（生物化学与分子生物学专业论文）高等植物长链脂肪醇氧化酶初步研究.pdf

、p ，。、 p ( ，l0 0 p h d d i s s e r t a t i o ns u b m i t t e dt os h a n g h a ij i a ot o n gu n i v e r s i t y p rlm a r ys t u d yo f a l c o h o l0 xld a s e s l o n g - c h alnf a t t y in hlg h e rp l a n t s c o l l e g e ：s c h o o lo fl i f es c i e n c ea n dt e c h n o l o g y m a jo r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f z h i x i nl i n ，p r o f d al u o a u t h o r ：s h i l a nz h a o a p r , 2 0 0 9 一 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：赵 t 兰 日期：舢7 年中月多e t 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密留。 ( 请在以上方框内打“) 学位论文作者签名：越秒兰 日期：闪7 年中月弓日 指导教师签名：抓数苟 日期：矽勺年中月多e t _ 咤 国 一鼍 q 上海交通大学博士学位论文答辩决议书 所在 姓名赵仕兰学号0 0 3 0 8 0 2 0 1 5生物化学与分子生物学 学科 指导教师 林志新 答辩 2 0 0 9 0 4 0 3 答辩 上海交大阂行校区生物药学楼3 号楼1 0 3 室 日期地点 论文题目 高等植物长链脂肪醇氧化酶初步研究 投票表决结果： ( 、f 厂 ( 同意票数实到委员数应到委员数)答辩结论：町迈过口未通过 评语和决议： 脂肪醇代谢对植物的生长发育具有重要作用，赵仕兰同学的博士论文主要围绕高等植 物中的长链脂肪醇氧化酶的功能进行了研究，取得的研究结果如下： ( 1 ) 通过r t - p c r 方式获得了拟南芥a t f a 0 1 ，a t f a 0 4 a 和a t f a 0 4 b 基因，并通过原 核表达获得了具有长链脂肪醇氧化酶活性的a t f a 0 4 b 蛋白。发现a t f a 0 3 与植物对冷害胁 迫响应可能有关，而a t f a 0 4 b 与植物的抗病性可能相关。 ( 2 ) 得到了l j f a 0 1 和l j f a 0 2 基因，并通过原核表达获得了具有长链脂肪醇氧化酶 活性的l j f a 0 1 蛋白。发现冷害胁迫可以下调l j f a 0 1 在子叶及植株顶端中的表达水平。 ( 3 ) 对水稻基因组数据库的搜索结果表明，水稻可能存在4 个f a o 基因，这些基因 的表达具有组织特异性，而且对不同的胁迫处理具有不同的响应。 上述结果为进步研究长链脂肪醇氧化酶在植物体生长发育中的意义奠定了基础，具 确里晏的参考价值。 该生答辩时表述清楚，回答问题基本准确，经答辩委员会无记名投票表决，全票( 5 票) 通过博士学位论文答辩，建议授予博士学位。 3 q c 7 年午月3 日 职务姓名职称单位签名 主席杨洪全 教授 上海交通大学 嘞崂 答 镌锥 辩 委员杨继教授复旦大学 委 委员 米华玲 研究员( 自然科学) 中科院植物生理生态研究所 挣瞻 口 贝 铋州 会委员王志民 研究员( 自然科学) 上海交通大学 成 员 委员吴更教授上海交通大学 敝 签 委员 名 委员 秘书 柴燕群未知上海交通大学 辗参旃 11 上海交通大学博士学位论文 高等植物长链脂肪醇氧化酶初步研究 摘要 一些酵母在以烷烃或长链脂肪酸为碳源进行生长时，首先利用定位 在内质网膜上的一氧化系统将烷烃或长链脂肪酸氧化形成羧酸或二羧 酸，然后进入b 一氧化为生物体生长提供碳源及能量。 在6 0 一氧化中，烷烃或脂肪酸的亚甲基端依次由p 4 5 0 单加氧酶、产 生过氧化氢的长链脂肪醇氧化酶( l o n g c h a i nf a t t ya l c o h o lo x i d a s e ， f a o ) 及醛脱氢酶氧化分别生成( - ) 一醇、d 一醛及( i ) 一脂肪酸。 研究表明，当酵母利用烷烃或长链脂肪酸为碳源时，催化第一步反 应的p 4 5 0 单加氧酶是由c y p 5 2 基因家族的成员编码的。已经发现多种植 物中存在与c y p 5 2 同源的基因，且这一类基因大都和植物的抗病抗逆相 关。既然在植物中存在类似于酵母中催化一氧化第一步的酶，那么在植 物中是否存在类似的f a o ? 其功能又是什么? 本研究主要对拟南芥、百脉根及水稻这三种高等植物中的f a 0 基因 进行了基因序列分析、生化功能及生理功能等方面的初步研究。 首先利用酵母f a o 的氨基酸序列对拟南芥全基因组序列进行搜索， 发现四个与f a o 同源性较高的基因，分别是a t f a o i ( a t l 9 0 3 9 9 0 ) 、a t f a 0 3 ( a t 3 9 2 3 4 1 0 ) 、a t f a 0 4 a ( a t 4 9 1 9 3 8 0 ) 和a t f a 0 4 b ( a t 4 9 2 8 5 7 0 ) 。