（生物物理学专业论文）螺旋藻种质与形态重建的分子遗传学研究.pdf

一一 摘要 本论文利用r a p d 分子标记及抗生素抗性标记分析了不同钝顶螺旋藻品系的 遗传多态性，并与其形态学特征进行了比较，以期建立更合理的螺旋藻分类方法及 加深对螺旋藻遗传背景的了解；同u , l ，发现在养殖环境下变直藻丝体可以回变为正 常螺旋形态的现象。在比较了正常藻丝体、变直藻丝体及回复正常螺旋形态的藻丝 体一组材料生物学特性的基础上，进一步在蛋白质及d n a 水平上找到了转座子调 控此形态变异的某些证据，为阐明螺旋藻形态变异与重建的分子遗传学机制以及解 决螺旋藻大规模生产的实际问题提供理论依据。研究主要结果如下： 1 螺旋藻种质形态及r a p d 分子标记的研究 对s p d 、s p z 、s p s 、s p b 、s p - c 、s p f 1 和s p f 2 等7 株钝顶螺旋藻材料的 藻丝体及细胞的形态学特征进行了统计分析。结果表明，它们的形态具有一定差 异。 以含水量约为1 0 的冷冻藻泥为材料，采用c t a b 缓冲液及二次沉淀提取 法，建立了一个可获得较高纯度和得率、适用于r a p d 分析的螺旋藻基因组d n a 制备方法。在此基础上，采用优化后的提取方法制备s p d 等7 株钝项螺旋藻的基 因组d n a ，利用1 0 6 条随机引物对其进行r a p d 扩增，从中筛选出2 3 条多态性引 物，其扩增出的总条带数为1 5 l ，多态性条带数为1 2 0 。用n e i s 公式与欧氏距离 类平均法对此扩增结果进行聚类与亲缘关系分析。结果表明，r a p d 分类结果与7 株材料的某些生理生化和分子生物学特性相吻合。因此，r a p d 分子标记可以在分 子遗传学水平上作螺旋藻分类的重要依据，结合螺旋藻的形态特征，建立更科学合 理的分类方法。 2 螺旋藻抗性标记的研究 采用s p d 、s p - j 、s p z 、s p - s 、s p b 、s p c 、s p f 1 等7 个正常螺旋形的钝顶 螺旋藻藻株、一个辐射诱发藻丝超长的突变体藻株s p z ( s l ) 及2 个由螺旋形变为直 线形的藻株s p d ( l ) 与s p j ( l ) ，就其对氯霉素、青霉素、卡那霉素、洁霉素及链霉 素等5 种抗生素标记的抗性进行了分析与比较，结果表明：( 1 ) 1 0 株钝顶螺旋藻对 卡那霉素、氯霉素及链霉素的抗性表现较为一致。对卡那霉素的抗性均为极强；对 链霉素的抗性较小，i c ，。为5 6 4 7 6 0 ug m l ；对氯霉素的抗性最小，i c ”为1 3 1 2 1 5ug m l 。( 2 ) 1 0 株钝顶螺旋藻对青霉素和沽霉素的抗性，因螺旋藻藻株的不同 有较大差异。其中s p z 和s p s 对青霉素的抗性较强；s p c 其次；s p d 、s p d ( l ) 、s p z ( s l ) 的生长虽受到青霉素的明显抑制，但未能完全致死；s p - j 、s p - j f l l 、s p 。b 、s p f 1 可被全部致死，因此它们对青霉素的敏感性最强，抗性最小。 同时，s p d 、s p - j 、s p z 和s p c4 个藻株对洁霉素抗性较强，而其余6 个藻株则 对洁霉素的作用较为敏感。( 3 ) s p d 、s p _ j 及s p z3 株正常形态的钝顶螺旋藻品系 与其形态变异( 或突变) 藻丝体s p d ( l ) 、s p - j ( l ) 及s p z ( s l ) 对洁霉素的抗性存在差 异，该差异可能与其形态变异有关。 3 养殖环境下变直螺旋藻回复正常形态的发现及形态变异相关蛋白的研究 首次发现在养殖环境下钝顶螺旋藻s p m 藻株的变直藻丝体s p m ( l ) 可以回变 为正常螺旋形态藻丝体s p m ( l h ) ，且生长速率和细胞组成等可几乎完全回变。采 用含s d s 的缓冲液提取蛋白，以2 0 、3 0 、4 0 及8 0 ( v v ) 丙酮分级沉淀，对 s p m 、s p - m ( l ) 和回变藻丝体s p m ( l h ) 不同蛋白级分进行梯度凝胶电泳分析。结 果发现，3 种材料以2 0 、3 0 、4 0 丙酮沉淀的蛋白级分电泳图谱均相同；在 8 0 ( v v ) 丙酮沉淀的蛋白级分中，s p m 与s p m ( l h ) 两种螺旋形藻丝体都存在分子 量为5 3 7k d 的一条蛋白带，而直线形藻丝体s p m ( l ) 则缺失此带，表明此5 3 7k d 蛋白与螺旋藻的形态变异相关。 4 转座子调控螺旋藻形态重建的分子遗传学研究 根据螺旋藻中已知的转座子分别设计合成上游及下游各一组半套式引物，通过 对半套式引物有效性、随机引物和半套式引物的退火温度与反应浓度以及有效半套 式引物组合与随机引物的筛选试验，建立了可特异性扩增转座子在基因组上位点旁 侧序列的u n e v e np c r 分析技术。 用筛选出的有效的随机引物$ 5 3 与半套式引物组合p u 2 p u 3 p u 4 、s 8 9 与p d 一 1 p d 一2 p d - 4 配对，从s p - m 的基因组d n al | j 分别扩增出了已知转座子的上游和下 游目的片段( s p - m u 和s p - m d ) 。测序结果表明。s p m u 为5 1 3b p ，其中3 0 6b p 与 转座子的5 端重合；s p m - d 为5 8 lb p ，其l j8 8b p 与转座子的3 端重合。根据 s p m u 及s p m d 中的转座子外侧碱基顺序设计一对可向内扩增的引物，以s p m 的基因组d n a 为模板进行p c r 扩增。其产物的测序结果表明，其中正好包含已知 转座子及s p m u 和s p m d 中引物内侧的序列，从而进步证实s p - m u 和s p m - d 即为转座子在基因组上存在位点的上游及下游旁侧序列，且属于同一个转座子拷 贝。