（药理学专业论文）中国青岛文昌鱼c型凝集素amphictl的发现及其相关性质研究.pdf

巾山大学硕士学位沦文 摘要 文昌鱼是一个介于脊椎动物与无脊椎动物的过渡物种，其天然免疫系统相对完 善。参与模式识别反应的模式识别受体在文昌鱼的天然免疫系统中发挥着荤要的作 用。本文通过一系列研究手段，对中国青岛文昌鱼的一个第组c 型凝集素进行研 究，以阐述c 型凝集素在文昌鱼如何通过识别并排除病原体而发挥作用，并进一步 确定模式识别受体在文昌鱼天然免疫中的重要地位。 我们从青岛文昌鱼全鱼c d n a 表达文库的e s t 分析中发现了一个编码c 型凝 集紊结构域的c d n a 序列。克隆到序列全长，命名为a m p h i c t l 。经分析确定这是 一个编码一个n 一末端的信号肽及一个c 一末端的c 犁凝集素结构域的c 型凝集素序 列。整体结构与脊椎动物的第组c 型凝集素一致。 通过r e a l t i m e p c r 和成体切片原位杂交检测了a r n p h i c t l 的表达模式。在胚胎 的发育早期( 囊胚、，原肠胚) ，a m p h i c t l 。的表达量达到顶峰。a m p h i c t l 在所 有组织中均有表达，在肝肓囊中表达量最高，存皮肤和消化道表达量也比较高。在 对文昌鱼进行免疫刺激后，发现文昌鱼在革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 ( s t a p h y l o c o c c u s “r e “5 ) 的感染下却能够引起高达4 0 0 倍基因表达量上调，酵母聚 糖( z y m o s a n ) 和酿酒酵母( s a c c h a r o m yc e s c e r e v i s i a e ) 刺激后a m p h i c t l 的表达量 提高至7 0 倍。 本文构建了重组融合蛋白表达载体p t r x a m p h i c t l ，在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中进行了原核表达，并j ； jn r c h e l a t i n gs e p h a r o s e 亲和层析拄进行分离纯化，得到 较纯的重组融合蛋门。用纯化后的重组蛋白进行功能的初步探索：通过细胞凝集活 力测定证实a m p h i c t l 具有凝集素最基本的功能红细胞凝集活性；通过糖抑制 凝集活性实验证实除葡萄糖在高达1 5 0m m 的浓度仍然不能抑制重组蛋广1 对红细胞 的凝集活性外，其余的糖类住适当浓度下均能不同程度抑制蛋白的红细胞凝集活 性。通过抑菌圈实验验证了a m p h i c t l 的对金葡蔺的直接杀死作用，我们认为 a m p h i c t l 可能代表了文昌鱼中 种原始的凝集素介导天然免疫形式。 关键词：文昌鱼，c 型凝集素，实时荧光定量p c r ，原位杂交，融合表达，红细胞 凝集实验，糖抑制实验，抑荫圈实验 中山大学碗上学位论文 a b s t r a c t a m p h i o x u si so n eo ft h et r a n s i t i o n a ls p e c i e sl i n k i n gv e r t e b r a t e sa n di n v e r t e b r a t e s t h ei n n a t ei m m u n i t yo f a m p h i o x u si sr e l a t i v e l ym a t u r e t h e p a t t e r nr e c o g n i t i o nr e c e p t o r s w h i c hi n v o l v ei n p a t t e r nr e c o g n i t i o nr e a c t i o n sp l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h ei n n a t e i m m u n i t ys y s t e mo fa m p h i o x u s w es t u d i e dan o v e lc t y p el e c t i no fc h i n e s ea m p h i o x u s a tt h el e v e lo fd n aa n dp r o t e i n ，u s i n gm e t h o d so fm o l e c u l a rb i o l o g y t h ea i mo ft h e s t u d ) , w a st of i n do u th o wc - t y p el e c t i na c t e da sap a t t e r nr e c o g n i t i o nr e c e p t o ri n a m p h i o x u s t h ec t y p el e c t i n sa r ec l a s s i f i e di n t os e v e n t e e ng r o u p s t h em e m b e r so ft h ef i r s t s e v e ng r o u p sh a v