通过 r t p c r 方法获得了at f a 0 1 ( a t1 9 0 3 9 9 0 ) ，at f a 0 4 a ( a t 4 9 1 9 3 8 0 ) 和 rr卜_一h 卜一l一糖 基因大多为三个外显子和两个内含子的基因结构；其氨基酸序列都具有 酵母f a o 蛋白的五个保守结构域。进化分析表明f a o 在单双子叶植物中 的分化是在单双子叶植物分化之后。 将得到的基因序列用原核表达系统进行蛋白表达后检测酶活，结果 只有h t f a 0 4 b 和l j f a 0 1 两个蛋白能够催化长链脂肪醇的氧化。酶动力学 分析表明，h t f a 0 4 b 和l j f a 0 1 都具有底物特异性。利用n i n t a 柱纯化 这两个蛋白后进行电泳检测，结果都得到了单一的蛋白条带。 对at f a 0 3 和at f a 0 4 b 的表达模式进行了r t - p c r 检测。结果显示： a t f a 0 3 和a t f a 0 4 b 基因在整株中均有表达，但是其表达水平在不同组织 部位存在差异；a t f a 0 3 和a t f a 0 4 b 对低温胁迫响应不同。对a t f a 0 3 和 ；o，；。一，叫一；l，； 。 上海交通大学博士学位论文 at f a 0 4 b 的t - d n a 插入突变体进行病原菌接种，发现病原菌感染对at f a 0 3 的t d n a 插入突变体生长没有影响，而at f a 0 4 b 的t - d n a 插入突变体表 现出易感性增高。这些结果说明a t f a 0 3 和a t f a 0 4 b 虽然都能够催化长链 脂肪醇氧化，但是它们在植物体内的功能不相同。at f a 0 4 b 可能在拟南 芥脂肪代谢及细胞壁发育中具有重要的作用。 r t - p c r 分析显示l j f a 0 1 在整株中都有表达，但是在顶端表达水平 最高而在果荚中表达量最低。在8 日龄的百脉根幼苗的顶端和子叶中， l j f a 0 1 表达水平可被低温诱导下调。 对公共数据库中水稻f a o 基因的表达模式数据进行分析发现o s f a 0 1 和o s f a 0 4 的表达水平较高，o s f a 0 2 徊o s f a 0 3 的表达水平较低，而且四 ，p 个基因对逆境处理有不同的响应。 上述结果说明，在高等植物中普遍存在f a o 基因，拟南芥、百脉根 与水稻的研究表明该类基因可能与植物的抗病抗逆相关。 謦! 关键词：拟南芥，百脉根，水稻，长链脂肪醇氧化酶，低温，病原菌 i i i 上海交通大学博士学位论文 p r i m a r ys t u d yo ft h el o n g c h a i ni 埝l t t y a l c o h o lo x i d a s e si nh i g h e rp l a n t s a b s t r a c t w h e ns o m ei n d u s t r i a ly e a s ts p e c i e sa r eu t i l i z i n ga l k a n e sa n d o rl o n gc h a i nf a t t ya c i d s a sc a r b o ns o u r c ef o rg r o w t h , t h e yf i r s tm e t a b o l i z ea l k a n e sa n d o rl o n gc h a i nf a t t ya c i d st o c a r b o x y l i ca c i d so rd i c a r b o x y l i ca c i d st h r o u g h - o x i d a t i o ns y s t e ml o c a t e da te n d o p l a s m i c r e t i c u l u mm e m b r a n e ，a n dt h e np r o v i d ec a r b o ns o u r c eo re n e r g yt oo r g a n i s mb y 1 3 - o x i d a t i o n d u r i n go d - o x i d a t i o n , t h em e t h y le n do f t h em o l e c u l ei so x i d i z e ds u c c e s s i v e l yb ya c y t o d o m ep 4 5 0a l k a n e d f a t t ya c i dh y d r o x y l a s e , ah y d r o g e np e r o x i d e - g e n e r a t i n ga l c o h o l o x i d a s e ，a n da na l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e , p r o d u c i n g - a l c o h o l ，一a l d e h y d e ，a n df o f a t t y a c i d ，r e s p e c t i v