（应用化学专业论文）多溴二苯醚内分泌干扰作用的体外评价.pdf

摘要 摘要 多溴二苯醚( p o l y b r o m i n a t e dd i p h e n y le t h e r s ，p b d e s ) 作为添加型阻燃剂被广泛的应 用于塑料、纺织、建材等产品中。p b d e s 分布的广泛性、难降解性、生物富集性以及对 动物和人体的潜在危害已引起人们的普遍关注。绪论部分首先对多溴二苯醚的应用、物 理化学性质以及环境行为等方面进行了概述，从生殖毒性，神经毒性、免疫毒性以及内 分泌干扰作用等方面介绍了多溴二苯醚的毒理效应，并着重介绍了多溴二苯醚的雌激素 效应以及研究方法，说明了研究低剂量暴露条件下多溴二苯醚内分泌干扰作用的重要 性。 以e s t r o g e nr e c e p t o r ( e r ) 阳性m c f 7 细胞增殖和p s 2 基因表达为终点指标，研究 了b d e 4 7 、b d e 2 0 9 以及b d e 4 7 和b d e 2 0 9 的复合暴露的雌激素效应。结果显示， p b d e s 在1 1 0 0 0n g l 1 的研究剂量下，在低剂量暴露条件时会抑制细胞增殖以及p s 2 基因的表达，但是在高剂量暴露条件下则会促进m c f 7 细胞增殖以及p s 2 基因的表达， 显示为非单一剂量一效应关系曲线。 以人肾上腺癌h 2 9 5 r 细胞的c y p l 9 基因的表达为终点指标，研究了b d e 4 7 、 b d e 2 0 9 以及b d e 4 7 和b d e 2 0 9 的复合暴露的芳香化酶效应。结果显示，p b d e s 在1 1 0 0 0n g - l 1 的研究剂量下，在低剂量暴露条件下( 1 - 1 0 0n g l 。) 促进c y p l 9 基因的表达， 高剂量暴露下( 1 0 0 0n g l 1 ) 没有显著影响。 为初步探讨电子废物拆解导致的p b d e s 和类似物构成的复合污染的潜在的生态健 康风险，从电子废物拆解区的三黄鸡血液和肝脏样品中提取了包含p b d e s 在内的复合 污染组分，分别体外暴露乳腺癌m c f 7 细胞和m d a m b 一2 3 1 细胞6d ，检测细胞增殖 和雌激素靶基因p s 2 的m r n a 的表达。结果表明，包含多种p b d e s 在内的复合污染组 分在不产生细胞毒性的条件下，可显著抑制m c f 7 细胞增殖和雌激素靶基因p s 2 的 m l l n a 表达，表现出抗雌激素活性。此结果提示由电子废物拆解造成的复合污染对生物 体和人体可能存在潜在的生态健康风险。 关键词多溴二苯醚内分泌干扰雌激素效应m c f - 7 h 2 9 5 r a b s t r a c t a b s t r ac t p o l y b r o m i n a t e dd i p h e n y le t h e r s ( p b d e s ) a sak i n do ff l a m er e s t a r d a n t sa r ew i d e l y a p p l i e di ni n d u s t r i a lp r o d u c t s ，s u c ha sp l a s t i c ，t e x t i l e ，c o n s t r u c t i o nm a t e r i a l ，e t c p b d e sh a v e a r o u s e dg r e a tc o n c e r nb e c a u s eo ft h e i rw i d es p r e a d i n g ，s t a b l es t r u c t u r e ，a n dp o t e n t i a lr i s kt o a n i m a l h u m a nh e a l t h i nc h a r p t e ro n e ，t h ea p p l i c a t i o n ，c h e m i c a la n dp h y s i c a lp r o p e r t i e sa n d e n v i r o n m e n t a lb e h a v i o ro fp b d e sw e r ei n t r o d u c e d t h ee c o t o x i c o l o g yo fp b d e s ，i n c l u d i n g r e p r o d u c t i v ed e v e l o p m e n t a lt o x i c i t y ，n e u r o t o x i c i t y ，i m m u n o t o x i c i t y a n de n d o c r i n e d i s r u p t i o n ，w e r es u m m a r i z e d i np a r t i c u l a r , e s t r o g e n i ca c t i v i t yo fp b d e s a n dr e l a t e dr e s e a r c h m e t h o d sw e r ec l a r i f i e d t h ei m p o r t a n c et os t u d ye n d o c r i n ed i s r u p t i o no fp b d e sa tl o wd o s e w a