eb e e ns t u d i e di nd e t a i l ，w ef o u n do n ec d n as e q u e n c ef r o mt h ee d n a l i b r a r yo fc h i n e s ea m p h i o x u sw h i c he n c o d e dac t y p el e c t i n l i k ed o m a i n a f t e rt h e s e q u e n c i n go f3 t e r m i n a la n d5 r a c e ，t h ef u l l - l e n g t hs e q u e n c ew a so b t a i n e d i tw a s c o n f i r m e dt ob eac - t y p el e c t i nw i t has i g n a lp e p t i d ei nt h en t e r m i n a la n dac - t y p e l c c t i n l i k ed o m a i ni nt h ec t e r m i n a la n dw a sn a m e da m p h i c t li tb e l o n g e dt ot h eg r o u p b a s e do i lt h ew h o l ep r o t e i ns t r u c t u r e i th a da ne p nm o t i fa n dt h ec h a r a c t e r i s t i c s e q u e n c eo fc a b i n d i n gs i t e2i n d i c a t i n gt h a ta m p h i c i 、lm i g h tf u n c t i o na sa c a 2 + _ d e p e n d e n tm o n o s a c c h a r i d eb i n d i n gl e c t i ns p e c i a l l yr e c o g n i z i n gm a n n o s e t y p e l i g a n d s w es t u d i e dt h ee x p r e s s i o n p a t t e r n so fa m p h i c t lb yr e a l t i m e p c ra n di n s i t u h y b r i d i z a t i o na n df o u n di tw a sa b u n d a n ti nh e p a t i cd i v e r t i c u l u m ，i n t e s t i n ea n ds k i no f a d u l tm n p h i o x u s t h ea m p h i c 1 1 lm r n ae x p r e s s i o nw a su pt o4 0 0 一f o l da f t e r2 4 h s t i m u l a t i o n sb ys t a p h y l o c o c c u sa l d f t 2 1 i s ，a n d7 0 一f o l db ys a c c h a r o m yc e s c e r e v i s i a eo r z y m o s a n t h ed n af r a g m e n te n c o d i n gm a t u r ep r o t e i no fa m p h i c t lw a sc l o n e di n t ot h e p t r xe x p r e s s i o nv e c t o ra n dw a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e du s i n ge c o t ia sh o s ts t r a i n t h e f u s i o np r o t e i nt r x a m p h i c t lw a so b t a i n e da f t e rp u r i f i c a t i o nb yn i 2 + _ c h e l a t i n ga f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y t h eh e m a g g l u t i n a t i n ga c t i v i t yw a st e s t e dw i t ht h ep u r i f i e df u s i o n p r o t e i no nr a b b i te i l y t h r o c y t e sa n dw a si n h i b i t e db yd i f f e r e n ts a c c h m i d e so fd i f f e r e n t r r l 固青岛文禺鱼c 型凝集素a m p h i c t l 的发现及其十h 关j _ 牛质研究 c o n c e n t r a t i o n s e x c e