e l y t h ep 4 5 0g e n ew h i c he n c o d e st h ee n z y m et h a tc a t a l y z e st h ef i r s ts t e po ft h e r e a c t i o n su s i n gt h ea l k a n e so rl o n g - c h a i nf a t t ya c i d sa sc a r b o ns o u l c b e l o n g st oc y p 5 2 g e n ef a m i l y t h e r ee x i s tm a n yh o m o l o g o u sg e n e so fc y p 5 2g e n ef a m i l yi np l a n t s m o s to f t h i sk i n do f g e n e sa l er e l a t e dt or e s i s t a n c ea g a i n s td i s e a s ea n ds t r e s s s i n c et h ee n z y m e s s i m i l a rt ot h o s ec a t a l y z i n gt h ef i r s ts t e po ft h e 一o x i d a t i o ni ny e a s te x i s ti np l a n t s ，w h e t h e r t h ee n z y m e ss i m i l a rt of a o si ny e a s ta l s oe x i s ti np l a n t sa n dw h a ta r et h e i rf u n c t i o n s ? t h i sr e s e a r c hm a i n l yf o c u s e so ng e n es e q u e n c e sa n a l y s i s ，b i o c h e m i c a la n d p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n so f f a o s i nt h r e eh i g h e rp l a n t si n c l u d i n ga r a b i d o p s i st h a l i a n a , l o t u s j a p o n i c u sa n do r y z as a t i v a t h e r ea r ef o u rl o n g - c h a i nf a t t ya l c o h o lo x i d a s eg e n e sf o u n di na r a b i d o p s i st h a l i a n a g e n o m eu s i n gt h ea m i n oa c i ds 以l u 沁o f t h ef a oi ny e a s tt os e a r c ht h ed a t a - b a s eo ft h e a r a b i d o p s i st h a l i a n a t h e s ef o u rg e n e sa r ed e s i g n a t e d 嬲a t f a 0 1 ( a t l9 0 3 9 9 0 ) ，a t f a 0 3 ( a t 3 9 2 3 4 10 ) ，a t f a 0 4 a ( a t 4 9 19 3 8 0 ) a n da t f a 0 4 b ( a t 4 9 2 8 5 7 0 ) w eh a v eo b t a i n e dt h e f u l l - l e n g t ho r f o ft h r e ea t f a o se x c e p ta t f a 0 3b yr t - p c r t h el o t u sj a p o n i c u se s td a t a b a s ew a ss e a r c h e da g a i n s ta t f a o sf u l l l e n g t ha m i n o v 上海交通大学博士学位论文 a c i ds e q u e n c e s o n ee s tf r a g m e n tw a sd e t e c t e d a1 4k bf r a g m e n tw a sc l o n e db y 3 - r a c eu s i n gt h ep r i m e r sw h i c hw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h i se s ta n dt h ee d n at h a t i sf r o mt h ea p e x e so fl o t u sj a p o n i c u sa st e m p l a t e t h ec o r r e s p o n d i n gf u l l l e n g t he d n a w a so b t a i n e db ys c r e e n i n gae