r l ya m e n a b l et od e t a i ls t u d y , a n dm a ya f f o r di n s i g h ti n t o t h e r e s p o n s e so f m o r ec o m p l e xm a m m a l i a nc e l l so u rr e s e a r c h e sf o c u so nt h ee f f e c to f m e c h a n i c a l f o r c e s ，i n c l u d i n g r o t a t e df l o w , o s m o t i cs t r e s s ，a n d d r u g - i n d u c e d c e l l d e f o r m a t i o n ，o n t h e p r o p e r t i e s o f e r y t h r o c y t e m e m b r a n e t r a n s p o r t e r s ，g l u c o s e t r a n s p o r t e rp r o t e i n ( g l u t l ) ，a n i o n se x c h a n g ep r o t e i n ( b a n d3 ) v i 复且大掌博士论文 g l u t li sa5 5k d ai n t e g r a lm e m b r a n eg l y c o p r o t e i nt h a tf a c i l i t a t e st h ep a s s i v e d i f f u s i o no f d g l u c o s ea c r o s st h ec e l lm e m b r a n ea n dc o n t a i n s1 2m e m b r a n e - s p a n n i n g h e l i c e s b a n d3 ，i sa9 5 k d ai n t e g r a l - m e m b r a n eg l y c o p r o t e i na n de x c h a n g e sc i f o r h c 0 3 a sp a r to f t h ep r o c e s so fc 0 2e l i m i n a t i o n t h ep r o t e i nc o m p r i s e st w od o m a i n s ： t h e5 2 k d a c a r b o x y l t e r m i n a ld o m a i n e m b e d d e di nt h em e m b r a n ew h i c hc o n t a i n st h e a n i o n - t r a n s p o r t i n gs i t e ，a n dt h e4 3 - k d aa m i n o t e r m i n a ld o m a i nc o n t a i n st h eb i n d i n g s i t e sf o rt h ec y t o s k e l c t a lp r o t e i n s ，h e m o g l o b i n , a n dg l y c o l y t i ce n z y m e si nt h i sr e p o r t ， w ef o u n dt h a tt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fg l u t la n db a n d3 r e s p o n d e d t o m e c h a n i c a lf o r c e t h es t r u c t u r eb a s i sw a si n v e s t i g a t e d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n g l u t la n db a n d3r e s p o n dt om e c h a n i c a ls i g n a la l s os u p p o r t st h ep r e s u m p t i o nt h a t g l u t la n db a n d3i ne r y t h r o c y t e sa r ei nc l o s ee n o u g hc o n t a c tt h a ti n f o r m a t i o nc a n b et r a n s m i t t e df r o me a c ho t h e n i n c r e a s i n gt h em e c h a n i c a ls t r e s s ( r o t a t i o ns p e e d ，) r e s u l t e di na ni m m e d i a t e e n h a n c e m e n to f v o ( i n i t i a lv e l o c r yo f g l u c o s et r a n s - z e r oe n t r y ) b u ta no p p o s i t et r e n d f o r 、，m “( m a x i m a lv e l o c i t yo fg l u c o s ei n f i n i t e c i se x i t ) t h i sm a yp l a ya ni m p o r t a n t r o l ef o re r y t h r o c y t e si nt h eh i g hm e c h a n i c a lf o r c ec o n d i t i o nn e e dm o r ea t pt om a k e b i gc e l ld e f o r m a t i o n , w h i c hc a nb es a t i s f i e db y i n c r e a s eo f g l u c o s ei n f i u xt oa d v a n c e t h ee n e r g yl e v e li n s i d et h ec e l l s t h i si sa l s oc o n s i s t e n tw i t hp r e v i o u sr e p o r t ：a t p r e g u l a t i o no f s u g a rt r a n s p o r ti nh u m a ne r y t h r o c y t e a sac o n s e q u e n c eo f t h ec e l lm e m b r a n ep e r m e a b i l i t yf o rw a t e rm o l e c u l a r , w h i c h f o l l o w h y d r o s t a t i ca n d o s m o t i c p r e s s u r eg r a d i e n t s ，m a m m a l i a n c e l lv o l u m ec o n s t a n c y i s c h a l l e n g e db ya n ya l t e r a t i o n i ni n t r a c e l l u l a ra n d o re x t r a c e l l u l a ro s m o l a r i t y a n o t a b l ee x a m p l ei st h ek i d n e ym e d u l l a , w h e r ee x t r a c e l l u l a ro s m o l a r i t ym a yr a n g e f r o mi s o t o n i c i t yt om o r et h a n1 , 5 0 0m o s md u r i n gw a t e rd e p r i v a t i o n a n dm a n y e v i d e n c e ss h o wo s m o t i cs t r e s si sa u b i q u i t o u ss t i m u l u s e r y t h r o c y t e s o s m o t i c r e g u l a t o r y m e c h a n i s m sa r e s p e c i f i c a l l yi m p o r t a n t i n l i m i t i n g a l t e r a t i o n so fc e l l v o l u m e d u r i n g t h e i rp a s s a g et h r o u g ht h eh y p e r t o n i ck i d n e ym e d u l l aa n dd u r i n gh c o s 。 