p tg l u c o s e w e s t u d i e dt h ef u n c t i o nm o d eo fa m p h i c t lb y a n t i b a c t e r i a la s s a ya n df o u n dt h a ta m p h i c t lc o u l dk i l lb a c t e r i ad i r e c t l ys u g g e s t i n gt h a t a m p h i c t lm i g h tr e p r e s e n ta l le v o l u t i o n a r i l yp r i m i t i v ef o r mo fl e c t i n m e d i a t e di n n a t e i m m u n k y k e yw o r d s ：a m p h i o x u s ，c t y p el e c t i n ，r e a l t i m e p c r ，i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f u t i o n e x p r e s s i o n ，h e m a g g l u t i n a t i n ga c t i v i t y ，s a c c h a r i d ei n h i b i t i o na s s a y ，a n t i b a c t e r i a la s s a y 巾山大学硕+ 学位论文 缩略语 a c r ( a c r y l a m i d e ) a m p ( a m p i c i l l i n ) b i s ( n n 一m e t h y l e n e - b i s - a c r y l a m i d e ) b p ( b a s ep a i o b s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) c a c l 2 ( c a l c i u mc h l o r i d e ) c d n a ( c o m p l e m e n t a r yd n a ) d e p c ( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ) d t tr d i t h i o t h r e i t 0 1 ) f c o l i ( e s c h e r i c h i ac o i l ) e b ( e t h i d i u mb r o m i d e ) e d t a ( t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ) e g t a ( e t h y l e n e g l y e o l b i s ( b - a m i n o e t h y l ) 一n ，n ，n ，n 1 - t e t r a c e t i ca c i d ) e s i m s ( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ) e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ) t t e p e s ( 4 - ( 2 一h y d r o x y e r h y l ) p i p e r a z i n e 一1 一e r h a n e s u l f o n i ca c i d ) h r f h o u r ) i p t g ( 1 i s o p r o p h y lt h i o b d g a l a c t o s i d e ) k b ( k i l o b a s e ) k d a ( k i l od a l t o n ) m c s ( m u l t i p l ec l o n i n gs i t e s ) m i n ( m i n u t e ) o d 2 8 0 o d 6 0 0 p b s ( p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e ) p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) p e g ( p o l y e t h y l e n eg l y c 0 1 ) v l l 丙烯酰胺 氦苄青霉素 n ，n 1 一亚甲义闪烯酰胺 碱基刘 牛血清向蛋自 氯化钙 互补d n a 焦碳酸一乙酯 二硫苏糖醇 人肠杆尚 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 厶二醇双( 2 - 氨乙基) 四乙酸 电喷雾电离质带 表达序列标签 4 一羟乙基哌嗪丙磺酸 小时 异丙基硫代一b d - l a l 糖苷 干碱基列 道尔顿 多克隆位点 分钟 波k 2 8 0 n mr 的光密度值 波k 6 0 0 n mf 的光密度值 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应 