（生物物理学专业论文）干湿实验结合预测及鉴定转录因子dna结合靶点和靶基因.pdf

j j l l i j i l l l l f l l l fl lj l l l l l l f l l lr l j u l l jl l l l lr u l y 17 619 3 9 p r e d i c t i o na n di d e n t i fi c a t i o no f d n a bi n d i n gsi t esa n dt a r g e t g e n eso ft r a n sc r i p t i o n 王0 c t o r s b yap i p e l i n eo fc o m b i n a t i o no f d r ya n dw e te x p e r i e m n t s at h e s i ss u b m i r e dt o s o u t h e a s tu n i v e r s i t y f o rt h ea c a d e m i cd e g r e eo fm a s t e ro f b i o p h y s i c s b y z h a n gc h e n g u a n g 一 一 s u p e r v i s e db y 硷n gj i n k e s c h o o lo fb i o l o g i c a ls c i e n c ea n dm e d i c a le n g i n e e e r i n g s o u t h e a s tu n i v e r s i t y j u n e2 0 1 0 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研 究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：量筮就e i 菇j - 型里生至旦c 7 1 3 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件 和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括以电子 信息形式刊登) 论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布( 包括以电子信息形 式刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：耋瞄师签名递生仞 a 结合靶点和靶基因 研究的核心问题之一。构建基冈表达 调控网络最重要的首先是鉴定基因组编码的所有转录因子蛋白以及它们在基因组中全部的 d n a 结合靶点( t f b s ) 及靶基因。目前已经在人的基因组鉴定出近3 0 0 0 种转录因子，而其中 能够和d n a 直接结合的转录因子约7 0 0 多个。在这些d n a 结合转录因子中，几乎没有一个转 录冈子在人基因组中的全部功能性d n a 结合靶点( 也称为结合谱) 及其靶基因得到彻底明确 地描述。因此，成为构建基冈表达调控网络面临的最大障碍。 为了解决这一问题，近年来已经发展了多种高通量预测及鉴定t f b s 的新技术，如双链 d n a 微阵列芯片( d s d n am i c r o a r r a y ) ( 也称为蛋白结合微阵列，p b m ) 、染色体免疫沉淀芯片 ( c h i p - c h i p ) 、染色体免疫沉淀测序( c h i p s e q ) 。另外，还出现了大量生物信息学预测技术。 目前把基于生物学实验的技术统称为湿实验( w e te x p e r i m e n t ) ，把基于生物信息学的技术 统称为干实验( d r ye x p e r i m e n t ，i ns i l i c oe x p 嘶m e r i t ) 。大量新颖的研究表明，要在全基因组范围鉴 定转录因子的t f b s 及靶基因，必须将干湿实验技术有机结合。为此，本论文展开了这一方面 的研究。 本研究希望建立一种“湿实验一千实验_ 湿实验”紧密结合的研究思路，快速高效鉴定一 个转录因子蛋白的t f b s 及靶基因，进而构建一个转录因子控制的基因表达调控网络。本研究 希望通过具体的实验研究证实这一思路是可行的，是有效的。 本论文首先设计出“湿实验+ 干实验_ 湿实验”的基本思想，即首先以湿实验手段获得一 个转录因子与大量人工设计d n a 结合序列的结合特异性及亲合性数据，筛选出所有能够与转录 因子结合的d n a 序列；然后以干实验手段扫描人全基因组，定位这些序列在基因组中的分布， 将它们推定为转录因子在基因组中的假定结合位点( p u t a t i v eb i n d i n gs i t e s ，p b s s ) ，并依据这些 位点提取附近的基因，将这些基因推定为转录因子在基因组中的假定靶基因( p u t a t i v et a r g e t g e n e s ，p t g s ) ；最后，以此为蓝图，再以湿实验手段快速验证这些假定结合位点及假定靶基因 是否是转录因子的功能性( f u n c t i o n a l ) 结合位点及靶基因。