（生物物理学专业论文）自组装纳米水凝胶在疏水界面上的动力学研究.pdf

1i i l l il lii i ii iii i i ii iiii y 17 9 8 0 0 4 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下 各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位 论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文； 学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权 按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为 目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：振睦、 知口8 年乡月2 够日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： _ l 一 一； ) ) ) 一 釉m 予少少一 好砂砂一 年m 一 尝| ；|，年埤埤 ，稚 m 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：孩吃、 矿够年岁月丫e l 在 相容性有着至关重要的意 义。胆固醇基普鲁兰( c 肿) 由亲水的普鲁兰主干和疏水的胆固醇集团组成，能在 水溶液中自组织形成直径为2 0 3 0 纳米的纳米凝胶。为了提高其生物相容性，用 生物膜仿生高分子2 丙烯酞乙氧基磷脂酸胆碱( m p c ) 修饰c l i p 纳米凝胶表面， 设计自组织纳米凝胶分子c m ( 2 m c t h a c r y l o y l o x y e t h y lp h o s p h o r y l c h o l i n eg r a r e d c h o l e s t e r o lb e a r i n gp u l l u a n ) 。本文重点研究了这种新合成的纳米水凝胶分子在疏 水的固体界面上结构形态的变化并对这些变化的动力学过程进行了深入的探 讨。利用敲击模式原子力显微镜观察了三种样品随时间推移扫描得到的c m 纳 米水凝胶吸附在高定向热解石磨( h o p g ) 表面上的形貌图，发现c m 在h o p g 表面能够形成稳定的纳米凝胶颗粒及铺展开的c m 单分子层。根据所修饰上的 m p c 化学组分的不同，吸附在h o p g 表面上的c m 分子层表现出不同的动力学 过程，并计算了吸附过程的反应速率及吉布斯自由能，经过计算c m 吸附过程的 活化自由能约为3 7 k b t 。 关键词；自组装纳米水凝胶c m 聚合物原子力显微镜固液交界面分子动力 学 t oe n d o wb e t t e rb i o c o m p a t i b i l i t y , c m ( 2 一m e t h a c r y i o y l o x y e t h y lp h o s p h o r y i c h o l i n e g r a f t e dc h o l e s t e r ylg r o u pb e a r i n gp u l l u l a n ) w a sd e s i g n e db yg r a f t e db i o m e m b r a n e m i m e t i cp o l y m e rm p ct oc i - i pb a c k b o n e t h i st h e s i ss t u d i e dt h em o r p h o l o g y c h a n g e so ft h i sn e wd e s i g n e dn a n o h y d r o g e lo nh y d r o p h o b i cs o l i di n t e r f a c e sa n di t s d y n a m i cp r o g r e s s t a p p i n g - m o d ea t o m i cf o r c em i c r o s c o p yw a su s e dt og e tt h e t i m e - d e p e n d e n tt o p o g r a p h i ci m a g e so ft h e r ec l a s s e so fs a m p l eo nt h es u r f a c eo f h i g h l yo r i e n t e dp y r o l y t i cg r a p h i t e ( h o p g ) i m a g e so b s e r v a t i o nr e v e a l e dt w o d i s t i n c t i v ep a t t e r n s ，t h ei m m o b i l i z e dn a