t r a n s p o r ti nt h el u n ga n d t h ep e r i p h e r y e r y t h r o c y t e ss w e l l i n ga n ds h r i n k i n gr e s u l t e d i nv a r i o u sm e m b r a n et e n s i o n s t e n s i o na c t e do ng l u t lo rb a n d3t h e m s e l v e s ，o r m e m b r a n el i p i d so rm e m b r a n ep r o t e i n s t h a ti n t e r a c t e dw i t ht h e m ，m a d et h e m j r 且大掌博士论文 r e s p o n d e d t oo s m o t i cs t r e s s 。t h e a n d a f f i n i t yc o n s t a n tf 劭o f g l u c o s e i n f i n i t e - c i s e x i tu n d e ras e r i e so f o s m o l a l i t i e sw e r ed e t e r m i n e d b o t ho f t h e mw e r ei n c r e a s e dw i t h t h ee n h a n c e m e n tt oo s m o t i cs t r e s sf r o m2 4 0m e s mt o4 8 0m o s m w ea l s o i n v e s t i g a t e dt h ee f f e c to f m e c h a n i c a lf o r c eo nt h er a t ec o n s t a n to f n 0 2 p e r m e a b i l i t y ( k ) i ns p i t eo fm o d i f y i n gm e m b r a n es k e l e t o n s ，c h a n g i n gi o nc o n c e n t r a t i o n ，a l t e r i n g m e t a b o l i s ma n da g i n gc o n d i t i o n ，a n i o ne x c h a n g ed i dn o tc h a n g et or a t a t i o ns p e e di n o u r e x p e r i m e n t b u t i tw a s v e r yi n t e r e s t i n gt h a tk w a s r e s p o n d e d t ot h eo s m o t i c s t r e s s ， i e ，i t w a si n c r e a s e dw i t ht h ee n h a n c e m e n to fo s m o l a l i t y , t h o u g hm a n yp a p e r s r e p o r t e dt h a ta n i o nt r a n s p o r tw a s n o te f f e c t e db ys h e a rs t r e s s c e l l u l a rc o n t r o ll i e si nt h eb a l a n c eo ff o r c e ss h e a rs t r e s sa n do s m o t i cs t r e s sa r e t w ok i n d so fm e c h a n i c a lf o r c ea n dd i f f e r e n ti na c t i n gp a t t e r n t h ef o r c eo ff o r m e ri s t a n g e n t i a lt o t h em e m b r a n ea n dt h a to fl a t t e ri sv e r t i c a l i ti so b v i o u st h a tr e s p o n s e so f p r o t e i n st ot h e ma r ev a r i o u s ，t h e r e f o r eb a n d3a n s w e r st oo s m o t i cs t r e s sb u tn o tt o s h e a rs t r e s sb a n d3i n t e r a c t sw i t hs om u c hp r o t e i n ss u c ha sm e m b r a n es k e l e t o n s ， g l y c o p h o r i n ，g l y c o l y t i ce n z y m e ，e t c ，a n dp l a y sak e y r o l ei nc i r c u l a t i o n r e p o r t e dt h a t t h ee f f e c t o rf o ri n c r e a s e dc a t i o np e r m e a b i l i t yi sm e m b r a n et e n s i o nr a t h e rt h a nt h e m e m b r a n ed e f o r m a t i o n ，a n ds w e l l - a c t i v a t e dk c ic o t r a n s p o r ti sd e t e r m i n e db yc e l l v o l u m er a t h e rt h a nc e l l s h a p e i ts e e m st h a tt h ee n o u g hm e m b r a n et e n s i o ni s t h e c o n d i t i o nr e q u i r e dr e s p o n d i n gt om e c h a n i c a lf o r c e c o n t r a s tw i t hg l u t l ，t h ef a i l u r e t oi n d u c ea n ya b n o r m a la n i o nf l u xa sar e s u l to fr o t a t e ds t r e s s ta p p e a r e dt h a tt h e r e s p o n s eo f b a n d 3t om e c h a n i c a lf o r c ew