d n a l i b r a r yo f 厶j a p o n i c u su s i n gt h e1 4k bf r a g m e n ta s p r o b e t h el j f a o ig e n o m i cd n a w a sa m p l i f i e db yp c r , t og i v eap r o d u c to f3 6k bi n l e n g t h c o m p a r i s o nb e t w e e nt h el j f a 0 1e d n aa n dg e n o m i cd n ar e v e a l st h a t t h e l j f a o ic o n t a i n s3e x o r l sa n d2i n t r o n s i na d d i t i o n ，t h el j f a 0 2w a so b t a i n e db ys c r e e n i n g t h es a m ee d n a l i b r a r y t h eg e n o m eo f o r y z as a t i v aw a sa l s os e a r c h e da g a i n s tt h ea m i n oa c i ds e q u e n c e so f f a o g e n e si na r a b i d o p s i s , b yt b l a s t na n db l a s t p i ts h o w st h a tt h e r ea r ef o u rf a og e n e si n g e n o m eo fo r y z as a t i v a o n ei sl o c a t e da tt h ec h r o m o s o m e2a n di ti sd e s i g n a t e da s o s f a 0 1 t h eo t h e rt h r e en a m e da so s f a 0 2 ，o s f a 0 3a n do s f a 0 4 r e s p e c t i v e l ya r ea l la t t h ec h r o m o s o m e10 a n a l y s i so ft h et e nf a og e n es e q u e c e sm e n t i o n e da b o v ei n d i c a t e st h a tm o s to ft h e f a og e n e sw h i c he x i s ti nh i g h e rp l a n t sa l ec o m p o s e do ft h r e ee x o n sa n dt w oi n t r o n s ，a n d t h e ya l lc o n t a i nf i v ec o n s e r v e dd o m a i n si nt h e i ra m i n oa c i ds e q u e n c e s e v o l u t i o n a r ys t u d y s h o w st h a tt h ed i f f e r e n t i a t i o no f 尉份i nh i g h e rp l a n t sf o l l o w st h ed i f f e r e n t i a t i o no ft h e m o n o c o t y l e d o na n dd i c o t y l e d o n e n z y m e sa s s a yw e r ec a r r i e do u ta f t e ro v e r - e x p r e s s i o no ft h ea b o v em e n t i o n e dg e n e s b yb l 21 ( d e 3 ) t h er e s u l t ss h o w t h a to n l yt h ea t f a 0 4 ba n dl j f a 0 1h a v et h ea b i l i t yt o c a t a l y z et h eo x i d a t i o no f t h el o n g - c h a i nf a t t ya l c o h 0 1 e n z y m ek i n e t i c sa n a l y s i ss h o w st h a t a t f a 0 4 ba n dl j f a 0 1b o t hh a v es u b s t r a t es p e c i f i c i t y a f t e rt h ep r o t e i n sp u r i f i c a t i o nu s i n g n i - n t ac o l u m n sa n d e l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i s ，s i n g l ep r o t e i nb a n dw a so b t a i n e d r e s p