n o h y d r o g e lp a n i c l e sa n dt h ef l a t t e nl a y e r s b a s e do nt h ed i f f e r e n tq u a n t i t yo fp o l y m e r i z e dm p c ，t h ea d s o r p t i o np r o c e s s e so n h o p gs u r f a c ee x h i b i td i f f e r e n td y n a m i co b s e r v a t i o n t h ea d s o r p t i o nr a t eo fc m n a n o h y d r o g e la n dg i b b s f l e ee n e r g yw e r ec a l c u l a t e d t h ef l e ee n e r g yo ft h e a d s o r p t i o np r o c e s sw a sa t 3 7 幻t k e yw o r d s ：s e l f - a s s e m b l e dn a n o h y d r o g e l ，c mp o l y m e r , a f m ，l i q u i d s o l i d i n t e r f a c e ，d y n a m i cp r o c e s s 第一章引言1 第一节研究背景及选题目的l 第二节原子力显微镜2 第三节吸附过程的动力学研究理论4 第二章实验材料及方法6 第一节实验材料6 2 1 1c h p 聚合物6 2 1 2m p c 聚合物8 2 1 3c m 聚合物。9 第二节：实验方法。l l 2 2 1 试验安排1l 2 2 2 试验的具体过程1 2 第三章实验结果分析和讨论1 3 第一节：不同样品分别图像分析1 3 3 1 1 对c m 0 的研究1 3 3 1 2 对c m 6 2 的研究15 3 1 3 对c m l 4 3 的研究1 8 第二节：样品间综合对比分析2 l 3 2 1 分子层厚度变化对比2 l 3 2 2 综合三种样品的吸附过程2 2 i v j l - 目 选题目的 高分子，是当前科学界研究的热点 之一。当水凝胶受到外界环境的刺激，如温度，溶液的组成，p h 值，电场等变 化时，都会引起凝胶体积的突然收缩或膨胀，呈现体积相转变的行为，从而具 有智能功能。这种性能使其在活性酶包埋和蛋白质分离【1 4 1 ，生物传感和催化【5 ， 6 】，药物的靶向定位及缓控释放【7 ，8 】等方面具有很大的应用前景。 水凝胶与疏水聚合物相比，与被固定化的酶或细胞只有弱得多的相互作用， 固定在水凝胶中的生物分子活性能过保持较长时间。因此，利用水凝胶固定化 的生物分子和细胞有着非常广泛的应用。a k i y o s h i 等人曾合成出了一种在水环境 下能够通过疏水基团的疏水作用力自组装形成直径在2 0 3 0 n m 尺度的水凝胶颗 粒：胆固醇基普鲁兰c 肿( c h o l e s t e r 0 1 b e a r i n gp u l l u l a n ) 【9 ，l o 。其疏水的内 核可以用来携带药物等生物分子，当运输到需要的靶细胞处经过对外界环境的 特定响应经携带的分子释放出来。在整个过程中使材料与血液接触时，能够不 引起凝血及血小板的凝聚，能够不破坏血液中有形成分的溶血现象，成为至关 重要的一项要求，即提高材料的生物相容性【l l ，1 2 。 磷酰胆碱( p c ) 是生物细胞外层膜的主要成分，从结构来看p c 带有两性离 子端基，因而具有很强的结合水能力。这种性质使富含p c 集团的材料表面不易 吸附和沉积蛋白质，脂质等生物成分，表现出良好的生物相容性。含p c 集团的 共聚物2 一甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱( m p c ) 与一般的生物材料相比其抗血小板黏 附性有很大的提高 1 3 - 1 5 。日本东京药学和牙科大学的n o b u y u k im o r i m o t o 教 授等人将m p c 修饰到c m p 纳米凝胶表面，合成了能够在水环境下自组装成纳米 水凝胶的聚合物c m ( 2 - m e t h a c r y l o y l o x y e t h y lp h o s p h o r y l c h o l i n eg r a f t e d c h o l e s t e r o lb e a r i n gp u ll u l a n ) 1 6 。我们利用原子力显微镜在液态环境下 扫描出修饰了不同组分m p c 的c m 在疏水的高定向热解石墨表面的显微图，进而 研究了c m 纳米水凝胶在固液界面上的构象变化，及相应的动力学过程。 我们的这项研究，对了解在水环境下通过自组装方式形成水凝胶纳米微粒在 第一章引言 与疏水固态界面接触时所表现的结构特性，行为特征提供了直观有力的实验依 据。