荧光定量PCR实验操作流程ppt课件VIP

荧光定量PCR,1,细胞RNA提取,样品：293T细胞试剂：超纯RNA提取试剂盒、氯仿、70%乙醇方法：柱式原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH和盐浓度下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离。,2,细胞悬液离心，倒掉上清，加入1mlRLT；反复吹打，使样本充分裂解；室温放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离,1.裂解：,2.抽提：,加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2min；412,000rpm离心10分钟，此时样品分为三层；,上层无色水相，中间白色蛋白质相，下层红色有机相，RNA在上层水相中,细胞RNA提取,3,3.过柱子：,吸取上层水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中层）加入等体积70%的乙醇，颠倒混匀；将溶液全部加入到已装入收集管（CollectionTube2ml)的吸附柱（SpinColumnRM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入；12,000rpm离心20s，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；,4.洗涤：,向吸附柱加入700lBufferRW1，12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；向吸附柱中加入500lBufferRW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；重复步骤8；12,000rpm离心2min，弃废液，吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；,细胞RNA提取,4,5.洗涤：,将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（CollectionTube1.5ml）中向吸附柱的中间部位加入30-50lRNase-FreeWater，室温放置1min，12,000rpm离心1min，收集RNA溶液，进行后续试验或-70保存RNA，防止降解。,注意：1）RNase-FreeWate体积不应小于30l，体积过小影响回收率。2）若提高RNA的产量，可用30-50l新的RNase-FreeWater重复步骤5。3）若提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤5。,6.RNA检测：,用ddH2O，对仪器进行调零；取1ul的RNA溶液进行测定；测定样品纯度和浓度。纯度：OD260/OD280=1.9-2.12.2RNA水解浓度：RNA(ug/ml)=40OD260*稀释倍数,细胞RNA提取,5,逆转录,实验材料：HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒，RNA实验步骤：1.将RNA模板、PrimerMix、dNTPMix、DTT、RTBuffer、HiFi-MMLV和RNase-FreeWater溶解并置于冰上备用。2.根据以下表格配置反应体系，总体积为20l。,6,3.涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。4.42孵育3050分钟，70孵育15分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。5.逆转录产物可直接用于PCR和荧光定量PCR，或置于-20长期保存。,逆转录,7,荧光定量PCR,材料：2UltraSYBRGreenMixture，cDNA，actin引物实验步骤：1.稀释模板：每稀释一个倍数，需要将溶液混匀，并短暂离心。,8,2.配制PCR预混反应体系：做5个样本，配制8个样本的预混体系，配制方式如下：,3.将配制的预混体系，分装到八连管中。共加6个孔，每个孔中加入18l的预混体系。,荧光定量PCR,9,4.模板加入：每个孔中分别加入2l模板，加样顺序如下：,5.混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。,6.PCR反应程序：,