其中第一次湿实验手段是d s d n a 微 阵列芯片，第二次湿实验手段主要是染色质免疫沉淀( c h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n ，c h i p ) 、 p c r 等。 其次以著名的转录因子n f - r , b 为研究对象，用单碱基突变d s d n a 微阵列芯片研究了n f r , b 对所有单碱基突变d n a 序列的结合，筛选出具有较高亲合性的1 0 个序列( g g g a c t t t c c 、 g g g a c t t c c c 、g g g a r n r t c c 、 g g g a a r 】r r c c 、g g g a g t t t c c 、 g g g g c l t t c c 、 g g g t c l t ，r c c 、g g g a c t t t a c 、g g g a c t g t c c 、g g g a c 唧c ) ；在本论文的干实验部分， 对人基因组进行了这1 0 个序列的全基因组扫描，定位了这些序列的分布，发现这些序列在基因 组中确有分布，并且大量位于已知基因附近( 上游、下游、内部) ，因此将这些位点预测为n f - r , b 的假定结合位点，将与之联系的基因预测为n f - r , b 的假定靶基因；扫描共得到4 2 0 1 7 个靶点，其 中2 2 1 7 0 个靶点1 0 k b 内有基因，被预测为p b s s ，相应的预澌u 9 8 6 9 个p t g s ；通过文献检索，发 现在p t g s 中有1 3 5 个经实验研究鉴定的n f r , b 靶基因。对p b s s 在基因组中的分布进行统计分析， 发现有1 1 的位点在基因5 端1 0 k b 内( 其中0 1 k b 内1 ，1 - 5 k b l 勾5 ，5 1 0 k b 内5 ) ，2 7 的位 点在基因内部( 其中第一内含子内1 0 ，其他内含子内2 4 ，外显子内3 ) ，1 0 的位点在基 因的37 端1 0 k b 内，4 2 的位点在基因1 0 k b s b ；这些分布特征与c h i p c h i p 等实验研究取得的结果 相似。对p b s s 和p t g s 的染色体分布分析发现，两者都有成簇分布的现象。对p t g s 进行功能聚 类分析，并与文献报道的确证靶基因的g o 聚类分析结果进行比较，发现p t g s 的3 3 个聚类条目 中，有8 个条目与确证靶基因组的聚类条目重叠。干实验部分的研究为进一步大规模实验鉴定 n f - 心的d n a 结合靶点和靶基因提供了行动蓝图。在湿实验部分，我们挑选了具有代表性的7 个靶基因( t n i p l 、 i l - 6 、h f e 、m i a 、r a r g 、s t a t l 、l t b p l ) ，对其相应d n a 靶点进行了 湿实验分析，采用染色质免疫沉淀技术配合p c r 技术验证了7 个典型基因附近预测的d n a 结合靶 点，1 2 个新预测d n a 靶点中9 个靶点与n f r , b 结合，湿实验部分的研究不仅发现了新的n f r , b d n a 结合靶点，同时也印证了干实验预测的可靠性。 通过这些研究，论证了本论文提出的干湿实验结合预测及鉴定转录因子d n a 结合靶点和靶 基因研究思路的可行性，为转录因子d n a 结合靶点和靶基因的研究提供了一种新的思路。 关键词：转录因子、d n a 结合靶点、靶基因、干湿实验结合 东南大学硕士学位论文 p r e d i c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f d n a b i n d i n gs i t e sa n dt a r g e t g e n e so ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r sb y ap i p e l i n eo fc o m b i n a t i o no f d r ya n d w e te x p e r i e m n t s a b s t r a c t t h ec h a r a c t e r i z a t i o no fg e n er e g u l a t o r yn e t w o r k ( g r n ) i so n eo fc o r ep r o b l e mo ff u n c t i o n a l g e n o m i c sa n ds y s t e mb i o l