s e m p h a s i z e d u s i n gt h ec e l lp r o l i f e r a t i o na n dp s 2g e n ee x p r e s s i o ni ne s t r o g e nr e c e p t o r ( e r ) 一p o s i t i v e m c f 一7c e l l sa se n d p o i n t s ，w ei n v e s t i g a t e de s t r o g e n i ce f f e c t so fp u r eb d e 一4 7 ，p u r eb d e - 2 0 9 ， a n de q u i p o t e n tb i n a r ym i x t u r eo fb d e - 4 7a n db d e 一2 0 9a tl o wd o s e s t h ef i n d i n g si n d i c a t e d t h a tt h et e s tp b d e ss u p p r e s s e dc e l l sp r o l i f e r a t i o na tl o wc o n c e n t r a t i o n sa n ds t i m u l a t e dc e ll p r o l i f e r a t i o na th i g h e rc o n c e n t r a t i o n s ，a n dd i s p l a y e d ab i p h a s i ce f f e c t so i lh u m a nb r e a s tc a n c e r c e l l s t h ea b o v ea n dr e l a t e df i n d i n g ss u g g e s t e dt h a tp b d e sm a ya c ta sa na g o n i s t a n t a g o n i s t ， d e p e n d i n go nt h eb i o l o g i c a le n d p o i m a n dt h ec o n c e n t r a t i o n se m p l o y e d u s i n gc y p 19g e n ee x p r e s s i o ni nh 2 9 5 rc e l l sa se n d p o i n t ，w ei n v e s t i g a t e da r o m a t a s e e f f e c t so fp u r eb d e 一4 7 ，p u r eb d e 一2 0 9 ，a n de q u i p o t e n tb i n a r ym i x t u r eo fb d e - 4 7a n d b d e 2 0 9a tl o wd o s e s t h ef i n d i n g si n d i c a t e dt h a tt h et e s tp b d e si n d u c e dc y p 19g e n e e x p r e s s i o na tl o wc o n c e n t r a t i o n s ( 1 10 0n g l 1 ) a n dh a dn oe f f e c ta th i g h e rc o n c e n t r a t i o n s ( 1o o on g l 1 ) i no r d e rt oe x p l o r ep r e l i m i n a r i l yt h ep o t e n t i a lr i s ko ft h ec o m p l e xp o l l u t a n t sc o n t a i n i n g p b d e sf r o me w a s t et r e a t i n ga r e a s ，t h ec o m p l e xp o l l u t a n t sc o n t a i n i n gp b d e sw e r ee x t r a c t e d f r o ms a n h u a n gc h i c k e ns a m p l e sf r o ma ne w a s t er e c y c l i n gr e g i o n h u m a nb r e a s tc a n c e r m c f 7c e i l sa n dm d a m b 一2 31c e l l sw e r ee x p o s e dt ot h ee x t r a c t sf o r6d ，a n dt h ec e l l i i a b s t r a c t p r o l i f e r a t i o na n dm r n ae x p r e s s i o no fp s 2 ，a l le s t r o g e n - t a r g e tg e n e ，w e r ed e t e r m i n e d r e s u l t s s h o w e dt h a tt h ee x t r a c t sh a dn oc y t o t o x i ce f f e c t sb u ts u p p r e s s e ds i g n i f i c a n t l yt h