e c t i v e l y r t - p c rw a s p e r f o r m e dt oc h e c kt h ee x p r e s s i o np a t t e r n so f t h ea t f a 0 3 a n da t f a 0 4 b t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ea t f a 0 3a n da t f a 0 4 ba r eb o t he x p r e s s e di nt h ew h o l ep l a n tb u t r e s p e c t i v et r a n s c r i p t i o nl e v e li sv a r i a n ti nd i f f e r e n tt i s s u e s s e m i q u a n t i t a t i v er t - p c r r e s u l t sa l s os h o wt h a tt h ea t f a 0 3a n da t f a 0 4 bh a v ed i f f e r e n tr e s p o n s e st oc o l ds t r e s s t o d n ai n s e r t i o nm u t a n t so fa t f a 0 3a n da t f a 0 4 bw e r ei n o c u l a t e dw i t hp a t h o g e n , 只 v i 上海交通大学博士学位论文 s y r i n g ep v t o m a t od c 3 0 0 0 a t f a 0 3t - d n a i n s e r t i o nm u t a n ts h o w sn oo b v i o u sc h a n g e w h e r e a sa t f a 0 4 bt - d n ai n s e r t i o nm u t a n ts h o w sh i g h e rs u s c e p t i b i l i t yt oi n f e c t i o n t h e s e r e s u l t si n d i c a t et h a ta t f a 0 3a n da t f a 0 4 bb e t hc a l lc a t a l y z et h el o n g - c h a i nf a t t ya l c o h o l o x i d a t i o nb u tt h e ym a yc a r r yo u td i f f e r e n tf u n c t i o n s nr i v e ，a n da t f a 0 4 bm a yh a v e i m p o r t a n ti m p a c to nl i p i dm e t a b o l i s ma n dc e l lw a l ld e v e l o p m e n t i na t h a l i a n a r t - p c ra n a l y s i ss h o w st h a tt h el j f a 0 1i se x p r e s s e di nt h ew h o l ep l a n t , w i mt h e h i g h e s te x p r e s s i o nl e v e l i na p e xa n dt h el o w e s te x p r e s s i o nl e v e l i nt h es i l i q u e s t h e l j f a 0 1g e n ei sd o w n - r e g u l a t e db y c o l ds t r e s si nb o t ht h ea p e x e sa n dt h ec o t e l y d o n so ft h e 8 - d a yo l ds e e d l i n g s a n a l y s i so ft h eo s f a og e n e se x p r e s s i o nd a t ad o w n l o a d e df r o mt h ep u b l i cd a t a - b a s e s h o w st h a tt h eo s f a 0 1a n do s f a 0 4h a v eh i g h e re x p r e s s i o nl e v e lw h i l eo s f a 0 2a n d o s f a 0 3h a v el o w e re x p r e s s i o nl e v e l f u r t h e rm o r et h ef o u rf a og e n e sh a v ed i f f e r e n t r e s p o n s e st os t r e s s e s a l lt h er e s u l t sm e n t i o n e da b o v ei n d i c a t et h a tt h ef a og e n e se x i s tu