（应用化学专业论文）2’脱氧腺苷相关中间体的合成路线研究.pdf

中文摘要 摘要：5 一沪( 4 ”，4 - _ 二甲氧基三苯基甲基) 一6 一 l 苯甲酰基一2 一脱氧腺苷，作为一 种寡核苷酸在反义药物研究中的关键医药中间体，在抗病毒、治疗高血压、治疗 癌症等诸多方面有着非常重要的作用，寡核苷酸的合成中间体研究，有着广阔的 应用前景。 以2 一脱氧腺苷为原料，分别用不同的合成方法，制备了重要的反义药物关键单体 6 一胪苯甲酰基一2 一脱氧腺苷和5 一伊( 4 ”，4 ”一二甲氧基三苯基甲基) 一6 一肛苯甲酰基 一2 一脱氧腺苷，小试实验和中试放大实验产品纯度均可达到( h p l c ) i 9 8 5 ，产品 纯度高，且工艺简便，成本较低，收率较高，有利于进一步实现工业化生产。此 外，在实验过程中，用六甲基二硅胺烷作为保护试剂的实验方法是一种创新的合 成路线。 以腺苷为原料，改进了2 一脱氧腺苷的合成方法，制备了6 一 l 苯甲酰基一腺苷和 5 一沪( 4 ”，4 ”一二甲氧基三苯基甲基) 一6 一胪苯甲酰基一腺苷两种腺苷的衍生物，产品 的纯度和收率都达到了合成要求，具有一定的经济价值和实际意义。本中间体合 成路线的工艺研发成功将在一定程度上推动了反义药物地发展。 关键词：核苷、2 一脱氧腺苷、有机合成、中问体 分类号： a bs t r a c t a b s t r a c i ： 5 - o - ( d i m e t h o x y t r i t y l ) - 6 - n - b e n z o y l 一2 d e o x y a d e n o s i n e ，觞a l lo l i g o n u c l e o t i d ei n a n t i s e n s ed r u gr e s e a r c hi nt h ek e y p h a r m a c e u t i c a li n t e r m e d i a t e s ，p l a y sav e r yi m p o r t a n t r o l ei na n t i v i r u s ，t h et r e a t m e n to fh y p e r t e n s i o n ，c a n c e rt r e a t m e n ta n ds oo n t h e s y n t h e s i so fo l i g o n u c l e o t i d e si n t e r m e d i a t er e s e a r c h ，h a s b r o a dp r o s p e c t s u s i n g2 - d e o x y a d e n o s i n ea sr a wm a t e r i a l ，6 - n - b e n z o y l 一2 一d e o x y a d e n o s i n e a n d 5 - o - ( d i m e t h o x y t r i t y l ) 6 - n - b e n z o y l 一2 d e o x y a d e n o s i n e ，w h i c h i st h ei m p o r t a n tk e y m o n o m e ro fa n t i s e n s ed r u g ，w e r es y n t h e s i z e dw i t ha ni m p r o v e de x p e f i e r n e n t a lm e t h o d t h eh i g hp u r i t y ( h p l c ) 至9 8 5 ，s i m p l eo p e r a t i o n ，l o wc o s ta n dt h ee l e v a t e db e n e f i ta r e p r o p i t i o u s t oi n d u s t r i a l i z a t i o n t h es u c c e s s f u lr e s e a r c hi n t ot h es y n t h e s i so ft h i s i n t e r m e d i a t ew i l lg r e a t l yp r o m o t et h ed e v e l o p m e n to fa n t i e n s ed r u g f u r t h e r m o r e ，i nt h e c o u r s eo ft h ee x p e r i m e n t ，h e x a m e t h y l d i s i l a n ea sap r o t e c t i v er e a g e n ti sa ni n n o v a t i v e s y n t h e t i cr o u t e t oa d e n o s i n ea sr a wm a t e r i a l s ，u s i n g t h ei m p r o v e ds y n t h e s i sm e t h o d