（微生物与生化药学专业论文）复苏促进因子rpf对淡水浮游细菌可培养性的影响.pdf

复苏促进因子r p f 对淡水浮游细菌可培养性的影响微生物与生匕菇学专业硕士研究生柳云帆指导老师：谢建平研究员摘要自然环境中大量微生物处于v b n c ( v i a b l eb u tn o n c u l t u r a b l e ) 状态，实验室中微生物的可培养性通常不足1 。造成微生物可培养性低的原因很多，其中一个主要的原因是实验室条件下缺乏细胞同交流的信号因子。过低的可培养性已经成为筛选新型天然活性产物的瓶颈。革兰氏阴性菌通常采用小分子化合物作为细胞与细胞问交流的信号分子。在培养基中加入o s ( q u o m m s e n s i n g ) 信号系统中的酰基高丝氨酸环内酯( n a c y l h o m o s e r i n e l a c t o n e s a h l s )和参与大多数革兰氏阴性菌基网调控的c a m p 均能有效提高海水和淡水中浮游细菌的可培养性。但作为生物活性物质重要来源的放线营属于革兰氏阳性菌，而革兰氏阳性菌通常使用寡肚作为信号分子。复苏促进因子r p f ( r e s u s c i t a t i o np r o m o t i n gf a c t o r ) 是第一个被发现的细菌的细胞因子，在皮摩尔浓度下便能促进休眠期的细菌复苏和生长。r p f 家族蛋白广泛分布于革兰氏阡f 性菌中，高度保守并具有种间括性。本文通过在大肠杆菌中克隆表达结核分枝杆菌h 3 7 r v p 屉，经1 f t g 诱导，n i 2 + s e p h a r o s e纯化可溶性重组蛋白；同时制备藤黄微球菌在l m m 培养基中对数生长中后期上清( 吉天然r p f ) 。纯化后的r r p f c 及藤黄微球菌上清均能显著缩短休眠状态的藤黄微球菌低密度接种( 1 0 0 c e l l s m l ) 到基本培养基( l m m ) 中的延滞期。在重庆j e 碚缙云山黛湖采集水样，测定样品非生物因素：温度1 5 + 8 0 ，p h 7 3 8 ， r o c4 9 1 m g m l , c o d c r 2 7 5 m g m l 。部分水样2戊二醛固定，n 染色，荧光显微镜5 3 5 n m 激发波k f 观察计算得出黛湖浮游细菌含量为1 2 9 x l o b c e l l s m l 。将样晶做1 0 倍梯度稀释，m p n 法测得添加r r p f c 及藤黄微球卣上清后水样中浮游细菌可培养数量约占细曲总数的o 2 ，与对照相当。通过改良的试剂盅法抽提宏基因组d n a 及m p n 法培养后的细菌总d n a ，p c r 扩增1 6 sr d n a v 3 一v 5 区d g g e 指纹图谱分析发现添加r p i 后细菌多样性增加，添加i r p f c 及藤黄微球曲上清有一定差异。通过r p f 介导提高环境微生物的可培养性，有望筛选到之前未曾培养的新菌种，进而筛选新型天然活性产物。关键词：复苏促进因子浮游细菌可培养性活的但不可培养状态信号分子西南大学硕十学伊论文a b s t r a c te f f e c to fr e s u s c i t a t i o np r o m o t i n gf a c t o ro nt h ec u l t u r a b i l i t yo ff r e s h w a t e rb a c t e r i o p l a n k t o nm a s t e rc a n d i d a t e ：l i uy u n f a nm a j o r ：m i c r o b i o l o g ya n db i o c h e m i c a lp h a r m a c e u t i c sd i r e c t i o n ：p h a r m a c e u t i c a lm i c r o b i o l o g i c a lf u n c t i o n a lg e n o m i c sa n dn e wd r u gs c r e e ns u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rx i ej i a n p i n ga b s t r a c tg e n e r a l l y , o n l yas m m lf r a c t i o no ft h eb a c t e f i ap r e s e n ti nn a t u r a ls a m p l e sa r ee u l t u m b l ei nl a b o r a t o r ym e d i a t h ec u l t i v a t i o ne f f i c i e n c yi su s u a l l yb e l o w1 m o s tb a c t e r i a lc e l l sa r ei