o g y t h em o s ti m p o r t a n tw o r kf o rg r nc o n s t r u c t i o ni st oi d e n t i f ya l l t r a n s c r i p t i o nf a c t o r sa n dt h e i rd n a b i n d i n gs i t e s ( t f b s ) a n dt a r g e tg e n e s a tp r e s e n t , a b o u t3 0 0 0 t r a n s c r i p t i o nf a c t o r sw e r ef o u n di nh u m a ng e n o m e ，a m o n gw h i c ha b o u t7 0 0a r ed n a - b i n d i n g t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s h o w e v e r , t h ec o m p l e t ef u n c t i o n a ld n a - b i n d i n gs i t e sa n dt a r g e tg e n e so fn o n e o ft h e s et r a n s c r i p t i o nf a c t o r sw e r ei d e n t i f i e d ，t h i sh a m p e r st h ec o n s t r u c t i o no fg r n t oa d d r e s st h ep r o b l e m ，m u l t i p l en e w t e c h n i q u e sf o rp r e d i c t i n ga n di d e n t i f y i n gt f b sa n dt a r g e t g e n e so ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r sw e r ed e v e l o p e di nr e v e n ty e a r s ，i n c l u d i n gd s d n am i c r o a r r a y ( a l s o c a l l e dp r o t e i n - b i n d i n gm i c r o a r r a y , p b m ) ，c h o r o m o t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s o c i a t e dw i t hd n a m i c r o a r r a y ( c h i p - c h i p ) ，c h o r o m o t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s o c i a t e dw i t hn e x tg e n e r a t i o nd n a s e q u e n c i n gt e c h n i q u e s ( c h i p - s e q ) i na d d i t i o n , m a n yb i o i n f o r m a t i c a lp r e d i c t i o nm e t h o d sw e r ea l s o d e v e l o p e df o rt h i sp u r p o s e a tp r e s e n t , t h ee x p e r i m e n t sb a s e do n b i o - t e c h n o l o g i e sa r ec a l l e d w e t e x p e r i m e n t , i n c o m p a r i s o n ，t h ee x p e r i m e n t sf i n i s h e dw i t hc o m p u t e ra r ec a l l e dd r ye x p e r i m e n to ri ns i l i c oe x p e d m e n t m o s tn o v e lr e s e a r c h e sr e v e a l e dt h a ti ti sn e c e s s a r yt oc o m b i n et h ew e ta n dd r ye x p e r i m e n t sf o r g l o b a lp r e d i c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fd n a - b i n d i n gs i t e sa n dt