so f 2 - d e o x y a d e n o s i n e，p r e p a r e d t h et w od e r i v a t i v e s o fa d e n o s i n e 一 6 - n - b e n z o y l a d e n o s i n ea n d5 - o - ( d i m e t h o x y t r i t y l ) 一6 - n - b e n z o y l a d e n o s i n e ，p u r i t ya n d y i e l du pt ot h es y n t h e s i so fr e q u i r e m e n t s ，h a v eac e r t a i ne c o n o m i cv a l u ea n dp r a c t i c a l s i g n i f i c a n c e t h ei n t e r m e d i a t er o u t eo ft h ep r o c e s sw i l lb es u c c e s s f u l l yd e v e l o p e d t oa c e r t a i ne x t e n t ，p r o m o t e dt h ea n t i s e l l s ed r u gd e v e l o p m e n t k e y w o r d s ：n u c l e o s i d e ；2 - d e o x y a d e n o s i n e ；o r g a n i cs y n t h e s i s ；i n t e r m e d i a t e c l a s s n o 2 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解北京交通大学有关保留、使用学位论文的规定。特 授权北京交通大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：王晓胡 签字日期： 铆 f 年f 月e t 导师签名： 凫乏、闭 签字日期：歹p o2 年占月6e t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研 究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得北京交通大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：王晓胡签字同期：刎睁 细多只 6 1 2 0 0 8 年6 月 致谢 本论文的工作是在我的导师杨玉国副教授的悉心指导下完成的，杨玉国副教 授严谨的治学态度和科学的工作方法给了我极大的帮助和影响。在此衷心感谢两 年来杨玉国老师对我的关心和指导。 非常感谢中国医药研究开发中心有限公司的于中生总经理提供给我这次来到 中心核苷化学合成部门实习的机会，这里拥有专业的核苷中间体的合成团队、提 供足够的实验原材料与试剂，并配备了先进的分析与检测仪器，这些为我这一年 多来实验的顺利开展起到了莫大的帮助作用。于中生总经理丰富的合成经验、独 到的分析见解为我的实验丌拓了思路，此外，核苷合成部门的劳白云经理，还有 李凡、王倩、刘妍、朱斌等同事都对我的实验给予了很大的关心和帮助，没有他 们的悉心指点，我是无法顺利完成实验的，在此我对他们表示衷心的感谢。 许韵华老师对于我的科研工作和论文都提出了许多的宝贵意见，在此表示衷 心的谢意。 在实验室工作及撰写论文期间，白墨、赵婷、赵璐等同学对我给予了热情帮 助，在此向他们表达我的感激之情。 另外也感谢家人，他们的理解和支持使我能够在学校专心完成我的学业。 序 核酸这一生命大分子相对于其他生命分子如脂肪、糖类和蛋白质来说，是最 后被人类认识和发现的，直到2 0 世纪5 0 年代，人们才完全认识到它对于生命的 极端重要性。自m i e s c h e r 发现核酸以后，核酸这一研究领域引起许多化学家、生 物学家和医学家极大的兴趣，他们为揭示核酸的化学组成、结构、功能和作用以 及提取和合成做出了巨大的贡献。由核酸降解而来的核苷酸又分为核苷和磷酸两 部分，核苷在分子生物学和基因克隆中以及具有治疗疾病效果的化学药物中都有 着非常重要的作用。提取天然核苷存在着生产周期长、效率低下、无法大规模生 产及受自然资源的影响等问题，而核苷的化学合成具有合成步骤较少、可以大规 模工业化生产、反应周期大大缩短、生产效率高等优点，因此必须走化学合成核 苷的道路，才能满足日益增长的对核苷和核苷衍生物的需求。 中国医院研究开发中心有限公司核苷化学合成组主要从事以胞苷、尿苷、腺 苷、鸟苷等为原料的核苷衍生物的小试实验及中试放大的合成研究，拥有多年来 先进而丰富的合成经验，制备了众多相关的寡核苷酸中间体，产品发往囤内外多 个厂家，具有较大的影响力。本论文主要以2 一脱氧腺苷和腺苷为原料，合成了几 种反义药物关键单体，得到了纯度较高的产物， 1 引言 1 1 核苷的化学结构 从化学结构看，核酸是以核苷酸为基本单位，通过磷酸酯的形式( 3 ，5 一磷酸 二酯) 组成的生物多聚体。