nas t a t ec a l l e dv i a b l eb u tn o n c u l t u r a b l e b n c ) p o s s i b l er e a s o ni sl a c k o fc e l l t o c e l lc o m m u n i c a t i o ni nl a b o r a t o r ym e d i a m i c r o o r g a n i s mi sam o s ti m p o r t a n tr e s o u r c eo fb i o a c t i v ec o m p o u n d s t h el o wc u l t i v a t i o ne f f i c i e n c y , h o w e v e r ,b e c o m eo n eo ft h eb o t t l e n e c k st os c l e e nn e wc o m p o u n d s i n t e r c e l l u l a rc o m m u n i c a t i o ns y s t e m si ng r a m n e g m i v eb a c t e r i aa l eo f t e nb a s e do nc h e m i c a lm o l e c u l e s a d d i n ga h l sf n a c y lh o m o s e r i n ei a c t o n e s ) w h i c hi n v o l v e di nq s( q u o r u ms e n s i n g ) s i g n a l i n gp a t h w a ya n dc a m p ( c y c l i ca m p ) w h i c hi n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no ft h em a j o r i t yo fg e n e se x p r e s s e du n d e rs t a r v a t i o n o fg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i ac a ni n c r e a s et h ec u l t i v a t i o ne f f i c i e n c yo fb a c t e r i o p l a n k t o ni nf r e s h w a t e ra n ds e aw a t e r h o w e v e r , c e l l - t o - c e l lc o m m u n i c a t i o ni ng r a m - p o s i t i v eb a c t e r i ai n c l u d i n ga c t i n o b a c t e r i au s u a l l yi n v o l v e di na u t o i n d u c i n gp e p t i d e s r p f ( r e s u s c i t a t i o np r o m o t i n gf a c t o r ) ，as e c r e t e dp r o t e i ni nm i c r o c o c c u sl u t e u s ，i sab a c t e r i a lc y t o k i n e ，w h i c hc a ns t i m u l a t et h er e s u s c i t a t i o na n dg r o w t ho fm l u t e u s ，a sw e l la ss e v e r a lo t h e rh i g hg + cg r a m - p o s i t i v eo r g a n i s m sa tp i c u m o l a rc o n c e n t r a t i o n r p fc o g n a t e sa l ew i d e s p r e a di nm a n yg e n o m e sa n dh a v ec r o s s - s p e c i e sa c t i v i t y c l o n e dr p f co f 肘：t u b e r c u l o s i sh 3 7 r vi np e t 2 8 a ( + ) a n de x p r e s s e di ti n e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) w i t ht h ei n d u c t i o no fi p t ga f t e rn i “a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h ，t h ep u r i f i e dr r p f cr e d u c e dt h el a gp h a s eo fd o r m a n tml u t e u sc e l l sw h e ni n c u b a t e di nl m m( 1a c t a t em i n i m a lm e d i a ) w i t hl o wd e n s i t y ( 1 0 0 c e l l s m l ) a tp ml e v e l t h es n( s u p e m a t a n t ) o fml u t e u si nl a t ee x p o n e n t i a lp h a s ew a sa l s ot e s tt h eb i o l o g i c a la c t i v i t y两南人学硕十学伊论文a b s t r a c tb yt h es a m ee s s a ym e t h o d s a m p l e sw e r ec o l l e c t e di nd a i h ul a k eo nj i n y u nm o u n t a i nb e i b e ic h o n g q i n g a b i o t i cf a c t o r sw e r ed e t e c t e d ：t e m p e r a t u r e1 5 8 c ，p h7 3 8 ，t o c4 9 1 m g m lc o d c r2 7 5 m g m lt o t a lc e l lc o u n t sd e t e r m i n e db ye p i f l u o r e s c e n c ea f t e rs t a i n i n gw i t hp i ( p r o p i d i u mi o d i d e ) w e r e1 2 9 x l o oc e l l s m lm p n ( m o s tp r o b a b l en u m b e r s ) w a se m p l o y e dt oc o u n tt h ev i a b l ec e l l si nt h es a m p l e s t h ec u l t i v a t i o ne f f i c i e n c yw a sc a 0 2 w h e na d d i n gr p fi n t or e s u s c i t a t i o nm e d i a t h e r ew a sn od i f f e r e n c ef r o mc o n t r 0 1 m e t a g e n o m eo ft h ee n v i r o n m e n t a ls a m p l ea n dt h et o t a ld n ao fc u l t u r e sb ym p nw a se x t r a c t e db ym o d i f i e db a c t e r i ag e n o m ee x t r a c tk i t v 3t ov 5r e g i o n1 6 sr d n aw e r ea m p l i f i e db yp c r d g g e ( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ) p r o f i l e so fp c rp r o d u c t ss h o wt h eb a c t e r i a ld i v e r s i t yw a si m p r o v e dw h e na d d i n gr p f , b u tt h e r ea r es o m ed i f f e r e n c e sb e t w e e nt h ee f f e c to fr r p f ca n ds n( s u p e m a t a n t ) o f m 1 u t e u s i n c r e a s i n gt h ec u l t u r a b i l i t yo fe n v i r o n m e n t a ls a m p l e sm e d i a t e db yr p fc o u l db eau s e f u ls t r a t e g yt oi s o l a t ea sy e tu n c u l t u r a b l em i c r o o r g a n i s m sa n dt oi d e n t i f yn e wn a t u r a lm e t a b o l i t e s k e y w o r d s ：r e s u s c i t a t i o np r o m o t i n gf a c t o r , b a c