a r g e tg e mo ft r a n s c r i p t i o nf a c t o r s f o r t h i sp u r p o s e ，t h i sp a p e rd i dt h es t u d i e si nt h i sf i e l di no u rl a b t h i ss t u d ye x p e c tt oe s t a b l i s har e s e a r c hr o u t ew h i c hc o m b i n e sw e te x p e r i m e n tc l o s e l yw i t hd r y e x p e r i e n m tf o re f f e c t i v ep r e d i c t i o na n di d e n f i c a t i o no fd n a - b i n d i n gs i t e sa n dt a r g e tg e n so f t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s t h i sp a p e ra i m st ov e r i f yt h ef e a s i b i l i t yo ft h i sr e s e a r c hp i p e l i n eb yp e r f o r m i n ga p r o o f - o f - c o n c e p ts t u d y a tf i r s t ，t h ea u t h o rd e s i g n e dt h ear e s e a r c hp i p e l i n eo f w e te x p e r i m e n t - - - , d r ye x p e r i m e n t - - - , w e t e x p e r i m e n t ”t h ef i r s ts t e pi saw e te x p e r i m e n tw h i c hi su s e dt os t u d yt h ei n t e r a c t i o no fat r a n s c r i p t i o n f a c t o rw i t hl a r g ea m o u n t so fv a r i a n t so fat y p i c a ld n a - b i n d i n gs i t e si no r d e rt os c r e e no u tt h o s ed n a s e q u e n c e sc a p a b l eb i n d i n gt r a n s c r i p t i o nf a c t o r t h es e c o n ds t e pi sb i o i n f o r m a t i c a l l ym a p p i n gt h e s e d n a s e q u e n c e si nh u m a ng e n o m e i ft h e s ed n as e q u e n c e se x i s ti ng e n o m ea n dn e i g h b o r i n gk n o w n g e n e s ，t h e s es e q u e n c e sw i l lb ep r e d i c t e da sp u t a t i v et f b s so ft h i st r a n s c r i p t i o nf a c t o r , a n dt h e n e i g h b o r i n gg e n e sw o u n d b ep r e d i c t e da sp u t a t i v et a r g e tg e n e so ft h i st r a n s c r i p t i o nf a c t o r f i n a l l y , t h e l i s t so fp r e d i c t e dt f b s sa n dt a r g e tg e n e sa r eu s e da sa b l u e p r i n tt oi n s t r u c tf u r t h e rw e te x p e r i m e n t sf o r h i 曲l ye f f e c t i v ev e r i f i c a t i o no ff u c t i o n a lt f b s sa n dt a r g e tg e n e s a m o n gt h i sr e s e a r c hp i p e l i n e ，t h e f i r s tw e t e x p e r i m e n t i sd