对c m 纳米水凝胶在生物医药学领域的应用提供了思路和依据。 第二节原子力显微镜 原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ) 是一种利用原子，分子间的相 互作用力来观察物体表面微观形貌的新型实验技术。它有一根纳米级的探针被 固定在可灵敏操控的微米级弹性悬臂上，当探针靠近样品时，其顶端的原子与 样品表面原子间的作用力会使悬臂弯曲，偏离原来的位置。根据扫描样品时针 尖的偏离量或震动频率重建三位图像，就能间接获得样品表面的形貌或结构信 息。 原子力显微镜主要由带针尖的微悬臂，微悬臂运动检测装置，监控其运动 的反馈回路，使样品进行扫描的压电陶瓷扫描器件，计算机控制的图像采集， 显示及处理系统组成，如图1 1 所示。微悬臂运动可用如隧道电流检测等电学 方法或光束偏转法，干涉法等光学方法检测，当探针与样品充分接近相互之间 存在短程相互斥力时，监测该斥力可获得表面原子级分辨图像，一般情况下分 辨率也在纳米级水平。a f m 具有很宽的工作范围，可以在诸如真空，大气和各种 液体环境中使用，观测的生物医学样品可以从单个分子到整个细胞。a f m 还可以 在分子水平上进行力谱曲线的检测，研究其结构和功能的关系，这在生物医药 学研究中具有重要的意义 1 7 - 1 9 。 目前，a f m 己广泛应用于对生理生化反映中蛋白质，核酸等生物大分子的 形态或功能的动态研究。在此基础上还可以进行分子水平的热力学和动力学的 研究。研究生物大分子的生理生化过程是目前a f m 在生命科学中应用最多的领 域之一。配备了环境气氛箱的a f m 可以在样品箱内进行气氛控制，样品调整以 及样品观察。这样可以对生物大分子在各种不同的气氛( 不同湿度，温度等条 件) 下的形态结果等进行研究。如对蛋白的聚合，纤维组装过程的研究，在对 胶原的超微结构和组装，蛋白三维晶体增长的研究，生物膜的结构和生物物理 特性的变化，d n a 的装配过程以及生物大分子之间的交互作用的研究方面a f m 都 有重要的应用。 2 第一章引言 能霹敏 感性光 探溯器 扫 z - 轴测镟范阐；8 u r n 力范同：l o 1 3 1 0 。 压电f 专感器 骶控样黼台 图1 1 ：原子力显微镜主要组成部分示意图 用a f m 对生物大分子进行形态结构观察的同时，还可对大分子的其它性质 进行研究，如配体一受体之间的作用力 2 0 ，抗原一抗体之间的作用力 2 1 等。对 生物分子表面的各种相互作用力进行测量是原子力显微镜的一个十分重要的功 能。这对于了解生物分子的结构和物理特性是非常有意义的，因为这种作用力 决定两种分子的相互吸引或者排斥，接近或者离开，化学键的形成或者断裂， 生物分子立体构象的维持或者改变等等。在分子间作用力的支配下，还同时支 配着生物体内的各种生理现象，生化现象，药物药理现象，以及离子通道的开 放或关闭，受体与配体的结合或去结合，酶功能的激活或者抑制等等。因此， 对生物分子在界面上的结构变化，作用力的研究，在某种意义上说就是对生命 体功能活动中最根本原理的研究。这也为人们理解生命原理提供了一个新的研 究手段和工具。 原子力显微镜通常有三种工作模式，非接触模式( n o n - c o n t a c tm o d e ) 轻 敲模式( t a p p i n gm o d e ) 和接触模式( c o n t a c tm o d e ) 。在非接触模式中，由于 a f m 针尖与样品表面间距较大，a f m 的扫描能力受到很大的限制。在接触模式中， 当a f m 沿着样品表面扫描时，a f m 针尖与样品表面间的切向力将引起样品表面发 3 第一章引言 生形变，甚至导致软材料表面发生不可恢复的破坏。a f m 的轻敲工作模式不仅可 以得到样品表面的原子级形貌，而且可以克服接触式导致样品表面变形或破坏 的缺点，在实际中得到了广泛的应用 2 2 - 2 4 。 a f m 的轻敲模式又称为间歇接触模式( i n t e r m i t t e n t - c o n t a c tm o d e ) ，其 基本原理是对a f m 的微悬臂梁施加一频率接近或等于其共振频率的激励，通过 处理由黏着力导致的变化的振幅或相位信号来得到样品表面的形貌特征。在a f m 轻敲模式中，不仅可获得样品表面的形貌像，还可获得微悬臂探针的相位图， 相位图通常比表面形貌像更清晰，而且能给出样品表面在纳米尺度的更多信息， 如吸附力，摩擦力，黏滞力等，成为a f m 研究中的一个新热点。 本项研究的实验都是采用原子力显微镜的轻敲模式，以减少针尖对水凝胶 这类柔软样品的损伤。 第三节吸附过程的动力学研究理论 聚合物和界面的吸附过程一般分为两类，化学吸附和物理吸附。物理吸附 一般不具选择性，在吸附过程中没有电子的转移，化学键的变化等反应，产生 的吸附只是分子间的引力，即范德华力，吸附过程中吸附速率和解吸速率都很 快，此类吸附的实质是一种物理吸附。从分子运动观点来看，吸附在固体表面 的分子由于分子运动，也会固体表面脱离而近入液体中去，其本身不发生任何 化学变化。因此过程是可逆的。