t e d o p l a n k t o n ，c u l t u r a b i l i t y , v i a b l eb u tn o n c u l t u r a b l e ，s i g n a lm o l e c u l a r1 1 1独创性声明学位论文题目：复菱堡进国王基匹殖遗盔涅进垫菌互壁差性的墅蝤本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特另t l d i ：l 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者：刮印琳签字日期：俨7 年月刁日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密期限至年月止)学位论文作者签名：韵易栅签字日期：和刁年f 月1 f 日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：移守日电话：() l撕南大学硕十学位论文综述第一章综述环境中v b n c ( v i a b l eb u tn o n c u l t u r a b l e ) 状态微生物及复苏促进因子r p f 研究进展1 1 环境中v b n c 状态微生物纯培养技术一直是微生物学研究的基石。一百多年以来，微生物学家采用各种纯培养方法从自然环境中，如土壤，水，活性淤泥等，分离得到众多微生物纯培养，并在此基础上对这些微生物的生理代谢水平进行描述，分离纯化生物活性分子，开发微生物药物。然而，微生物生存的自然环境复杂多样，微生物的种属也非常复杂，传统的培养手段难以满足所有微生物的要求，使得大量的微生物难以被培养。通常情况下海水中微生物可培养性不足1 ，淡水0 2 5 ，土壤约0 3 1 1 1 。1 9 8 2 年徐怀恕等通过对1 4 c h o l e r a e 和ec o l i 的研究，首次发现并提出了细菌活的非可培养状态( v i a b l eb u tn o n c u l t u r a b l e ，v b n c ) 1 2 】。用常规方法不能使其生长，但仍具有代谢活性。未培养微生物广泛存在于各种自然环境中，以细菌为例，5 2 个门( p h y l u m ) 中有2 6 个门迄今尚未得到其代表微生物的纯培养【3 1 。传统微生物学里，对一个细胞活性的定义是根据其是否能被培养来描述的，即细胞能否分裂，能否在固体培养基上形成克隆或在液体培养基中增殖。通过这样的定义，我们只能说，这个细胞之前是活的，而不是现在是活的。同时，由于v b n c 状态微生物的发现，传统对微生物活性的定义受到极大挑战( 图1 ) 4 1 。n o n c u 删f t b l en “1o m o p _ h d o 钟图1 一个细胞可能表现出来的几种生理状态f i g1s o m em a j o rp h y s i o l o g i c a ls t a t e st h a tm a yb ee x h i b i t e db ya ni n d i v i d u a lc e l l 两南大学硕十学伊论文综述1 1 1v b n c 微生物形成原因实验室条件下的纯培养缺乏必要的信号分子是形成v b n c 微生物的重要原因。自然条件下微生物依靠各种信号分子相互作用，形成类似于多细胞生物共同行使生理代谢功能，如生物膜等。微生物间的共生互惠行为以及群体感应o s( q u o r u ms e n s i n g ) 系统已经被证实是微生物生长所必需1 5 1 。但由于人们目前对这些微生物间复杂的信号转导系统的了解非常有限，同时传统的纯培养人为的将微生物与生存环境分离，微生物间缺乏必要的生长因子或信号因子，造成不可培养。微生物经过亿万年的进化，高度适应特定的环境。一些细菌生长迅速，繁殖率高，为r 型生长；而一些细菌适应低营养，生长率极低，为k 型生长。由于自然界中微生物的数量巨大，造成可利用的营养物质极度匮乏。常规纯培养手段将这类微生物迅速置于过度营养环境中，微生物生长初期快速生长产生过量的过氧化物，超氧化物等毒性氧物质( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) l “，出现底物加速死亡( s u b s t r a t e a c c e l e r a t e dd e a t h ) 7 1 ，从而表现出微生物的不可培养性。另一方面，k型生长的微生物，虽然能在低营养浓度条件下生长，但生长速率太慢以至于在常规培养时间内没有形成菌落而被认为不可培养。有些细菌甚至不会形成菌落，只是在琼脂平板上迁徙生长或扩散生长i 鄹。这些情况都容易被认为该微生物不可培养。在恶劣的自然环境中微生物为了躲避不利环境，革兰氏阴性菌常产生孢子，不产生孢子的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌则进入几乎不分裂增殖仅有极低生理代谢的休眠状态。