聚乙二醇 - i ，固青岛文吕鱼c 型凝集素a m p h i c l l 的发现及其相关】生质研究 r n a s ea ( r n ae n z y m ea 、 r p m ( r e v o l u t i o np e rm i n u t e ) s ( s e c o n d ) s d s ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) s d s - p a g e ( s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) t e m e d ( n ，n ，n n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e ) t r i s ( t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) 一a m i n o m e t h a n e ) t r x ( t h i o r e d o x i n ) v ( v o l t a g e ) v i i l 核糖核酸酶a 每分钟转数 秒钟 十烷基硫酸钠 s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳 n ，n n n 四甲基乙二胺 三( 羟甲基) 氢基甲烷 硫氧还蛋向 电压 - p 山人学硕+ 学位隆文 1 1 文昌鱼概况 第1 章概述 文昌鱼，属脊索动物门头索动物亚门的文昌鱼科。文昌鱼的拉丁文学名为 b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ，中文译名为白氏腮口鱼。民间传说，文昌鱼是文昌帝赐给 祭祀他的信徒的，每年文昌帝君诞辰前后，这种鱼样的动物才出现，所以取名为“文 昌鱼”( 詹绍琛，2 0 0 5 ) 。文昌鱼最早是南德国动物学家p a l l a s p s 在英国的c o r n w a l l 发现的，当时他认为是软体动物中蛞蝓的+ 种，在1 7 7 4 年命名为l i m a xl a n c e o l a t u s ： 1 8 3 4 年意大利人c o s t a0 g 认为是低等脊椎动物，命名为b r a n c h i o s t o m a ；18 3 6 年 英国人w i l l i a my a r r e l l 命名为a m p h i o x u sl a n c e o l a t u s 。根据命名优先的原则，采用 b r a n c h i o s t o m a 作为属名，而以a m p h i o x u s 作为英文俗名。 文吕鱼是比鱼类低等的动物，其生理构造甚为奇特。文昌龟是种半透明的鱼 形动物，但没有头与躯干之分。体尢右侧扁，两端较尖。牛活时体色稍带肉红色， 具有口须的一端为前端。成体体长约4 2 4 7i t l r f l 。身体前端的腹i 缶为一漏斗形的i j 笠， 口笠的边缘约有4 0 条触须，防止大形沙粒进入_ f 内。文昌鱼的皮肤自 表皮和真发 的分化。文昌鱼的表皮是由币层柱状卜皮所构成，间有感觉细胞和单绌胞腺体，和 脊椎动物有所区别( 脊椎动物的表皮全是由多层上皮细胞构成的) 。文昌鱼尚没有 骨质的骨骼，主要是脊索作为支持身体的结构。 文昌鱼的摄食并不是靠身体运动去主动捕捉食物，而是被动的营养方式，即依 靠由于纤毛摆动所形成的水流，将食物和氧带进口和咽部。存幼体发生期，文昌鱼 的鳃裂和脊椎动物的鳃裂样，是直接开口于体外的，后来形成了围鳃腔，于是鳃 裂就1 i 卣接通向体外，而是开口于围鳃腔内，同鳃腔以腹孔与外界相通。 肠为直管，尚未迸一步分化。在肠管起始处的腹面伸出一中空的占突向前插 到咽的存侧，名肝盲囊，肝盲囊的 勺壁是腺细胞，能分泌消化液，通常被认为是相 当于脊椎动物的肝，但同源关系还不清楚。除此之外，文昌鱼没有任何其他消化腺。 文昌鱼除具有胞外消化外，至少在盯盲囊和后肠部还具有胞内消化，该部细胞能吞 噬小的食物颗粒。肠未端以肛f 、丌口体外。肛门的位首在腹孔后方，稍偏向身体的 吲青岛义昌鱼c 型凝集素a m p h i c t l 的发现及其相关性质研究 左侧。 文昌鱼的循环系统虽然还是原始的，但已经与脊椎动物的低级种类相似了。与 尾索动物的丌管式循环不同，它是属于闭管式的，也就是说，它的j f l 液沿着有真正 管壁的血管循环各处。血液的流动是靠腹大动脉和每一入鳃动脉基部稍稍膨大的 “鳃心”以及肝静脉的收缩。文昌鱼还没有心脏的分化，相当于心脏的血管不是背部 的( 无脊椎动物的情形) ，而是腹血管( 脊椎动物的心肌! 仝是在腹部) 。文昌鱼的 中枢神经系统是一条纵行的神经管，位于脊索的背而，并稍短于脊索。沿整条神经 管的两侧有一系列黑色小点，称眼点。每一个眼点由一个感受细胞和一个色素细胞 组成。光线透过文昌鱼半透明的身体，射到脑眼上面，起到感光的作用，这有助于 文昌鱼在游泳和掘沙时的定位。 文昌鱼为雌雄异体，但外形并无性别差异。生活时，可透过皮肤肌肉看到成熟 的生殖腺：卵巢呈淡黄色方形小块，精巢呈白色方形小块。文昌鱼年产卵3 4 次，产卵时间在6 7 月。不具生殖管道，成熟的生殖细胞穿过生殖腺壁和体壁出 来，进入围鳃腔，随水流由腹孔排出，在海水中行受精作用。 