b i q u i t o u s l yi n h i g h e rp l a n t s r e s e a r c hf o c u s i n go nt h ea r a b i d o p s i st h a l i a n a ，l o t u s j a p o n i c u sa n do r y z a s a t i v as h o wt h a tt h i sk i n do fg e n e sa r er e l a t e dw i t ht h er e s i s t a n c ea g a i n s td i s e a s ea n d s t r e s 潞 k e y w o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，l o t u s j a p o n i c u s ，o r y z as a t i v a ，l o n g - c h a i n f a t t ya l c o h o lo x i d a s e ，c o l ds t r e s s ，p a t h o g e n v 一 上海交通大学博士学位论文 摘要 目录 一i v 一 x 目录 缩写列表 第一章酵母和植物中咖氧化研究进展 l 1 1 酵母中的( ) 氧化研究进展”l 1 1 1 酵母c y p 5 2 的特性与功能2 1 1 2 酵母长链脂肪醇氧化酶研究进展”l o 1 1 3 酵母脂肪醛脱氢酶研究进展1 7 1 2 植物中的长链脂肪酸氧化研究进展1 8 1 2 1 植物中c y p 5 2 同源基因的研究进展1 9 1 2 2 植物中的长链脂肪醇氧化酶基因研究进展2 3 1 3 本文的目的与意义2 5 第二章 材料和方法一一。一一2 7 2 1 实验材料2 7 2 1 1 植物材料2 7 2 1 2 大肠杆菌菌株2 7 2 1 3 常用载体2 7 2 1 4 e d n a 文库2 7 2 1 5 常用耗材2 8 2 1 6 引物序列2 8 2 1 7 序列分析软件3 0 2 2 实验方法3 0 2 2 1 植物材料的培养3 0 2 2 2 植物基因组d n a 的提取”3l 2 2 3 植物总d n a 的制备“3 2 2 2 a p c r 反应一3 3 2 2 5 p c r 产物克隆及鉴定3 4 2 2 6 基因组s o u t h e r nb l o t t i n g 3 4 2 2 7 e d n a 文库的筛选3 5 2 2 8 蛋白的制备3 6 2 2 9 酶活性检测( 1 m l 体系) ”3 7 2 2 1 0 植株的逆境处理3 8 2 2 11 拟南芥遗传转化及筛选3 8 第三章 高等植物长链脂肪醇氧化酶基因的克隆及序列分析 i x 4 1 上海交通大学博士学位论文 3 1 前言4 l 3 2 实验结果4 3 3 2 1 高等植物长链脂肪醇氧化酶基因的克隆”4 3 3 2 2 高等植物长链脂肪醇氧化酶基因序列分析5 3 3 2 3 s o u t h e r nb l o t t i n g 检测百脉根l j f a o 拷贝数 3 2 4 高等植物长链脂肪醇氧化酶的进化分析6 2 3 3 讨论6 5 3 3 1 l j f a o 基因的拷贝数检测及序列分析”6 5 3 3 2 水稻中翩d 基因结构的预测6 5 3 3 3 水稻f a 0 基因的克隆6 6 3 4 本章小结6 7 第四章高等植物长链脂肪醇氧化酶的生物化学功能研究一6 9 4 1 前言”6 9 4 2 实验结果”7 0 4 2 1 a t f a 0 4 b 蛋白的原核表达及纯化7 0 4 2 2 a t f a 0 4 b 蛋白的酶活测定7 2 4 2 3 l j f a 0 1 蛋白的原核表达与纯化7 4 4 2 4 l j f a 0 1 蛋白的酶活测定7 6 4 2 5 截短及点突变l j f a 0 1 蛋白研究”7 7 4 3 讨论7 9 4 3 1 保守结构域对l j f a 0 1 蛋白酶活性的影响7 9 4 3 2 底物浓度对酶活性检测的影响7 9 4 3 3 水稻f a o 基因的原核表达- 8 0 4 4 本章小结8 5 第五章高等植物长链脂肪醇氧化酶生理功能研究盯 5 1 前言8 7 5 2 实验结果8 8 5 2 1 a t f a 0 3 和a t f a 0 4 b 的启动子元件分析8 8 5 2 2 a t f a 0 3 和a t f a 0 4 b 的芯片数据分析8 9 5 2 3 a t f a 0 3 和a t f a 0 4 b 的表达”9 l 5 2 4 4 艺刚a 1 3 和a t f a 0 4 b 对冷害处理的响应9 2 5 2 5 a t f a 0 3 和a t f a o 铀的t d n a 插入突变体鉴定”9 3 5 2 6 a t f a 0 3 和a t f a 0 4 b 的t - d n a 插入突变体的表型”9 7 5 2 7 r t - p c r 确定l j f a o i 基因的表达模式“1 0 0 5 2 8 l j f a o j 对逆境的响应1 0 1 5 2 9 水稻尼l d 基因的表达模式1 0 2 5 2 1 0 水稻f a o 基因对逆境的响应1 0 4 5 2 1 1 水稻f a o 