（化学工程专业论文）高效液相色谱法测定大豆异黄酮的方法研究.pdf

，；，tg* at h e s i si nc h e m i c a le n g i n e e r i n g iillllliu li l li ii i iil l l i y 1716 6 5 9 s t u d y o nt h em e a s u r e m e n to f s o y b e a n i s o f l a v o n e sb yh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y b yg uy a n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rw a n gl i n s h a n n o r t h e a s t e r n u n i v e r s i t y j u n e2 0 0 9 独创性l 声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 二 思0 学位论文作者签名： 凇号丧 日期：州多丫 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 作者和导师同意网上交流的时间为作者获得学位后： 一年口一年半口两年口 学位论文作者签名： 瓜每三 签字日期： c t 圹 导师签名： 签字日期： 上b 尸f 矽 东北大学硕士论文 高效液相色谱法测 异黄酮是黄酮类化合物中的一 豆生长中形成的一类次级代谢产物 因此称为植物雌激素。大豆异黄酮 性、蛋白质合成、生长因子活性， 从非转基因大豆精制而成的生物活 营养因子，是纯天然的植物雌激素 本研究建立了高效液相色谱法( h p l c ) 同时测定大豆异黄酮五种组分大豆苷、黄 豆黄苷、染料木苷、大豆苷、黄豆黄素的测定方法。实验考察了不同流动相体系、流动 相配比、柱温、流速、进样量等因素对分离的影响，确定了最佳色谱条件：z o r b a x s b c 1 8 色谱柱( 1 5 0r n m 4 6m m ，5 岬) ；二极管阵列检测器，检测波长为2 5 5n m ； 色谱柱温度2 0 ，流速：1 0m l m i n ，进样体积：5 “l 。在最佳色谱条件下，建立了各 物质的标准曲线，相关系数r 为0 9 9 9 6 - 一0 9 9 9 9 ；样品的加标回收率均在8 3 0 一- 1 0 0 6 ， 方法相对标准偏差在3 0 以内，实现了3 0 m i n 内对5 种化合物的同时测定。 研究结果表明，本实验所建立的测定大豆异黄酮五种组分大豆苷、黄豆黄苷、染料 木苷、大豆苷元、黄豆黄素的高效液相色谱法，具有操作简单，快速、准确、重现性好、 检出限低的特点。 关键词：h p l c ；异黄酮；大豆苷；黄豆黄苷；染料木苷；大豆苷元；黄豆黄素 一i 卜 东北大学硕士论文 a b s t r a c t s t u d yo nt h em e a s u r e m e n to fs o y b e a ni s o f l a v o n e s b yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y a bs t r a c t t h ei s o f l a v o n e si so n ek i n do ff l a v o n o i d sw h i c hm a i n l ye x i s t si nt h el e g u m i n o u sp l a n t 功es o y b e a ri s o f l a v o n e si sak i n do fs e c o n d a r ym e t a b o l i t ef o r m e db yt h es o y b e a ng r o w t h b e c a u s ei ti se x t r a c t e df r o mt h ep l a n t ，h a st h es i m i l a rs t r u c t u r ew i t ht h ee s t r o g e n ，t h e r e f o r ei s c a l l e da st h ep l a n te s t r o g e n s n l es o y b e a ri s o f l a v o n e se s t r o g e na f f e c t st h eh o r m o n es e c r e t i o n ， m e t a b o l i s mb i o l o g ya c t i v i t y ，t h ep r o t e i ns y n t h e s i s ，g r o w t hf a c t o ra c t i v i t