文昌鱼生长于潮汐不人、沙滩教大、风平浪静的内海浅湾。幼鱼生活在泥、沙 交界的细纱中。一般可生活3 4 年。文昌鱼一般钻在沙子的表层，寻觅沉淀在沙 罩的食物。晚上它也会离开沙底，垂直游到水面，寻找海藻等东西吃。白天它躲在 海底泥沙中，露出半个身子，摇摇摆摆，依靠水流带来的浮游生物作食饵，晚上出 来活动。它垂直游泳，有时会象脱弓的羽箭射到水面卜，它会用触须帮助摄取海水 中微小的浮游生物( 张影，2 0 0 2 ) 。 文吕鱼共有2 9 个种。分布在热带、亚热带的8 1 6 米的浅水海域中，特别在 北纬4 8 。至南纬4 0 。之旺l j 的环形地区，如l a g o sl a g o o n ( 尼日利亚) 、k i n g s t o n h a r b o u r ( 圣：文森特) 、v i l l ac i s n e r o s ( 1 西撒哈拉) 、t a m p ab a y ( 美国) 以及我国的厦门、 青岛和烟台沿海等处。 在文昌鱼研究的两百多年历史中，曾经经历了几次兴衰：十九世纪后叶在著名 德国生物学家e r n s th a c k e l 的普通形态学( 1 8 7 4 ) 的推动下，再加上当叫组织学技 术的发展，文吕鱼的研究达到空前的高涨。但是当时多数集l _ 在关于文昌鱼胚胎以 及成体的解剖学的研究，所以在二十世纪前叶，受光镜水平的限制，文昌鱼研究技 术难有新的突破，研究的热情也随之减退。直到二十世纪六十年代，随着电子显微 中【f 人学坝小学位论文 技术的成熟和广泛应用，文昌鱼研究爿重新掀起一个新的高潮。正当第二次高潮乃 兴未艾的时候，分子，i = ：物学技术的出现再为它推波助澜，文昌鱼的研究又重露头角， 成为分子，l 物学研究的重要对象( 洪水根，2 0 0 3 ) 。 圈l i 文吕鱼器官示意幽 f i g 1 - ! d i s s e c t i o no f a m p h i o x u s n e r v ec o r d ，神经管；n o t o c h o r d ，脊索；b o d y w a l lm u s c l e s ，体姥肌肉：i n t e s t i n e ，肠 o r a lc i r r i ，口须；p h a r y n g e a lg i l ls l i t s ，咽鳃裂；g o n a d ，牛殖腺：m r i a lc a v i t y ，荆鳃腔 a t r i o p o r e ，同鳃脏孔；a u u s ，肛fj 。 近年束，文昌龟免疫系统进化方面的研究取得了不少杰出的成果。h e m a n d e z 等人在文昌鱼中发王见了免疫分子可变区结合蛋白( v a r i a b l er e g i o n c o n t a i n i n g c h i t i n b i n d i n gp r o t e i n s ，v c b p s ) ，为了研究v c b p s 与脊椎动物适应性免疫受体之间 潜在的联系，他们推导出v c b p s 的三维结构，得mv c b p s 分子巾无论是可变区折 叠的完整结构还是独特的可变区配对都可能反映了现代脊椎动物多种多样的免疫 受体的祖先的分子特点的结论( h e m a n d e z ，2 0 0 6 ) 。杜品春等人在文昌鱼中发现两个 巨噬细胞迁移抑制因了( m a c r o p h a g em i g r a t i o ni n h i b i t o r yf a c t o r , m i f ) ，并通过蛋白 实验证明了两个蛋白与其它物种的m i f 的不同之处，提示着文昌鱼的免疫系统迸化 的特殊地伉( d u ，2 0 0 4 ：d u & y u ，2 0 0 6 ) 。于翠玲等为了寻找文昌鱼中存在适应性免 疫系统的证据，对文昌鱼c d n a 史库进行检索分析，发现了很多直接或问接参与适 应性免疫的分子，这些分子可能是脊椎动物适心性免疫相关基凼的祖先基因；对这 些基因的转录表达情况的分析后推测文吕鱼的消化系统可能是适应性免疫的发源 地( y u ，2 0 0 5 ) 。 目前，文昌鱼的基因序列和表达模式已经被广泛用于不同物种之间的比较基凼 ，川剥青岛文r 鱼c 型凝集索a m p h i c t i 的发现及其相关性质研究 组学研究和发育同源性分析中。通过对文昌鱼、无脊椎动物和脊椎动物的基因组之 间的比较，可以揭示脊椎动物原始祖先基因组的结构和演化过程进而探索人类的起 源。同时，通过对文昌鱼和其它物种发育基因表达图式的比较【呵以显示_ i l 司生物身 体部缸之削的同源关系，并可以了解发育基因是如何引起不同物种之间形态变化 的。而免疫系统的起源特别是适应性免疫的起源一直以来都是免疫学研究的热点问 题。通过对脊索动物如文昌龟免疫的研究可能可以帮助我们了解人类免疫系统的起 源。 1 2c 型凝集素简介 1 2 1 天然免疫识别的机制与途径 1 2 1 1 组成性防御与诱导性防御 对“非己”物质的侵犯，机体的天然免疫系统有两种防御机制：组成性的和诱导 性的。组成性防御机制包括体表屏障与呼吸器官、胃肠道、生殖道的粘膜e 皮屏障 及其上皮细胞分泌的抗微生物肽和体液中的抗菌酶、溶菌酶等。通常组成性防御机 制有两大特征：茸先，发，k 于和微生物有持续一陛作用的部位，其次，其杀伤效果取 决于微生物的种类，这是冈为不同的部位( 体表和体腔) 有其不同的自然属性，例如 溶菌酶、防御素只对细菌胞壁具有特异性杀伤力。