而核苷酸的次级单位是磷酸和核苷；核苷是碱基和核糖 或脱氧核糖的第一个碳原子连接而成的糖苷化合物，是由核糖和核酸碱基以b n 一 糖苷键的形式而构成1 ( 图1 - 1 ) 。 ( n u c l 核e i c 酸a c i d 曲! 致( nd 曲 嗡啶 ( p y n m i d i n e ) 嘌呤 ( p u r i u e ) ( n u ce o s i d e s ) 殴 r i ca c i d ) o 对o 对0 吣砖n h 2 年代以来还发现有6 0 7 0 种少量或极少量存在于核酸分子中的其他碱基，称为修 饰碱基。例如一甲基腺嘌呤、一甲基鸟嘌呤、一乙酰胞嘧啶和5 ，6 一二氢尿嘧啶。有 的修饰碱基结构非常复杂，叫做高度修饰碱基，如y 碱和q 碱。 o 胸苷( d n a ) 1 5 t h y m i d i n e ( t h d ) o h o h 尿苷( r n a ) 8 u d d i n e u r d ) 胞苷c y t i d i n e c y d ) d n a 巾：r = h ，1 6 ( d c ) r n a 中：r = o ，h ，7 图1 - 3d n a 和r n a 中的嘧啶类核苜 f i g 1 - 3d n aa n dr n a i np y r i m i d i n en u c l e o s i d e 1 萌8 蛹赫 0 hr 腺苷，a d e n o s i n e ( a d o ) r n a 中：r = o h ，2 0 d n a 中：r = h ，2 1 ( d a ) o o hr 鸟苷，g u a n o s i n e ( g u o ) r = o h 。2 2 r = h ，2 3 ( d g ) 图卜4d n a 和r n a 中的嘌呤类碱基和核苷 f i g 1 - 4d n aa n dr n a i nt h eb a s ea n dp u r i n en u c l e o s i d e 寡核苷酸是由2 - - - 2 0 个核菅酸连接而成。2 0 个以上的核苷酸组成的化合物叫 多核苷酸。核酸是一种多核苷酸h 1 。1 9 8 3 年有入发现一类不含戊糖而含葡萄糖的 “核苷酸 组成的核酸葡萄糖核酸( g n a ) 啼3 。核苷酸及其衍生物广泛地参与生 物体内各类生物化学反应叫，如( a t p ) 和鸟苷三磷酸( g t p ) 是生命活动广泛需要的能 源；环腺苷酸( c a m p ) 、环鸟苷酸( c g m p ) 和2 ，5 一寡聚腺苷酸是代谢调节信号分子； 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸和辅 酶a 是广泛存在的；u d p - 葡萄糖、c d p - 胆碱等参与糖代谢和磷脂代谢；肌苷酸、 鸟菅酸是味精的助鲜剂。 2 1 2 核苷的作用与用途 具有治疗疾病效果的核苷和核苷酸类药物在化学药物中占有非常重要的地 位，其数量呈迅速增长的趋势。在人类基因机会研究的推动下，有关基因与疾病 的信息受到人们的高度重视，开发研制核苷( 包括核苷的碱基) 和核苷酸的新药 已形成热点。 这两类药物从结构上分，又可分为两大类，天然的核苷与核苷酸和非天然的 核苷与核苷酸，它们分别有不同的治疗作用。 1 2 1 天然的核苷与核苷酸 天然核苷与单核苷酸的用途 由于天然核苷与单核苷酸这类化合物都是构成细胞核酸的主要成分，是天然 的代谢激活剂，对改善机体的物质代谢和能量代谢有很大帮助，它们中大多数要 直接进入细胞，参与糖代谢，促进蛋白质合成，加速受损组织的修复，促使病态 细胞、缺氧组织等恢复正常的生理功能口1 。所以这类化合物广泛用于放射病，血小 板减少，急慢性肝炎，血细胞减少，心血管疾病和脑损伤等。这类化合物中也有 少数一些基团进行修饰，如二丁酰环腺苷酸，腺苷用二丁酰基修饰后，可增强环 腺昔酸的亲酯性，易于透过细胞膜，避免在体内被磷酸二酯酶水解，从而增强缓 解冠心病作用，用于抢救异常心绞痛和急性心肌梗死等。又如二磷酸胆碱与磷脂 代谢有十分密切的关系，它是卵磷脂体内生物合成的重要辅酶，可治疗意识障碍， 对脑损伤恢复有作用1 。 寡核苷酸与反义治疗 现今临床所应用的绝大多数药物和即将上市的大多数药物都是以蛋白质如 酶、受体或离子通道为靶点的，由于蛋白质的结构和其作用模型非常复杂，常不 能彻底搞清楚，所以使药物的作用( 即疗效) 以及新药设计受到相当的限制。如 果人们把作用靶点放到核酸水平上，即抑制基因表达，不让产生引起疾病的蛋白 质，则会对疾病达到彻底治疗的目的。 1 9 7 8 年z a m e c n i c k 和s t e p h e n s o n n 们首先提出用人工合成的寡核苷酸作为病毒 核酸翻译的抑制剂的思想，并且用1 3 一m e r 寡核苷酸与r o u s 肉瘤病毒核酸互补， 从而在细胞培养中抑制该病毒生长，这种寡核苷酸被称为反义寡核苷酸，这一治 疗方法被称为反义疗法。 反义疗法是一个较理想的治疗策略，其优点是十分明显的。