y , i st h en a t u r a lc a n c e r c h e m i s t r yp r e v e n t i v e h e a l t hb e n e f i t so fs o y b e a ri s o f l a v o n e sr e f i n e df r o mn o n g e n e t i c a l l y m o d i f i e ds o y b e a r li st h eb i o l o g i c a l a c t i v i t ys u b s t a n c e ，w i t h av a r i e t yo f i m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a la c t i v i t yo fn a t u r a ln u t r i t i o nf a c t o r sa n dt h ep u r en a t u r a lp l a n te s t r o g e n s i ti s e a s i l ya b s o r b e di n t ot h eb o d y , c a p a b l eo fc o m p l e m e n t i n gn u t r i t i o nr a p i d l y am e t h o dt od e t e r m i n ed a i d z i nd i n 、g l y c i t i ng l i n 、g e n i s t i ng i n 、d a i d z e i nd e n ia n d g l y c i t e i ng l e i ns i m u l t a n e o u s l yb yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) w a s d e v e l o p e d t h ee f f e c t so fm o b i l ep h a s ec o m p o s i t i o n ，p r o p o r t i o n ，c o l u m nt e m p e r a t u r e ，f l o w r a t ea n di n j e c f i o nv o l u m no ns e p a r a t i o nh a v eb e e ns t u d i e d t h eb e s tc h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n si n c l u d e daz o r b a xs b - c 1 8c o l u m n ( 15 0t u r nx4 6r a i n ，5r u n ) a n dad a d d e t e c t o r t h eo p t i m a ld e t e c t i o nw a v e l e n g t h sw e r e2 5 5 m n t h ec o l u m nt e m p e r a t u r ew a s2 0 c t h ef l o wr a t ew a s1 0m l m i n n ei n j e c t i o nv o l u m ew a s5 9 l u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ， c a l i b r a t i o nc u r v e so fe a c hs u b s t i t u t e sw e r ee s t a b l i s h e d ，a n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r e o 9 9 9 6 - - - 0 9 9 9 9 t h er e c o v e r i e so fs t a n d a r di ns a m p l e sw e r ei nt h er a n g eo f8 3 0 10 0 6 a n dr s do ft h em e t h o dw a sw i t h i n3 0 t h em e t h o dh a sa c h i e v e dt h es i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o no ft h ef i v ec o m p o n e n t si n3 0m i n u t e s r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eh p l cm e t h o d se s t a b l i s h