s d n a m i c r o a r r a y , t h e s e c o n dw e t e x p e r i m e n t i sc h r o m a t i n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( c h i p ) a n dp c r t h e n , t h ea u t h o ru s e dt r a n s c r i p t i o nf a c t o rn f - 出t od op r o o f - o f - c o n c e p ts t u d y t h ea u t h o r a n a l y z e dt h er e l a t i v eb i n d i n ga f f i n i t yo fn f - r , bt oa l lp o s s i b l es i n g l e n u c l e o t i d em u t a t e ds e q u e n c e s f r o mak n o w nb i n d i n gs i t e ( g g g a c t t t c c ) w h i c ho b t a i n e db yd s d n am i c r o a r r a y , a n ds c r e e no u t 10s e q u e n c e s ( g g g a c t r t c c ，g g g a c t t c c c ，g g g a n 广r t c c ，g g g a a n 广r c c ，g g g a g l 、t t c c ， g g g g c t 丫r c c ，g g g t c l t r c c ，g g g a c t t t a c ，g g g a c t g t c c ，g g g a c l t r r c ) w i t hh i g h e s t i l i 2 7 s i t e sw e r ef o u n di ni n t r a g e n e ( 1 0 i n1 s ti n t r o n ；2 4 i no t h e ri n t r o n s ；3 i ne x o n s ) ，a n d1 0 s i t e sw e r ef o u n di n + 1 0 k br e g i o no fk n o w ng e n e s t h er e m a i n i n g4 2 s i t e sw e r ef o u n do u t s i d eo fa l l 东南大学硕士学位论文 目录 摘要j i a b s t r a c t i i i 第1 章综述1 1 1 背j 豪1 1 2 转录因子d n a 结合位点及靶基因研究现状及重要技术2 1 2 1转录因子d n a 结合靶点和靶基因研究的湿实验方法2 1 2 2 转录因子d n a 结合靶点和靶基因研究的干实验方法8 1 3n f - r , b 的研究现状9 1 3 1 n f r , b 的生物学特性。9 1 3 2n f r , b 复合物的组成9 1 3 3n f r , b 的激活。9 1 3 4n f r , b 的靶基因1 0 1 4 本论文研究背景1 5 第2 章转录因子n f - r , bd n a 结合位点全基因组扫描及靶基因预测1 7 2 1 实验方法1 7 2 1 1 1 0 个位点的人类全基因组扫描及周围基因提取1 7 2 1 2d n a 靶点与基因位置关系的确定1 7 2 1 3n f r , b 靶基因的文献检索1 7 2 1 4 d n a 靶点及靶基因在染色体上分布作图。1 8 2 1 5 功能聚类1 8 2 2 实验结果1 8 2 2 1 1 0 个序列的基因组定位信息及其相关的基因信息1 8 2 。2 2 不同范围推测靶点及推测靶基因数目统计2 0 2 2 3 文献确证靶基因的统计2 l 2 2 4 预测d n a 靶点及靶基因可视化2 3 2 2 5 基因的功能分类2 4 2 3 讨论3 0 本章小结3 3 第3 章典型靶基因预测d n a 靶点的c h i p p c r 实验验证3 5 3 1 实验材料。3 5 3 2 实验方法3 7 3 2 1 细胞培养和n f - r 。b 的诱导。3 7 3 2 2 染色质免疫沉淀( c h i p ) 3 7 3 2 3c h i pd n a 的p c r 检测引物及反应体系3 9 3 2 4p c r 产物电泳检测4 0 3 3 实验结果4 l 3 3 1 超声效果检测4 l 3 3 2 每个c h i p 中使用的染色质的量的计算( 3 次不同实验) 4 l 3 3 3c h i pd n a 的p c r 产物检测4 1 3 4 讨论4 5 本章小结4 7 全文总结4 8 v v i 4 9 5 9 6 7 6 8 o m ep r o j e c t ，h g p ) 的完成，生命 ) 上，基因表达调控分析是基因功 能研究最重要的组成部分。