休眠状态的微生物在没有合适的条件诱导前几乎不分裂，即处于v b n c 状态。有研究证实，水环境中的微生物绝大部分处于这种状态1 9 1 0 l 。1 1 2 诱导微生物进入v b n c 状态的因素温度和寡营养环境所诱导细菌进入v b n c 状态最显著的两个因子。如低温能诱导w c h o l e r a e ，v u l n i f i c u s 进入休眠状态1 2 ，1 1 j 。紫外线对水生环境中细菌的存活也有很大影响，有研究证实阳光辐射是海水中肠道细菌减少的重要因素【1 2 l 。但不同细菌间对光的敏感程度有差异。如海水中的s a l m o n i c i d a 和w a n g u i l l a r u m 对光不敏感【1 3 】。盐度和渗透压对水生细菌影响较小，对大多数肠道微生物的生存影响较大。细菌在自然环境下长期处于寡营养状态。细菌进入v b n c 的休眠状态可以保持其活性，增强在恶劣环境中的存活能力。因此，当营养缺失时容易诱导细菌进入休眠状态【1 4 l ，这点和其他因素不同。在实验室条件下常采用此方法诱导细菌进入v b n c 状态。值得注意的是，似i n i f i c u $ 在营养丰富的培养基中低温也能诱导v b n c 的产生【1 5 l 。这说明饥饿和低温通过不同的应答系统诱导v b n c 状态的发生。2西南人学硕十学伊论文综述塑鲤竺兰堡曼兰塑：! 坦苎鲍堑曼旦至茎堇! 鲢j 口稍哪慵捌* 棚附妇l wtk s协舭耳j ，曲锄肭，_ m 吲瑶l wa瑚憎“s年a l c a i l j 懈柏御 sd 触朋j 圈妇匝j 圳删6 黼州d 却口懈eb f 霄k s血弘c 碲刃j 却口渤r 鼬0 娜t油b 耳。嘞捌n 埘坤蛆l盘f wi t wt 善s h o t 嘲班相臼 - t ，鲥“啊4 荨3 翟坩等，舢荨，雠t 茁等，捕哪和_ 吨。蛔睡学耐跏蝌at 善s p e 鼬叫哪并且w 糟k 跏曲霄一3 上sl d e黼，扎衙l 怵姐和h 吲锄王h 舯搿蟹- 缸蹦l w 。僻t l 辩盈峨卫萼臼_ k 等，i b h 等l j - 等量曲t h f b - 耐c m j e w w tv l mt o0 弛荨a r ，：如辱q 血“相o 目射ap r i mb * h 辱，l wr 霄日聊，o 嚣s ，托丑 l a 雌t o n 拱萼t 蛐r 釉a 哪j 目勰等却d 扣0 9 w ，s w s e d硼0 m 佃e n 雠氆溅荨 l 越t 苷e 埘，t 出和触d 霜萼。臼埘嘲b n 等，s 咄k 等，m 尊知嘲碍等量岫薅，砗缸# 和d 岫詹f 衄扣r 衙捧细ro d 且谨毫w j 猎，s w t n s螂等铀h 黼等c a l m 等篮a “，榭h m 硼坩娜，；wk sk 妒洳荨t 暑】晡等触耐h p 抽埘k 咖at n sd e融捌嘲耳z 婚州缸胂”荦a 妇珊1 管，螂t 弘，b 曲# 啊羊h 咖舶肆b 时荨，锄岫篝强c 煳嘲泄j 勰c m p wk 5脚喊嗍柑鞠m ，脚捌侧 强 k _ k 4 胂d 由s 镩，s t 。，薅地爿咖”耳胁翻舯茁，f 埘懈t tc mzp警tk s螂萼) t 础t 辱量：赢l 自托如_ a k 舯e 耳：耐”硝d 诸m 掰ti f w i 霄t 1 以e o 盐l 军c 缸函山础和韵1 吐5 拼_ 翻# k 班砖捌岱匐c r n 栅3 b is 甜目蜊d 括$ w _ 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状态的有限了解，可设计试验改变培养手段，让部分未培养的微生物在实验室培养基中活跃的分裂繁殖，提高环境微生物的可培养性，为充分认识和利用该微生物奠定坚实基础。大量微生物的不可培养是实验室条件下不能完全模拟自然条件下微生物复杂的生存环境造成的。亿万年的进化赋予了微生物复杂的生物多样性和高度适应环境的特异性，而传统的纯培养方式只是简单的将微生物置于恒温、恒湿、充分营养等环境中。纯培养中缺少生长的必要条件和生长因子，导致了很多微生物的不可培养。最直接的方式是将微生物直接转入生长的环境。许兵等用v b n c 状态的矿c h o l e r a e 注射到离肠、游离于腹腔的兔肠结扎段中1 1 6 1 ；c o l w e l l 等注射c h o l e r a e0 1减毒株的v b n c 细菌到自愿者体内，两个试验在经过一段时间内，都在体内发现大量复苏的毒性很强的c h o l e r a e 。科学家们从生态学的角度模拟自然，显著提高环境微生物的可培养性。该技术主要是通过滤膜隔绝培养基中的纯培养细菌与外界其他微生物，但允许营养物质和小分子自由进出培养器具，即模拟自然条件又达到获得纯培养的目的。如扩散盒法1 1 9 1 、细胞包囊法等脚t 。这些方法都能提高环境微生物的可培养性，同时还获得之前不能培养的一些种属。部分模拟自然环境中条件，如加入额外的营养形成加富培养基可用于培养具有特定生理类群的微生物。加入的物质包括血液、血清，动植物组织浸出液等。