ec e l l p r o l i f e r a t i o na n dm r n ae x p r e s s i o no fp s 2i n m c f - 7c e l l s t h ee s t r a c t se x h i b i t e d a n t i e s t r o g e n i ca c t i v i t y t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tc o m p l e xp o l l u t a n t sc o n t a i n i n gp b d e sf r o m e w a s t er e c y l i n gr e g i o nh a v ec e r t a i np o t e n t i a lr i s kf o ra n i m a la n dh u m a nh e a l t h k e y w o r d sp o l y b r o m i n a t e dd i p h e n y l e t h e r se n d o c r i n ed i s r u p t i o n e s t r o g e n i ca c t i v i t y m c f 7c e l lh 2 9 5 re e l l i l l 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名：团屡日期： 学位论文使用授权声明 年j l 月址日 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密 ( 请在以上相应方格内打“4 ) 保护知识产权声明 导师的研究经费资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产 权所制定的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学和中国科学院生态环境研究中心所有，未 经征得指导教师和河北大学及中国科学院生态环境研究中心的书面同意和授权，本人保 证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反本声明，本人愿意承担 相应法律责任。 声明人：落 日期：珥年月鱼日 作者签名： 显宓日期：塑4 年月茎l 日 导师签名：二这l 窒已量l 一日期：j 耳年月卫日 第1 章绪论 第l 章绪论 摘要本章首先对多溴二苯醚的应用、物理化学性质以及环境行为等进行了概述，从内 分泌干扰作用、生殖毒性、神经毒性以及免疫毒性等方面介绍了多溴二苯醚的毒理效应， 并着重介绍了多溴二苯醚的雌激素效应以及研究方法，说明了研究低剂量条件下多溴二 苯醚内分泌干扰作用的重要性。 关键词多溴二苯醚毒理效应内分泌干扰作用雌激素效应 1 1 引言 持久性有机污染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ，p o p s ) ，是指持久存在于环境中， 可以通过食物链积聚，并对人类健康及环境造成不利影响的有机化学污染物。其对环境 的影响日益引起人们的关注。多溴二苯醚( p o l y b r o m i n a t e dd i p h e n y le t h e r s ) 是一类典型的 p o p s 。p b d e s 作为添加型阻燃剂被广泛的应用于塑料、纺织、建材等行业产品中【l 】。 p b d e s 已经在多种生物体中被检测出，近年来其污染水平呈逐年增高趋势2 钏。由于 p b d e s 化学结构与p c b s 和d d t 相似，而p c b s 和d d t 有着广泛的毒性，所以p b d e s 的毒理效应受到学者们的关注。 1 2 多溴二苯醚的生产应用 自从上个世纪7 0 年代，人们为了减少火灾发生的频率，降低火灾的危害性，在大 量商品中添加了溴代阻燃剂。常用的溴代阻燃剂主要为多溴二苯醚( p b d e s ) 、四溴双酚 a ( t b b p a ) 、六溴环十二烷( h b c d ) 和多溴联苯( p b b s ) 【5 】o 溴代阻燃剂在世界范围内被大 量生产应用，从2 0 0 4 年世界范围内溴代阻燃剂使用情况得知，在这些溴代阻燃剂中 p b d e s 的需求量最多，达到整个溴代阻燃剂销售量的6 0 。p b d e s 有五溴( p e n t a ) 、八 河北大学t 学硕十学伊论文 溴( o c t a ) 和十溴( d e c a ) = 种商品。2 0 0 1 年p b d e s 的全球产量已经达到6 7 0 0 0 吨年，是过 去近二十年总产量的两三倍，其中十溴二苯醚的使用量达到8 0 以上【6 】。 由于五溴二苯醚和八溴二苯醚对环境的危害较大，现在已经被欧盟和美国一些州政 府禁止生产使用i _ ”。十溴二苯醚以b d e 2 0 9 为主要成分，至今还在使用，尽管欧盟经过 十年的风险评价后确定十溴二苯醚作为阻燃剂不会对人类和环境造成风险，但其一直是 环境界争议的焦点【8 j 。 1 3 多溴二苯醚的物化性质及环境行为 1 3 1 多溴二苯醚的物化性质 p b d e s 是一类以碳为基础的含溴化合物。它的分子通式是c 1 2 h ( 0 9 ) b r ( 1 一l o ) ，按其所 含的溴原子数分类，共有2 0 9 种同类物，如图1 1 所示。