化学吸附具有选择性，这类吸附一般都需要一 定的活化能，这种化学键的亲和力要大大超过物理吸附的范德华力。化学吸附 放出的吸附热比物理吸附所放出的吸附热要大得多，达到化学反应热这样的数 量级。化学吸附往往是不可逆的，儿媳吸附的物质常发生了化学变化不再是原 有的性状。化学吸附的速率大多进行的较慢，吸附平衡与需要相当长时间才能 到达。 大分子聚合物在固液界面的吸附过程是由聚合物网络的分子动力学过程 来控制的。当聚合物吸附在固体界面上之后有一个初始的聚合物层厚d 。，原因是 来自聚合物单体与单体之间，聚合物与水分子，聚合物与固体表面之间的相互 作用和弹性力的竞争。因此，随着吸附时间的延长，聚合物的层厚也发生着变 化，在这个过程中受到各方面力的影响，是一个复杂的网络体系，我们利用分 子动力学来分析过程的自由能，来对整个吸附过程有个宏观的认识。 4 第一章引言 我们将聚合物到固液界面的吸附过程定义为一个一级反应，而样品的吸附 过程看作是从一种非平衡状态发展到平衡状态的过程。在聚合物吸附理论方面 p e f f e r k o r n 和e l a i s s a r i 2 5 ，2 6 提出了“指数增长 及“指数递减 的模型， 后来这一模型又被v a ne i j k 和c o h e ns t u a r t 2 7 发展。在这个模型中，聚合 物吸附在固体界面上有一个初始的区域，在一个很短的时间聚合物在固液交界 面附近会迅速下沉，吸附在界面上，这一过程的时间很短，在1 0 1 0 秒的数量级 上。设聚合物吸附到固体界面上其高度即层厚为d 6 ，当其达到平衡时层厚为耽， 反应速率常数为k 到达平衡所用的时间为，则有层厚随时间的变化关系式： d ( f ) = 优+ ( 砬一优) ( 1 一p 咄，) 由此可反推出反应速率： 仁一l fl n 篙 ( 1 ) 反应过程的吉布斯自由能为：g v n 等 其中岛力波尔兹曼常量，h 为普朗克常量，为绝对温度。 因此，通过( 1 ) 式我们能通过试验测得聚合物吸附到界面上随时间的层厚 变化便可以计算得到吸附的反应速率，再根据求得的反应速率值又可以就算出 这一过程所需的自由能。经过这些分子动力学的分析我们便可以更清楚地认识 聚合物在固液界面上吸附过程的动力学过程。 5 第二章实验材料及方法 2 1 1c h p 聚合物 第二章实验材料及方法 第一节实验材料 c h p ：c h o l e s t e r y lg r o u p b e a r i n gp u l l u l a n ，即有胆固醇基团结合的普鲁兰。 普鲁兰是一种水溶性多聚糖，以洳l ，6 糖苷键结合的麦芽糖构成的同型多糖， 即葡萄糖分子通过哥l ，4 糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以洳l ，6 糖苷键与其 它的麦芽三糖相结合，如此反复形成高分子多糖，其中小l ，4 糖苷键与a 1 ， 6 糖苷键之比为2 ：l ，如图2 1 ( a ) 所示。一般普鲁兰多糖的聚合度为1 0 0 5 0 0 0 ， 分子量为4 8 x 1 0 4 2 2 x 1 0 6 。在水溶液中，由于胆固醇基团的疏水作用，c l i p 能 自组装成稳定的纳米水凝胶颗粒，直径约2 0 - 3 0 n m ，如图2 1 ( b ) 。其胆固醇疏 水内核由胆固醇基团通过非共价结合的方式形成相互十字铰链的结构，包裹在 亲水的糖链内部。c h p 形成的水凝胶结构十分稳定，在室温条件在经过一周的时 间其凝胶颗粒的体积也不会发生变化 2 8 - 3 0 。 双亲性聚合物目前在生物技术和制药方面已经有了很多的应用。水溶性聚 合物经过疏水性修饰后其溶解特性发生了很大的变化。疏水性决定着聚合物的 构造，并最终影响其在液体中的流变特性。c h p 在水溶液中的单分散性即归功于 其中的疏水胆固醇部分。这种凝胶颗粒的大小和密度可以通过改变c h p 中胆固 醇的含量来进行控制。c h p 的疏水内核以及外部包裹亲水的糖链，糖链上有很多 氢键，这样的结构使它们可以紧密的结合两亲的可溶性蛋白 3 1 ，因此这类水 凝胶被广泛应用在胰岛素及抗癌疫苗等体内运输方面的研究 3 2 。 6 第二章实验材料及方法 x ： h ( 9 2 6 t 0 0 1 ) 胆圈碑 麓水内核 - ( a ) 图2 1 ：( a ) c l i p 的化学结构；( b ) c l i p 在水溶液中形成 纳米水凝胶结构的示意图 7 ( b ) 第二章实验材料及方法 2 1 2m p c 聚合物 m p c ：2 - m e t h a c r y l o y l o x y e t h y lp h o s p h o r y i c h o l i n e ，即2 一甲基丙烯酰氧基乙基 磷酰胆碱。其中的磷酰胆碱( p c ) 是组成细胞膜基本单元的亲水端基，是细胞外膜 中的最外层集团，如图2 2 ( a ) 所示，图2 2 ( b ) 为卵磷脂，是细胞膜的基本 组成单元。n a k a b a y a s h i 和c h a p a m a n 研究组分别较早提出了仿细胞膜结构的概 念，设计合成了m p c ，并将其与憎水性丙烯酸酯类单体共聚得到了具有亲水 亲油两亲性能的共聚物。