同时，也有添加一些微生物相互作用的信号分子，如革兰氏阴性菌的q s 信号系统中的酰基高丝氨酸环内酯( n a c y lh o m o s e f i n el a c t o n e s ，a h l s ) 和参与大多数革兰氏阴性菌基因调控的c a m p 均能有效提高海水和淡水中浮游细菌的可培养性 2 1 , 2 2 】。采用稀释培养法培养那些长期处于寡营养状态的微生物【2 3 1 ，也可以认为部分模拟了微生物存在的天然环境。该方法把水环境中的微生物稀释至痕量，处于寡营养环境中的微生物可以不受少数几种优势微生物的竞争干扰而得到培养。但该方法在削弱竞争作用时，有利的相互作用也被稀释，不少共生关系的细菌因此仍然得不到培养。改良人造培养基中对微生物可培养性的限制因素，也能达到提高可培养性的目的。通过降低营养培养基的浓度【刎，添加具有毒性氧降解功能的物质【吲，例如丙酮酸钠、过氧化氢酶等，降低培养过程中的氧分压【2 6 】等措施均能减少毒性氧物质的毒害作用，减少底物加速死亡现象，能在不同程度上提高v b n c 状态细菌的可培养性。由于不同微生物代谢过程中对底物的要求在培养基中添加新型的电子供体和受体，也能发现未知的生理型微生物1 2 7 1 。对寡营养状态中培养的细菌，延4矾南大学硕十学位论文综述长培养时蚓也能适当提高实验室条件下对微生物的可培养性。但培养时间的延长对无菌的要求就较高。1 1 4 研究v b n c 状态微生物的理论与实践意义由于v b n c 状态微生物的发现，对微生物活性的经典定义受到了挑战。简单的将活性等同于可培养性已经不再适用。v b n c 状态的微生物对传统的微生物学、流行病学、食品安全、水质监测等研究均提出了新挑战。大量微生物不可培养严重限制了人们对这个重要生物资源宝库的利用。虽然诸如宏基因组等非培养手段有助于解决这个问题，但纯化的培养物能获得更多的化合物。因此提高环境样本的可培养性，不仅极大的丰富了菌种资源库，还衔接了经典的微生物研究方法，能获得更多的生物活性物质。常规的培养方法不能检测出处于v b n c 状态的细菌。而关系到公众健康的食品安全、饮用水的细菌检测因采用传统的培养方法对v b n c 状态的致病菌显得力不从心。当这些致病菌在适当的条件下恢复到正常状态就会给人类健康造成直接的伤害。因此这也给流行病学的研究提出新课题。当我们沉浸在消灭天花的喜悦中时，是否应该怀疑天花病毒进入v b n c 状态暂时隐藏起来而保持警惕? 确定病原体的柯赫法则是否应该加入v b n c 状态细菌的检测?1 2 复苏促进因子r p f ( r e s u s c i t a t i o np r o m o t i n gf a c t o r )1 2 1r p f 的发现诸如生长因子等细胞信号分子在脊椎动物、无脊椎动物甚至单细胞动物( 如纤毛虫) 体内广泛存在，但在m u k a m o l o v a 等人的工作以前，还不曾观察到原核生物自分泌或旁分泌的生长因子。1 9 9 8 年，m u k a m o l o v a 等人从在藤黄微球菌( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) 培养物中分离到一个约1 6 1 7 k d a 的蛋白【锄。该蛋白在皮摩尔浓度下不仅能促进休眠状态的藤黄微球菌的复苏，还能促进其他一些高g + c 含量的革兰氏阳性菌的生长，如结核分枝杆菌，牛分枝杆菌等。该蛋白被命名为复苏促进因子( r e s u s c i t a t i o n p r o m o t i n gf a c t o r , r p f ) 。r p f 是迄今发现的第一个能使休眠状态的细菌复苏并促进其生长的因子，是一种分泌蛋白，经加热或胰蛋白酶水解可失活。藤黄微球菌只有一个，盯基因，位于一个单顺反子中。反复冲洗藤黄微球菌细胞，以j l d , 的密度接种到基本培养基，细胞在缺少r p f 的情况下将不再生长；同时，在接种时加入抗勋f 的抗体，阻止细胞生长( 但该抗体不抑制活细胞的生长) 。这些现象提示r p f 为藤黄微球菌生长所必需【2 9 i 。5嫂南大学硕十学伊论文综述1 2 2 结核分枝杆菌a p f 样因子类似r p 的基因广泛分布在高g + c 含量的革兰氏阳性菌中。g c n b a n k 数据库中有3 4 个与r p f 同源性较高的蛋白质，包括m y c o b a c t e r i u ms p p s t r e p t o m y c e ss p p c o r y n e b a c t e r i u ms p p 和分枝杆菌噬菌体的蛋白( b a r n y a r dg p 3 3 ) 。分枝杆菌属的共有1 9 个。结核分枝杆菌与，万相似的基因共5 个p o l ，分别为r p f a ( r v 0 8 6 7 c ) ，r p i a( r v l 0 0 9 ) ，矾( r v l 8 8 4 e ) ，r p f d ( r v 2 3 8 9 c ) 和r p e ( r v 2 4 5 0 c ) ( 图2 ) 。