基因的t - d n a 插入突变株系1 0 5 5 3 讨论1 0 6 5 3 1 彳痢d 突变体的表型1 0 6 5 3 2 a t f a 0 3 和a t f a 0 4 b 的功能差异1 0 7 x 上海交通大学博士学位论文 5 4 第六章 6 1 6 2 参考文献 5 3 3 低温对l j f a 0 1 基因表达水平的影响1 0 7 本章小结1 0 8 全文总结1 0 9 主要结论1 0 9 研究展望；11 0 附录一文中部分基因序列 附录二载体图谱 在读期间发表论文 致谢 x i 1 1 3 1 2 1 1 2 7 1 2 9 1 3 1 轰 曩 缩写列表 1 f a o f a t t ya l c o h o l o x i d a s e 2 r t p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 3 g m cg l u c o s e m e t h a n o l c h o li n ed e h y d r o g e n a s e 4 f a l d hf a tt ya ld e h y d ed e h y d r o g e n a s e 5 a b t s 2 ，2 一a z i n o b i s ( 3 一e t h y l b e n z t h i a z o li n e 一6 一s u l p h o n i ca c i d ) 6 i p t g i s o p r o p y lb d - i t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e 7 x g a l 8 o r f 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y lb d g a l a c t o p y r a n o s i d e o p e nr e a d i n gf r a m e 9 g s p g e n es p e c i f i cp r i m e r 上海交通大学博士学位论文 第一章酵母和植物中6 0 氧化研究进展 1 1 酵母中的( i ) 一氧化研究进展 迄今为止人们发现脂肪酸在生物体内有三种氧化方式，分别为b 一氧化，q 一氧 化和一氧化。其中( - ) 一氧化最初是由v e r k a d e 等人在1 9 3 2 年提出的。他们将制备的辛 酸、壬酸、癸酸和十一碳酸的三酰甘油酯饲喂动物，收集并检验尿中的脂肪酸降解 产物，发现十一碳酸能产生c 1 1 、c 9 和c 7 的二羧酸。由此推出，十一碳酸是远离羧基 的末端碳原子，即一碳原子被氧化，形成a ，一二羧酸，这种氧化方式被称为一 氧化。d 一氧化涉及末端甲基的羟基化，形成一级醇，继续氧化形成醛，再转化成羧 酸n 1 。通常认为该种氧化方式在脂肪酸分解代谢中并不占主要地位，但是这种氧化作 用的中间产物q ，一二元酸却是一类重要的精细化工产品，可以作为工业原料应用 在香料合成、聚合物合成、粘合剂和大环内酯类药品的生产方面。 迄今为止，壬二酸( n o n a n e d i o i ca c i d 或a z e l a i ca c i d ) 、癸二酸( d e c a n e d i o i ca c i d 或s e b a c i ca c i d ) 和十二碳二元酸( d o d e c a n e d i o i ca c i d ) 这三种二元酸已经得到了较 好的商业应用。虽然二元酸具有广泛的用途，但是低产量和高价格却成为限制其应 用的因素。目前人们一般通过植物油裂解、化学合成法和生物合成法等三种方法制 取二元酸仫羽。而氧化可产生二元酸，所以对该种氧化方式的研究日益受到重视。 烷烃和长链脂肪酸被麦芽糖假丝酵母( c a n d i d am a lt o s a ) 、热带假丝酵母 ( c a n d i d at r o p i c a l i s ) 、阴沟假丝酵母( c a n d i d ac l o a c a e ) 等假丝酵母作为碳源 利用要经过定位在内质网膜系统上的一氧化和定位在过氧化物酶体上的b 一氧化途 径。d 一氧化起始于烷烃或长链脂肪酸远羧基端的亚甲基，该基团被细胞色素p 4 5 0 烷烃脂肪酸单加氧酶加羟基，继而由脂肪醇氧化酶、醛脱氢酶氧化生成c o 一醇及一 上海交通大学博士学位论文 醛并最终形成二元酸再继续进行b 一氧化为酵母的生长提供物质和能量h 5 1 ( 图卜1 ) 。 图1 - 1 工业酵母中一氧化和o 一氧化途径可能的相互联系模式图”1 f i g 1 - 1a no v e r a l ld i a g r a mo f t h ep r o p o s e d c o n n e c t i o nb e t w e e l lt o - o x i d a t i o na n d ，- o x i d a t i o np a t h w a y s i ni n d u s t r i a ly e a s t s 5 1 1 1 1 酵母c y p 5 2 的特性与功能 当酵母利用烷烃或长链脂肪酸作为碳源进行生长时所进行的d 一氧化的第一步 反应由细胞色素p 4 5 0 单加氧酶催化完成。 细胞色素p 4 5 0 是广