e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd a i d z i n d i n 、g l y c i t i ng l i n 、g e n i s t i ng i n 、d a i d z e i nd e n ia n dg l y c i t e i ng l e i nw e r es i m p l e ，r a p i d ， a c c u r a t ea n dw e l lr e p r o d u c i b l ew i t l ll o wd e t e c t i o nl i m i t s k e yw o r d s ：h p l c ；s o y b e a ni s o f l a v o n e ；d a i d z i nd i n ；g l y c i t i ng l i n ；g e n i s t i ng i n ；d a i d z e i n d e n i ；g l y c i t e i ng l e i n - i i i - 东北大学硕士论文 目录 独创性声明i 摘要。i i a bs t r a c t i i i 目录 第1 章绪论1 1 1 前言1 1 2 大豆异黄酮的结构、组成与性能1 1 2 1 大豆异黄酮的结构与组成1 1 2 2 大豆异黄酮的性能5 1 3 大豆异黄酮的分布与医学价值6 1 3 1 大豆异黄酮的自然分布6 1 3 2 大豆异黄酮的医学价值7 1 4 大豆异黄酮的提取技术9 1 5 国内外大豆异黄酮分析方法的研究进展1 1 1 6 选题的目的及意义1 2 第2 章方法原理1 5 2 1 引言。15 2 2 反相键合液相色谱法分离机理15 2 3 定性和定量依据16 2 - 3 1 定性分析依据1 6 2 3 2 定量分析依据1 7 2 4 样品预处理方法1 7 第3 章实验部分1 9 一一 东北大学硕士论文目录 3 1 仪器和试剂1 9 3 1 1 所用仪器1 9 3 1 2 试剂与标准品1 9 3 2 色谱条件1 9 3 3 实验方法2 0 3 3 1 样品预处理2 0 3 3 2 仪器操作2 0 第4 章结果与讨论2 1 4 1 色谱柱及其操作参数的选择2 l 4 2 流动相体系的选择2 l 4 3d a d 检测波长的确定2 2 4 4 梯度洗脱方式及洗脱程序的确定2 5 4 5 柱温的选择2 9 4 6 进样量的选择2 9 4 7 最佳色谱条件3 0 4 8 标准曲线3l 4 9 仪器精密度实验3 3 4 1 0 检出限和定量限3 4 4 1 1 样品前处理方法的确定3 5 4 1 2 回收率实验3 6 第5 章结论4 3 参考文献4 5 致谢5 1 已发表论文5 3 一v 一 东北大学硕士论文 1 1 前言 异黄酮是黄酮类化合 提取，与雌激素有相似结 泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性，是天然的癌症化学预防剂。 大豆异黄酮是非转基因大豆精制而成的生物活性物质，是一种具有多种重要生理 活性的天然营养因子，是纯天然的植物雌激素，容易被人体吸收，能迅速补充营 养。 纯天然大豆异黄酮是医药原料药及保健品原料市场的热销产品之一，2 0 0 1 年纯天然 大豆异黄酮产品正式流向市场，因其特有的功能效应( 防癌抗癌，防止骨质疏松，预防 冠心病等) 迅速成为热销产品，全年纯天然大豆异黄酮产品稍量达到十几个亿。在国外， 1 9 8 6 年，美国科学家发现大豆中抑制癌细胞的异黄酮。1 9 9 0 年6 月，美国国家癌症研 究院组织全美著名学者研讨了大豆的抗癌效果，肯定大豆异黄酮是最佳的天然物质。此 后又证实大豆异黄酮可以防止骨质疏松症，减轻妇女更年期不适症及降低冠心病的发病 率，女性美容养颜方面的有显著作用。目前，大豆异黄酮产品已引起全球范围内医药、 保健品科研工作者和生产企业的广泛关注。 1 2 大豆异黄酮的结构、组成与性能 大豆异黄酮是一种类植物雌激素，是大豆生长中形成的一类次级代谢产物，具有 与植物雌激素类似的分子结构，同时也是一种植物多酚，具有较强的抗氧化作用。 1 2 1 大豆异黄酮的结构与组成 大豆异黄酮是属于黄酮类化合物中的异黄酮成分。黄酮类化合物的基本母核为2 一 苯基色原酮的一系列化合物，目前黄酮类化合物泛指两个苯环通过三碳链相互联结而成 的一系列化合物。 大豆异黄酮是一种混合物，主要有3 类，即大豆甙类( d a i d z i ng r o u p s ) 、染料木 甙类( g e n i s t i ng r o u p s ) 、黄豆甙类( g l y c i t i ng r o u p s ) ，每类以游离型、葡萄糖甙型、 东北大学硕士论文第1 章绪论 乙酰基葡萄糖甙型和丙二酰基葡萄糖甙型等四种形式存在( 游离型一般称作甙元，后三 类则归结为结合型的糖甙形式) 。 