e 岛矿，。要堂窆甲z 移蒂尹妒p ，# 、扩，三三罩二三_ ! 皇三 ! 三2 三三量矿，矿1 2 2 铹嚣：芄尹刍尹爹苦苫竺。签! ；篓。尹尹拶矿；鼯专尹4 亏户4 i 尹方露蔫尹气爹一图2 结核分枝杆菌基因组中5 个，万样基因1 3 1 1f i g2 f i v er p f g e n e sl o c u si ng e n o m eo f m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s1 2 3 结核分枝杆菌r p f 样蛋白的生物信息学分析及功能结核分枝杆菌中5 个r 巧样基因是分散的分布在整个染色体上( 图2 ) 。生物信息学分析表明，这5 个基因的产物中有一个保守的约由7 0 个氨基酸组成的功能未知的域( 图3 ) 。实验证明该保守的域对r p f 的复苏起主要作用【3 2 l 。r p s b l a s t 分析发现该5 个蛋白均含有一个糖基转移酶的域( d o m a i n ) ( 图4 ) ，而r p f b 在c端还有功能未知的结构域d u f 3 4 8 三个拷贝，该域常以串联重复，在酿酒酵母d n a结合蛋白y c r 5 9 3 中有一个拷贝。r p f c 中u _ g e w l 域为裂解性糖基转移酶( l t )和鹅蛋清溶菌酶( g e w l ) 域，二者都催化肽聚糖中的b - 1 ，4 糖苷键，并在同一个胞壁酸残基的c 6 的羟基上形成一个新的糖苷键。3 d 结构预测r p f 保守的结构域和溶菌酶同源 3 2 , 3 3 】。在构建的模型中发现，催化位点及和底物结合位点的氨基酸残基保守。高度保守的催化位点g l u 为r p f 活性必需。但试验证明r p f 没有溶菌酶活性。进化树( 图5 ) 可见，结核分枝杆菌中的5 个r p f 样基因和藤黄微球菌中的r p f 在进化上非常接近。5 个r p f 预测均可能为分泌蛋白1 3 卅( 表2 ) 。r p f a 的保守序列之后有一个富含脯氨酸和丙氨酸的序列，r p f b 可能通过膜上脂蛋白n 末端6两南大学硕十学位论文综述的脂结合位点锚定在细胞膜的外表面。所有的5 个r p f s 很可能都具有细胞质外功能。2 9 03 0 0n o3 2 03 3 03 4 03 5 03 由n b 啊o m i 劬r 西。晰f i p o f e g ”口d i 1 1 弋艄f y 啪f t l g 鲥o a 獬b 一一一i 毂p h l 0 a s ，口”o t k r a e i z 0 d l o ；_ 1 z f ，i cl k l g l t舢8 6 7 c a 一啊d o w lc e 鬻g c l 缸g i n t ； 二y z o 。l o e t q s t 锄：。g e f a p 自￥m g r 自0 0 i a v g e f 椎 2 噼w p v 嵋f b lm ir ，u 日bs i ：? 豫【玷：a g c i 舡a i n t ：k y y o ：v 0 f d 0 嚣e = 丑r y a p m l a t r e ：二t a 掘e v 。r l r j 蕊p v a p 艋强r闩p t l h cc 一 w = a v a o = e g g c 雕a | t ：n g k z g c z o f - 朝x a a f j ：、卜一gp a a a s r 日c 心i a 咐p v l a 二= 口l w p c 瑚a a s g i , pr z 翻* tdi i = a 啦e e o ；腑a a ：r r j h ：i ；l ob o a ? i d s 擀：v 一一一g s p a a i g p 心二i f m d l | 口h k p ) ；p g # * p k ：0 c g q g nr 嘴出e 掰汹【 o 二e g o j 持涫i n 嚣? 蚱y y 。zf 珏t h r 辅。；f 一一一g s a a 也s r er o i r 8 船帆解r 腓p q 嚣p r 一一0 ，_ l i 工碍i 0 c e 9 0 0 i 阮i n t g i 黜0 5 工q f t o r t _ a n 自；vg s p aa s r 日0 q i a 、融bv lt i q g 口啊乳k 铀r s g图3mt u b e r c u l o s i s 的5 个r p f含有一个保守的功能未知域f i g3f i v er p f so f mt u b e r c u l o s i sh a v eac o n s e r v e dd o m a i nl i p f l i 备高3 ，荒，一了墨3；：ir p fbi ，：二：o五四日魁圃匿口芷鲞燃曩曩隔r p fc _ _ _ _ _ 二_ _ _ _ _ _ j _ _ _ _ _ _ ：_ _ _ _ _ _ 二_ _ - _ _ ：_ _ _ - _ j ：- _ _ _ _ ；- _ _ _ _ _ ；_ o曩翻飘蹑爱羔葺蕾翻雕墨墨圈曩雹匠g p fd嘲囊e 墨曩硝爨慰嚣舞霜豳哪r p fe ；：j ：；：一b 墨曩理蕾蜀篡，一图4 mt u b e r c u l o s i s5 个r p f 样蛋白的一级结构都含有一个糖基转移酶f i g4f i v er p f - l i k ep r o t e i n so f mt u b e r c u l o s i s p r i m a r ys t r u c t u r eh a st r a n s g l y c o s y l a sf ，0 3 5 7 e $图5 肛t u b e r c u l o s i s 中5 个r p f 样蛋白和ml u t e u s 的r p f 构建的进化树f i 9 5 p h y l o g e n e t i c t r e e o f f i v e r p f - l i k e p r o t e i n s i n m t u b e r c u l o s i sa n d r p f i n m 1 u t e u s将结核分枝杆菌中的5 个r p f 样基因除去预测的信号序列的部分克隆到大肠杆菌后表达、纯化。纯化后的重组蛋白r p f a ，r p f c ，r p f d ，r p f e 能明显缩短快速生长的m i c r o c o c c u sl u t e u s 和膨s e g m a t i s 延滞期，缩短时间随浓度变化而升降，暗示r p f 可能有最适浓度。同时，四种蛋白对两种生物的活性有差异。而对慢速生长的mb o v i s ，5 种蛋白的任一蛋白在皮摩尔浓度下对长期处于平稳期的细胞，在经过一个短暂的延滞期后促进其生长，但对正在生长的细胞没有促进生长的作用。大部分的r p f 对三个菌株都有较显著的生理活性，提示该因子对不同种均有7两南大学硕+ 学伊论文综述n 表虢帮：分乒纠预测信号肽的切除位点r p 执m s g r h r k p t r s n v s v a k i a f f g a 蝴i a m a a o a t a aa m a a o ( 3 3 4 3 4 )t d g e w d o v a r c e s g g n w s i n t g n g y l g g l q fr p t bm u 阻删g a u l i l a e g o y m a c k t v t l t v d g t a m r v ta v ai ia c ( 2 2 2 3 )t m k s r v i d i v e e n g f s v d d r d d l y p a a g v q vr p f cm h p u m d h g r s r a 哪t i l p i s p i s u g n a s a t s g d m s s m t r l aa s a b ( 2 9 3 0 )k p u k s a m 从g l 、n 螨m s l 5 l 蚺，a h a g p sr p t dm t p g l u n a o a g r p r d r c a r i v c i v f i e t a v v a t m f v a l l g l ss k a d d ( 4 9 5 0 )t i s s k ai id d i d w d a i a q c e s g g n w a a n tr p f em l ( 】吼u r r 山州a g i u 邪p a g l a n a0d d a g l d p n a a a g pa n ai d d ( 2 8 - 2 9 )d a v g f d p n l p e a p d a a p v 叩p a p e d a g f表2 m t u b e r c u l o s i s 中5 个r p f 样基因信号肽切除位点预测m 】( h u p ：a v w w c b s d t u d k s e r v i c e s s i g n a l p )t a b l e 2 t h e p r e d i c t i o n o f s i g n a ls e q u e n c ec l e a v a g es i t e s o f f i v er p - l i k e g e n e p r o d u c t s o fm t u b e r c u l o s i sr p f 一般对培养在液体培养基中的微生物有复苏并促进生长的作用m3 6 1 ，但也会在固体培养基中起作用p o l 。通常情况下，纯化的重组r p f 在诸如苏通培养基( s a u t o nm e d i u m ) 等基本培养基上能明显缩短菌株的延滞期，且c f u ( 克隆形成单位) 呈i 0 1 0 0 倍的增长，而在诸如m i d d l e b r o o k7 h 9 等丰富培养基中效果不明显【州，而后者为临床上分离培养分枝杆菌较为理想的培养基，其原因还有待进一步研究。1 2 4