在此基础上，采用同样的u n e v e np c r 方法，以随机引物s 1 1 2 和$ 5 3 分别获得 了s p - m ( l ) 与s p m ( l - h ) 的转座子上游序列s p m ( l ) - u 和s p m ( l - h ) - u 。s p m ( l ) - u 为3 7 3b p ，其中3 0 7b p 与转座子的5 端重合：s p - m ( l h ) u 为4 4 2b p ，其中3 0 3 b p 与转座子的5 端重合。表明它们分别为s p m ( l ) 与s p m ( l h ) 基因组中转座子 的上游片段。通过对s p - m u 、s p m ( l ) 一u 及s p m ( l h ) 一u 的比较，首次发现s p m 在变为直线形藻丝体s p m ( l ) 的过程中，转座子在基因组上的存在位点可能也发生 了改变：而当s p m ( l ) 回变为正常螺旋形态的s p m ( l h ) 后，转座予又回到了原来 的位置。表明螺旋藻藻丝体变直及直线形藻丝体回变为正常螺旋形的形态变异及重 建与转座子调控有关。j a b s t r a c t i nt h i ss t u d y ，g e n e t i cd i v e r s i t yo fv a r i o u ss t r a i n so fs p i r u l i n ap l a t e n s & i sa n a l y z e d w i t hr a p dm o l e c u l a rm a r k e ra n da n t i b i o t i c sm a r k e r ，t h er e s u l t sa r ec o m p a r e d w i t ht h e i r m o r p h o l o g i cc h a r a c t e r s ，a i m e d a tc o n s t r u c t i n gam o r er e a s o n a b l ec l a s s i f i c a t i o nc r i t e r i o n a n dk n o w i n gm o r ea b o u tt h eg e n e t i cb a c k g r o u n do fs p i r u l i n a a d d i t i o n a l l y ，i ti sf o u n d t h a tu n d e rt h ec u l t i v a t e dc o n d i t i o nt h el i n e a rf i l a m e n tc a nr e t r a n s i t et ot h en o r m a lc u r v e d o n ew h i c hi ss i m i l a rt o o r i g i n a ls p i r a lf i l a m e n t b yc o m p a r i n g t h e b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c so fo r i 6 i n a ln o r m a lf i l a m e n t ，l i n e a rf i l a m e n ta n dt h ec u r v e df i l a m e n t r e t r a n s i t e df r o ml i n e a rf i l a m e n t ，c e r t a i ne v i d e n c eo ft h em o r p h o l o g i cv a r i a t i o nr e g u l a t e d b y a s p e c i a lt r a n s p o s o na r ed e t e c t e do n t h el e v e lo f p r o t e i na n dd n a ，w h i c h w i l lh e l pu s t od i s c o v e rt h em e c h a n i s m so f t h i sm o r p h o l o g i cv a r i a t i o no nm o l e c u l a rg e n e t i c sl e v e la n d s o l v et h ep r o b l e mi n p r o d u c t i o no fs p i r u l i n ai nl a r g es c a l e t h em a i nr e s u l t s a r ea s f o l l o w s ： 1 s t u d i e so nt h es p i r u l i n am o r p h o l o g ya n di t sr a p dm o l e c u l a rm a r k e r a n a l y s i s m o r p h o l o g i c c h a r a c t e r so ff i l a m e n t sa n dc e l la b o u ts e v e ns t r a i n so fs p i r u l i n a p l a t e n s i s ( s p - d ，s p z ，s p s ，s p b ，s p c ，s p f i ，s p - f 2 ) a r es t a t i s t i c a l l ya n a l y z e d t h e r e s u l t ss h o wt h a tt h e yh a v es o m e m o r p h o l o g i cd i f f e r e n c e a p r e p a