大豆中的异黄酮分为游离型的甙元( a g l y c o n ) 和结合型的糖甙( g l y c o s i d e s ) 两类， 甙元占总量的2 3 ，包括染料木素( g e n i s t e i n ) 、大豆素( d a i d z e i n ) 和黄豆黄素 ( g l y c i t e i n ) 。糖甙占总量的9 7 - - 9 8 ，主要以染料木甙( g e n i s t i n ) 、大豆甙( d a i d z i n ) 、 黄豆甙( g l y c i t i n ) 和丙二酰染料木甙( 6 - 0 一m a l o n y g e n i s t i n ) 、丙二酰大豆甙 6 - o - m a l o n y d a i d z i n ) 、丙二酰黄豆甙( 6 - 0 一m a l o n y g l y c i t i n ) 形式存在，约占总量的 9 5 。 ( 1 ) 大豆苷( d a i d z i nd i n ) 异名大豆黄酮苷【12 1 ，黄豆苷，7 羟基3 一( 4 一羟苯基) 异黄酮7 糖苷， d a i d z e i n 7o p d g l u c o p y r a n o s i d e 。c a sn o ：5 5 2 6 6 - 9 ，分子式：c 2 1 h 2 0 0 9 ，分子量： 4 1 6 3 8 ，熔点：2 1 5 c 2 1 7 ( 分解) 针晶，无荧光，易溶于乙醇。 料o 卜 0 、 d 。 图1 1 大豆苷分子结构式 f i g 1 1d a i d z i nd i ns t r u c t u r a lf o r m u l a o 阳 h 大豆苷对低雌激素水平者，表现弱的雌激素样作用，可防治一些和激素水平下降有 关的疾病的病症，如更年期综合征、骨质疏松、血脂升高等；对于高雌激素水平者，表 现为抗雌激素活性，可防治乳腺癌、子宫内膜炎，具有双向调节平衡功能。大豆苷也具 有抗脂减肥、抗凝血、抗血栓、抗糖尿病、抗氧化、抗病毒、抗突变和抗癌等作用。 ( 2 ) 黄豆黄苷( g l y c i t i ng l i n ) 英文别名：g l y c i t e i n7 - 0 p g l u c o s i d e ；g l y c i t i n 。c a sn o ：4 0 2 4 6 - 1 0 - 4 ，分子式： c 2 2 h 2 2 0 l o ，分子量：4 4 6 4 0 ，沸点：7 5 1 1o c 【13 1 。 一2 _ 东北大学硕士论文 图1 2 黄豆黄苷分子结构式 f i g 1 2g l y c i t i ng l i ns t r u c t u r a lf o r m u l a 黄豆黄苷具有抗菌、抗病毒作用、雌激素样作用。可预防骨质疏松症、防止心脑血 管疾病、预防癌症和减少肿瘤数目、减轻或避免因雌激素减少引起的更年期综合症，以 及具有抗衰老和防止酒精中毒等功效。 ( 3 ) 染料木苷( g e n i s t i ng i n ) 别名：4 ，5 ，7 一三羟异黄酮7 糖苷， c a sn o ：5 2 9 5 9 9 ，分子式tc 2 1 h 2 0 0 1 0 ， 分子量：4 3 2 3 8 ，熔点：2 6 5 ，带黄色针状晶体，不溶于水，稍溶于热水。 h o h o 图1 3 染料木苷分子结构式 f i g 1 3g e n i s t i ng i ns t r u c t u r a lf o r m u l a - 3 - 东北大学硕士论文第1 章绪论 高金雀花碱的非活性类物质，用于反向控制高金花雀碱和其它的酪氨酸激酶抑制 剂。 ( 4 ) 大豆苷元( d a i d z e i nd e n i ) 学名：4 ，7 一二羟基异黄酮，c a sn o ：4 8 6 6 6 8 ，分子式：c 1 5 h l 0 0 4 ，分子量： 2 5 4 2 4 ，熔点：3 1 5 - - 3 1 6 ，为黄色或淡黄色粉状、味微苦，在乙醇中极微溶解，在 氯仿、水、热水中几乎不溶，在氢氧化纳溶液中溶解并分解。 h o 图1 4 大豆苷元分子结构式 f i g 1 4d a i d z e i nd e n is t r u c t u r a lf o r m u l a 0 捌 大豆苷元用于治疗妇女更年期综合症、前列腺癌、乳腺癌、心脏病、心血管病、骨 质疏松，以及高血压引起的颈项强痛、头痛、头晕、冠心病及早期神经感觉性耳聋。 ( 5 ) 黄豆黄素( g l y c i t e i ng l e i n ) 学名：4 ，7 二羟基6 一甲氧基异黄铜，c a sn o ：4 0 9 5 7 8 3 3 ，分子式：c 1 6 h 1 2 0 5 ， 分子量：2 8 4 2 6 。 粼0 o l 图1 5 黄豆黄素分子结构式 f i g 1 5g l y c i t e i ng l e i ns t r u c t u r a lf o r m u l a 一4 0 h 色粉末，熔点在1 0 0 以上，气味微苦，略有涩味，主要来源于大豆类植物的胚芽。 