研究表明用m p c 聚合物对生物材料表面进行仿细胞膜 外层结构的修饰，可显著增加材料的生物相容性【3 3 ，3 4 】。m p c 化学式为 c i i h 2 z n 0 6 p ，它由一个具有高亲水性的极性头磷酰胆碱以及一个由2 甲基 丙烯酰基组成的具有碳碳双键容易发生聚合的尾部组成，如图2 2 ( c ) 所示。 在生物材料领域，蛋白质的吸附是植入体内材料与组织发生作用的第一步。 材料植入体内几秒钟就会被蛋白质所占据，随后会进一步发生一系列的反应。 一般认为植入材料与生命体之间的相容性问题直接由植入材料表面的性质有 关。由于l v l p c 聚合物具有良好的血液相容性 3 5 1 ，组织相容性 3 6 ，3 7 及亲水性， 使得m p c 聚合物在材料的表面修饰领域有着重要的应用。将m p c 聚合物溶液 涂敷在材料表面，或将m p c 聚合物与基材反应或物理共混，在材料表面形成仿 生膜结构，从而改善材料的生物相容性等使用性能。 近年来，随着m p c 聚合物研究工作的深入，其优良性能逐渐被认可。m p c 可以与不同的单体以及不同的比例形成结构和性能干差万别的共聚体，获得任 意设计性能的聚合物膜表面，从而达到精确调控生物材料与生物组织相互作用 的目的。预期在生物分子识别【3 8 ，3 9 ，生物器官的仿生制造 4 0 ，4 1 ，基因治疗 【4 2 ，生物传感器【4 3 ，4 4 ，生物药物制备分离 4 5 ，4 6 等方面将有较大突破。 8 第二章实验材料及方法 m p c 图2 2 - ( a ) 细胞膜结构及基本单元；( b ) 细胞膜基本 单元卵磷脂的化学结构( c ) m p c 的化学结构 2 1 3c m 聚合物 ( c ) 由于c h p 纳米水凝胶在生物分子载体方面的应用前景，为了提高c h p 的 生物相容性及抗血栓性，日本东药学和牙科大学生体研究所的n o b u y u k i ， m o r i m o t o 教授等人，用m p c 修饰c i - i p 合成了c m ( c l i p m p c ) 聚合物【4 7 】。 两亲性高分子c h p 通过自组装可以获得纳米尺寸的药物传递系统，其亲水 性外层的存在可起到延长体内循环时间的作用，目前生物相容两亲性大分子的 有序化的研究方向和重要的内容包括对两亲性高分子用于包裹疏水性，亲水性 药物的研究，以及对提高药物的溶解性和生物利用度的研究，并帮助药物越过 生物屏障，增加药物在运输过程中的稳定性，以实现药物的靶向运输的研究。 生物相容性的细胞膜仿生聚合物m p c 胶束，能对疏水性药物进行有效的包埋与 释放，所制备的载药纳米粒子能进入肿瘤细胞内部，达到与自由抗癌药相当的 药效，为纳米药物传递体系的研究提供了新的选择。 c m 的合成的关键问题是不能失去c h p 水凝胶由胆固醇基团形成的功能疏 水内核，因此c h p 上甲基丙烯酸盐c h p m a ( m e t h a c r y l a t eo f c h o l e s t e r o lb e a r i n g p u l l u l a n ) 部分即成为合成位点。胆固醇在c h p 中的比例为每1 0 0 个葡萄糖单元 9 第二章实验材料及方法 结合1 2 个胆固醇。而本项研究所用的c m 材料中c h p m a ( 即结合c ) 所 占的比例为每1 0 0 个葡萄糖单元有6 2 个c i - i p m a 。在水溶液中c h p m a 就如同 c 肿一样由于胆固醇基团的疏水作用，形成c 肿m a 的纳米水凝胶颗粒，同时 c 唧m a 上的异丁烯酰基键提供了可聚合的位点，这时在溶液中加入一定聚合度 的m p c 聚合物就可与该位点形成碳碳双键缩合，最终形成c l i p m p c 凝胶颗粒， 即c m 纳米水凝胶，如图2 4 所示。 mi，：=：亳：三：t基 自堑装簟显 照圈辟基目) ( 刑田m 渔纳米凝胶 图2 4 ：c m ( c h p m p c ) 纳米水凝胶的合成过程 这里我们根据c 聚合物的聚合度不同分别研究了三种c m 纳米水凝胶。 包括没有加入i y i p c 的c m o ，聚合了6 2 个i v l p c 单体的c m 6 2 及聚合了1 4 3 个 i v l p c 单体的c m l 4 3 ，如图2 5 所示。c m 在水溶液中通过非共价键力如静电作用 力疏水作用力，离子间作用力等构成稳定的网状水凝胶结构。但是由于结合的 i v l p c 聚合度不同，必然会使三种水凝胶表现出不同的性质，这也是本项研究的 重点。 1 0 第二章实验材料及方法 h 6r a t t 峋 ) 【： 一c h 扣c o n h c 弭l r n h c 0 0 一c 。c h c c h ，c 心1 既防 o h 2 m d ) ：0c i j o 6 2 ( 盈艏2 1 4 3c m l 4 3 图2 5 ：三种c m 纳米水凝胶c m o ，c m 6 2 和c m l 4 3 的化学结构 2 2 1 试验安排 第二节：实验方法 水凝胶由于其优越的生物相容性和容易调控的理化性质，广泛应用于药物 凝胶由于其优越的生物相容性和容易调控的理化性质，广泛应用于药物控制释 放和组织工程支架材料中。