r a t i o nm e t h o do fg e n o m ed n a i ns p i r u l i n aw i t hh i g hq u a l i t ya n dh i g h e x t r a c t i o nr a t ef o rr a p da n a l y s i si ss t u d i e d t h e h i g hq u a l i t yg e n o m ed n aw a s o b t a i n e df r o mt h ep e l i t o m o r p h i cs p i r u l i n aa b o u t10 w a t e rc o n t e n ta f t e r l y o p h i l i z e d ， i s o l a t e dw i t hc t a bb u f f e ra n d t w o t i m e p r e c i p i t a t i o nm e t h o d a n d t h eg e n o m ed n ao f s e v e ns t r a i n so f s p i r u l i n ap l a t e n s i sa sm e n t i o n e da b o v ea r ea n a l y z e dw i t h1 0 6r a n d o m p r i m e r su s i n gr a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) t e c h n i q u e w i t ht h e 10 6 r a n d o mp r i m e r s ，2 3p r i m e r sr e v e a l e dt h e i ro b v i o u sp o l y m o r p h i s m sa n d g e n e r a t e da t o t a l o f151 f r a g m e n t s ，1 2 0o fw h i c hw e r e p o l y m o r p h i c c a l c u l a t e dw i t h n e i 。sf o r m u l aa n dt h e u n w e i g h t e dp a i r - g r o u pm e t h o dw i t ha r i t h m e t i ca v e r a g e s ( u p g m a ) ，t h ec l u s t e ra n a l y s i s r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ec l a s s i f i c a t i o no fs e v e ns t r a i n so f s p i r u l i n ap l a t e n s i sw i t h r a p dm a r k e r si sc o n s i s t e n tw i t hs o m eo ft h e i rp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r s a sw e l la ss o m em o l e c u l a rb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s s o ，r a p d m a r k e rc a nb eu s e da sa n i m p o r t a n tp r o f i l ei nt h ec l a s s i f i c a t i o n o f s p i r u l i n aa td n a l e v e l am o r es c i e n t i f i ca n d r e a s o n a b l ec r i t e r i o nf o rt h es p i r u l i n ac l a s s i f i c a t i o n c a nb ee s t a b l i s h e dw i t hr a p d t e c h n i q u ea n dm o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s 2s t u d i e so nt h ea n t i b i o t i cm a r k e r si ns p i r u l i n a t h et o l e r a n c eo fs e v e ns t r a i n so fn o r m a lf i l a m e n t s ( s p - d ，s p j ，s p - z ，s p s ，s p b ， s p c ，s p - f 1 ) ，as u p e r l o n gs t r a i ni n d u c e db yi r r a d i a t i o n s p z ( s l ) 】，t w os t r a i n so f l i n e a r f i l a m e n t sv a r i a t e df r o mn o r m a lf i l a m e n t s s p d ( l ) a n ds p - j ( l ) 】o fs p i r u l i n ap l a t e n s i st o 5k i n d so f a n t i b i o t i c s ( c h l o r o m y c e t i n ，a m p i c i l l i n ，k a n a m y c i n ，l i n c o m y c i n ， s t r e