异黄酮类化合物与其他黄酮类化合物相比，由于苯环共轭程度与黄酮类相比较小， 因此仅显微黄色、灰白或无色，紫外线下多显紫色。大豆甙和染料木甙是大豆异黄酮的 两种主要活性成分，一般占总异黄酮含量的9 0 以上。大豆异黄酮中的染料木素呈灰白 色结晶，紫外灯下无荧光，大豆素呈微白色结晶，紫外灯下无荧光。而商品大豆异黄酮 一般纯度较低( 以4 0 为主) ，含有其他杂质成分，因生产工艺的不同，颜色从黄色至 浅黄色不等，个别生产厂家生产的产品略带红色。 大豆异黄酮中丙二酰基大豆异黄酮糖甙不耐热，在湿热情况下容易转化成相应的 糖甙型异黄酮，糖甙型大豆异黄酮对热比较稳定，在2 4 0 0 0 ( 2 以上高温时才会发生分解。 在大豆异黄酮生产过程中，大豆中含有的丙二酰基大豆异黄酮糖甙在湿热条件下已基 本全部转化成糖甙型大豆异黄酮，因而商品大豆异黄酮主要是以糖甙的形式存在，对 热比较稳定，只需在阴凉、干燥处保存即可，而不必采取特别的保护措施。 低纯度的大豆异黄酮一般具有一定的吸湿性，暴露在空气中时容易吸潮、结块， 同时颜色变深，高纯度的大豆异黄酮则很少出现上述现象。这是由于大豆异黄酮本身 并不吸潮，在低纯度的大豆异黄酮中残存有一定含量的大豆皂甙和低聚糖类，上述两 类成分都具有较强的吸湿性。 在保存大豆异黄酮时一定要密封保存，使用时尽可能一次用完，如果不能一次用 完，则应重新密封保存，以免吸潮。如果在使用过程中出现吸潮、结团现象，需重新 干燥使用，一般不会对大豆异黄酮的质量产生影响。 大豆异黄酮的甙元不具有旋光性，但对于结合型的糖甙结构而言，由于结构中引 入了糖基，因而具有旋光性。大豆异黄酮的甙元一般难溶或不溶于水，可溶于甲醇、乙 醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂中及稀碱中，大豆异黄酮的结合式甙易溶于甲醇、乙醇、 吡啶、乙酸乙酯及稀碱液中，难溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚等有机溶剂，对水溶解度 一5 一 东北大学硕士论文第1 章绪论 增加，可溶于热水。 1 2 2 2 大豆异黄酮的化学性能 大豆异黄酮分子中有酚羟基，故其显弱酸性，一般在酸性条件下比较稳定，而在强 碱性条件下，其分子母核容易发生断裂而失去活性。由于异黄酮分子中有酚羟基，故其 显酸性，可溶于碱性水溶液中及吡啶中。 大豆异黄酮中只有葡萄糖苷配基即游离型苷元的生物活性最高，大豆异黄酮 中的在加热和碱性条件下可以水解去掉丙二酰基和乙酰基而转化成。碱水解条件 p h 值为8 1 3 ，水解程度随p h 值及温度的升高而加大。大豆异黄酮在强酸高温或 酶存在的条件下可水解去掉葡萄糖基而转变成葡萄糖苷配基形式。酶解法所采用 的酶为b 葡萄糖苷酶，水解最适条件以酶的活性最高为准。 1 3 大豆异黄酮的分布与医学价值 1 3 1 大豆异黄酮的自然分布 异黄酮在自然界中的分布只局限于豆科的蝶形花亚科等极少数植物中，如大豆、 墨西哥小白豆、首楷和绿豆等植物中，一般大豆中异黄酮含量为0 1 o 5 。在每1 0 0 g 大豆样品中，含异黄酮12 8m g ，传统方法生产的分离蛋白含异黄酮1 0 2m g ，而 豆乳中含9 6 5m g ，因为豆乳含水9 3 2 7 ，相当于干物质中每1 0 0g 也含异黄酮1 0 0 m g 以上。豆腐中含异黄酮2 7 7 4m g ，其干物质含异黄酮2 0 0m g 以上。资料表明， 大豆异黄酮主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，种皮含量极少。子叶中含量为0 1 0 3 ，但由于子叶占种子总重量的9 5 以上，故子叶中异黄酮含量占总量的8 0 - - 9 0 。 胚轴中所含异黄酮种类较多，且含量较高，为1 2 ，占大豆异黄酮总含量1 0 - - 2 0 。 品种和栽培环境对大豆中的异黄酮含量和种类分布都有很大的影响。不同品种中的异 黄酮含量和种类分布有很大的差别。日本和美国大豆品种的异黄酮含量总量表现为美 国品种大于日本品种。我国大豆品种异黄酮以东北大豆中的异黄酮含量为高。另外， 水处理、热处理、发酵、凝固、添加非大豆成分以及大豆蛋白提取工艺等加工环节和 方法均显著影响大豆制品中异黄酮的含量和成分。其中发酵产品如腐乳、纳豆、豆豉 等食品中含量较大豆中高，可能是发酵过程中微生物产生能断开p 一葡萄糖昔键的酶， 大豆异黄酮在葡萄糖苷酶的作用下转化为苷元所致。在大豆中异黄酮主要以糖苷形式 存在，约占总量的9 7 - - 9 8 ，只有极少量异黄酮以游离苷元形式存在。染料木苷：大 豆苷：黄豆苷约为1 1 ：1 0 ：0 3 。 - 6 - 东北大学硕士论文第1 章绪论 1 3 2 大豆异黄酮的医学价值 大豆异黄酮在化学上作为结构类似物与雌激素活性有关【l 】，显示抑制和协同的 双向调节功效：当人体内雌激素水平偏低时，”异黄酮占据雌激素受体，发挥弱雌 激素效应，表现出提高雌激素水平的作用；当人体内雌激素水平过高时，异黄酮 以“竞争”方式占据受体位置，同时发挥弱雌激素效应，因而从总体上表现出降 低体内雌激素水平的作用。 它与脑、前列腺、膀胱、心血管、骨组织这些受体的亲和力强，而对子宫、 卵巢、乳腺等的亲和力弱，而且其活性只有雌性激素的1 1 0 0 0 , - - , 一1 1 0 0 0 0 0 ，因而避 免了补充雌激素可能诱发癌症的风险。 ( 1 ) 预防妇女更年期综合征 在妇女绝经前后，由于卵巢功能减退，体内雌激素水平下降，引起各器官组 织的功能调整不相适应，出现一系列病症，而补充雌激素可以达到预防和治疗这 类病症的目的。 妇女更年期的表现【2 4 】：潮热、出汗、畏寒、胸闷、心悸、气短、头眩、血压 波动等；出现情绪不稳定、烦躁、易激动或抑郁、多虑、失眠、记忆力减退、思 想不集中、综合判断力下降。 ( 2 ) 预防、改善骨质疏松 骨质疏松是指骨组织减少而导致骨骼脆而易碎，易骨折。常见于更年期后妇 女及老年男子( 由于激素变化或钙和维生素d 不足) 。中老年女性骨质疏松发病 率比男性高很多，主要原因是卵巢功能衰退后雌激素水平下降，骨代谢出现负平 衡，骨量减少。异黄酮可与骨细胞上的雌激素受体结合，减少骨质流失，同时增 加机体对钙的吸收，增加骨密度。 ( 3 ) 预防癌症 异黄酮是一种弱的植物雌激素，大豆是人类获得异黄酮的惟一有效来源。在 雌激素生理活性强的情况下，异黄酮能起抗雌激素作用，降低受雌激素激活的癌 症如乳腺癌的风险，而当妇女绝经时期雌激素水平降低，异黄酮能起到替代作用， 避免潮热等停经期症状发生。异黄酮的抗癌特性十分突出，能阻碍癌细胞的生长 和扩散，而且只对癌细胞有作用，对正常细胞并无影响。异黄酮还是一种有效的 - 7 - 东北大学硕士论文第1 章绪论 抗氧化剂，能阻止氧自由基的生成，而氧自由基是一种强致癌因素。可见异黄酮 的抗癌作用有多种方式和途径。 大豆产品含有5 种己知的抗癌因子，其中之一是植物雌激素( 异黄酮) ，这 是大豆食物特有的抗癌因子。科学家得出结论，染料木黄酮的抗氧化性和防止增 生的功效是其抗癌效果的主要原因。大豆异黄酮对乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列 腺癌和皮肤癌及白血病有明显的治疗作用，大豆异黄酮也可预防卵巢癌、结肠癌、 胃癌和前列腺癌的发生【5 。7 1 。长期单独服用雌激素可使乳腺癌、子宫内膜癌发生率 增加5 - - - 7 倍。大豆异黄酮物质结构和雌性激素相似，所以能结合到细胞表面的雌 性受体，同时激活其它抗癌症机制，减少了妇女因雌激素高水平患子宫内膜癌、 乳腺癌的危险性。 ( 4 ) 预防心血管疾病 心脏病也是一种与雌激素相关的疾病，作为植物雌激素的大豆异黄酮其降低 血脂、预防心脏病的机制为：雌激素样的作用促进甲状腺素分泌，促进胆汁排泄。 在降低胆固醇时能降低低密度脂蛋白( l d l ) 胆固醇，而不降低高密度脂蛋白 ( h d l ) 胆固醇，已是被充分证明了的。异黄酮作为黄酮类化合物的特色，具有 生物抗氧化作用，这一点非常重要。因为低密度脂蛋白( l d l ) 胆固醇的氧化是动 脉硬化过程的关键因子。每天接受8 0m g 染料木黄酮纯品的妇女可增加动脉弹性 约2 6 。 大豆异黄酮可降低机体对血清l d l 氧化的易感性。血清l d l 脂蛋白被氧化后， 激活人体内巨噬细胞的吞噬作用，并在动脉管壁内发展为泡沫细胞，进而形成粥 样斑块。大豆异黄酮不仅自身具有抗氧化作用，还可诱导抗氧化酶活性的增高， 提高血清l d l 的抗氧化性预防动脉血管壁粥样斑块的形成，防止血管粥样性硬化。 同时增加动脉血管的顺应性，扩张血管。大豆异黄酮还通过影响酪氨酸激酶抑制 动脉粥样硬化过程，包括泡沫细胞、脂肪样纹、增生、纤维状噬斑浸润、破裂与 溃疡，保持了心脏动脉血管的畅通无阻，预防心血管疾病的发生。 ( 5 ) 预防早老性痴呆症 早老性痴呆症是目前最常见的一种痴呆症，女性多患。近年来研究表明，人 类的大脑也属于雌激素作用的靶组织，脑内具有记忆功能的海马突触小体含雌激 素受体，医学界已证实，雌激素水平与老年性痴呆密切相关，服用大豆异黄酮和 真正的雌激素对脑部都是有益的【8 ，9 1 。 一8 一 东北大学硕士论文第1 章绪论 ( 6 ) 美容、延缓衰老的作用 大豆异黄酮的雌激素样作用可使女性皮肤光滑、细腻、柔嫩、富有弹性，焕 发青春风采【m 】。女性通过补充雌激素激活乳房中的脂肪组织，使游离脂肪定向吸 引到乳房，从而达到丰乳的效果。 研究表明：现代女性出现更年期提前现象，长期补充大豆异黄酮可使体内雌 激素维持j 下常水平，推迟绝经期，达到延缓衰老的作用。 ( 7 ) 降低胆固醇 心血管疾病( c h d ) 为多因素疾病，其中胆固醇( c h ) 起着重要作用。