o u l db en o ta ss i m p l ea st h a to f g l u t l t h ei n t r i n s i cp r o t e i nf l u o r e s c e n c ed u et oi t se n d o g e n o u st r y p t o p h a n ( s ) i sk n o w nt o b es e n s i t i v et ol o c a lm i c r o e n v i r o n m e n t sa n dh a ss e r v e da su s e f u lp r o b ei ns t u d y i n g p r o t e i nt e r t i a r ys t r u c t u r ea n di t sd y n a m i c s b e c a u s e t h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gc a m e f r o m b i n d i n go f g l u t lo rb a n d3w i t ht h e i rs p e c i f i cs u b s t r a t e s ( g l u c o s eo rd i d s ) ， s ow ec o u l de x c l u d et h ec o n t r i b u t i o no ft h et r y p t o p h a nr e s i d u e so fo t h e rm e m b r a n e p r o t e i n sf r o mt h ev a l u eo f f l u o r e s c e n c ec h a n g e ( a f f ) t h em e m b r a n es k e l e t o n s w e r e s t r i p p e d i n e x p e r i m e n t s a n dt h e c h a n g e s o fd i s s o c i a t i o nc o n s t a n t ( k 9 r e p r e s e n t e d t h ed i r e c ta c t i n go f m e c h a n i c a lf o r c eo ng l u t lo rb a n d3 t h ed e c r e a s e o fk dm e a n st h ei n c r e a s eo ft h ea b i l i t yo fg l u c o s eb i n d i n gw i t hg l u t lo rd i d s 复旦大掌博士论文 b i n d i n gw i t hb a n d3 ，a n dt h i sa l s oa c c o r d e dw i t ht h er e s u l tt h a t m e c h a n i c a lf o r c e m i g h te x c i t et h e i n f l u xo f g l u c o s eo re x c h a n g eo f n 0 3 i ni n t a c te r y t h r o c y t e s aw i l dr a n g e o f a m p h i p a t h i cd r u g s c a r lc h a n g em e m b r a n et e n s i o na n dc u r v a t u r ei n t h e e r y t h r o c y t e sa c c o r d i n g t ot h e b i l a y e r - c o u p l eh y p o t h e s i s c h l o r p r o m a z i n e m o l e c u l e sp r e f e r e n t i a l l yp a r t i t i o ni n t ot h ei n n e rl e a f l e to ft h ep h o s p h o l i p i db i l a y e rt o b e n dt h ee r y t h r o c y t e si n w a r da n df o r mc u ps h a p e t h i si sa n o t h e rw a yt om i m i ct h e e f f e c to fm e c h a n i c a lf o r c e o u rd a t as h o w e dt h a t i n c r e a s i n g t h ec h l o r p r o m a z i n e c o n c e n t r a t i o nf r o m0t o2 0 0 山r e s u l t e di ne n h a n c e m e n to fg l u c o s ei n f l u xa n d d e c r e a s eo f n 0 2 。p e r m e a b i l i t y , i td e m o n s t r a t et h a tt r a n s p o r tp r o p e r t yo f g l u t la n d b a n d3w a ss e n s i t i v et ot h ec u r v a t u r ew h i c hi n d u c e db y c h l o r p r o m a z i n ea n dd i f f e r e n t w i t ht h a to fc a t i o n st r a n s p o r t k n o w l e d g eo ft h et e m p e r a t u r ed e p e n d e n c eo fm e m b r a n et r a n s p o r tm a k e sa n a p p r a i s a l o ft h et h e r m o d y n a m i cf e a t u r e so ft h et r a n s p o r t s y s t e mp o s s i b l e f r o m a r r h e n i u sp l o to f t h ed a t a t h er e s u t ss h o w e dt h a ta r r h e n i u sa c t i v a t i o ne n e r g y , e 。，o f g l u c o s et r a n s p o r ta n d a n i o ne x c h a n g ew e r er e s p o n d e dt ot h em e c h a n i c a lf o r c e t h e y w e r ea l ld e c r e a s e dw i t ht h ee n h a n c e m e n to fr o t a t es p e e d ( ( ) ) a n do s m o t i cs t r e s sa n d i tw a sd e d u c e dt h a tad e c r e a s ei nt h ea c t i v a t i o ne n e r g yi n d u c e db ym e c h a n i c a lf o r c e r e s u l t si na ni n c r e a s ei nt h er a t eo f t r a n s p o r t t h i si so b v i o u s l yr e a s o n a b l e r e d u c t i o n o ft h ea c t i v a t i o ne n e r g ym e a n st h ed