绝大多数多细胞生物的防御反应 是由感染所引起的，或者是由自身基因突变所引起，即是可诱导性的。因此，只有 对入侵的微乍物及病毒感染细胞能够特片性的识别，机体才一叮以启动合适的防御反 应，只有对机体的肿瘤细胞加以鉴别，机体爿可以激发免疫监视功能( m e d z h i t o v 2 0 0 0 ) 。 1 2 i 2 分子模式识别作用( m o l e c u l a rp a t t e r nr e c o g n i t i o n l 病原体相关分子模式( p a t h o g e n a s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e r n ，p a m p 、 病原体相关分子模式由微生物病原产生。最具代表性的p a m p 莫过于细菌的脂 多糖( l p s ) 、脂蛋i 兰t ( b l p ) 、肽聚糖( p g n ) 、脂磷壁酸( l t a ) 、末甲基化的c p gd n a 、 分枝杆菌的脂阿拉伯甘露聚糖( l a m ) 、酵母菌的甘露聚糖。p a m p 被天然免疫系统 的受体( 即模式识别受体) 识别，使灭然免疫系统能够准确无误地区别机体自己成分 中山大学硕十学位论文 和病原体相关非己结构( m e d z h i t o v , 2 0 0 0 ) 。p a m p 的这种特性很好的解释了脊椎动 物获得性免疫系统对自g q k 己结构识别的功能。 p a m p 代表的是对微生物的生存所必需的保i ：的分子模式。最恰当的例子莫过 于青霉素的杀菌效应一抑制肽聚糖的生物合成。青霉素对细菌的致死性是由于细菌 不能够没有肽聚糖，具有青霉素耐药性的细菌是使青霉素的作用失活而生存，去| j 仍 然离不丌肽聚糖。冈此，类肽聚糖的结构演化成为天然免疫系统识别的粑标一点也 不让人惊奇，这亦防止了因基因突变向产生的病原体的免疫逃逸。 p a m p 为一大组微生物所共有，例如，所有的细菌都有p g n 和b l p ，而l p s 和i - a 分别为革兰阴性菌与革兰阳性菌所有。p a m p 的这种特性使有限数量的胚系 编码的模式识别受体能够识别极多类的微生物。p a m p 代表了病原体被同有免疫细 胞识别的分子，是病原体生物信息的标志，例如l p s 、l 1 、a 、l a m 、甘露聚糖分别 代表了革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、分枝杆菌及真菌的信息。因此对p a m p 的识 别不仅暗示了感染的存在，而且提供了与入侵病原体类型相天的信息。p a m p 的这 种特性使天然免疫系统刈以选择对某一病原最有效的效应机制。 模式识别受体( p a t t e r nr e c o g n i t i o nr e c e p t o r ，p r r l 从前述p a m p 的特性町见，p a m p 是天然免疫识别的理想靶标。由胚系摹因编码 的在机体内不断进化以识别p a m p 的受体，即被称为模式识别受体，是一大类存结 构和功能上有一定异质性的蛋白。结构k p r r 分属于3 种蛋n 家族，它们的特征是分 别含有c 型凝集素结构域、清除受体半胱氨酸富集区、富亮氨酸重复区( e r r ) 。从功 能上，p r r 可分为3 类：分泌型、内吞型和信号型。分泌开, ! p r r ( s e c r e t e dp r r ) 的主要 功能是调理作用，它们结合到微生物的胞壁上，激活补体系统和吞噬细胞，最具代 表性的是甘露聚糖结合凝集素( m a m l a nb i n d i n gl e c t i n ，m b l ) ，它由肝细胞合成分泌 如m ，是一种急性期蛋白，属_ c 型凝集素，识别细菌、真菌、病毒、寄生虫的相 应糖基配体后活化c 3 ，激活补体途径。内吞型p r r ( e n d o c y t i cp r g 9 位于吞噬细胞的 表面，识别配体后起辅助吞噬的作用，使病原蛋白加工并被m h c 提呈到细胞表面。 最具代表性的是巨噬细胞甘露糖受体，它办属于c 型凝集紊家族，可以识别一大类 病原的甘露糖的术端糖基，并介导巨噬细胞对病原的吞噬。巨噬细胞清除受体也是 典型代表。信号型p r r ( s i g n a l i n gp r a ) 识别p a m p 后激活信号传导通路，诱导包括炎 性因了在内的各种免疫反应基因的表达。天然免疫的关键作用之一是识别病原体及 中国青岛文吕也c 型凝集索a m p h i c t l 的发现及其相关性质研究 其产物，p r r 是天然免疫向着识别病原体保守结构进化的产物，通过对p a m p 的模 式识别，能发现病原体的存在并辨别其性质与类型，例如，c 型凝集素- t 叮识别各种 病原体或瘸原体感染细胞表面的糖结构，c d l 4 能识g s l p s ，清除受体可识别细菌细 胞壁成分，肽聚糖识别蛋白则识别肽聚糖。近年研究的热门p r r 还有t o l l 样受体 f t o l l l i k er e c e p t o r ，t l 鼬家族，已发现9 个成员，b 3 t l r l t l r 一9 。