第一，具有极高 的特异性，从统计学意义来讲，一个1 7 个碱基的寡核苷酸序列只在人体基因内出 3 现一次，因而只要知道靶分子的核酸序列，即可根据w a s t o n c r i c k 碱基配对原理， 直接写出其抑制剂反义核苷酸的化学结构，达到理想的药物设计；第二，反 义核苷酸是内源性的，天然的，其毒副作用小，一般较为安全；第三，人类疾病 的发生，都是人体细胞中的基因异常改变( 受外界的影响) ，或基因遗传的缺陷， 或由外源病原体的基因及其产物与人体相互作用的结果，故反义疗法可治疗人体 许多疾病，如阻止损伤或缺陷基因的表达，抑制外源病原体遗传物质的复制等； 第四，开发反义化合物的费用较少( 相对于传统的药物) ，避免费时费力的化学药 物的合成和筛选。 反义疗法根本的机制是通过阻抑从d n a 到m r n a 的转录过程，或从m r n a 到蛋 白质的翻译过程，达到阻断细胞中有害的蛋白质的合成。用于反义疗法的寡核苷 酸常有寡脱氧核苷酸( o d n ) ，o d n 可与基因组r n a 或d n a ，或者基因组衍生的r n a 互补，这样的o d n 称为反义o d n 。同样也有反义的r n a ，另外，还有由r n a 组成的 酶，即核酶，它可催化r n a 的切割和r n a 剪接反应，故核酶可作为基因表达和病 毒复制的抑制剂。 表卜5 反义疗法的分子结构类型和作用 f i g 1 - 5a n t i s e n s et h e r a p yt y p eo fm o l e c u l a rs t r u c t u r ea n df u n c t i o n 核酸类型链作j j 策略 靶点 d n a单链三螺旋d n a 单链反义 m r n a 单链组合蛋白质 叔链 垂钓转录因子 r n a 单链 反义m r n a 核酶 m r n a 组合蛋白质 小核糖核酸( m i c r o r n a ) 的作用 小r n a 的作用有：可控制基因的打开、关闭或沉默，能将不需要的遗传信息 割裂成碎片，即将细胞内的与其相似的r n a 片断降解。小r n a 在细胞分裂过程中 可指导染色体中的物质形成正确的结构。 1 2 2 非天然的核苷与核苷酸 非天然核苷与核苷酸可称为核苷与核苷酸类似物，从化学结构上看它们和天 然核苷与核苷酸有不同程度的相似之处，所以在体内有以假乱真之效，从而干扰 或者直接作用于核酸的代谢过程，阻断蛋白质、核酸的生物合成，因而这些化合 4 物在抗病毒和抗肿瘤化疗药物中具有非常重要的地位。 抗肿瘤药物 由于非天然的核苷和核苷酸干扰作用于核酸的代谢过程，故这些类似物可被 称为代谢药物，按核苷的碱基的不同，分为两类。 a 嘌岭类 这类化合物包括修饰的嘌呤碱基和出它们所形成的核苷和单核苷酸，如图卜6 的化合物，其中应用最早的抗肿瘤嘌呤核苷类似物是6 一硫基嘌呤n 。 ，奶。鸯国 鹞r = h ，3 1l o p 0 3 h 2 3 2r h 。3 3r - - p 0 3 h 2 图1 - 6 嘌呤类抗肿瘤约物的化学结构 f i g 1 6p u r i n eo ft h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fa n t i c a n c e rd r u g s 这类化合物包括修饰的嘌呤碱基和由它们所形成的核苷和单核苷酸。这类化 合物的主要特点是6 一位有一个疏基或甲硫基，从而一直体内嘌呤核苷酸的生物合 成，主要用于抗白血病。 b 嘧啶类 这类化合物主要以5 一氟尿嘧啶及其核苷，和胞苷衍生物为主n 2 1 ( 见图卜7 ) 。 由于c - f 键有较高的稳定性，参与体内的代谢过程中不易分解，从而干扰脱氧胸 苷酸的生物合成，对肝癌及头颈部癌症等有疗效。 o 斛f 少n h 图1 - 7 几种嘧啶类抗肿瘤药物的化学结构 f i g 1 - 7s e v e r a lp y r i m i d i n eo ft h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fa n t i t u m o rd r u g s 5 抗病毒药物 目前，核苷类似物在抗病毒药物中占有很重要的地位，它们主要作为病毒复 制过程中一些重要酶的抑止剂，达到中止病毒复制，阻止病毒侵染靶细胞的目的。 按其作用的病毒种类可分为以下两大类。 a 抗d n a 病毒的核苷类药物 5 一取代脱氧嘧啶核苷“引。这类化合物主要包括5 一取代的脱氧尿苷和苞苷，( 见 图卜8 ) 。 如。如吼 掣哟掣 对o 批声1 图1 - 8 几种5 一取代脱氧嘧啶核苛类似物的化学结构 f i g 1 8s e v e r a lr e p l a c e5 - d e o x yp y r i m i d i n en u c l e o s i d ea n a l o g so ft h ec h e m i c a ls t r u c t u r e 阿糖腺苷( a r a a ) 类。由于核苷中的核糖被阿糖替代，所以这类化合物对d n a 和r n a 病毒均有作用，具有广谱性，主要有阿糖腺苷( 4 3 ) 和碳环阿糖腺苷( 4 4 ) ( 见 图1 9 ) 。 