环境中多见的如四溴二苯醚、 五溴二苯醚、六溴二苯醚、八溴二苯醚和十溴二苯醚等，分别含有4 、5 、6 、8 、1 0 个 溴原子。室温下p b d e s 的蒸气压很低，具有较强的脂溶性，1 0 9 k w 在4 2 8 9 9 之间。 p b d e s 溶解度较低，并且随着溴原子的增加溶解度逐渐变小( 见表1 1 ) 。热稳定性好， 沸点在3 1 0 一4 2 5 。p b d e s 结构稳定，不易通过物理过程和化学反应途径分解，也 不易生物降解，属于持久性有机污染物。p b d e s 的这些性质和p c b s 非常相似，可能具 有和p c b s 类似的毒性。 三画。顾2 图1 1p b d e s 的分子结构式 f i g 1 - 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fp b d e s 第1 章绪论 四漠二苯醚 随啪d i p i ，蜘y le t h e r ( t e t r a b d e ) 五滨二苯醚 p e m b n 蒯i p h e n y te t h e rfp 鲫i | b d e ) 六澳二苯醚 r l 洲p h e u y le t h e r ( h e x a d 跣) 八澳二苯醚 0 e t a b r o m o d i p h e n y le t h e r ( e e u d d e ) 十澳二暮醚 d e c a b r m o d i p h e n y le l h e r ( d e e a b d e ) c 1 2h 6 b r , 0 c u l l ，取o c 1 2 h 4 1 1 r 6 0 c u h 2 b r t 0 c n l k 埔0 4 8 5 8 ( z 6 - 3 3 ) x 1 0 5 9 - 6 2 2 5 5 6 1 8 ( z 9 7 3 ) x 1 0 6 s 7 。o 2 5 6 4 3 6 ( 4 2 9 4 ) x 1 0 。 毛9 - 7 9 2 5 咖5 ( 1 2 2 2 ) x 1 0 8 4 - 8 9 2 5 9 5 9 2( 1 0 4 。2 0 1 9 m ) 可以诱导t 4 7 d 细胞的雌激素介导基因的表达。 m e r c a d o f e l i c i a n o 等【2 8 】发现商品d e 7 1 具有弱的抗雌激素效应。h a m e r s 等2 9 1 研究发现， 四溴、七溴以及6 - o h b d e 4 7 等也具有弱的抗雌激素效应。但这些研究都是在高剂量 暴露条件下所得出的，而环境中的剂量往往要比这些剂量低很多，因此，低剂量暴露条 河北大学t 学硕十学伊论文 件下p b d e s 的雌激素效应的研究很有实际意义。 雌激素对e r 阳性人体乳腺癌m c f 7 细胞的增殖有促进作用，所以m c f 7 细胞的 体外增殖试验作为检测环境雌激素的经典方法已使用多年【5 7 ，5 8 1 。雌激素发挥生理作用主 要由雌激素( e r ) 介导，即雌激素与细胞内e r 结合为复合体，复合体与雌激素靶基因上 的受体反应元件( e r e ) 结合，从而诱导靶基因的表达，产生生物学效应m 】。p s 2 基因是 雌激素调控基因，雌激素以及类雌激素物质可以诱导其表达【5 9 , 6 0 ，p s 2 基因表达试验与 细胞增殖试验结合，可以辨别非雌激素受体介导的细胞增殖现象1 5 9 j 。 b d e 4 7 是环境中广泛存在的p b d e s 单体，其高剂量暴露下雌激素毒性研究比较广 泛，但低剂量下的雌激素效应还比较缺乏，而b d e 2 0 9 目前还在广泛应用，因此本实 验通过对b d e 2 0 9 、b d e 4 7 以及b d e 2 0 9 和b d e 4 7 的复合暴露，来研究p b d e s 在低 剂量暴露条件下( 1 1 0 0 0n g l 。1 ) 的雌激素效应。 2 1 2 实验部分 2 1 2 1 仪器与试剂 二氧化碳培养箱( 日本s a n y o 公司，m c o 一1 5 a c ) 、低温离心机( 德国e p p e n d o r f 公司，5 4 1 5 r ) 、酶标仪( b i o - r a d ，6 8 0 ) 、超微量紫外可见分光光度计( 美国n a n o d r o p 公司，n d 1 0 0 0 ) 、p c r 仪( 美国a p p l i e db i o s y s t e r m s 公司) 、全自动凝胶成像系统 ( s y n g e n e ，u k ) 、精密分析天平( m e t t l e r ，a e 2 4 0 ) 、低温冰箱( 日本s a n y o 公司) 、 倒置显微镜( 德国z e i s s 公司) 、以及制冰机、紫外透射仪、电泳仪、恒温水浴锅、超净 工作台等。 b d e 一4 7 同类物( 2 ，2 ，4 ，4 一t e t r a b r o m i n a t e dd i p h e n y le t h e r ) 和b d e 一2 0 9 同类物 ( 2 ，2 ，3 ，3 ，4 ，4 ，5 ，5 ，6 ，6 一d e c a b r o m i n a t e dd i p h e n y le t h e r ) 购自d r e h r e n s t o r f e rg m b h ( a u g s b u r g ，g e r m a n y ) 。