t l r - 4 识别革兰 阴性菌的l p s ，t l r 一2 识别革兰阳性菌和酵母的产物如肽聚糖和脂肽，t l r 9 识别细 菌d n a 的c p g 模体。p r r 能识别许多不同的配体，只要这些配体具有相同的保守性 分子模式【l i n e h a n ，2 0 0 0 ) 。这些受体在动物进化的早期就已出现，而且细胞表面糖 蛋白糖基化作用模式的变化，或者胞膜磷脂成分的变化，使得p r r 结构与功能上的 同源性受体如同生物一样具有千变万化的多样性，识别的病原种类远远超出我们所 能想象的范围。 模式识别效应 天然免疫的另一关键作用是效应功能。p r r 识别p a m p 后，导致了各种不同的 细胞内信号传导途径的激活，产生各神各样的效心机制。总体上可分为三大类：一 类是产生活性氧、活性氮以及各种抗微生物的肽，它们具有生物学活性，对机体有 卣接的保护作用；一类是产生细胞因子、粘附分子、急性期蛋白，它们参与炎症和 早期机体防御反应以及较后的获得性免疫；第三类是共刺激分子b 7 1 和b 7 2 ，它 们和t 细胞表面的c d 2 8 结合，作为t 细胞活化的第_ 信号( z h a n g ，2 0 0 1 ) 。 1 2 2c 型凝集素家族简介 c 型凝集素家族的发现 凝集素足。类能专一识别糖并与之非共价可逆结合的非酶非抗体蚩白质，早在 1 8 6 0 年，蛇毒凝集素的凝集活性最先被报道( k i l p a t r i c k ，2 0 0 2 ) 。在1 9 8 8 年d r i c k a m e r 建议将动物凝集素分成几类，并将结构与蛋白聚糖相似的钙依赖性凝集素定义为c 型凝集素( d r i c k a m e r 1 9 8 8 ) 。c 型凝集素是最早发现的动物凝集索之一。自1 9 0 6 年 报道第一个动物c 型凝集素牛胶固素( c o n g l u t i n i n ) 以来， 在哺乳动物体内发现了 多种多样的c 型凝集素，它们构成了。个庞大的超级家族。c 型凝集索分布广泛， 功能复杂，涉及体内许多重要的生理、病理过程，因而成为当今令人瞩目的研究热点 6 山大学硕十学位论文 之。 c t l d s 仪在后生动物中发现，这个结构域具有多种多样的结构和功能特征。大 量编码c t l d 的基因在后生动物的基因组序列中被发现，如在线虫基因组中c t l d 家族是第七个最丰裕的家族( c o n s o r t i u m ，1 9 9 8 ) 。这个家族同时体现r 进化的多样 性与保守性。仝基因组序列分析结果表明虽然事实上线虫、果蝇和脊椎动物的c t l d 家族成员的序列相似性很低，而从鱼到哺乳动物这些脊椎动物物种中的c t i d 序列 却没有发生太大的变化。 c 型凝集素种类繁多，构成了一个庞大的超家族。这种细胞外蛋白质有两种类 型：一种是存在于血淋巴中的可溶性凝集素，这类蛋白可以同病原分子等表面的糖 基决定簇结合，从而导致病原体或异物的凝集；另外一种为整合型跨膜蛋白。它们 都是c 扩依赖性的，并目具有约1 3 0 个残基的c 型凝集素样结构域( c t y p e l e c t i n 1 i k e d o m a i n ，c t l d ) ，c t l d 长约1 1 5 1 3 0 个残基，其中有1 4 个恒定碱基f 包括4 个 c 残基) 和1 8 个保i 了：残基。某些c ，i l d 含额外2 个c 残基，称作长型c t l d ，而 只有4 个c 残基者称为短型c t l d 。由c 残基形成的二硫键对于维系c t l d 的构 象及整个分子的活性均十分重要。c f l d 的一级结构不同，决定了c 型凝集素有不 同的糖识别特异性。基于c f l d 一级结构比较确定其在进化树中的位置，哺乳类c 型凝集素超家族分为蛋白多糖、i i 型跨膜受体、胶原凝紊、选凝素、n k 细胞受体、 多c t l di 型跨膜受体受体及r e g 蛋白等1 7 个家族。每一家族的成员具有同源的 氨基酸序列、相同的总体分子结构及类似的生物学功f i v ( d r i c k a m e r ，1 9 9 9 ) 。 c 型凝集索家族的结构特征 每个c 型凝集素的成员都含有一个或多个的c 型凝集素样结构域( c t y p e l e c t i n l i k ed o m a i n ，c t l d ) 。这个c t l d 含有个双环结构。整个结构域就是一个 环，通过c 末端和n 末端的p 链相互靠在一起形成反向平行的b 片层。篇二个环义 成为长环区，位 i 结构域的内部。c t l d 最保守的四个半胱氨酸( c 1 一c 4 ) 在环的 摹部形成二硫键，c l 和c 4 连接b5 和a l ( 整体结构形成的环) ，c 2 和c 3 连接b 3 和1 35 ( 长环区) 。长环区与钙依赖性的糖结合相火，有时也与些c t l d 的二聚 化有关( f e i n b e r g ，2 0 0 0 ；m i z u n o 2 0 0 1 ；h i r o t s u ，2 0 0 1 ；l i u & e i s e n b e r g ，2 0 0 2 ) 。值得 提的另一个序列特征是个高度保守的w i g i ，基序，它位于b2 链上，是序列分析 的一个有用的标志。 