从人类基因组全序列中探索基因的表达调控规律，进而揭示生命的 奥秘，将成为生命科学的研究热点，同时成为新学科的生长点【1 1 0 】。在基因组序列中对各种 调控元件进行准确的预测是进行表达调控研究的前提和基础。 对转录过程的调控是表达调控的重要形式。而转录过程的激活、抑制和调节则主要通过转 录因子( t r a n c r i p t o nf a c t o r ，t f ) 与其在序列中对应的结合位点之间的交互作用来实现。作为一 种重要的转录调控元件，转录因子结合位点( t r a a s e r i p t i o nf a c t o rb i n d i n gs i t e ，t f b s ) 的计算预测 可作为传统实验识别方法的辅助手段，从而加速推动表达调控机理的研究和转录调控网络的构 建。转录因子结合位点通常是一段8 1 2 b p 的d n a 序列，不同的基因表达需要特定的转录因子结 合到这段d n a 序列上，对于某种转录因子，其结合的d n a 序列比较相似，但又不完全一样，这 是由于对不同的基因需要不同的结合亲和力。通常，转录因子结合在基因上游启动子区域的结 合位点上称为近程作用。还有一些转录因子结合在距离基因很远的上游区域称之为远程作用。 另外也有一些结合在基因的下游。基因转录水平上的调控如图1 1 【1 1 】。 g f i m f 呐a x i m a lt 田s 图l - 1 基因转录水平调控示意图【l l 】 经过对人类基因组系统分析发现，蛋白质编码基因的数量只有3 万左右( 3 2 0 0 0 个，3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 ，2 0 0 0 0 2 5 0 0 0 ，2 6 5 8 8 ) 3 ，1 2 - 1 4 ，而在这些蛋白编码基因中，调节基因表达的反式 因子占据了相当大的比例，估计约1 8 5 0 1 7 至u3 0 0 0 1 2 。近几十年转录因子及其d n a 结合位点 l 第1 章综述 得到了广泛的研究，结果大都收录在t r a n s f a c 1 5 和j a s p a r 1 6 数据库中。2 0 0 6 年推出的 t r a n s f a c 专业版r e l 7 0 中包含了6 1 3 3 个真核生物转录因子和7 9 1 5 个特异d n a 结合位点， 其中人( h o m os a p i e n s ) 有1 0 4 0 个转录因子【1 5 】。 众多反式因子与大量顺式元件的相互作用控制着基因表达调控的一个重要环节一基因转录 调控，形成了精确而复杂的基因转录调控网络。因此，要解析基因转录调控网络，就首先要在 全基因组中鉴定所有的反式因子及其作用的所有顺式元件。 由于种类的繁多和功能的多样性，大多数转录因子以及结合位点的相关知识都还比较有限。 传统分子生物学技术只是零打碎敲地取得了非常有限的信息，为了解决这一问题，包括生物信 息技术大规模预测调控元件、染色体免疫沉淀( c h r o m a t i ni m m u n o p r e c i p i t a t i o n ，c h i p ) 等技术手段 应运而生，对于大规模挖掘这类顺式调控信息取得了显著的效果。但截止目前还没有任何一个 转录因子的全基因完整d n a 靶点及靶基因名单( 1 i s t ) 得到阐明。 1 2 转录因子d n a 结合位点及靶基因研究现状及重要技术 转录因子( ，r f ) 对真核生物的转录调控有着举足轻重的作用，转录因子的相互作用，对生物 的生长发育是至关重要的，因为几乎所有的基因在表达时都要受到转录因子的调控，要解析基 因转录调控网络，就首先要在全基因组中鉴定所有的反式因子及其作用的所有顺式元件；目前 只有一部分转录因子蛋白得到鉴定，而其余的转录因子的鉴定成为功能基因组和蛋白质组研究 的重要内容之一；然而对于已知转录因子蛋白作用的顺式元件及其靶基因的鉴定仍然不完整。 近年来随着生物学实验技术和生物信息学技术的发展，出现了大量高通量转录因子d n a 靶点 和靶基因的生物学实验鉴定技术和生物信息学预测技术【1 7 】。 目前把基于生物学实验的技术统称为湿实验( w e te x p e r i m e n t ) ，把基于生物信息学的技术 统称为干实验( d r ye x p e r i m e n t ，i ns i l i c oe x p e r i m e n t ) 。 