p t o m y c i n ) i sa n a l y z e d a n dc o m p a r e ds t a t i s t i c a l l y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ：( 1 ) t o l e r a n c eo ft e ns t r a i n st ok a n a m y c i n ，c h l o r o m y c e t i na n ds t r e p t o m y c i na r ec o n s i s t e n t w i t he a c ho t h e r a l lo ft h e ma r eh i g h l yt o l e r a n tt o k a n a m y c i n ，b u tc o m p a r a t i v e l y s e n s i t i v et os t r e p t o m y c i n ，o fw h i c ht h em e d i a ni n h i b i t e dc o n c e n t r a t i o n ( i c 5 0 ) i sb e t w e e n 5 6 4ug m la n d7 6 0ug m l ，a n dt h em o s ts e n s i t i v et oc h l o r o m y c e t i n ，o fw h i c ht h e m e d i a ni n h i b i t e dc o n c e n t r a t i o no c 5 0 ) i sb e t w e e n1 3 1ug m la n d2 1 5ug m 1 ( 2 ) t h e t o l e r a n c eo ft e ns t r a i n st oa m p i c i l l i na n dl i n c o m y c i na r eq u i t ed i f f e r e n t a m o n gt h e m ， s p - z a n d s p sa r er e m a r k a b l yt o l e r a n tt oa m p i c i l l i n n e x tt ot h et w o i ss p c t h o u g ht h e g r o w t h o f s p - d ，s p - d ( l ) a n ds p z ( s l ) i sd i s t i n c t l yi n h i b i t e db ya m p i c i l l i n ，t h e ya r es t i l l a l i v ei nt h ec u l t u r e s ；w h e r e a ss p - j ，s p j ( l ) ，s p ba n ds p f ia r el e t h a li nt h i sc o n d i t i o n i t m e a n st h a tt h e ya r em o s ts e n s i t i v et oa m p i c i l l i n m e a n w h i l e ，t h er e s u l t ss h o wt h a ts p - d ， s p j ，s p - za n ds p - ca r er e l a t i v e l yt o l e r a n tt ol i n c o m y c i n ，b u tt h eo t h e r6s t r a i n so f m e t e r i a l sa r en o t ( 3 ) s p - d ，s p - ja n ds p zd i f f e rw i t ht h e i rm o r p h o l o g i c a lv a r i e t i e so r m u t a n ts p - d ( l ) ，s p j ( l ) a n ds p - z ( s l ) a b o u tt h et o l e r a n c et ol i n c o m y e i n ，t h er e a s o no f w h i c hi sp r e s u m a b l yr e l a t e dt ot h e i r m o r p h o l o g i c a lv a r i a t i o n 3 ad i s c o v e r yo ft h er e t r a n s i t i o nf r o ml i n e a rf i l a m e n tt on o r m a lc u r v e ds h a p ef i l a m e n t u n d e rt h ec u l t i v a t e dc o n d i t i o na n dt h e s t u d y o nt h e p r o t e i n r e l a t e dw i t ht h i s m o r p h o l o g i c a l v a r i a t i o n i ti sf o u n di nt h ef i r s tt i m et h a tt h el i n e a rf i l a m e n ts p - m ( l ) v a r i e df r o m s p ms t r a i n o f s p i r u l i n ap l a t e n s i sc a nr e t r a n s i t et on o r m a lc u r v e ds h a p ef i l a m e n t s p - m ( l h ) 】i n p r o d u c t i