作为药物的控制释放载体时，水凝胶的化学组成和 交联度必须与药物的特定分子尺寸和性质相适应，另外凝胶颗粒之间相互作用 及与其它界面接触时产生的响应对它的性能和应用都至关重要。 由于固液界面的广泛存在及其在生物学和胶体系统中的重要意义，固液界 面的研究特别受到关注 4 8 】。众所周知，蛋白质的界面吸附在理论和应用上都非 常重要，是人造器官，组织工程，生物芯片和生物传感器等诸多前沿领域研究 的重要课题。而了解生物材料的表面性质，尤其是原位性质对全面的了解该材 料表面对蛋白质的吸附有着重要的意义。本研究选择高定向热解石墨h o p g ，研 究生物材料c m 纳米水凝胶在固液较界面上的表面特性，及动力学过程。h o p g 第二章实验材料及方法 是一个原子级平整的疏水表面，由此可以考察材料表面对亲疏水性的响应。另 外，h o p g 表面的原子台阶可以作为定位标记，实现a f m 原位成像，获取c m 纳米水凝胶在疏水界面上的直接信息。 本试验通过修饰m p c 聚合度的不同，研究聚合m p c 度不同的c m 纳米水凝胶 的溶胀度和网络尺寸。另外本试验研究了c m 纳米水凝胶在固液态交界面上的动 力学过程，试验选择三种c m 纳米水凝胶c m o ，c m 6 2 和c m l 4 3 ，利用原子力显 微镜在观察纳米级生物柔软样品上的优势，得到了这三种c m 水凝胶在疏水的 高定向热解石墨( h o p g ) 表面随时间溶胀度及网络结构变化的过程，实验始终 在液态环境下进行。 2 2 2 试验的具体过程 将三种聚合物( c m o ，c m 6 2 和c m l 4 3 ) 溶解在p b s 缓冲液中，然后利用超 声震荡降解，最后用不同孔径的滤纸过滤，备用。 将高定向热解石墨用双面胶面贴到原子力显微镜配套的钢片上，并用胶带 粘合h o p g 的另一边，压实，一分钟后迅速撕下胶带，这样钢片上的h o p g 表 面就能保证为一块平整的单层面。 将准备好的粘有h o p g 的钢片固定在原子力显微镜( a f m ) 下，并装好原 子力显微镜配套的液态环境的组件，配备o 圈和液槽。在液体中成像时，液体 成像环境由带有o 圈的液槽完成，它与基底h o p g 共同构成液体小室。用注射 器将3 0 微升准备好的c m o 样品注射n d 室中，这样就在h o p g 表面形成了一 个固液交界面。原子力显微镜采用敲击模式，得到虽c m o 水凝胶随沉积时间的 变化在h o p g 表面上的形貌图，这样第一组实验就完成了。 接下来重复上面的实验步骤，只是将样品换成c m 6 2 和c m l 4 - 3 0 以上的实验都是在中科院化学所，国家纳米中心及泰达应用物理学院孙骞 老师的实验室进行的。其中原子力显微镜微悬臂长：1 2 5 9 m ，力常数为0 5 8 n m 。 所用针尖的曲率半径为6 8 n m 。在室温条件下，选用硅探针悬臂，工作模式为敲 击模式。其中参数设置为：工作频率( 5 1 0 ) k h z ；工作振幅( 0 5 1 0 ) v ；扫 描频率( o 4 7 6 8 1 0 0 0 1 ) h z 。 1 2 第三章实验结果分析和讨论 第三章实验结果分析和讨论 第一节：不同样品分别图像分析 3 1 1 对c m 0 的研究 图3 1 既是得到的原子力显微镜随时间变化的扫描图，图左半部分是形貌 图，图中所能看到的浅色亮点既是沉积在h o p g 表面的c m o 纳米水凝胶，而左 图中明暗交接的带状图像是由于亮的部分由c l v l o 铺展开形成的层状结构。右图 为相位图，作为敲击模式的一项重要的扩展技术，相位模式是通过检测驱动微 悬臂探针震动的信号源的相位角与微悬臂探针实际震动的相位角之差( 即两者 的位移) 的变化来成像。引起该相移的因素很多，如样品的组分，硬度，粘弹 性质等。因此，利用相位模式，可在纳米尺度上获得样品表面居于性质的丰富 信息。迄今相位模式已成为原子力显微镜的一种重要检测技术。当相位图和形 貌图结合分析，能得到样品表面特性的信息。在图3 1 的右图中最深颜色的暗 点对应为高度图上的亮点，为凝胶颗粒，而很多凝胶颗粒在h o p g 上铺展开来， 形成规律的层状结构，表现在相位图上较深颜色的片状结构。 根据开始沉积开始阶段的图像分析，c m o 纳米水凝胶的平均尺寸为直径 6 1 8 + 5 1 3n m ；高度1 1 l 0 2 1 n m 。从形貌图和相位图上都可观察到随着c m o 在 h o p g 表面沉积时间的延长，c l v i o 的凝胶颗粒渐渐铺展开。如图3 1 从上到下的 图像分别是在h o p g 表面放入c l v l o 的1 8 分钟，2 7 分钟，3 6 分钟，4 5 分钟和 5 4 分钟的扫描图。凝胶颗粒的铺展表现在形貌图上开始清晰可见的颗粒状亮点 变得越来越模糊不清，从相位图上的中间部分开始有着深色内核的颗粒渐渐铺 展形成清晰可见均匀的片状结构，如图3 1 圆圈部分。 