1 2 1 转录因子d n a 结合靶点和靶基因研究的湿实验方法 1 211d s d n a 微阵列芯片( p b m ) 双链d n a 微阵列芯片( d o u b l e s t r a n d e dd n am i c r o a r r a y ，d s d n am i c r o a r r a y ) ( 也称为蛋白结 合微阵列，p r o t e i n b i n d i n gm i c m a r r a y ，p b m ) 是一种新型d n a 微阵列芯片，最早报道于1 9 9 9 年， 当时美 h a r v a r d 大学b u l y k r 研究小组在a f f y m e t r i x 公司原位合成单链d n a 微阵列芯片的基础上， 采用引物退火再进行在片d n a 聚合酶延伸的办法制备双分子双链d n a 微阵列芯片 1 8 】( 图1 2 ) ， 用于研究序列特异性d n a 结合蛋白与d n a 靶点的作用特征，通过研究限制性内切酶和锌指转录 因子蛋白与d s d n a 微阵列芯片上d s d n a 探针分子的相互作用，论证了d s d n a 微阵列芯片用于体 外研究序列特异性d n a 结合蛋白与其d n a 靶点相互作用的可行性。 b u l y k 研究小组通过改变对应于一个锌指结构的三连核苷酸，研究了锌指转录因子蛋白与所 有可能三连核苷酸组合d n a 靶点的相互作用，以此评价不同位置上核苷酸对转录因子蛋白结合 的重要性及其转录因子蛋白与d n a 靶点相互作用时，氨基酸与碱基的对应关系，以期借此高通 量筛选发现一个转录因子蛋白在全基因组范围内的结合位点，并研究这些位点的核苷酸组成特 征，进而建立生物信息学模型，以便在全基因组范围内预测一个转录因子蛋白的靶位点【1 9 】。 这一研究证实了d s d n a 微阵列芯片在d n a 结合质研究中的应用前景。 m u k h e r j e e 等( 2 0 0 4 ) 用此法分离酵母转录因子a b f l 、r a p l 、m i g l 的靶基因时，筛选到的靶 基因不仅包括用其他方法已经证实的靶基因，而且又筛选出a b f l 转录因子1 0 7 个新的靶基因， r a p l 转录因子有9 0 个新的靶基因，m i g l 转录因子有7 5 个新的靶基因。许多靶基因是一些不典型 的开放阅读框的上游序列 2 0 】。b e r g e r 和b u l y k ( 2 0 0 6 ) 在m e t h o d si nm o l e c u l a rb i o l o g y q b 介绍了这 种高通量的方法【2 l 】。目前，b u l y k 实验室已经完成大规模地鉴定酵母转录因子的靶位点的工作， 并认为可以将此方法与其他方法整合后用于高等真核生物转录因子及顺式作用元件的鉴定 2 东南大学硕士学位论文 【2 2 】。 b u l y k 研究小组的研究表明p b m 技术可高通量鉴定转录因子蛋白的顺式调控元件和转录调 控网络；通过p b m 技术与c h i p - o n - c h i p 技术的比较，发现p b m 获得的i nv i t r o 结合位点信息能够精 确地反映c h i p - o n - c h i p 获得的i nv i v o 结合位点信息，而且p b m 还发现了大量c h i p - o n - c h i p 不能够 显示的结合位点信息【2 0 】。d s d n a 微阵列芯片还用于测定细胞核中转录因子蛋白的表达和活化 水平等【2 3 】。 图1 - 2b u l y k 等的双链d n a 芯片的制备原理图 1 8 】 鉴于双链d n a 微阵列芯片在研究d n a 蛋白质的相互作用方面极大的应用潜力。我们实验 室从2 0 0 0 年就开始了双链d n a 微阵列芯片的研究工作 2 4 2 6 。针对当时国际上已经出现的双分 子( b i m o l e c u l a r ) d s d n a 微阵列芯片的不足之处，我们提出了单分子d s d n a 微阵列芯片 ( u n i m o l e c u l a r d s d n a m i c r o a r r a y ) 概念( 图1 3 ) ，并发展了几种单分子d s d n a 微阵列芯片制备 技术 2 4 2 6 】( 图1 4 ) 。同时制备了针对重要转录因子n f r b 的全单核苷酸突变d s d n a 微阵列芯 片，用该芯片研究了n f r , b 对大量单核苷酸突变d n a 位点的结合特异性和亲合性 2 4 2 6 】( 图 1 5 ) 。我们的研究表明，单分子d s d n a 微阵列芯片为d n a 蛋白质相互作用的研究提供了一种 新的高通量实验技术。 图1 - 4 单分子d s d n a 微阵列芯片制备原理 图1 5 针对n f r , b 的单核苷酸突变单分子d s d n a 微阵列芯片与n f r , b 蛋白的结合反应 w i l d t y p ei g - k b ：5 - g i g 2 g 3 a 4 c 5 t 6 t t t 8 c 9 c ! o - 3 ；n n ：n 位置上突变的碱基。 