中田青岛义昌鱼c 掣凝集素a m p h i c t l 的发_ | j i l 及其相关陆质础f 宄 图1 - 2c 型凝集素结构域的结构图 f i g 1 - 2c t u d s t r u c t u r e t h el o n gl o o pr e g i o ni ss h o w ni nb l u e c y s t i n eb r i d g e sa r es h o w na so r a n g e s t i c k s t h ec y s t i n eb r i d g es p e c i f i cf o rl o n gf o r mc t l d s ( c o c o7 ) i sa l s os h o w n ( z e l e n s k y ，2 0 0 5 ) c t l d 中有四个钙结合位点( 如图1 - 3 a ) 。其中只有钙结合位点2 与糖结合相 关( w e i s ，1 9 9 1 ) 。其巾序列中的e p n 基序及w n d 基序分别提供了两个氨基酸残基 形成钙结合位点2 ( d r i c k a m e r ，1 9 9 3 ；w e i s ，1 9 9 2 ) 。很多时候用这两个基序来推测未知 蛋白的钙依赖型糖结合能力。钙结合位，_ l 、2 、4 则与维持c t l d 的结构有灭 ( f e i n b e r g ，2 0 0 1 ；s u g a w a r a ，2 0 0 4 ) 。钙结合位点2 有五个保守的氨基酸残基( 如图 1 - 3 b ) 。钙依赖的糖结合能力手要l i j 以分成两种：c t l d 中具有e p n 基序的：结合 甘露糖及相关糖类，而具有q p d 基序的则结合半乳糖及相关糖类( d r i c k a m e r & d o d d 1 9 9 9 ；d o d d & d r i c k a m e r 2 0 0 1 ) 。 以卜以大鼠m b p a 为例子阐述一下c 型凝集素的结构与功能的关系。大鼠 m b p a 的c t l d 及其与寡糖配体复合物的品体结构已经测定，明确了m b p 与配体 结合的细节，并作为模式指导着其他c 型凝集素选择性糖识别的分子暴础的研究。 m b p - a 的c t l d ( 1 0 9 2 2 1 ) 大小为4 1 0r i m 2 1 4r i m 2 1 5t i n l ，由两个不同的二级结 构区组成：一部分是5 段1 3 折叠和2 段n 螺旋，另一部分为4 个环状结构。该c t l d 可结合2 个c a 2 + ，c a ”和糖的结合位点由3 个环状结构( l 1 ，3 ，4 ) 及1 段b 折叠( 04 ) 上的残基构成。第一个c a 2 + 配位位点由d 1 6 1 、e 1 6 5 、d 18 8 和d 1 9 4 形成，而e 1 8 5 、 n 1 8 7 、e 1 9 3 、n 2 0 5 和d 2 0 6 则涉及与第二个c a 2 + 的配位结合，同时构成糖结合位 点：e 1 8 5 n 1 8 7 和e 1 9 3 1n 2 0 5 分别与术端m a n 的3 一o h 和4 - - o h 形成氢键。后 5 个钱基在所有结合甘露糖或半乳糖的c t l d 都足保守的，但e p n ( 1 8 5 l8 7 ) 巾的 中山人学坝】：学位论文 a c b 翻1 - 3c t l d 的钙结合位点 f i g 1 - 3c a - b i n d i n gs i t e si nc t l d s r i b b o nd i a g r a m so fh u m a na s g p r _ | ( a ) a n dr a tm b p a ( b ) c fi o n sa r es h o w na sb l a c ks p h e r e s a n dn u m b e r sr e f e r e n c e dt ot h e d i f f e r e n ts i t e si nt h et e x ta r e i n d i c a t e dn e x tt ot h ea r r o w s ( c ) as t e r e o v i e wo ft h em b p - ac o m p l e xw i t hm a n n o s e ( p d b2 m s b ) c o o r d i n a t i o nb o n d sa r eo r a n g e h y d r o g e nb o n d sw h e r es u g a rh y d r o x y la c t sa sa c c e p t o ra n dd o n o ra r e r e da n db l u e ，r e s p e c t i v e l y t h ec a “a t o mi ss h o w na sab l u es p h e r e ( z e l e n s k y ，2 0 0 5 ) 1 8 5 和1 8 7 位残基的性质则是c t l d 配体结合特异性的主要决定冈素。m b p a 的这 两个位置分别是e 和n ，而结合g a l 的c t l d ( o l j 肝细胞凝集素) 则分别是e 和d 。 定点突变m b p - a 的e l8 5 和n 1 8 7 为e