雌二醇( 17 一p e s t r a d i o le 2 ) ，二甲基亚枫( d i m e t h y ls u l f o x i d e d m s o ) ，罗丹f 芟 ( s u l f o r h o d a m i n e b ) ，活性炭( c h a r c o a l ) 和葡聚糖( d e x t r a n ) 购自s i g m a 公司。胰蛋白酶和t r i z o l 购自i n v i t r o g e n 公司。反转录酶以及p c r 所用试剂购白天根 公司。细胞培养基等购自i n v i t r o g e n 公司。 第2 章多溴二苯醚雌激素效市的研究 2 1 2 2 细胞培养 e r 阳性乳腺癌细胞m c f 7 对雌激素敏感，能够在其诱导下加快细胞增殖和p s 2 基 因表达；而e r 阴性乳腺癌细胞m d a m b 2 31 对雌激素不敏感，雌激素对细胞增殖和 p s 2 基因表达无影响。所以通过样品对m c f 7 细胞增殖和p s 2 基因表达的影响，并与 对m d a m b 2 3 1 细胞影响比较，可以评价样品的雌激素抗雌激素活性【5 7 1 。 m c f 7 细胞( e r 阳性) 由t u f t s 大学的s o t o 教授提供。m c f 7 细胞培养于 d m e m ( d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sc u l t u r em e d i u m ) 培养基中，包含5 的胎牛血清( f e t a l b o v i n es e r u mf b s ) ( h y c l o n e ) 。m c f 一7 细胞培养于3 7 c 和5 c 0 2 的条件下，2 3d 换液。 m d a m b 2 3 1 细胞( e r 阴性) 购自中国科学院细胞库。m d a m b 2 3 1 细胞培养于 l 1 5 ( l e i b o v i t z sl 1 5 ) 培养基中，包含1 0 f b s 。m d a m b 2 3 1 细胞培养于3 7 的条 件下，2 3d 换液。 2 1 2 3 细胞增殖实验 m c f 7 细胞用胰蛋白酶消化，然后接种于9 6 孔板中，接种密度为l 1 0 4 个细胞孑l 。 当细胞贴壁之后，换含有受试物的d m e m 培养液( 含5 c h a r c o a l d e x t r a n 处理的胎牛血 清，d c c - f b s ) 。p b d e s 暴露剂量分别为1 1 0 0 0n g l 。1 ( 其中d m s o 的含量小于 0 0 0 1 ，v ) 。每个培养板中同时作对照组( 含0 0 0 1 d m s o ) $ 1 1 j t 性对照组( 1 0 以om e 2 ) 。共培养6d ，每2d 换一次液。暴露6d 后，用s r b 法对培养板中的细胞记数，方 法如下：每个孔中加入2 0 0 “l 冷的1 0 三氯乙酸孵育2 0r a i n ，用自来水冲洗三遍放至 干燥，待之完全干燥后往每个孔中加入1 0 0l a l0 4 罗丹明( s u l f o r h o d a m i n e bs r b ) 染 色2 0r a i n ，之后用l 的乙酸冲洗细胞三遍，待浮色洗尽后，放至完全干燥，然后加入 1 0 0 “l ( 1 0n l n ) t r i s 溶液，用振荡器振荡3 0s ，最后用酶标仪测定其吸光度( 波长为4 9 0 r i m ) 。用m d a m b 2 3 1 细胞对p b d e s 的雌激素效应进行了同样的增殖试验，用以和 m c f 7 细胞进行比较。细胞增殖试验重复两次。 2 1 2 4p s 2 基因扩增实验 在接种9 6 孔板的同时，将m c f 7 细胞接种于2 4 孔板中，接种密度为2 x 1 0 4 个细胞 孔。每个处理包含3 个重复孔。接种一天待细胞贴壁后，用与细胞增殖试验同样的方法 暴露p b d e s ，每2d 换一次液。6d 后用t r i z o l 提取细胞r n a ，取l l a gr n a 反转录成 河北大学t 学硕十学位论文 e d n a ，反转录体系总体积为2 0 l ，3 7 反应6 0m i n ，然后在9 4 下反应2m i n 。p c r 扩增3 6 8 4 基因( 管家基因) 和p s 2 基因。3 6 8 4 基因引物序列为5 a a ac t g c t gc c t c a t a t cc g 3 a n d5 - t t tc a g c a ac t gg g a a g g t o 3 1 6 1 。p s 2 基因的引物序列为 5 - g c ga a gc t tg g c c a cc a tg g a g a a c a ag g 3 a n d5 g c gg a tc c a c g a a c g g t gt c g t c ga a 3 ，【6 2 1 。p c r 的反应条件为：9 4 。c 下酶失活2m i n ，然后扩增条 件为2 5 个循环，每个循环为9 4 。c4 5s ，5 5 。c ( p s 2 ) o r6 3 。c ( 3 6 8 4 ) 4 5s ，7 2 。c4 5s ，最 后在7 2 。c 条件下延伸7m i n ，放入4 。c 冰箱保存。p s 2 和3 6 8 4 扩增产物大小分别是1 8 9 b p 和5 6 2b p 。p c r 产物用含1 2 的琼脂糖电泳跑胶，用凝胶成像系统进行照相分析。 独立的基因表达试验共重复两次。 2 1 2 5 数据分析 采