运用d s d n a 微阵列芯片可以非常有效在体外实验环境中研究两个重要的问题，一是评价顺 式元件中每个位置核苷酸对反式作用因子结合特异性及亲合性的所发挥的作用，揭示反式作用 因子对顺式元件每个位置核苷酸的偏好性；这些信息对设计具有转录治疗作用的转录因子诱骗 子、s i r n a 及反义寡核苷酸非常重要。二是高通量鉴定基因组中反式作用因子的顺式元件，绘 制转录调控网络：这对解析真核生物高度复杂而精确的基因表达调控过程非常重要。 1 2 1 2 染色质免疫沉淀分析技术( c h i p ) 1 2 121 原理和方法 c h i p 技术由o r l a n d o 2 7 等- 于1 9 9 7 年创立。该技术综合利用了甲醛交联及免疫沉淀方法的优 点，即用甲醛交联固定处于结合状态的蛋白质d n a 复合物，再用免疫沉淀分离d n a 蛋白质交 联复合物，最后分析复合物 d n a 。其基本原理是：在活细胞状态下，用1 的甲醛溶液处理使 4 东南大学硕士学位论文 d n a 蛋白质发生共价交联，固定d n a 蛋白质复合物，然后将细胞裂解，提取d n a 蛋白质复合 物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，通过免疫沉淀法特异性地富集目的蛋 白结合的d n a 片段，除去蛋白质，与d n a 结合蛋白特异性结合的d n a 片段经p c r 扩增后进行电 泳检测，从而得出蛋白质结合位点信息( 图l _ 6 ) 【2 s l 。 c e i il y s a t ew i t hc m s s , 4 i n l o k i p r o t e i n - d n ac o m p l e x e s o 上+ 圪 o f c d ld e b 懦 磅气竺吖 i 孓q 。i 删饼p 删n 鹏 n 杂k 1 i r 一0 ：鹏 d n ai s o l a t i o n & a n a l y s i sb y s o u t h e r ns l o tb l o to rp c r 图l - 6 染色质免疫沉淀分析的原理示意图【2 8 】 c h i p 技术其操作步骤可大致分为固定、沉淀和检测三步。第一步为固定，即在活细胞状态 下，通过甲醛交联作用固定d n a 蛋白质复合物，然后用化学微球菌酶或者机械超声波的手段 5 第1 章综述 将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。第二步为免疫沉淀，即利用目的蛋白质的特 异抗体通过抗原抗体反应形成d n a 蛋白质抗体复合体，然后沉淀此复合体( 常用蛋白a 修饰 的磁珠) ，特异性地富集目的蛋白结合的d n a 片段。第三步为目的d n a 片段的纯化与检测， 即经过解偶联，纯化d n a 片段，再用聚合酶链式反应p c r 或s o u t h e r n 印迹等方法分析d n a ( 图1 6 ) 。 1 2 122注意事项( 改进优化) 在上述c h i p 过程中，甲醛能够进入细胞并使蛋白质与d n a 或蛋白质与蛋白质之间通过希 弗( s c i h f 0 键交联，形成稳定结合的复合物。如果交联效果不太好，可以先用交联剂 d m a ( d i m e t h y la d i p i m i d a t e ) 2 9 或d s g ( d i s u c c n i m i d y lg l u t a r a t e ) 3 0 处理细胞，以加强后续甲醛 交联的效果。破碎d n a 可采用超声物理破碎或特定酶切消化，以获得所需长度的d n a 片段。 由于d n a 片段长度将影响抗体免疫沉淀效率，因此破碎d n a 是c m p 实验成功与否的重要因 素。超声效果与细胞裂解是否充分、细胞浓度及裂解液成分等因素有关。超声处理后的液体应 从浑浊状态变为透明状态【3 1 】。 选择专一性及亲和力较高的抗体是c h i p 成功的关键。非特异性抗体将增加大量的非目标靶 点d n a 片段信息，从而掩盖了真实的蛋白质结合位点信息；而亲和力较差的抗体，则无法获得 高信噪比靶点d n a 片段 3 2 1 。 1 2 12 3 染色质免疫沉淀的d n a 的分析方法 染色质免疫沉淀的d n a 的分析方法有许多种。如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑 某个序列是目的蛋白的靶序列，可以采用狭缝杂交和p c r 分析 3 3 3 4 】；如果目的蛋白的靶序列 未知或者高通量的( h i g h - t h r o u g h p u t ) 研究目的蛋白在基因组上的分布情况，找出反式作用因子 的结合位点，可以采用s o u t h e r n 杂交 2 7 ，3 5 1 、c h i p 克隆( c h i p c l o n i n g ) 3 6 、d n a 芯片方法 ( c h i p 。c h i p ) ( 染色质免疫沉淀后的d n a 片段的基因芯片分析) 【3 7 4 4 、高