h 4 3x - - o ；4 4x - - - c4 5 ( a c v ) 图1 - 9 抗d n a 病毒的嘌呤类核苷类似物举例 f i g 1 - 9t h ee x a m p l eo fa n t i v i r u sd n ap u r i n en u c l e o s i d ea n a l o g s 无环核苷类似物。阿昔洛韦( a c v ，4 5 ) 是第一个研制成功的已用于临床的无环 核苷抗病毒化合物，是广谱抗病毒药物并且很少见有不良副反应n 铂( 见图卜9 ) 。 b 抗r n a 病毒的核苷类药物 r n a 病毒包括引起人类呼吸系统疾病的病毒，如流感病毒等，也包括对人类生 命正构成严重威胁的艾滋病病毒( h i v ) 和乙肝病毒( h b v ) 等n 5 1 ( 见图1 - 1 0 ) 。 6 叫伽 叭 叫佣 蛰om d 舱斟b啪dm d 舱斟 n 3 4 6 ( a z a 3 b ：= c a ，g ，i b - - i ：d 4 t ( 4 7 ) n h 2 心 h o 割 h o o ho h 4 8 ( i s o - d d a ) 4 9 ( 3 t c ) 5 0 图i - 1 0 抗r n a 病毒的核苜类似物举例 f i g 1 1 0t h ee x a m p l eo f a n t i r n av i r u sn u c l e o s i d ea n a l o g s 非天然的核苷与核苷酸的其他生物活性作用 除了以上两种主要药物作用外，非天然核苷和核苷酸的衍生物还具有其他的 生物活性作用，如以下几个方面。 a 中枢神经系统( c n s ) 用药 n i c h o l i n 与磷脂代谢关系十分密切n 6 1 ，是体内卵磷脂生物合成的重要辅酶( 见 图1 - 11 ) 。 p宫h 气c t l 3 o 剞溜 o h o n i c h o l i n s - a d e n o s y l m e t h j ( m i n e ( s a m ) 图1 - 1 1 治疗神经系统疾病的核苷类似物 f i g 1 11t r e a t m e n to fd i s e a s e so ft h en e r v o u ss y s t e mo f n u c l e o s i d ea n a l o g u e s b 。对循环系统有作用的核苷类化合物 腺苷是已知的对循环系统有作用的药物，它有促进冠状动脉扩张和心肌代谢 的功能，因此可用于心脏功能不全等病症的治疗。 c 核苷类抗生素 虫草素具有抗菌作用，同时也有抗r n a 病毒的活性，它也是一种胞毒剂。虫 草素是此一个核苷类抗生素，从它被发现以来，至今已发现2 0 0 多种核苷类抗生 7 o nn 惫叫 素。嘌呤类核苷抗生素( 见图卜1 2 ) 。嘧啶类核苷抗生素( 见图卜1 3 ) 。 确i c j 螂科棱杀霉黎) o 嘲蛳单j i i 虫孳豢，s i n e f u n g i n - a m i n o 3 永o x y 掰k n o 鲥n e t ) x e l a o c i t 3 + 簸簇，3 般缴艨替j n h c h h h b i e p l a n o ( , i n h 筘一n c o i h 2 0 旧j 玳卜2 q 、期瑚黼州 ( t - 毓臻- 2 艇，馥喝静i 图1 - 1 2 嘌呤类核苷抗生素举例 f i g 1 12t h ee x a m p l eo fp u r i n en u c l e o s i d ea n t i b i o t i c s 力器怨 r n i k k o m 。i nz定= h 。 x o h e z o m y c m sa 2 敦争l - c 蝣0 8 i n e n i k k o m y e i njr 一 ， x ”心l u - l e z o m y c i n s 戳r = 。p 5 - u 4r a e i l n i k k o m y c i nj tr * ( 灌靠x # 一g ；t 卜le z t n n y e i n sc 2r = 盘5 - t n c i l d 囝霉系- g i u - l ：一n h c h ( c c h h ) c ih c h 2 c 0 2 h f i g 1 1 3t h ee x a m p l eo f p y r i m i d i n en u c l c o s i d ca n t i b i o d c s 8 1 3 核苷化学合成的优势 利用化学合成核苷及其衍生物具有优于天然提取核苷的多方面优点，主要有 以下几点： 合成步骤较少，可以大规模地工业化生产，产量高； 反应周期大大缩短，保证需方对时间的要求，生产效率高； 减轻生态环境负担，合成的原料可来自多方面，如石化产品，农副产品等； 可根据需要用化学方法合成单一核苷和各种修饰性核苷及其衍生物，这是 化学方法的最为重要的优势n 8 。 国外研制的第一代反义核苷酸药物是以2 一脱氧核苷的磷酰胺衍生物为主要 原料，进行反义o d n 合成，这只有用化学合成方法才可得到所需要的原料和反义 o d n n 引。