肝脏中转氨酶活力的测定.doc

实验九 肝脏中转氨酶活力的测定一、实验目的1. 了解转氨酶的性质和临床意义；2. 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二、实验原理本实验以丙氨酸的氧化脱氨基为例，分别测定谷丙转氨酶，谷氨酸脱氢酶活性外，又通过抑制剂观察肝组织中的联合脱氨基作用。在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和-酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。次反应可逆，平衡点近于1.0无论正向反应或逆向反应皆可用于测定此酶的活性，既可测定所产生的氨基酸，也可以测定生成的酮酸，因此可有多种测定方法。本实验以丙氨酸和-酮戊二酸作为谷丙转氨酶作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼结合，生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收峰为 439-530nm，可用于测定丙酮酸的含量。-酮戊二酸也能与 2,4-二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱与丙酮酸二硝基苯腙有差别，在 520nm波长比色时，-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。经转氨基作用后，-酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长为520nm 处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸和-酮戊二酸的摩尔浓度呈线性关系，故可借此测定谷丙转氨酶的活力。三、实验材料、试剂和仪器（一）材料与试剂猪肝脏、乙醇、0.4mol/LNaOH标准丙酮酸溶液（1mL 相当于500g）：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于100mL 的0.05mol/L的H2SO4中，此液需临用前配制。谷丙转氨酶底物：称取L-丙氨酸0.90g 及-酮戊二酸29.2mg，先溶于pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲液中，然后用1mol/L NaOH 调至pH7.4，再加pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲稀释至100mL，贮藏于冰箱内，可保存一周。（试验了一下pH 接近7.5，中间未调整pH 值）0.1mol/L 的磷酸缓冲液（pH7.4）：称取13.97gK2HPO4（如果是K2HPO4H2O，则需称取18.31g）和2.69gKH2PO4 溶于1000mL 蒸馏水中。0.02% 2,4-二硝基苯肼溶液：称取2,4-二硝基苯肼20mg 溶于少量1mol/L 盐酸中，加热溶解后，利用1mol/L 盐酸稀释至100mL。（二）仪器/器具电子天平、分光光度计、剪刀、移液管、组织破碎机四、实验步骤1. 肝匀浆制备与稀释将猪肝用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.5g，剪成小块，置于烧杯内，加入4.5mL 预冷的pH7.4的0.1mol/L 磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存备用。吸取上述肝匀浆1mL，加入预冷的pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲液49mL（即稀释50 倍）摇匀，作为实验中使用的稀释肝匀浆（室温中放置时间过久，会引起酶活性下降或失活因此需现用现配制，且放置时间不宜过久）。2. 谷丙转氨酶活力的测定（1）取试管4 支，分别标“测定管A”、“对照管B”、“标准管S”，“空白管”按下表进行操作。测定管A标准管S对照管B空白管O谷丙转氨酶底物/mL0.50.50037 保温5 min稀释肝匀浆/mL0.1标准丙酮酸0.10.1H2O 0.1混匀后，37水浴准确保温30min0.02% 2,4-二硝基苯肼0.50.50.50.5谷丙转氨酶底物/mL000.50.5混匀后，37水浴准确保温20min0.4mol/LNaOH5.05.05.05.0（2）混匀后，静置10min，于520nm波长处进行比色，以空白管调零，读取测定管A、对照管B、标准管S 的吸光度，将测定管A 吸光度减去对照管B 吸光度后与标准管S 相比算出其相当之丙酮酸含量。（3）谷丙转氨酶活力计算：本法规定酶在37与底物作用30min 后，能产生2.5g 的丙酮酸的酶量为一个谷丙转氨酶活力单位（U）。五、实验结果测定管A标准管S对照管B空白管O520nm吸光值0.1020.1700.0320.0001. 每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位：=82.353其中，D 每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位（U/mL），即肝匀浆的比活；A 样品管的吸光度值；B 对照管的吸光度值；S 标准管的吸光度值；500标准丙酮酸溶液的浓度；2.5谷丙转氨酶换算单位系数。2. 每克肝脏谷丙氨酶的活力单位=20588.2356、