c m o 虽沉积时间渐渐向h o p g 表面铺展的原因是由于c l v l o 结构中c 唧的 胆固醇集团与h o p g 表面的碳原子之间的疏水作用力。在固液交界面上c m o 的凝胶颗粒吸附在h o p g 表面，由于h o p g 表面的疏水性，使落在其上的c l v l o 的凝胶颗粒中被包裹在其内部形成铰链结构的胆固醇集团收到来自下部基地的 疏水作用力的吸引，同时相邻的水凝胶颗粒之间的一些牵引影响也会成为影响 第三章实验结果分析和讨论 凝胶颗粒稳定性的因素。 图3 1 ：左图原子力显微镜扫描c m o 样品的相貌图，右图为相位图 扫描的时间点从上到下依次为1 8 m i n ，2 7 m i n ，3 6 m i n ，4 5 m i n 和5 4 m i n 。 如图3 2 所示，时间从开始到1 0 0 分钟，h o p g 基底所占比例一直下降，而 图中代表的纳米凝胶颗粒所占的比例也随沉积时间延长而变少，而c m o 分子层 所占比例却显著上升，这说明随着沉积时间延长一方面一些凝胶颗粒铺展开变成 c m o 分子层，另一方c m o 的单分子层结构也在h o p g 表面延伸扩展。这一过程 是由于c m o 结构中c l i p 的葡萄糖链随时间变得更加伸展，塌向h o p g 表面的一 个过程。这一过程也表明与h o p g 表面疏水结合的胆固醇基团的距离随时间是 变大的一个方向。 1 4 第三章实验结果分析和讨论 覆盖率 0 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 o 1 o i h o p gi i 分子层l i ! 丕邀膣l 2 06 01 0 0 ( m in ) 时间 图3 2 ：随时间变化h o p g 基底，c m o 单分子层及c m o 凝胶颗粒所 占比例变化。 3 1 2 对c m 6 2 的研究 图3 3 中a ) ；b ) ；c ) ：d ) ；分别为c m 6 2 在h o p g 表面沉积2 7 分钟， 3 6 分钟，4 5 分钟和5 4 分钟时的扫描的形貌图。在水溶液中c m 6 2 形成纳米水凝 胶，其在原子力显微镜敲击模式下的沉积在h o p g 表面和c m o 类似，都可以观 察到清晰的纳米水凝胶颗粒，和铺展开的分子层结构。c m 6 2 凝胶颗粒的平均大 小为，直径3 8 9 1 3 4n m ；高度7 3 1 7n m 。其中凝胶颗粒的密度为2 4 g m 2 。 从扫描图中还可以看出c m 6 2 基本上是一个均匀的分布状态。 3 3 图中下面的四幅图a ) ；b ) ；c ) ；d ) 分别对应上面每幅图中放大的相 同的位置，为a ) 图中自框部位。从下面放大的图中，我们可以清楚直观的来认 识c m 6 2 在h o p g 表面上随时间沉积的过程。在图3 3 下面的放大图片中我们可 以观察到箭头所指的凝胶颗粒从a ) 图的清晰可见到d ) 图消失不见。这个过程 从c m 的凝胶颗粒到铺展为分子层可以观察到是发生在从c ) 图到d ) 的这一时 间段中，之前凝胶颗粒内部由于受到周围相对大的凝胶颗粒及其下面分子层及 邻近左下方暴露出的h o p g 基底的综合作用力的影响在交界面上逐渐向其能量 第三章实验结果分析和讨论 最低的方向不断发生一些内部构型的变化，最终在c ) 图到d ) 图的过程中发生 了突变，从凝胶型态到打开的铺展的分子型态。这一过程也发生在a ) 到b ) 图 白色圆圈部分。a ) 图中清晰可辨的凝胶颗粒在b 图已经完全铺展开成为了分子 层结构。经过更进一步的研究，我们发现所形成的凝胶颗粒如果比较大的话， 其结构也相对更加稳定，不容易发生这种塌陷的过程。而如果形成的凝胶颗粒 尺寸较小的话，其稳定性也会相应的有所下降，表面形成的亲水层不足以将其 疏水内核有效包裹，当其外面的亲水层受到周围伸展出来的m p c 聚合链的互相 影响的话，其内部的胆固醇疏水集团与暴露的h o p g 疏水表面的作用力足够大， 就会打破其凝胶颗粒的这样的一个结构状态。这样随着胆固醇集团向下与h o p g 表面的结的这样的一个结构状态。这样随着胆固醇集团向下与h o p g 表面的结 合，便打破了其内部十字交叉的胆固醇形成的疏水内核，表现为c m 凝胶颗粒 的塌陷。 图3 3 ：上图a ，b ，c ，d 分别为c m 6 2 在h o p g 表面沉积 2 7 m i n ，3 6 m i n ，4 5 m i n 和5 4 m i n 的形貌图；下图a ，b ，c ，d 分 别对应上图白框部位的放大图像。 如图3 4 所示为原子力显微镜图像的断层分析，这里我们分析了3 3 图中圆 1 6 第三章实验结果分析和讨论 圈部分塌陷的凝胶颗粒，从断层图像中可以清晰地观察到这一过程，且通过我 们更深入的研究，发现纳米凝胶颗粒的高度小于约4 1 6 n m 的凝胶颗粒的状态容 易发生塌陷，如图3 4 中左面红色箭头所指的纳米凝胶颗粒，其开始的高度为 3 8 7 7 n m ，但塌陷后的平均高度仅为1 7 9 8 n m ，到5 4 分钟时这点上的分子层高度 为1 1 2 9 n m 。