随着反义药物研究深入，人们发现为了避免体内核酸酶对反义o d n 的破坏， 以及满足不同的给药途径，必须对反义药物作新的改造，如第二代反义药物则以 2 一修饰的核苷为原料，这样的修饰性核苷必须用化学方法从头合成。 总之，用于反义疗法中各种各种寡核苷酸片断必须进行结构上的修饰或改造， 因为没有经过修饰的反义寡核苷酸将会面临以下的障碍。 没有修饰的天然寡核苷酸片断，由于带有负电荷的磷酰基，很难穿越亲酯 性的细胞膜进入细胞中而发挥作用，这是由于细胞膜有防止遗传物质流失的天然 功能； 在细胞中，有许多核酸酶会迅速分解寡核苷酸片断； 单链的反义寡核苷酸的链一般都不长，故它们的半衰期大大地低于所期望 的值。 为了适应活细胞的生物化学过程，只有用化学修饰的寡核苷酸片断才能克服 上述的障碍。如增加寡核苷酸的亲水性，但又必须防止亲酯性过大导致寡核苷酸 和细胞膜连接，或进入到其他亲酯性高的细胞中乜。另外，必须考虑寡核菅酸在 细胞内外侧要求具有的水溶性，这些条件的满足都只有用化学修饰方法才能达到。 为避免核酸酶分解，除要用有一定体积基团修饰核糖和磷酸部分外，还必须对碱 基作一定的修饰；或者应用其他结构形式的非天然糖基。在延长寡核苷酸半衰期 方面，除需要保证反义寡核苷链有一定长度，还需要从碱基修饰上下功夫，如增 加碱基间的杂交配对能力，利用修饰碱基上可成对、可堆聚或可相互插入的取代 基，使寡核苷酸能和靶序列有效杂交，但又需考虑到这样形成的双螺旋股的外加 能量总值不应提高1 。由以上分析可见，对反义寡核苷酸序列的分子设计是较为 复杂的过程，实现分子设计目标的化学合成会涉及到多方面的知识和经验。 9 羟基 取代 氧原子被c ，n ，s 等置换 碱基多位点的修饰核变换 ( 如增抽取代基，环上c - 一n 或 ( ；f i o h 侄糖环上或下) 图1 - 1 4 核苷分子被修饰和变换的部位 f i g 1 1 4n u c l e o s i d eb em o d i f i e de l e m e n t sa n dt r a n s f o r mt h es i t e 1 4 化学合成核苷类化合物的任务 化学合成核苷的任务是根据各种不同应用而设计出所需核苷化合物的结构， 用化学方法合成这些目标核苷产物，或者根据需要，用化学方法合成天然存在的 核苷化合物。这些合成核苷的方法和策略必须尽可能地满足经济学和社会学方面 的要求，即达到合成方法合理、经济、原料来源方便、对环境友好并能较大量地 生产等条件乜驯。 要达到以上要求，作为核苷化学合成方面知识应包括研究和解决以下问题： 组成核苷的碱基部分，即氮杂环化合物的合成原理与方法，核苷糖基部分的合成 与方法，以及碱基与糖基如何偶合成糖苷的原理与方法等。另外，由于糖苷配基 和糖基上都含有非常活泼的化学基团，如何封闭和保护它们，以促进核苷的顺利 合成讲1 。再者，核苷类化合物绝大多数是具有光学活性或者有特定的手性中心的 有机化合物，又如何地利用立体选择性或区域选择性的方法与手段定向地或者不 对称合成得到这类化合物，所有这些均构成化学合成核苷类化合物的知识内容， 也必然成为化学合成核苷的研究对象。 1 5 选题意义及背景 本人的实验研究主要是以2 脱氧腺苷为原料展开合成研究的，合成出的衍 生物之后会进行添加磷酰化试剂的保护基反应，作为一种寡核苷酸在反义药物研 究中的关键医药中间体，有着非常重要的作用啪1 。 l o 现今，由于寡核苷酸在治疗及诊断试剂上应用的巨大潜力，寡核苷酸的研究 已经成为当今生物医药研究的一大热点。寡核苷酸是反义药物的基础。反义技术 作为分子生物学的新型抗基因技术，目前不仅广泛应用于生理学、病理学、药理 学的基础研究，而且已成为药物发展的新兴策略。利用这一技术开发的药物称 为反义药物，通常是指反义寡核苷酸，即人工合成的d n a 或r n a 单链片段。专门 设计的反义寡核苷酸能与特异m r n a 的特定序列相杂交，在基因水平阻止致病蛋白 质的产生，从而发挥治疗作用。例如，反义药物具有改变皮肤基因表达的能力， 局部应用反义药物能治疗系统性和皮肤疾病。与传统药物相比，反义药物具有 更高的特异性、更优的疗效和更低的毒性。由于反义药物的靶标是基因和蛋白， 作用更加专一药用副反应小于传统药物，因此，反义药物越来越成为人们研究和 开发的热点。迄今为止，医学界所了解的疑难杂症绝大多数与体内某些基因的病 变有关，包括肿瘤、风湿性关节炎、重症肌无力、多发性硬化症、牛皮癣、糖尿 病、视网膜黄斑退化症、克罗恩氏症( 慢性结肠炎) 、非典型性肺炎( s a r s ) 、血管 炎以及艾滋病引起的并发症( 如巨细胞病毒视网膜炎) 等幽，而反义药物能在第 一时间内制止能产生致病蛋白质的基因，如果可开发出针对上述病变基因的反义 药物，就能从源头上遏制致病蛋白质从而治疗疾病。国外已经有反义药物上市， 并有多种药物正在做临床研究。其中，研究反义药物比较出名的是美国的i s i s 公 司、礼来公司m 1 。而国内在反义药物方面研究滞后，寡核苷酸主要用于p c r 探针 研究及诊断试剂方面的研究。由于反义药物在抗病毒、治疗高血压、治疗癌症等 诸多方面的显现出的巨大潜力，寡核苷酸的研究必将会越来越引人的瞩目。因此， a m i d i t e 作为寡核苷酸的合成中间体，有着广阔的应用前景。 