o n t h eg r o w t h r a t ea n dc e l li n g r e d i e n tw i l la l m o s t l y r e s t o r ea f t e rt h er e t r a n s i t i o n t h et o t a l p r o t e i no ft h et h r e em a t e r i a l s s p m ，s p m ( l ) a n ds p - m ( l h ) ，w h i c h a r e i s o l a t e dw i t hs d sp r o t e i n i s o l a t i o nb u f f e r s ，g r a d e - p r e c i p i t a t e db y2 0 ，3 0 ，4 0 a n d 8 0 ( v v ) a c e t o n e ，a r ea n a l y z e dw i t hs d sg r a d i e n lp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ee l e c t r o p h o r e s i sm a p so ft h ep r o t e i ng r a d e p r e c i p i t a t e db y2 0 ， 3 0 a n d4 0 ( v v ) a c e t o n eo ft h r e em a t e r i a l sa r es i m i l a r o ft h ep r o t e i np r e c i p i t a t e db y 8 0 a c e t o n e ，t h e r ei s ab a n do f5 3 7k ds h o w e di nt h ee l e c t r o p h o r e s i sm a p so ft w o s p i r i a lf i l a m e n t s ，b u tn o ti nt h es t r a i g h tf i l a m e n t i ti sp r e s u m e d t h a tt h i s5 3 7k d p r o t e i n m a y b er e l a t e dt ot h em o r p h o l o g i c a lv a r i a t i o n 4 s t u d i e so nt h em o l e c u l a rg e n e t i c so ft h em o r p h o l o g i c a lv a r i a t i o na n dt h er e t r a n s i t i o n o f s p i r u l i n ar e g u l a t e db yt h et r a n s p o s o n a c c o r d i n gt ot h es e q u e n c eo ft r a n s p o s o na sk n o w ni n 印i r u l i n a , as e to fn e s t e d s e q u e n c e s p e c i f i cp r i m e r sf o ru p s t r e a ma n dd o w n s t r e a ma m p l i f i c a t i o na r ed e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d ，r e s p e c t i v e l y t h ee f f i c i e n c y o ft h en e s t e d p r i m e r s ，t h ea n n e a l i n g t e m p e r a t u r e sa n dt h ef i n a lc o n c e n t r a t i o no ft h er a n d o mp r i m e r sa n dt h en e s t e dp r i m e r s a r et e s t e d a tt h es a m et i m e ，t h ee f f i c i e n c yo ft h en e s t e d p r i m e r c o m b i n a t i o na n dt h e r a n d o m p r i m e r s a r ea l s os c r e e n e df o ro p t i m i z i n gt h eu n e v e np c rm e t h o d o nt h eb a s i so ft h i s ，t h e u p s t r e a ma n dd o w n s t r e a ms e q u e n c e si n t h eg e n o m e f l a n k i n gt h et r a n s p o s o n ( s p m ua n ds p - m - d ) a r eo b t a i n e df r o ms p ms t r a i no f s p i r u l i n a p l a t e n s i s a m p l i f i e dw i t hr a n d o mp r i m e rs 5 3v r t h en e s t e dp r i m e r c o m b i n a t i o np u 一2 p u 一 3 p u 4a n dr a n d o m p r i m e r $ 8 9v r t h e n e s t e d p r i m e r c o m b i n a t i o np