而大的凝胶颗粒由于其有较厚的分子层包裹因此都很稳定，所测得 的凝胶颗粒的平均高度7 3 1 7n r r l ，一般都较稳定。经过对图像整体分子层的 研究，发现随着沉积时间的延长，其分子层的平均厚度是有一个下降和趋于均 匀的趋势。 n m s e c t i o na n a l y s i s 八八尺入 m 一w v vvvv n m 八八y 八 厂一八八y 八 一 ww nw 刈。v 图3 4 ：图像a ，b 的切片分析图红色为塌陷的凝胶颗粒，绿色 为稳定的c m 凝胶颗粒。 1 7 第三章实验结果分析和讨论 3 1 3 对g m l 4 3 的研究 图3 5 为原子力显微镜扫描的c m l 4 3 的样品在h o p g 表面沉积7 分钟，1 6 分钟，2 5 分钟，3 4 分钟，4 3 分钟及5 2 分钟时的形貌图。刚开始的扫描图上可 以看到两色的线条形状，这是由于c m l 4 3 刚落到h o p g 表面还不稳定，在扫描过 程中被探针的针尖拖着的过程。根据3 5 图计算得到c m l 4 3 纳米水凝胶平均大小 为5 9 6 9 - t - 2 7 3 7n m ，高度为5 3 9 5 ：3 2 7n m 。 从图中也可看出在h o p g 表面c m l 4 3 也形成了纳米水凝胶颗粒，及c m l 4 3 的分子层结构。从a 图凝胶颗粒边界不是很清晰以及由于扫描过程被拖出的线条 可以看出，c m l 4 3 纳米水凝胶随着沉积时间的延长在h o p g 表面上变得越来越 稳定。在沉积时间还比较短的情况下，由于凝胶颗粒及c m 分子层在h o p g 表 面上还不稳定，很容易受到扫描时探针的影响，因此横向扫描的探针拖动不稳 定的c m 即形成了开始图像上的亮色线条噪音。观察扫描图的背景也可以很清 楚的看到，随着时间的延长c m l 4 3 分子层在h o p g 表面上的分布渐渐清晰， c m l 4 3 的分子层随沉积时间延长并不是仍然均匀的分布在h o p g 表面，而是有 规律性的运动，最后暴露出的h o p g 表面形成了有规律的条纹。 观察图3 5 发现开始的图片c m l 4 3 的分子层比较均匀，且c m l 4 3 的纳米水 凝胶颗粒与其分子层也都在一起，但在后面的图像中发现c m l 4 3 的分子层与其 水凝胶颗粒分开，这种现象并没有在c m o 和c l v l 6 2 的扫描图片中发现。从c m l 4 3 后面的图片可以看到似乎c m l 4 3 上聚合的长链的m p c 聚合物与c m l 4 3 的分子之 间有一种互相排斥的作用。 1 8 第三章实验结果分析和讨论 图3 5 ：a f 分别为c m l 4 3 沉积在h o p g 表面7 r a i n ，1 6 r a i n ， 2 5 m i n ，3 4 m i n ，4 3 m i n ，5 2 m i n 时的原子力显微镜扫描形貌图。 从图3 6 切片分析图中，可以清晰地看到凝胶颗粒l 与2 之间的分子层变 化的一个过程，从c 图中间a 部分表现为没有什么规律相对比较均匀的分子层 结构，绿色箭头和红色箭头基本上在一个水平面上，到f 图中，明显红色箭头 区域与绿色箭头区域表现出的高低之分，在这个过程中，c m l 4 3 分子层聚集到绿 色箭头处，同时暴露出红色箭头的部位，在f 图红色箭头所指的最低区域为露 出的h o p g 基底。并且暴露出的深色基底成规律的条纹状，这一排布与h o p g 基底的碳原子排布的方向相一致，呈6 0 度角方向，如图3 7 所示。这一点证明 了c m l 4 3 与h o p g 表面的作用为对碳原子的疏水作用，并且由切片图3 6 可以 清楚地看到其分子层是一个升高的趋势，因此相邻的与h o p g 上碳原子结合的 胆固醇基团应该是沿着碳原子的排布慢慢靠近的一个过程。 1 9 第三章实验结果分析和讨论 图3 6 ：b 为3 5 图中b 图的一部分，下图分别任3 5 图中c ，d ， e ，f 图中相同位置b 图中标定的凝胶颗粒l ，2 间的切片分析图。 图3 7 ：a 图为原子力显微镜5 2 分钟时的扫描图( 图3 5 f ) ； b 为原子力显微镜对h o p g 的扫描图。 第三章实验结果分析和讨论 第二节：样品间综合对比分析 3 2 1 分子层厚度变化对比 如图3 8 为三种样品c m o ，c m 6 2 c m l 们的分子层在h o p g 表面虽时间变化 的图，从图中可以看到c m l 4 3 分子层是随时间变化升高的一个过程，区别于c m o 和c m 6 2 分子层降低的过程。从这点可以说明m p c 聚合度的大小对c m 的影响。 c m l 4 3 与c m 6 2 和c m o 相比其聚合上的m p c 链更长，m p c 的性质在前言中也具 体讲到，其具有一个亲水的头部，当聚合在一起的m p c 链较长的话，其亲水度 也随之提高，因此在固液交界面上，尤其下面的固体面h o p g 其性质还是疏水 性的，因此亲水的m p c 支链便有一个向上的作用力，使其伸向水溶液，