现在一般的合成寡核苷酸的a m i d i t e 有d a ( b z ) ，d c ( b z ) ，d g ( i b u ) 和r 。但 是这四个标准化合物在合成寡核苷酸是有一定的缺陷：在脱保护时需要较高的温 度和较长的时间。5 一o - ( d i m e t h o x y t r i t y l ) 一2 一d e o x y a d e n o s i n ep h o s p h o r a m i d i t e 是合成寡核苷酸的重要中间体，被称为快速脱保护的a m i d i t e 产品，它能在温和 的条件下较短的时间内能够脱去保护基大大缩短了寡核苷酸的生产周期，而备受 青睐口2 1 。但在用脱氧腺苷合成寡核苷酸时需要在2 ，3 位进行磷酰化反应，为减少 副反应的发生，需对脱氧腺苷上的氨基和活泼羟基进行保护。以往的保护方法中 要么保护不够，要么保护基的脱去程度不易掌握，因此我们在以往经验的基础上， 采用了更加成熟的保护方法，即用苯甲酰基保护氨基，用4 ，4 一二甲氧基三苯基甲 基( d m t ) 保护五号位羟基啪1 。经过多次实验摸索，使得这种方法获得了成功。这 两种保护基在磷酰化过程中很稳定，而在一定的简单条件下可以很快的脱去，而 且容易除去，不会对反应过程造成任何不好的影响。 用2 一脱氧腺苷合成6 - n - 苯甲酰基一2 一脱氧腺苷和5 一o _ ( 4 ”，4 ”一二甲氧基三 苯基甲基) - 6 - n - 苯甲酰基一2 一脱氧腺苷，产品纯度高，且工艺简便，成本较低， 收率较高，有利于实现工业化生产。保护好的单体5 一o _ ( 4 。，4 ”一二甲氧基三苯基 甲基) - 6 - n - 苯甲酰基一2 一脱氧腺苷，同样还可以是其他重要反应的中间体。总之， 脱氧腺昔的衍生物是一种很重要的中间体，在各种合成过程中发挥着重要的作用， 苯甲酰基、d m t 保护脱氧腺苷中氨基羟基的成熟探索有着重要的学术价值和实际意 义，本中间体合成路线的工艺研发成功将会极大地推动反义药物地发展，使更多 更好的反义药物能够尽早的面世造福人类。 1 6 实验方法及成果概述 n 6 氨基上是2 脱氧腺菅及腺苷碱基上发生反应最多最集中的地方，保护反应 是n 6 氨基上很重要的一种方法。 1 6 1n 6 - 氨基上保护基的选择 对腺苷来说，n 6 氨基较不稳定，很易被碱性水解成羟基，使腺苷转为肌苷； 另外，为了避免在腺苷后继反应中，反应试剂对化学性质活泼的n 6 氨基发生副反 应，常需应用保护反应的策略，预先将n 6 一氨基封闭或保护起来1 3 引。 选择理想的保护基是一个较为复杂的问题，好的保护基应具有以下特征： 保护基易于引入到化合物上，并且在引入的反应中收率高； 保护基具有高度的选择性，对分子中的其他功能基团不会发生作用，并且 在引入保护基的反应条件下，也不会对其他功能基团或分子的其他部分有影响， 这些影响诸如不发生分子的重排、消除、聚合等反应，也不会使原分子的光学性 质发生改变等； 生成的被保护衍生物能经受后继反应条件的考验，即保护产物有一定的化 学稳定性，以保证目的反应的完成； 保护基易于脱除，切脱除保护基的反应条件的对分子中其他功能基团无影 响，以及脱除反应收率高； 当分子中有多种功能基团需保护时，保护基尽可能选择具有相同脱除条件， 以减少反应步骤；或者对不同的需保护的基团，尽量地选择相同的保护基，既选 择多功能保护基，如在腺苷中，可将n 6 一氨基和2 ，3 羟基都选择相同的酰基进行 保护，以便完成后继反应后，一同用适当的碱性条件除去这些酰基。 1 6 2n 6 - 氨基的保护基 1 2 以酰基作保护基 氨基的保护基是较多的，首选是酰基作n 6 氨基的保护基，但是，必须注意的 这里是腺苷与2 脱氧腺苷上的n 6 氨基，而不是单纯的腺嘌呤上的n 6 氨基，选 择酰基极为重要，因为在n 6 氨基上进行酰基化后，常会提高腺苷在酸性介质中脱 嘌呤的速率，这也许是由于在酸性介质中易发生环上n ( 7 ) 以及n 0 ) 的质子化反应， 对核苷键的稳定性造成影响所致。长期以来，人们在这样的思想指导下，寻找对 n 6 保护的酰基，即要求它们在保护n 6 氨基后，在中性及酸性的条件下稳定，并 且能在氨溶液( 水或醇中) 作用下方便地脱除p 引。 在对应后继的寡核苷酸合成的条件下，开始人们首先选用苯甲酰基作为腺苷中 n 6 氨基以及胞苷中n 4 氨基的保护基，对于鸟苷中n 2 氨基首选异丁酰基( i b u ) 来保护，这两种保护基可以承受核苷酸合成的条件，但在去除它们时，确实需用 较强烈的方法，如在5 5 下在浓氨溶液中处理数小时，才可将这两种酰基脱除， 这对核苷酸中的苷键是十分不利的【3 引。因此，为了能用较温和的反应条件脱除保 护基，对n 6 氨基保护的酰基逐渐被选用成较复杂的形式，如苯氧基乙酰基 ( p h a c ) 3 7 1 ，异丙氧基乙酰基( i p a ) 1 3 8 1 以及a 苯基肉桂酰基( a p h c m ) 3 9 1 ，或称为0 【 苯基苯丙烯酰基，这些酰基均可在寡核苷酸合成后，很方便地在温和碱性条件下 脱除( 见图1 1 5 ) 。 