d 1 p d - 2 p d 4 ， r e s p e c t i v e l y t h es e q u e n c i n gr e s u l t ss h o wt h a ts p - m ui s513b p ，3 0 6b po fw h i c hi s s u p e r p o s e dw i t h5 - t e r m i n a lo f t h et r a n s p o s o n ；s p - m di s5 8 1b p ，8 8b po f w h i c hi st h e s u p e r p o s i t i o no ft h ey - t e r m i n a lo ft h et r a n s p o a o n t w os p e c i f i cp r i m e r su sa n dd sa r e d e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ep a r ts e q u e n c e so fs p m ua n ds p m do u to ft h et r a n s p o s o n ， w i t hw h i c ht h ea m p l i f i e dd i r e c t i o n i sr e v e r s e d t h es e q u e n c i n gr e s u l to f t h ep c r p r o d u c t w i t hs p mg e n o m ed n a a st e m p l a t es h o w st h a ti tc o n t a i n st h et r a n s p o s o nf r a g m e n ta n d t w op a r ts e q u e n c e so f s p m ua n ds p m di n s i d et h ep r i m e ru sa n dd s t h i sc o n f i r m s t h a t s p 。m u a n ds p - m da r et h eu p s t r e a ma n dd o w n s t r e a m s e q u e n c e sf l a n k i n gt h e t r a n s p o s o ni ng e n o m ed n a o f s p m ，a n dt h e yb e l o n gt oo n et r a n s p o s o nc o p y w i t ht h es a m em e t h o d ，t h eu p s t r e a ms e q u e n c e s 【s p - m ( l ) - ua n ds p m ( l - h ) 。u 】 f r o m s p m ( l ) a n ds p m ( l - h ) a r e o b t a i n e d b y r a n d o m p r i m e r s 11 2 a n d $ 5 3 ， r e s p e c t i v e l y s p m ( l ) - ui s3 7 3b p ，3 0 7b p o fw h i c hi ss u p e r p o s e dw i t h5 - t e r m i n a lo ft h e t r a n s p o s o n ；s p m ( l h ) 一ui s4 4 2b p ，3 0 3b po f w h i c hi ss u p e r p o s e dw i t h5 - t e r m i n a lo f t h et r a n s p o s o n t h e s em a k es u r et h a tt h et w of r a g m e n t sa r et h eu p s t r e a ms e q u e n c e s f l a n k i n g t h e t r a n s p o s o n i n g e n o m ed n a o fs p - m ( l ) a n ds p - m ( l h ) ，r e s p e c t i v e l y c o m p a r e d t h e s et w os e q u e n c e sw i t hs p m u ，i ti sf o u n di nt h ef i r s tt i m et h a tt h es i t eo f t r a n s p o s o ni ng e n o m ed n ai sp o s s i b l yc h a n g e dw h e nt h es p i r a l f i l a m e n t so fs p m t r a n s i t et ol i n e a rf i l a m e n t so f s p - m ( l ) ，a n da f t e rt h er e c o v e r yt oc u r v e ds h a p ef r o ml i n e a r f i l a m e n to f s p - m ( l ) ，t h et r a n s p o s o nm a y b eb a c kt ot h eo r i g i n a ls i t ei ng e n o m ed n a ，t o o i ti sa s s u m e dt h a tt h i sk i n do fm o r p h o l o g i c a lv a r i m i o n ( f r o mh e l i xf i l a m e n t st o l i n e a r f i l a m e n t sa n dl i n e a rf i l a m e n t s r e s t o r e dt on o r m a lh e l i x s h a p e ) m a yb er e l a t e d t o t r a n s p o s o nr e g u l a t i o n 本研究获下列资助： 国家自然科学基金项目( 批准号：3 0 0 0 0 0 1 0 ) 浙江省科委“九五一重点资助项目( 批准号l9 6 1 1 0 2 2 0 8 0 0 1 ) 致谢 在此论文完成之际，谨向恩师凌备备教授和赵玉芳副教授致以最诚挚的谢意 和衷心的祝福。