在日 本进行的一项5 0 0 0 人的大规模研究，其结果表明大豆异黄酮具有降低胆固醇( c h ) 抑制血栓形成的作用。在英国对年青女性的一项研究中显示了异黄酮的剂量效应 关系，每天4 5m g 以上异黄酮连续3 0 天可降低总c h 和l d l - c h 水平1 0 ，而2 3m g 异黄酮则无作用1 0 ，1 1 1 。 1 4 大豆异黄酮的提取技术 由于大豆异黄酮在其胚芽中含量较高，现有文献大都用大豆胚芽为原料进行提取， 虽然得率较高，但必需事先对大豆进行胚芽的制备与选择，这不仅增加操做工序和成本， 对原料也有相当的浪费。也有直接从大豆粉中提取异黄酮，可以避免以上缺点，但提取 得率往往不高。事实上，大豆榨油后的豆饼或豆粕，己经除去大量油脂，大豆异黄酮在 豆饼或豆粕中得到了相当的富集，应该成为很好的提取大豆异黄酮原料，可惜至今未见 从豆饼或豆粕中提取大豆异黄酮的文献报道。究其原因可能是豆饼或豆粕是富含大豆蛋 白的饲料产品，对其中的大豆异黄酮尚未引起足够重视有关。关于提取方法，已有文献 报道有醇法【1 2 ，13 1 ，酸碱法和热水法等，从提取效果和产物纯度看，醇法最有效，所以 文献报道较多，但酸碱法和热水法由于蛋白质和糖类的溶解，使提取产物变得复杂，但 只要合理解决分离富集大豆异黄酮的操作步骤，酸碱法和热水仍不失为经济，简便的提 取方法之一。 ( 1 ) 超临界萃取技术 超临界萃取技术【1 4 ，1 5 】是一种新兴的分离提取技术，它是利用临界或者超临界状态 的流体及被萃取的物质在不同的蒸汽压力下具有不同的化学亲和力和溶解能力所进行 的分离纯化操作。异黄酮的超临界萃取以c 0 2 为溶剂，它的提取率往往与萃取温度、压 力、c 0 2 消耗量、夹带剂的种类和使用量、原料的装填方式以及粒度大小等很多因素紧 一9 一 东北大学硕士论文第1 章绪论 密相关。它与传统的溶剂提取方法相比有一系列优点：提取分离步骤简单、异黄酮得率 和含量较高、提取条件温和、不会使异黄酮的生物活性成分发生变化、提取周期短、没 有有机溶剂残留、环境友好等。 ( 2 ) 大孔树脂吸附法 吸附树脂是近l o 年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，它具有物理化学 选择性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简便、解析条件温和、使用 周期长、节省费用等诸多优点，避免了有机溶剂提取分离而造成的有机溶剂回收难、损 耗大、成本高等缺陷，可广泛用于异黄酮物质的提取。 ( 3 ) 有机溶剂萃取法 此法是国内外提取异黄酮使用最广泛的方法，常用的有机溶剂主要有：乙醇、甲醇、 乙酸乙酯以及它们的水溶液。本法主要用于提取脂溶性基团占优势的黄酮类化合物，因 为异黄酮的特殊分子结构，决定了其较大的分子极性，根据相似相溶的原理，该物质可 以被这些极性溶剂溶出，进入溶液相，为下一步的纯化处理提供了条件。在有机溶剂萃 取法中最常用的溶剂是乙醇，即醇提法。提取过程中乙醇的浓度对提取结果有较大的影 响。一般认为，乙醇浓度的提高有利于异黄酮的提取，但这还跟异黄酮物质的某一特定 结构有关，高浓度适用于提取游离型的甙元形式，低浓度的乙醇适用于提取葡萄糖苷形 式的异黄酮【1 7 2 2 1 。 ( 4 ) 超声波法 超声波提取异黄酮类物质的原理是其空化作用对细胞膜的破坏有助于异黄酮类化 合物的释放与溶出，超声波使提取液不断振荡，有助于溶质扩散，同时超声波的热效应 使水温基本维持在一定温度，对原料有水浴作用。因此超声波大大缩短了提取时间，提 高了有效成分的提取率、原料的利用率【2 3 圆】。 ( 5 ) 酸解法 大豆中异黄酮类化合物提取产品中异黄酮的存在形式是糖苷结合的形式。但是这种 极性溶剂提取法存在着提取专一性不强、提取物中杂质含量高、产品成分复杂等诸多缺 点，导致异黄酮产品分离纯化困难。针对以上问题提出了酸水解法提取异黄酮的新工艺。 该方法利用异黄酮甙和异黄酮甙元在分子极性上的明显差异，采取非极性溶剂提取和酸 水解结合的方法，选择性地提取出低分子极性的大豆异黄酮甙元成分。 ( 6 ) 酶解法 它是指在异黄酮提取过程中，通过加入适当的酶发生转糖反应和酶解反应，从而使 一1 0 一 东北大学硕士论文第1 章绪论 产品异黄酮得率和含量大大提高的新兴技术。传统的醇提法，适宜提取以糖苷为中心的 水溶性异黄酮，许多油溶性的异黄酮很难提取出，致使提取率低下。此时如选用适当的 酶加入，不仅可以将油溶性的异黄酮转化为易溶于水的糖苷类而有利于提取，而且还可 通过酶反应把植物组织分解，使提取传质阻力减小，有利于提取。另外也可使提取液中 的杂质如淀粉、蛋白质、果胶等分解去除，从而简化后续分离纯化工序【3 0 碰】。 ( 7 ) 高速逆流色谱技术 这是一种不用任何载体或支撑体的液液色谱分配技术，该技术建立在单向性流体动 力平衡体系上，利用相对移动的互不混溶的两相溶剂，在处于动态平衡时将具有不同分 配比的样品组分相分离。