d 段删i ( b 力 # 譬 h 舻钟 a n i o y g a n ) h 筘秽 辈邸 x y a c e t y l ( p h a c ) a - i 】h e n y l c i n n a m o y i l s o p r o p 似y a 僻刚和。p a ) ( a - p h c m ) 融rr r 蝴z a y t ( b o m b ) r 螂渊瞒i ( s i 0 m b ) 鳓l h a l o y i ( 璜l t h 嘎一，心举晶 h 零；c ，配h 厂。，葚一 a l l y l o x y c a r b o n ) , ! ( a o c ) 9 - f l u o r o n y l m c t h o x y c a r b o n y l2 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) e t h o x y c a f l 均n y ld i m c t i l y l f o n l 姗i d i f f m o c )(npeoc)(amo 图1 1 5 用于氨基的保护基团 f 蟾1 15f o rt h ep r o t e c t i o no f t h ea m i n og r o u p 1 3 为了使保护基能在温和条件下方便地被脱除，v a nb o e c k e l 【删和v a nb o o m 4 1 】 等人在苯甲酰基的邻位增加一个带有保护基的2 一羟基甲基侧链，如2 ( 苯甲酰氧甲 基) 苯甲酰基( b o m b ) 和2 - ( 7 , 酰氧基甲基) 苯甲酰基( a m b ) 中，这些羟甲基侧链的末 端羟基经酰基修饰后，会对苯甲酰基保护基的脱除有帮助，形成更巧妙的消除过 程。如在浓氨水或k 2 c 0 3 甲醇溶液中，首先是羟甲基末端的酰基先脱除，紧接着 在第二步中羟基分子内进攻酰胺基，形成l ，3 二氢异苯并呋喃衍生物作脱离基团， 从而腺苷等环外的氨基得以脱保护而自由。 对于2 ( 叔丁基二苯基硅氧甲基) 一苯甲酰基( s i o m b ) 作环外氨基保护基时，脱除 原理与以上b o m b 等一致，只是这里用氟离子促使羟基上的硅烷基裂解，完成苯 甲酰基从氨基上脱除的过程【4 2 1 。以上氨基的酰基保护基均能满足磷酸酰胺法合成 核苷酸片断的要求，虽在脱除这些保护基阶段过程较快，但所得到的核酸必须经 h p l c ( 高效液相色谱法) 纯化。随着核苷酸化学合成的自动化，以及越来越多地 需求高纯度的寡聚核苷用于以分子生物学为基础的技术中【4 3 1 ， 如p c r ( 多聚酶链式 反应) 和d a n 芯片等】，核苷保护基的要求和期望越来越高，要达到简捷地引入， 适用高速度的合成，迅速地脱保护和直接获得纯产品。所以，发展新的保护基十 分迫切。p n e i d e r e r l 4 4 】等人将邻苯二甲酰基( p h t h a l o y l ，p h t h ) 引入核苷碱基的反应中， 以保护环外的氨基，在脱除这个保护基时，应用有机碱d b u 很方便地消除p h t h ， 得到很纯的消除产品。首次将p h t h 保护基引入核酸合成中的是h a t a 4 5 1 等人，他们 内用p h t h 保护脱氧腺苷n 6 氨基，以适应磷酸三酯法合成核酸片断，脱p h t h 时应 用了亲核性碱，如肼、浓氨吡啶和e t 3 n ，但效果均不如d b u 。 羧酸酯类作保护基 除了以上的酰基外，另一大类氨基的保护基为羧酸酯类，引入这类保护基的 方法是常用氯代羧酸酯或用其n 甲基咪唑盐与氨基形成很稳定的氨基甲酸酯键， 脱除这类保护基则需用碱性诱导的1 3 消除法。如c h l a d e k 4 6 等人对保护氨基的9 芴基甲氧基曾建议用氨、三乙胺或d b u 进行消除，可获较好的结果。 p f l e i d e r 一4 7 】等人开发了核苷碱基环外氨基的新保护基2 ( 4 硝基苯基) 乙氧基 羰基( n p e o c ) 。这一保护基有一定的稳定性，可以承受寡核苷酸合成的反应条件， 更为重要的是，由于保护基上有硝基基团，使被保护的核苷在紫外光下有更强的 荧光效应，方便与反应过程的观察和反应终点的判断。脱除该保护基可在d b u 作 用下，经碱性1 3 消除反应而脱除，并且易与产物分离，有较广泛的应用。 另外，还有一个由n o y o r i 4 8 】等人首次应用的特殊的羟酸酯基保护基烯丙氧基 羟基( a o c ) ，用于环外氨基的保护。在脱除时，需用p d ( 0 ) 络合物催化反应分解去 除，区别其他同类保护基的去除方法，使被该保护基保护的核苷，可用于条件更 加剧烈的后继反应之中。 1 4 脒类保护基 用于腺苷和鸟苷环外氨基保护的非酰基类型的脒类保护基，这种保护基被越 来越多地应用【4 9 】，即二甲氨基甲脒基( d i m e t h y l f o r m a m i d i n ，d m o ，这一保护基的引 入可用v i l s m e i e r - h a a c k 试齐i j ( d m f + p o c i g s o c l 2 ) ，或者用n ，n 二甲基甲酰胺缩二 甲醇 ( c h 3 ) 2 n c n ( o