导师凌备备教授学识广博、思维开阔、治学严谨，从研究思路到论 文撰写都给予了宝贵意见和悉心指导。导师赵玉芳副教授在我硕士阶段的悉心指 导，给我打下了研究工作的基础。同时，她宽容乐观的生活态度和坦荡纯厚的为人 也给我留下了极为深刻的印象。五年来，导师在学术上循循善诱，在生活上关心入 微，这一切学生将永远铭记在心，并以此激励自己不断进取。 在论文完成的过程中，从研究思路、实验方法直至论文撰写，核农所汪志平 博士给予了许多宝贵的指导和无私帮助。他活跃的思维和勤勉的敬业精神令我由衷 敬佩。在此表示深深的谢意。 本论文研穷过程中，特别感谢核农所崔海瑞副教授在实验操作与分析方面给 予的许多帮助与指导。本论文的克隆与测序工作是在生命科学学院完成，感谢吴平 教授慷慨提供的实验条件，同时感谢易可可老师提出的宝贵建议与给予的热情帮助 和支持，以及刘非燕老师对完成测序工作的协助。论文的蛋白质电泳分析部分在动 物科学学院完成，感谢周继勇教授的大力支持。同时，感谢生命科学学院邱英雄老 师协助对部分实验数据进行分析，以及生化所金勇丰副教授在实验技术方面给予的 帮助和指点。 感谢本所的陈子元院士、孙锦荷教授、徐步进教授、舒庆尧教授、沈伟桥副 教授、傅俊杰副教授、叶庆富副教授、包劲松副教授以及其他老师对我的一贯关心 与鼓励。感谢本实验室的张世民老师和生命科学学院的翁晓燕博士在实验过程中给 予的帮助。 在论文研究过程中，农业与生物技术学院的彭锁堂博士、李英博士、生命科 学学院的姜华武博二i ：、杨玲博二i ：、 ! 首锋博1 ：、金维证博士、郑炳松博士、毛传澡 博士、陈双燕博士、吴忠长博士、杜黎明硕士、佃蔚敏硕士、张世龙硕士、王小兵 硕j ：、动物科学学院的程丽琴博士、李建荣博士、陈吉刚硕士、张德勇硕士等许多 老师和同学在实验技术与分析方面都给予了热情的帮助和指点，在此一并向他们表 示衷心的感谢。同时，也感谢这几年米与我朝夕相处的徐兵、蔡志强、赵希岳、张 明洲、刘丽丽、马美萍以及吴立成、商冠军、刘新、徐强、池晓菲、范j 下琪、曹学 成、刘艳辉等同学对我的帮助与支持。 最后，感谢家人长期以来对我的理解与支持，是他们的无私关爱给了我克服 困难的勇气和动力，使我能够顺利完成学业。 谨以此文献给所有关心和帮助我的人们! 李晋楠 2 0 0 2 年5 月于华家池 本论文创新之处： 1 首次利用r a p d 分子标记对不同钝顶螺旋藻种质进行了分类研究，获得了其 在分子遗传水平上的聚类分析结果。 2 首次利用抗性标记对不同钝顶螺旋藻种质进行了分子遗传背景的比较研究， 获得了有意义的结果。 3 首次在养殖环境下发现变直藻丝体能回变为正常螺旋形态的藻丝体。 4 首次发现螺旋藻的转座子在基因组d n a 上的存在位点随其形态重建而变 化，表明螺旋藻变直及形态重建的过程与转座子调控有关。 第一章文献综述 1 螺旋藻及其形态学与遗传学的研究进展 1 1 概述 螺旋藻( s p i r u l i n a ) 是一种光合放氧的原核丝状微藻，系蓝藻f ( c y a n o p h y t a ) 、颤 藻目( o s c i l l a t o r i a l e s ) 、颤藻科( o s c i l l a t o r i a c e a e ) 的一个属( o r i o ，1 9 8 1 ) 。目前已发现钝 顶螺旋藻( s p i r u l i n a p l a t e n s i s ) 、极大螺旋藻( 印i r u l i n am a x i m a ) 、巨型螺旋藻( 印i r u l i n a m a j a r ) 、盐泽螺旋藻( s p i r u l i n as u b s a l s a ) 、椭圆螺旋藻( s p i r u l i n af u s i f o r m i s ) ；f 1 强氏螺 旋藻( s p i r u l i n aj e n n e r i ) 等3 8 个种。螺旋藻砷：地球上已有3 5 亿年的生存历史，是最 早进行光合作用的生物之一( 胡鸿钧，1 9 9 7 ) ，广泛分析i 于土壤、沼泽、温泉、淡、 成水湖泊及海洋中( o r i o ，1 9 8 3 ：彭白露等，1 9 9 3 ；吴丌国，1 9 9 8 ) 。大多数螺旋藻 喜高温( 2 8 3 5 ) 、高碱( p h 8 5 1 0 5 ) 和高盐环境，在一些不适合其它生物的极 端环境，如高盐碱度的湖泊中，螺旋藻都能良好生l ( ：( 1 l t i s 和c a h i e r s ，1 9 7 3 ) 。象大 多数蓝藻一样，螺旋藻能利用光能将c o ，转化为有机物，且光能转化率高达1 8 ， 因而具有巨人的生产潜力f 李乐农和郭宝江，1 9 9 8 ) 。 1 9 3 9 年，法国探险家兼药物学家g r e a c h 在非洲的乍得湖首次发现被当地土著 居民作为食物食用的螺旋藻，但直至1 9 6 5 年，法国的c l e m e n t 博士和比利时植物 学家j e a nl e o n a r d 对螺旋藻的重新发现以及第一次对其分离培养实验的报道，才引 起了n i 在为世界人j 二l 急剧增长和食品短缺而忧虑的科学家们的高度重视( c i r r i 和 l i b o n i ，1 9 8 5 ) 。