目前已成功开发出分析型和制备型高速逆流色谱仪。h s c c c 可 以用于异黄酮的分离。该技术用于异黄酮的分离时，具有分辨率高、分离速度快、分离 纯化同步完成、产品纯度高、不存在载体对异黄酮的吸附和污染，制备量大和溶剂消耗 少等优点。 ( 8 ) 高速离心分离 高速离心分离技术是以离心机为主要设备，通过离心机的高速旋转，使离心加速度 超过重力加速度的成百上千倍，从而使沉淀速度增加，以加速料液中的沉淀并除去的一 种方法。该技术用于异黄酮的分离纯化时，与传统的溶剂沉淀法相比，避免了沉淀带走 有效成分而保证了药物的应用效果，具有省时省力、工艺流程短、成本低廉、容易实现 工业化等优点，而且由于是物理分离纯化，不会引起提取液中异黄酮总量的变化或损失。 1 5 国内外大豆异黄酮分析方法的研究进展 目前，文献报道的各种大豆异黄酮的检测方法有紫外吸收光度法【3 3 硼】，薄层分离 导数光谱法【4 ，高效液相色谱法f 4 2 _ 5 4 1 ，液相色谱一质谱法【5 5 - t o ，等。 物质的紫外吸收光谱基本上是其分子中生色团及助色团的特性，而吸收峰的波长是 和存在于分子中基团的种类及其在分子中的位置的共轭情况等有关。紫外吸收光度法是 基于物质对光的选择性吸收而建立的，它是既可定性，又可以定量检测的方法。 鞠兴荣等采用三波长紫外分光光度法测定大豆异黄酮含量，可以消除了随浓度不同 发生的本底漂移、油脂等干扰物质及吸收峰不对称给定量分析造成的影响。 袁金斌、卢建中以染料木素为标准品，3 2 5n i n 为测量波长，以染料木素计量试样中 的大豆总异黄酮。建立了测定大豆提取物及大豆展品黄酮为原料的保健食品中大豆总异 黄酮的紫外分光光度法。 东北大学硕士论文第1 章绪论 付钰洁等人建立一种检测大豆提取物中大豆异黄酮含量的快速分析方法，以葛根素 为标准品，在其紫外最大吸收峰2 5 0n l l l 处测定超声波循环提取液中大豆异黄酮的含量。 黄昀等人建立一种测定大豆中异黄酮类成分含量的紫外分光光度法分析方法。以染 料木素为对照品，利用染料木素与氢氧化钠产生反应，在2 7 1n l n 波长处有最大吸收峰， 用紫外分光光度法测定大豆中总异黄酮的含量。 刘延敏等人以大豆苷元为标准品，用紫外分光光度法检测三种市售保健品中大豆异 黄酮总浓度方法：保健品用甲醇+ 水( 8 0 + 2 0 ，v v ) 在7 0 超声提取4 0m i n ，以大 豆中的活性成分大豆苷元为标准品，检测波长2 5 4n l n ，计算样品含量。 石荣等人以大豆异黄酮成分之一染料木素为标准品，一阶导数光谱法在2 7 1n l n 测 定了总黄酮的含量染料木素标准品的线性范围为2 - 3 0i _ t g m l ，r = 0 9 9 9 9 ，平均回收率 为9 9 8 0 ，相对标准偏差为1 9 3 。 杨威等建立了同时测定保健品原料中4 种大豆异黄酮含量的高效液相色谱分析方 法。采用o d sc 1 8 色谱柱，流动相a 为甲醇：水= 1 ：1 ，流动相b 为甲醇：乙酸乙酯 = 1 ：l ，采用梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长为2 7 0n n l 。采用外标法定量大豆 苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素。该方法测定时间长，测定组分较少。 张艳舫等采用高效液相色谱法，对市场上销售的5 种国产和进口大豆异黄酮保健食 品中1 2 种大豆异黄酮的含量进行测定。对3 种苷元大豆素、黄豆素和染料木素，3 种糖 苷，大豆苷、黄豆苷、染料木苷采用各自的标准品绘制标准曲线用内标法进行定量，对 乙酰化或丙二酰化糖苷用对应糖苷的内标响应因子和转换因子来计算含量。 许晶等采用高效液相色谱法测定大豆异黄酮制品中染料木苷、黄豆苷、染料木黄酮 和黄豆苷元含量。固定相为a g i l e n t 1 1 0 0 c 1 8 柱( 39 1 5 0r a m ) ：以甲醇：水= 3 5 - - - 4 5 为流动相，进行梯度洗脱，流速为1 0 - - 2 0m l m i n ；柱温为室温；检测波长为2 6 0n n l 。 董怀海等人应用高效液相色谱一质谱法检测东北地区生产的6 个品种的大豆及其 胚芽中异黄酮的含量，检测到6 种类型的异黄酮。6 个品种的大豆全豆异黄酮含量为 0 1 5 1 o 3 8 8 ，胚芽异黄酮含量为1 4 5 6 - - - 3 0 3 ，所测大豆因品种差异而致异黄酮含 量相差1 倍以上。在天然状态下，异黄酮主要以丙二酰形式存在，所测结果在8 0 以 上。但该方法成本太高。 1 6 选题的目的及意义 从大豆中提取大豆异黄酮并开发其系列保健食品，目前已引起国内外营养学专家和 一1 2 东北大学硕士论文第1 章绪论 医药专家的高度重视。 我国是大豆生产大国，年产量达1 6 0 0